本發(fā)明涉及動物遺傳育種與繁殖、分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種大白豬抗病新品系的培育方法。
背景技術(shù)：
我國養(yǎng)豬業(yè)具有強大的肉豬生產(chǎn)系統(tǒng)，也就是常說的“我國是養(yǎng)豬大國”，但是在“金字塔”繁育體系中頂端核心種豬資源長期依賴進(jìn)口。在很長的一段時間內(nèi)，對于種豬，我國都處于“引種→維持→退化→再引種”的惡性循環(huán)，在加入wto后，這一狀況更嚴(yán)重。總之，明顯的種豬引進(jìn)依賴對我國養(yǎng)豬業(yè)的持久發(fā)展十分不利，從國家的長遠(yuǎn)利益考慮，此種現(xiàn)象不宜再發(fā)展下去。面對這一狀況，迫使我們必須變依賴進(jìn)口為創(chuàng)造性地進(jìn)行選育，尋求適合我國國情、在國際種豬市場占有一席之地的種豬品系和繁育體系。
豬病是養(yǎng)豬生產(chǎn)的大敵。育種實踐中，單純追求高產(chǎn)通常導(dǎo)致豬的抵抗力降低，一些原有疾病未根除，又出現(xiàn)了新的疾病，嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。疾病可導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品低劣和產(chǎn)量下降，同時它還嚴(yán)重降低遺傳進(jìn)展，給養(yǎng)豬業(yè)造成的直接經(jīng)濟損失約占總產(chǎn)值的12％～15％，因此，做好疾病預(yù)防是發(fā)展養(yǎng)豬業(yè)的前提。
產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(etec)是初生和斷奶仔豬腹瀉和水腫病最常見和最重要的病原菌，是養(yǎng)豬業(yè)中的重要威脅因素(boldinb，2008)，其中f18大腸桿菌又是目前在養(yǎng)豬業(yè)中發(fā)生最普遍、危害最大的大腸桿菌病原之一(vandenbroeckwetal,2000)。盡管當(dāng)前對仔豬腹瀉采取的一些預(yù)防性措施(如提高管理水平、改善衛(wèi)生環(huán)境、注射藥物以及亞單位疫苗接種等)，在一定程度上減少了該病的發(fā)生，但并沒有從根本上消除斷奶仔豬腹瀉的發(fā)生與流行，大腸桿菌性仔豬腹瀉仍然是引起仔豬高發(fā)病率和死亡率最主要的原因之一。為進(jìn)一步保障我國養(yǎng)豬業(yè)步入高產(chǎn)、高效和優(yōu)質(zhì)的新時期，非抗生素治療、廣譜、直接、高效和全新的仔豬細(xì)菌性腹瀉防治措施的研發(fā)是目前最迫切的攻關(guān)難題。從長遠(yuǎn)來看，采用現(xiàn)代遺傳學(xué)方法，提高豬對大腸桿菌的抗病力，進(jìn)行抗病育種，才是治本的辦法。
為了獲得更多的疾病防治方法，必須清楚地了解動物的免疫抗病系統(tǒng)及致病機理。疾病的發(fā)生一般是動物的遺傳背景與其所處環(huán)境之間相互作用的結(jié)果。若某一動物在遺傳上對一種疾病易感，則環(huán)境條件(包括常規(guī)疾病防治方法)可能僅對疾病的防治部分有效。一個可取代疾病常規(guī)防治法是針對提高家畜抗病力進(jìn)行選擇性育種。遺傳性抗病力包括了機體免疫抗病系統(tǒng)及其相互作用的許多方面，因而極為復(fù)雜。目前從根本上開展豬的抗性遺傳機制研究，進(jìn)行抗病育種，已引起了國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。
病原體在傳染過程中，會遇到3道防御機制，即上皮防御機制、非特異性防御機制和特異性防御機制。當(dāng)個體受到病原體侵染時，會調(diào)動這3方面的防御機制加以抵抗。豬是否發(fā)病取決于侵染和防御機能相互作用的結(jié)果，防御機能加強的豬便表現(xiàn)出自然抗病力。抗病力按遺傳基礎(chǔ)的不同可分為特殊抗病力和一般抗病力。特殊抗病力是指豬對某種特定疾病或病原體的抗性，這種抗性主要受一個主基因位點控制，同時也可不同程度地受其它位點(包括調(diào)控子)及環(huán)境因素影響?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，特殊抗病力的內(nèi)在機理在于宿主體內(nèi)存在或缺少某種分子或其變體，這不僅能決定異體識別及特異性異體反應(yīng)，還能決定病原體的特殊附著力，病原體進(jìn)入體內(nèi)后在體內(nèi)增殖，能否導(dǎo)致宿主發(fā)病。一般抗病力不限于抗某一種病原體，它受多基因和環(huán)境的綜合影響，病原體的抗原性差異對一般抗病力影響極小，甚至根本沒有影響，這種抗病力體現(xiàn)了機體對疾病的整體防御功能。
研究發(fā)現(xiàn)，不少豬病的發(fā)病機制與豬本身的遺傳背景有關(guān)，即豬可能對一些疾病存在完全或部分抗性。廣義上講，任何疾病的發(fā)生都是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，幾乎所有疾病都與遺傳有關(guān)。狹義上講，遺傳病是由于生殖細(xì)胞或受精卵中遺傳物質(zhì)發(fā)生了結(jié)構(gòu)或功能上的變異所致。因此，從長遠(yuǎn)角度來看，采用遺傳學(xué)方法從遺傳基礎(chǔ)上提高豬對疾病的一般抗性具有治本的功效。而一般抗性是維持豬在不良環(huán)境中生存和生產(chǎn)的必要條件，因此培育具有一般抗性的豬種成為育種領(lǐng)域的主要課題之一。
