一、技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于病蟲害防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及仙鶴草提取物在制備用于去除番茄植株中植物病毒的藥物中的應(yīng)用。
二、技術(shù)背景
對于植物病毒病的防控，主要采取利用抗病品種、用病毒拮抗劑控制病毒等手段，由媒介昆蟲傳播的植物病毒病，還可通過化學(xué)或物理手段控制傳毒介體來控制病害。關(guān)于病毒拮抗劑，主要通過抑制病毒侵染、抑制病毒增殖和轉(zhuǎn)運、抑制病毒癥狀表達(dá)、誘導(dǎo)植物抗病性等達(dá)到控制病毒病的目的，對于植物體內(nèi)已經(jīng)存在的病毒如何清除，尚未見相關(guān)研究報道。也因此，當(dāng)前生產(chǎn)上對于病毒病仍以防為主，對于已經(jīng)發(fā)生的植物病毒病，常無有效治療手段。發(fā)掘有效去除植物體內(nèi)病毒的方法對于病毒病的治理至關(guān)重要。
番茄黃化曲葉病毒屬雙生病毒科geminiviridae菜豆金色花葉病毒屬begomovirus病毒，為單鏈環(huán)狀dna病毒，由煙粉虱傳播。煙粉虱入侵性強，也因此已造成了番茄黃化曲葉病毒病在亞洲、非洲、美洲等地區(qū)多個國家的流行，在我國，番茄黃化曲葉病已蔓延到江蘇、浙江、云南等大多數(shù)省份，造成番茄大面積減產(chǎn)和品質(zhì)下降。
從自然界中尋找抗植物病毒活性物質(zhì)是獲取抗病毒藥物的重要途徑。植物源提取物來源豐富，已發(fā)現(xiàn)一些植物源提取物對植物病毒的拮抗作用，如丁香酚可對番茄黃化曲葉病毒有拮抗作用，但植物源提取物能否去除植物體內(nèi)的病毒，尚不清楚。仙鶴草agrimoniapilosaledeb.是一種薔薇科多年生草本植物，在我國很多地區(qū)有分布，其在醫(yī)學(xué)上具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖、降血壓和增強機體免疫功能等多種作用，是一種用途較廣的中藥。關(guān)于仙鶴草提取物在農(nóng)業(yè)上的作用，已發(fā)現(xiàn)其可提高昆蟲寄生蜂的寄生能力和耐藥性，也可提高蜘蛛對害蟲的捕食能力(已獲發(fā)明專利)。研究仙鶴草提取物對番茄植株中番茄黃化曲葉病毒的影響，以期望開發(fā)應(yīng)用仙鶴草提取物作為去除番茄植株中植物病毒的藥物，從而能實現(xiàn)病毒病的治療，在植物病毒病防控方面發(fā)揮作用。
三、
技術(shù)實現(xiàn)要素：
1、發(fā)明目的
提供一種利用仙鶴草提取物制備去除番茄植株中植物病毒藥物的方法，能完全去除一些番茄植株內(nèi)番茄黃化曲葉病毒，也可降低未完全去除病毒番茄植株中植物病毒的含量，此將為番茄黃化曲葉病的治療打開通道。
2、技術(shù)方案
本發(fā)明為一種番茄植株中植物病毒的去除方法，其特征在于利用仙鶴草乙醇提取物去除番茄植株中番茄黃化曲葉病毒的方法。
3、有益效果
本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，產(chǎn)生以下有益效果：(1)與常規(guī)的病毒拮抗劑通過抑制病毒增殖等控制番茄黃化曲葉病相比，本發(fā)明通過有效去除番茄植株中植物病毒來控制病毒病，可實現(xiàn)病毒病的直接治療；(2)與化學(xué)藥劑防治病毒病相比，本發(fā)明利用仙鶴草乙醇提取物進(jìn)行控制，可切實提高病毒病控制的無公害控制水平，有效減少環(huán)境污染。
四、具體實施方式
本發(fā)明的實施例是采用室內(nèi)測定的方法。
測定方法如下：
1、番茄植株上接種病毒
帶毒煙粉虱接入健康番茄植株苗，每10盆即10株苗為一個重復(fù)(放在同一養(yǎng)蟲籠內(nèi))，接入剛羽化且攜帶番茄黃化曲葉病毒的煙粉虱30頭，在接蟲7天后，將煙粉虱移出，番茄植株用于后面的處理。
2、仙鶴草的乙醇提取
用萬能粉碎機將中藥仙鶴草粉碎，稱取200g干粉放入1000ml三角瓶中，加入75％乙醇500ml，在室溫下浸提14天，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在水浴中減壓濃縮，蒸掉酒精，得中藥提取物并干燥，后溶解于25ml丙酮中，仙鶴草乙醇提取物的原始濃度按以下公式來表示：濃度＝藥材干重/終體積，按此計算，仙鶴草的原始濃度均為8g/ml，提取液保存于4℃冰箱中備用。
3、仙鶴草乙醇提取物處理番茄苗