衡量動物機體對疾病抵抗能力大小的指標(biāo)有很多，細(xì)胞因子(cytokines，ck)是其中一項重要指標(biāo)，其是由機體免疫細(xì)胞分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子多肽，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、促進(jìn)造血、參與炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)內(nèi)分泌效應(yīng)等多種生物學(xué)功能；在動物體內(nèi)，絕大多數(shù)細(xì)胞因子含量較低，其主要作用是提高動物的免疫功能。據(jù)報道，免疫指標(biāo)可代表機體的免疫功能狀態(tài)，從而間接反映機體的抗病能力，因此可通過免疫指標(biāo)的測定來了解動物的一般抗病力。然而迄今為止，尚未建立對大白豬一般抗病力的評價體系，因而無法從眾多的細(xì)胞因子測定指標(biāo)中選擇最佳數(shù)量指標(biāo)，形成一套適用的綜合評價指標(biāo)體系。
一般抗病力多個測量指標(biāo)中需要構(gòu)建一套適用的綜合評價指標(biāo)體系，在該體系中指標(biāo)模型的構(gòu)建是關(guān)鍵問題之一，主成分分析法(principalcomponentanalysis，pca)正好科學(xué)地解決了這一問題。pca是研究如何將多指標(biāo)問題轉(zhuǎn)化為較少的綜合指標(biāo)的一種重要統(tǒng)計方法，能使問題變得比較簡單、直觀，近來已成為多指標(biāo)綜合評價和權(quán)重系數(shù)確定的重要方法。
大白豬又稱為大約克夏，原產(chǎn)于英國。由于大白豬體型大，繁殖能力強，飼料轉(zhuǎn)化率和屠宰率高，世界各養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國家均有飼養(yǎng)，是世界上最著名，分布最廣的主導(dǎo)瘦肉型豬種。大白豬在我國“三元”雜交商品豬生產(chǎn)中發(fā)揮著極其重要的作用，引進(jìn)的大白豬優(yōu)良特性主要是高生長性能，但是也存在抗病力和繁殖力下降等問題和不足，尤其是近年來仔豬腹瀉病等疾病的發(fā)病率較高，直接和間接導(dǎo)致母豬受胎率、產(chǎn)活仔數(shù)和斷奶仔豬成活率下降。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種大白豬抗病新品系的培育方法，提升斷奶仔豬抗腹瀉病、抗應(yīng)激和適應(yīng)環(huán)境的能力，使得大白豬新品系的飼料報酬高和產(chǎn)仔數(shù)多。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是：提供一種大白豬抗病新品系的培育方法，包括以下步驟：
(1)采用飼料添加的方法對大白豬核心群斷奶仔豬進(jìn)行大腸桿菌感染試驗，根據(jù)表型鑒定的結(jié)果，組建大白豬大腸桿菌抗病育種基礎(chǔ)群；
(2)對基礎(chǔ)群中大腸桿菌抗性型群體細(xì)胞因子白介素1β、白介素4、白介素6、白介素8、白介素10、轉(zhuǎn)化生長因子β、腫瘤壞死因子α、γ干擾素進(jìn)行濃度測定；通過建立主成分綜合評價模型，根據(jù)不同個體的綜合得分來對大白豬一般抗病力進(jìn)行綜合指數(shù)選育，同時對繁殖性能、生長速度、瘦肉率、胴體品質(zhì)性狀進(jìn)行檢測和選擇，組建第一個世代；
(3)用群體繼代選育和分子標(biāo)記輔助選擇的方法，經(jīng)過4-5個世代，逐步實現(xiàn)既定育種目標(biāo)，建立新品系核心群。
在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(1)所述的大白豬大腸桿菌抗病育種基礎(chǔ)群的組建方法具體是：
1)選取的健康的30日齡大白仔豬自由飲水，按照斷奶仔豬的營養(yǎng)需求飼喂含有21.7％粗蛋白的顆粒飼料，飼料中不含有任何抗生素和微生態(tài)制劑；每天喂料4次，一次飼料計量50g，連續(xù)飼喂3天；
2)采用飼料添加的方法進(jìn)行大腸桿菌感染試驗，將大腸桿菌菌株與飼料混合飼喂，每頭豬每天接受菌株的平均劑量是4.6×108cfu，連續(xù)進(jìn)行10天，每天對豬的糞便采集進(jìn)行檢測，以“正?！?、“糊狀”、“水樣”對糞便的粘稠度進(jìn)行記錄；
3)對感染試驗后個體的大腸桿菌抗性/易感性進(jìn)行進(jìn)一步驗證，結(jié)合常規(guī)選種的標(biāo)準(zhǔn)，選留感染試驗后表型一直為“正常”的個體，并且在相同飼養(yǎng)管理環(huán)境條件下按家系分開飼養(yǎng)，組建大白豬大腸桿菌抗病育種基礎(chǔ)群。