灌根處理經(jīng)煙粉虱傳毒的番茄苗，處理分3種，分別為0.1g/ml仙鶴草乙醇提取物處理、發(fā)病清水對照(即接入帶毒煙粉虱)和未發(fā)病清水對照(即未接入帶毒煙粉虱)，每株苗灌根處理用20ml藥液或清水。灌根處理后，將苗放在養(yǎng)蟲籠中，相同處理每10株(盆)苗放一養(yǎng)蟲籠。每處理重復(fù)4組共40株苗，每株苗均進(jìn)行編號。番茄苗用于觀察生長和發(fā)病狀況以及病毒的定性和定量檢測。實驗在放有植物生長燈的室內(nèi)進(jìn)行，溫度為27℃，每天光照時間為14h。
4、番茄植株dna的提取
分別在處理前、處理后不同時間進(jìn)行取樣，每次每處理取每株上部葉片各一片，放入冰箱-20℃內(nèi)，用于番茄黃化曲葉病毒的檢測。病毒的定性分析樣品按單株葉片單獨進(jìn)行dna提取，在處理后一個月和兩個月分別取樣；定量檢測按每重復(fù)即10株為一組進(jìn)行dna提取，分別在處理后6周和10周進(jìn)行取樣。
dna提?。涸?.5ml的離心管中加入樣品和20μl的dna堿裂解液(50mmol/ltris-hcl(ph8.0)，20mmol/lnacl，1mmol/ledta，1％sds)，充分研磨。加1μl蛋白酶k(20mg/ml)，離心30秒，60℃水浴1小時，追加1μl蛋白酶k，離心30s，繼續(xù)水浴2小時，加178μl的雙蒸水，100℃水浴5min，滅活蛋白酶k。取100μl提取液于另一離心管中，加2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，充分混勻，4℃冰箱沉淀過夜后4℃13000rpm離心10分鐘，倒出乙醇，晾干后加20μl的雙蒸水溶解dna，-20℃保存。
5、番茄植株中番茄黃化曲葉病毒的定性檢測
定性檢測番茄黃化曲葉病毒的特異性引物為：
tv_p833(5’-ggtctacacgcttacgccttatt-3’)
paty_r(5’-ttccatccgaacattcaggcagc-3’)
擴增片段大約為800bp左右。pcr的反應(yīng)體系為10μl，包含5μlmix(100mmkcl，20mmtris-hcl，3mmmgcl2，400μmdntps，溴酚藍(lán))，0.2μltaq酶(5u/μl)，0.5μl引物tv_p833，0.5μl引物paty_r，3.2μlh2o，0.6μldna模板。pcr參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸20min。pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳和克隆測序，明確其病毒種類。記錄各處理攜帶病毒的番茄植株數(shù)，計算病毒攜帶率。
6、番茄植株中番茄黃化曲葉病毒的定量檢測
番茄黃化曲葉病毒基因組1462(+)至1601(-)片段的拷貝數(shù)通過abistepone熒光定量pcr儀來測定，用于擴增番茄黃化曲葉病毒基因組1462(+)至1601(-)片段的引物為：
(yg3)5’-gagttcccctgtgcgtgaa-3’
(yg5)5’-ctgttcgcaagtatcaatcaaggt-3’
反應(yīng)體系為：
擴增程序：52℃2min，95℃1min，40個循環(huán)：95℃r5s，60℃30s，72℃。
7、數(shù)據(jù)分析
用統(tǒng)計分析軟件spss17.0對番茄植株中番茄黃化曲葉病毒感染率和含量均采用t檢驗法進(jìn)行處理與對照間的差異顯著性分析。
五、實施效果：
1、仙鶴草乙醇提取物對番茄植株內(nèi)番茄黃化曲葉病毒感染率的影響
對仙鶴草乙醇提取物處理番茄植株中番茄黃化曲葉病毒感染率的分析表明，在處理前，仙鶴草乙醇提取物和對照組番茄苗的番茄黃化曲葉病毒感染率分別為95％和90％，無顯著差異(t＝1，p＝0.3559)；處理一個月后，仙鶴草乙醇提取物和對照組番茄黃化曲葉病毒感染率分別為60％和87.5％，處理組也未顯著高于對照組(t＝2.2，p＝0.0701)；處理兩個月后，處理組病毒感染率進(jìn)一步下降，仙鶴草乙醇提取物處理組感染率為42.5％，而此時對照組番茄黃化曲葉病毒感染率高達(dá)97.5％，處理組顯著低于對照組(t＝6.96，p＝0.0004)，表明仙鶴草乙醇提取物處理有效去除了部分番茄植株內(nèi)番茄黃化曲葉病毒。
2、仙鶴草乙醇提取物對番茄植株中番茄黃化曲葉病毒含量的影響
對仙鶴草乙醇提取物處理番茄植株中番茄黃化曲葉病毒含量的分析表明，處理6周后，仙鶴草乙醇提取物處理組番茄植株內(nèi)番茄黃化曲葉病毒含量顯著低于對照組(t＝3.95，p＝0.0168)；處理10周后，病毒量仍顯著低于對照(t＝3.3，p＝0.0298)，表明仙鶴草乙醇提取物處理有效降低了番茄植株內(nèi)番茄黃化曲葉病毒的含量。