在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(2)第一世代的組建具體是：
1)將大白豬大腸桿菌抗病育種基礎(chǔ)群繼續(xù)一般抗病力性狀的檢測和選擇；對大腸桿菌抗病育種基礎(chǔ)群仔豬在35日齡時采集前腔靜脈血，獲得血清樣品后利用豬多細(xì)胞因子檢測試劑盒對細(xì)胞因子白介素1β、白介素4、白介素6、白介素8、白介素10、轉(zhuǎn)化生長因子β、腫瘤壞死因子α、γ干擾素進(jìn)行濃度測定；將上述測得的指標(biāo)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)化z分值，代入下述綜合選擇指數(shù)公式，計算每個個體的綜合選擇指數(shù)值fi；
fi＝0.164zx1+0.209zx2+0.223zx3+0.446zx4+0.412zx5+0.232zx6+0.396zx7+0.303zx8，，其中zx1-zx8分別為白介素1β、白介素4、白介素6、白介素8、白介素10、轉(zhuǎn)化生長因子β、腫瘤壞死因子α和γ干擾素測定值的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)；
fi值越大表示該個體的一般抗病力越強；結(jié)合其他性狀的育種目標(biāo)選留fi值高的個體。
2)對一般抗病力強的個體實行選擇，運用blup模型進(jìn)行種豬的遺傳評估：測定的主要項目有繁殖性狀、肥育性狀、胴體性狀和體型外貌，同時剔除出現(xiàn)遺傳損征的個體；通過測定和評定，選留符合育種目標(biāo)的個體；
斷奶階段選擇：此階段許多性狀還沒有表現(xiàn)出來,因此主要是以多留為原則，剔除不合格的整窩及生長發(fā)育差的個別豬只，原則是：剔除出現(xiàn)遺傳缺陷的整窩豬，所有公豬去勢處理；根據(jù)親代成績，剔除繁殖指數(shù)過低的整窩豬，所有公豬去勢處理；在保證每窩至少有3頭公豬的前提下，將體重低、外形差、生活力弱的所有公豬去勢處理；
75日齡階段，保育結(jié)束時的選擇：此階段的選擇主要依據(jù)個體本身生長發(fā)育進(jìn)行選擇，僅淘汰生長發(fā)育差或有遺傳缺陷的豬只，因采用的是“全進(jìn)全出”的飼養(yǎng)模式，在斷奶階段選擇剔除的豬只是在此時進(jìn)行剔除出群的，原則是：剔除出現(xiàn)遺傳缺陷的整窩豬，所有公豬去勢處理；在保證每窩至少有2頭公豬的前提下，將體重低、生長發(fā)育差、生活力弱的所有公豬去勢處理；在保育出豬時，將在斷奶階段和此階段選擇剔除的豬只剔除至育肥舍，剩下的種豬轉(zhuǎn)入后備舍或種豬測定舍；
5～6月齡階段選擇：5～6月齡時，豬只重要的生產(chǎn)性狀除繁殖性能外都基本表現(xiàn)出來，因此，這一階段是選種的關(guān)鍵時期，應(yīng)該精選，原則是剔除體質(zhì)衰弱、肢蹄存在明顯疾患、有內(nèi)翻乳頭、體型有嚴(yán)重?fù)p征、外陰部特別小、同窩出現(xiàn)遺傳缺陷、體形外貌不符合選育目標(biāo)要求的豬只；其余豬只均進(jìn)行測定，按照綜合選擇指數(shù)進(jìn)行選留或淘汰；
母豬繁殖配種階段選擇：此階段主要是依據(jù)豬只本身的繁殖性能進(jìn)行選擇，原則是同批次的后備母豬應(yīng)在1個月內(nèi)集中配種完畢，1個月后淘汰未能發(fā)情配種的后備母豬；集中配種后，淘汰流膿、非正常返情的個體；正常返情的個體轉(zhuǎn)入生產(chǎn)群中再次配種，若再次返情者淘汰；初產(chǎn)時，淘汰母性太差的個體；對進(jìn)入生產(chǎn)群繁殖了3胎的母豬，發(fā)現(xiàn)其繁殖性能特別優(yōu)秀者，可再次純繁1胎；對于其繁殖性能較差的，則后代不留種；
3)采用不完全閉鎖的一年一世代的群體繼代選育法，維持6個以上的獨立血統(tǒng)數(shù)量。
在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(3)群體繼代選育的方法是：
1)統(tǒng)一場內(nèi)測定性狀、測定方法及數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)，將統(tǒng)計的各項測定數(shù)據(jù)輸入gbs遺傳評估軟件，采用多性狀動物模型blup法對種豬進(jìn)行遺傳評估，估算單性狀的育種值和多性狀綜合選擇指數(shù)，根據(jù)測定評估數(shù)據(jù)并結(jié)合現(xiàn)場觀察來嚴(yán)格選擇，只有最優(yōu)秀者才被入選為核心群；
2)世代選育，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇mas，實施分子育種與常規(guī)育種相結(jié)合，對個體繁殖性能進(jìn)行早期選擇，提高選擇準(zhǔn)確性，縮短世代間隔，從而加大年遺傳進(jìn)展；對特別優(yōu)秀的個體允許適當(dāng)?shù)氖来丿B，提高群體中高產(chǎn)基因頻率，通過不斷合理調(diào)整、優(yōu)化核心群的結(jié)構(gòu)來進(jìn)一步選育提高大白豬抗病新品系種豬的各項生產(chǎn)繁殖性能。
在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述繁殖性狀包括總產(chǎn)仔數(shù)和活產(chǎn)仔數(shù)，所述活產(chǎn)仔數(shù)包括主選性狀、初生重、21日齡窩重和產(chǎn)仔間隔，所述肥育性狀包括達(dá)100kg日齡、30kg－100kg日增重和30kg～100kg飼料轉(zhuǎn)化率，所述胴體性狀包括達(dá)100kg活體背膘。
在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述多性狀綜合選擇指數(shù)包括生長指數(shù)、繁殖指數(shù)、父系指數(shù)和母系指數(shù)。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明指出的一種大白豬抗病新品系的培育方法，具有以下優(yōu)點：
(1)從大白豬抗逆性入手開展抗病育種，提高豬的免疫應(yīng)答能力和一般抗病力，可以更有效地解決豬很多疾病如呼吸道疾病與環(huán)境相互作用的問題，從根本上降低諸多疾病的發(fā)病率；
(2)傳統(tǒng)的新品系培育技術(shù)，主要基于表型性狀進(jìn)行選擇，存在周期長、遺傳進(jìn)展緩慢等缺點，本發(fā)明將免疫學(xué)原理、分子育種技術(shù)及常規(guī)育種手段相結(jié)合，提高大白豬的特殊抗病力(抗大腸桿菌引起的斷奶仔豬腹瀉)和一般抗病力，尤其是先前的一般抗病力評估還僅局限于研究少數(shù)幾個參數(shù)進(jìn)行判斷，無法綜合、準(zhǔn)確地判斷一般抗病力的強弱。本發(fā)明則很好地解決了如何從眾多指標(biāo)中選擇最佳數(shù)量指標(biāo)的難題，最終達(dá)到科學(xué)評價豬個體一般抗病力的目的；
(3)本發(fā)明培育的新品系豬不僅抗斷奶仔豬腹瀉病，還具有瘦肉率高、肉質(zhì)優(yōu)、飼料報酬高、產(chǎn)仔數(shù)多、抗應(yīng)激、適應(yīng)環(huán)境能力強的優(yōu)點，可以直接用于種豬生產(chǎn)，還可以組成雜交配套系的母系；本發(fā)明還可以為其他豬品種的抗病育種和新品系選育提供技術(shù)支持和指導(dǎo)。
具體實施方式
下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：對大白豬核心群采用飼料添加的方法進(jìn)行大腸桿菌感染試驗，根據(jù)表型鑒定的結(jié)果，組建大腸桿菌抗病育種基礎(chǔ)群；同時基于主成分分析構(gòu)建一般抗病力的評估模型，對大腸桿菌抗病育種基礎(chǔ)群進(jìn)行一般抗病力綜合指數(shù)選育，結(jié)合生長速度、瘦肉率、胴體品質(zhì)等性狀進(jìn)行檢測和選擇，運用最佳線性無偏預(yù)測(bestlinearunbiasedprediction,blup)模型進(jìn)行種豬的遺傳評估，運用群體繼代選育和分子標(biāo)記輔助選擇的方法，通過4-5個世代的培育，最終培育出大白豬抗病新品系。
大白豬抗病新品系的培育方法包括以下步驟：
(1)對大白豬核心群斷奶仔豬采用飼料添加的方法進(jìn)行大腸桿菌感染試驗，根據(jù)表型鑒定結(jié)果，組建大白豬大腸桿菌抗病育種基礎(chǔ)群；
(2)對基礎(chǔ)群中大腸桿菌抗性型群體細(xì)胞因子白介素1β、白介素4、白介素6、白介素8、白介素10、轉(zhuǎn)化生長因子β、腫瘤壞死因子α、γ干擾素進(jìn)行濃度測定；通過建立主成分綜合評價模型，根據(jù)不同個體的綜合得分來對大白豬一般抗病力進(jìn)行綜合指數(shù)選育，同時對繁殖性能、生長速度、瘦肉率、胴體品質(zhì)等性狀進(jìn)行檢測和選擇，組建第一個世代；
(3)用群體繼代選育和分子標(biāo)記輔助選擇的方法，經(jīng)過4-5個世代，逐步實現(xiàn)既定育種目標(biāo)，建立新品系核心群。
抗病新品系豬的性能指標(biāo)為：
抗病力：抗斷奶仔豬腹瀉和水腫病，并具有很強的抗應(yīng)激能力和抗逆性。
繁殖性能：新品系豬總產(chǎn)仔數(shù)達(dá)到22頭以上，核心群經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)仔在12.0頭以上。
生長性能：達(dá)100kg日齡：公：155天，母：165天；30kg－100kg日增重：850g；30kg－100kg飼料轉(zhuǎn)化率：2.4。
1、胴體性狀：達(dá)100kg活體背膘：公：9.0mm，母：10.0mm。
實施例：
(一)對大白豬核心群采用飼料添加的方法進(jìn)行f18大腸桿菌(由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購買)感染試驗，根據(jù)表型鑒定的結(jié)果，組建大白豬f18大腸桿菌抗病育種基礎(chǔ)群；
1)細(xì)菌培養(yǎng)將f18大腸桿菌的單個菌落接種到3～5ml的lb培養(yǎng)基中，并37℃振蕩培養(yǎng)過夜(約18h)，次日將細(xì)菌用pbs反復(fù)離心洗滌3次，并將大腸桿菌菌株與pbs按照1:20的比例進(jìn)行稀釋，調(diào)整細(xì)菌濃度為4.6×108cfu/l。
2)飼料配制按照斷奶仔豬的營養(yǎng)需求飼喂含有21.7％粗蛋白的顆粒飼料，飼料中不含有任何抗生素和微生態(tài)制劑，配制不含有抗生素和微生態(tài)制劑的飼料，主要是為了避免飼料中抗生素等對試驗產(chǎn)生的干擾和影響。
3)e.colif18菌株和輪狀病毒的檢測攻毒之前，檢測所有個體糞便中是否含有f18大腸桿菌和輪狀病毒，采用棉花棒在肛門處采集少量糞便，每個肛拭子中加入800ul高壓雙蒸水混勻，取其中的200ul到另外一個ep管中，取20ul涂布麥康凱平板，其余120℃變性10min，12000r/min×1min，取上清做dna模板，用于檢測f18大腸桿菌；剩余的600ul反復(fù)凍融2次，用試劑盒提取rna，反轉(zhuǎn)成cdna，-20℃凍存用于檢測輪狀病毒。糞便dna的pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，只有糞便中均未發(fā)現(xiàn)f18大腸桿菌和輪狀病毒時，排除了攻毒個體自身攜帶輪狀病毒和大腸桿菌導(dǎo)致腹瀉的可能性，才可以進(jìn)行下一步的攻毒試驗。
f18大腸桿菌檢測：pcr反應(yīng)體系：模板dna5.0μl，10×buffer5.0μl，mgcl22ul，dntp混合物3.0μl，f18大腸桿菌(sta和stx2)上下游引物各1.25μl(引物見表1)，taq酶(5u/μl)1.0μl，加雙蒸水補足至50μl。pcr擴增條件為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸90s，共進(jìn)行30個循環(huán)，然后72℃后延伸10min，最后放入4℃保存?zhèn)溆?。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
輪狀病毒檢測：pcr反應(yīng)體系：模板cdna3.0μl，10×buffer2.5μl，mgcl21.0ul，dntp混合物1.0μl，rav-vp7引物各1.0μl(引物見表1)，taq酶(5u/μl)0.5μl，加雙蒸水補足至25μl。pcr擴增條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共進(jìn)行30個循環(huán)，然后72℃后延伸10min，最后放入4℃保存?zhèn)溆?，pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
表1f18大腸桿菌和輪狀病毒檢測引物
4)感染試驗并選擇f18大腸桿菌抗性型個體
試驗豬為選取的健康、30日齡大白仔豬，自由飲水，每天喂料4次，一次飼料計量50g，連續(xù)飼喂3天。采用飼料添加的方法進(jìn)行f18大腸桿菌感染試驗，將f18大腸桿菌菌株與飼料混合飼喂，每頭豬每天接受f18菌株的平均劑量是4.6×108cfu，利用連續(xù)進(jìn)行10天或直至它們出現(xiàn)腹瀉癥狀，在感染試驗后，每天對豬的糞便采集進(jìn)行檢測，以“正常”、“糊狀”、“水樣”對糞便的粘稠度進(jìn)行記錄。只有一直為正常糞便的豬表現(xiàn)為對f18大腸桿菌具有較強的抗性，才可以鑒定e.colif18抗性型個體。
結(jié)合常規(guī)選種的標(biāo)準(zhǔn)以及初生重、斷奶重指標(biāo)，選留攻毒后表型一直為“正常”的個體，并且在相同飼養(yǎng)管理環(huán)境條件下按家系分開飼養(yǎng)，組建大白豬f18大腸桿菌抗病育種基礎(chǔ)群。
(二)對基礎(chǔ)群中f18大腸桿菌抗性型群體細(xì)胞因子(白介素1β、白介素4、白介素6、白介素8、白介素10、轉(zhuǎn)化生長因子β、腫瘤壞死因子α、γ干擾素進(jìn)行濃度測定；通過建立主成分綜合評價模型，根據(jù)不同個體的綜合得分來對大白豬一般抗病力進(jìn)行綜合指數(shù)選育，同時對繁殖性能、生長速度、瘦肉率、胴體品質(zhì)性狀進(jìn)行檢測和選擇，組建第一個世代；
在實施本發(fā)明之前，課題組在蘇太豬(具有50％中國地方豬品種血統(tǒng)的培育品種中)群體利用測定白介素2(il-2)、白介素4(il-4)、白介素6(il-6)、白介素10(il-10)、白介素12(il-12)和β干擾素(ifn-β)來評價群體的一般抗病力，但是在本發(fā)明的預(yù)備試驗中，通過對斷奶前后以及斷奶時不同健康狀況仔豬小樣本量細(xì)胞因子的測定比較，發(fā)現(xiàn)白介素2(il-2)和白介素12(il-12)差異很小，因此不適宜作為評價大白豬的細(xì)胞因子，但是也不能推斷出適用的指標(biāo)；因此結(jié)合預(yù)備試驗測定結(jié)果、細(xì)胞因子的生物學(xué)功能以及國內(nèi)外關(guān)于大白豬細(xì)胞因子的相關(guān)報道，最終選擇白介素1β(il-1β)、白介素4(il-4)、白介素6(il-6)、白介素8(il-8)、白介素10(il-10)、轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-β)、腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor,tnf-α)、γ干擾素(ifn-γ)進(jìn)行測定，效果顯著。
對78頭30日齡健康仔豬前腔靜脈采血，4℃放置30min，常規(guī)分離血清。依次使用對應(yīng)緩沖液對標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行四倍八點濃度梯度稀釋，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時使用對應(yīng)緩沖液稀釋樣本血清，按照操作說明，利用豬多細(xì)胞因子檢測試劑盒(affymetrix公司，美國)對樣本血清進(jìn)行處理，送入已校正的bio-plex懸液芯片系統(tǒng)中讀出對應(yīng)熒光值，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中細(xì)胞因子(il-1β、il-4、il-6、il-8、il-10、tgf-β、tnf-α和ifn-γ)的濃度。
1)主成分分析
利用spssl6.0統(tǒng)計軟件的factor模塊對上述免疫指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。
1、原始數(shù)據(jù)的無量綱化
設(shè)有n個樣本，p項指標(biāo)：
2、計算相關(guān)系數(shù)(r)，建立相關(guān)矩陣(r)
3、求解相關(guān)矩陣r的特征根，確定主成分
利用spssl6.0factor模塊求相關(guān)矩陣r的特征值，累計貢獻(xiàn)率及特征向量。為了保留p維空間的信息量和簡化計算，一般選擇k個較大特征根，使累計貢獻(xiàn)率
4主成分綜合評估
采用加權(quán)算術(shù)平均來綜合，并以各主成分的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重。
2)綜合選擇指數(shù)的確定
18個細(xì)胞因子測定值間的相關(guān)分析
對78頭大白豬8個細(xì)胞因子進(jìn)行測定(見表2)，并將整理后的各指標(biāo)值無量綱處理，相關(guān)矩陣見表3。從表3可以看出，8個測定變量之間均呈一定程度的正相關(guān)。
表2大白豬8個細(xì)胞因子的測定值
表3大白豬8個細(xì)胞因子的相關(guān)矩陣
2主成分分析
按照主成分分析中關(guān)于累積貢獻(xiàn)率和特征向量的生物學(xué)含義，累積貢獻(xiàn)率為各復(fù)合性狀相對于所有復(fù)合性狀對于遺傳方差的貢獻(xiàn)的百分率；負(fù)荷值(特征向量)表示對復(fù)合性狀貢獻(xiàn)的大小，其絕對值反映了各性狀對該主成分作用的大小和性質(zhì)。通過對8個指標(biāo)的主成分分析，得到各主成分的特征根及方差貢獻(xiàn)率。由表4可知前5個主成分對總方差的貢獻(xiàn)率達(dá)到了87.721％>85％，基本上反映了原所有細(xì)胞因子包含的全部信息，可以用作大白豬細(xì)胞因子綜合評估模型的建立，且評價的可信度為87.721％。根據(jù)入選主成分的特征向量(表5)，5個入選主成分可分別表達(dá)為公式f1～f5，具體主成分表達(dá)式模型見表6。第一主成分的貢獻(xiàn)率為39.963％，對總方差的影響最大，從公式f1可以看出，第一主成分主要結(jié)合了il-1β、il-4、tgf-β和tnf-α等的變異信息。
表4各主成分的特征根和貢獻(xiàn)率
注：表中特征根代表各復(fù)合性狀遺傳方差大小，各特征根的累計貢獻(xiàn)率代表各復(fù)合性狀遺傳方差貢獻(xiàn)的百分率。
表5入選主成分的負(fù)荷值
3主成分綜合評價
因為前5個主成分在總變異的方差中的貢獻(xiàn)率超過85％，所以用各主成分的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)，計算前5個主成分的加權(quán)平均數(shù)，其公式如下，具體計算公式為：fi＝(39.963f1+21.722f2+10.612f3+9.269f4+6.154f5)/87.721。將f1～f5代入上式，簡化后的綜合主成分計算公式如下：fi＝0.164zx1+0.209zx2+0.223zx3+0.446zx4+0.412zx5+0.232zx6+0.396zx7+0.303zx8，其中zx1、zx2、zx3、zx4、zx5、zx6、zx7、zx8分別為il-1β、il-4、il-6、il-8、il-10、tgf-β、tnf-α和ifn-γ測定值的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。
從綜合評估公式fi中不難發(fā)現(xiàn)il-8、il-10、tnf-α和ifn-γ對大白豬的一般抗病力影響較大。
表6主成分表達(dá)式(模型)
注：il-1β(zx1),il-4(zx2),il-6(zx3),il-8(zx4),il-10(zx5),tgf-β(zx6),tnf-α(zx7),ifn-γ(zx8)。
本試驗選取的8個免疫指標(biāo)間均呈正相關(guān)，如果這種相關(guān)性較高的指標(biāo)直接進(jìn)行分析，可能會帶來嚴(yán)重的共線性問題，這也充分說明主成分分析適用于本研究。本試驗選取了5個主成分來反映大白豬一般抗病力的綜合水平，其中第一主成分能夠最大限度地結(jié)合原始信息，是概括指標(biāo)差異信息的最佳線性函數(shù)；此外，所有主成分加權(quán)綜合會提高評價函數(shù)區(qū)分的有效度，從而提高評估的準(zhǔn)確性。在主成分負(fù)荷矩陣中，負(fù)荷值實際上就是變量與因子的相關(guān)系數(shù)，它的平方就表示該因子解釋該變量的方差比例。因此當(dāng)負(fù)荷值小于0.3時，說明該因子對該變量變異的解釋度小于10％，從實用的角度看可以忽略。
從綜合評估公式來看，il-8、il-10、tnf-α和ifn-γ的負(fù)荷值均大于0.3，對評估模型的影響最大，可以解釋綜合主成分。白細(xì)胞介素10(interleukin-10，il-10)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，其生物學(xué)功能主要是限制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和增殖，大量研究證實il-10對炎癥、惡性腫瘤、自身免疫性疾病起重要作用。腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,tnf)主要作用是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生il-1、il-2和il-6引發(fā)炎癥，促使細(xì)胞凋亡，阻止腫瘤發(fā)生、病毒復(fù)制及病原菌的增殖等。作為tnf的重要組成部分，tnf-α是維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)和抵御病菌至關(guān)重要的細(xì)胞因子。干擾素γ(interferongamma，ifn-γ)主要由活化的t細(xì)胞和nk細(xì)胞產(chǎn)生，對機體免疫系統(tǒng)具有強大的調(diào)節(jié)作用，是機體發(fā)揮免疫功能、清除體內(nèi)病原體不可缺少的成分；大量研究表明，豬干擾素對生產(chǎn)有重大威脅的傳染病病毒(如prrsv、tgev、hcv等)均具有防御和抑制作用。作為多功能因子，il-8雖然在腫瘤免疫方面具有雙重性作用，但據(jù)報道多種微生物及其產(chǎn)物可刺激機體產(chǎn)生il-8，表明il-8在抗微生物感染中發(fā)揮重要作用；發(fā)生炎性疾病時，炎癥灶內(nèi)存在的白細(xì)胞與il-8有關(guān)，il-8對白細(xì)胞具有化學(xué)激動和趨化效應(yīng)，使白細(xì)胞游走能力加強，并增進(jìn)白細(xì)胞產(chǎn)生抗感染免疫應(yīng)答。根據(jù)上述4個細(xì)胞因子的生物學(xué)功能，其測定值越大則標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值也越大，即其一般抗病力越強。
3)大白豬一般抗病力的評估模型的驗證
在全場30日齡斷奶仔豬中，選取15頭出現(xiàn)腹瀉癥狀的斷奶仔豬和15頭健康的斷奶仔豬作為驗證一般抗病力模型的個體，同樣按照上述方法采血制備血清，獲得血清樣品后利用豬多細(xì)胞因子檢測試劑盒(affymetrix公司，美國)對白介素1β(il-1β)、白介素4(il-4)、白介素6(il-6)、白介素8(il-8)、白介素10(il-10)、轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-β)、腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor,tnf-α)、γ干擾素(ifn-γ)進(jìn)行濃度測定。分別對大白豬健康組(15頭健康的斷奶仔豬)和腹瀉組(15頭出現(xiàn)腹瀉癥狀的斷奶仔豬)第一主成分(f1)至第五主成分(f5)以及主成分綜合(fi)得分進(jìn)行計算，健康組和腹瀉組大白豬的綜合得分分別為0.080和-0.009(表7)。
表7健康組和腹瀉組大白豬細(xì)胞因子主成分及綜合得分
仔豬在斷奶時，在外界病原、環(huán)境因素以及斷奶應(yīng)激等因素的作用下，部分個體可能會出現(xiàn)腹瀉癥狀，對腹瀉抗性和易感性也在一定程度上反映了斷奶仔豬的一般抗病力和免疫應(yīng)答能力，因此選取15頭出現(xiàn)腹瀉癥狀的斷奶仔豬和15頭健康的斷奶仔豬作為驗證一般抗病力模型的個體，在綜合得分方面，健康組和腹瀉組大白豬的綜合得分分別為0.080和-0.009，初步驗證了本發(fā)明建立的一般抗病力模型可以為大白豬一般抗病力的早期選育提供了一定的指導(dǎo)和依據(jù)。
(三)組建第一世代
按照育種規(guī)劃，采用高選擇差法以及個體與家系相結(jié)合的選擇方法組建基礎(chǔ)群，根據(jù)組建基礎(chǔ)群的要求，首先將后備豬按照家系分組，在每個家系內(nèi)選擇fi值高的個體，選擇個體的數(shù)目按照每個世代需要選留的后備豬數(shù)量來確定。也就是在考慮家系親緣關(guān)系的前提下，選擇家系內(nèi)fi值高的個體。
對一般抗病力強的個體實行選擇，運用blup模型進(jìn)行種豬的遺傳評估：測定的主要項目有繁殖性狀(總產(chǎn)仔數(shù)、活產(chǎn)仔數(shù)(主選性狀、初生重、21日齡窩重、產(chǎn)仔間隔)、肥育性狀(達(dá)100kg日齡、30kg－100kg日增重、30kg－100kg飼料轉(zhuǎn)化率)、胴體性狀(達(dá)100kg活體背膘)、體型外貌，同時剔除出現(xiàn)遺傳損征的個體；通過測定和評定，選留符合育種目標(biāo)的個體；
斷奶階段選擇：此階段許多性狀還沒有表現(xiàn)出來,因此主要是以多留為原則，剔除不合格的整窩及生長發(fā)育差的個別豬只，原則是：剔除出現(xiàn)遺傳缺陷的整窩豬，所有公豬去勢處理；根據(jù)親代成績，剔除繁殖指數(shù)過低的整窩豬，所有公豬去勢處理；在保證每窩至少有3頭公豬的前提下，將體重低、外形差、生活力弱的所有公豬去勢處理。
75日齡階段(保育結(jié)束時)選擇：此階段的選擇主要依據(jù)個體本身生長發(fā)育進(jìn)行選擇，僅淘汰生長發(fā)育差，或有遺傳缺陷，的豬只。因采用的是“全進(jìn)全出”的飼養(yǎng)模式，在斷奶階段選擇剔除的豬只是在此時進(jìn)行剔除出群的，原則是：剔除出現(xiàn)遺傳缺陷的整窩豬，所有公豬去勢處理；在保證每窩至少有2頭公豬的前提下，將體重低、生長發(fā)育差、生活力弱的所有公豬去勢處理；在保育出豬時，將在斷奶階段和此階段選擇剔除的豬只剔除至育肥舍，剩下的種豬轉(zhuǎn)入后備舍或種豬測定舍。
5－6月齡階段選擇：5－6月齡時，豬只重要的生產(chǎn)性狀(除繁殖性能外)都基本表現(xiàn)出來。因此，這一階段是選種的關(guān)鍵時期，應(yīng)該精選。原則是剔除體質(zhì)衰弱、肢蹄存在明顯疾患、有內(nèi)翻乳頭、體型有嚴(yán)重?fù)p征、外陰部特別小、同窩出現(xiàn)遺傳缺陷、體形外貌不符合選育目標(biāo)要求的豬只；其余豬只均進(jìn)行測定，按照綜合選擇指數(shù)進(jìn)行選留或淘汰。
母豬繁殖配種階段選擇：此階段主要是依據(jù)豬只本身的繁殖性能進(jìn)行選擇。原則是同批次的后備母豬應(yīng)在1個月內(nèi)集中配種完畢，1個月后淘汰未能發(fā)情配種的后備母豬；集中配種后，淘汰流膿、非正常返情的個體；正常返情的個體轉(zhuǎn)入生產(chǎn)群中再次配種，若再次返情者淘汰；初產(chǎn)時，淘汰母性太差的個體；對進(jìn)入生產(chǎn)群繁殖了3胎的母豬，發(fā)現(xiàn)其繁殖性能特別優(yōu)秀者，可再次純繁1胎；對于其繁殖性能較差的，則后代不留種。
(四)用群體繼代選育和分子標(biāo)記輔助選擇的方法，經(jīng)過4-5個世代，逐步實現(xiàn)既定育種目標(biāo)，建立新品系核心群。
1)統(tǒng)一場內(nèi)測定性狀、測定方法及數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)，將統(tǒng)計的各項測定數(shù)據(jù)輸入gbs遺傳評估軟件，采用多性狀動物模型blup法對種豬進(jìn)行遺傳評估，估算單性狀的育種值和多性狀綜合選擇指數(shù)(如生長指數(shù)、繁殖指數(shù)、父系指數(shù)、母系指數(shù)等)，根據(jù)測定評估數(shù)據(jù)并結(jié)合現(xiàn)場觀察來嚴(yán)格選擇，只有最優(yōu)秀者才被入選為核心群。
2)世代選育，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇(mas)，實施分子育種與常規(guī)育種相結(jié)合，對個體繁殖性能進(jìn)行早期選擇，提高選擇準(zhǔn)確性，縮短世代間隔，從而加大年遺傳進(jìn)展。對特別優(yōu)秀的個體允許適當(dāng)?shù)氖来丿B，提高群體中高產(chǎn)基因頻率，通過不斷合理調(diào)整、優(yōu)化核心群的結(jié)構(gòu)來進(jìn)一步選育提高大白豬抗病新品系種豬的各項生產(chǎn)繁殖性能。
在組建大白豬抗大腸桿菌病群體的基礎(chǔ)上，測定不同發(fā)育時期干擾素、白介素等細(xì)胞因子及主要抗體水平等免疫應(yīng)答指標(biāo)，在分析免疫應(yīng)答指標(biāo)及其與生長發(fā)育關(guān)系的基礎(chǔ)上，確定免疫應(yīng)答和一般抗病力的評價指標(biāo)并納入常規(guī)選種選育體系，篩選有效的一般抗病力分子標(biāo)記并進(jìn)行育種效率評估，選留一般抗病力強的個體，同時對繁殖性能、生長速度、瘦肉率、胴體品質(zhì)等性狀進(jìn)行檢測和選擇，組建第一個世代；用群體繼代選育和分子標(biāo)記輔助選擇的方法，經(jīng)過4-5個世代，逐步實現(xiàn)既定育種目標(biāo)，建立新品系核心群，有望降低仔豬腹瀉疾病的發(fā)病率，培育具有抗大腸桿菌病和一般抗病力強、生長速度快的大白豬抗病新品系，從根本上為實現(xiàn)種豬的健康高效養(yǎng)殖奠定基礎(chǔ)，取得可觀的社會效益、經(jīng)濟效益和社會效益，該方法還可以為其他豬品種的抗病育種和新品系選育提供指導(dǎo)。
以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。