專利名稱:一種枸骨內生真菌-哈茨木霉菌株l的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物技術領域：
，特別是涉及植物內生真菌防治部分植物真菌病害有效菌株的分離，及其抑菌代謝產物的制備與應用方法。
背景技術：
植物體內都存在大量的內生真菌，內生真菌最早發(fā)現于牧草，后來又在木本植物、草本植物、禾本植物、苔蘚、地衣、海藻等植物中被發(fā)現。迄今的研究表明，植物內生真菌可增強宿主的抗病性、提高植物的生產力、抗逆抗蟲等。發(fā)揮這些作用是由于內生真菌在植物體內繁殖和生長，并在體內產生有生物活性的次生代謝產物。因此，內生真菌可能成為生物防治中有潛力的生物控制劑，在生態(tài)農業(yè)和生物農藥研制方面具有重要的用途。近年來植物內生真菌已引起了微生物學家、生態(tài)學家、植物保護學家的廣泛興趣，逐漸成為國內外研究的熱點。目前微生物源生物化學農藥的研究和開發(fā)在我國十分活躍，但微生物資源及其應用潛力尚沒有得到充分的發(fā)揮，而植物內生真菌即是這樣一類有待開發(fā)的新興微生物資源。
枸骨(Ilex cornuta Lindl.et Paxt.)為冬青科常綠植物，主要分布于河南、湖北、湖南、安徽、江蘇、浙江、江西、福建等地。枸骨葉味苦、微澀，性寒，是一種中藥，始載于《本草拾遺》。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認為，枸骨葉具有清熱養(yǎng)陰，平肝益腎，散風通絡等功效；近代藥理研究表明，枸骨葉具有抗生育，擴張冠狀動脈，抗菌等作用。眾所周知，雷公藤具有多種醫(yī)藥作用，從雷公藤中提取的化學成分具有抗腫瘤、抗炎、免疫抑制及抗生育作用，還有治療類風濕性關節(jié)炎等作用。同樣雷公藤也是一種良好的殺蟲植物，具有胃毒、拒食、抑制生長發(fā)育等殺蟲活性。D.Siva Sundara Kumar等從雷公藤中篩選到代謝產物具有抗類風濕作用的內生真菌(Journal of Ethnopharmacology，2004，295-300)，申屠旭萍等從雷公藤中篩選到具有對農作物真菌病害具有抑制作用的內生真菌(雷公藤內生真菌的分離及活性菌株的篩選，浙江農業(yè)學報，2006，18(5)308-312)。枸骨作為一種醫(yī)藥植物，已引起研究者廣泛興趣，但它是否也和雷公藤藥用植物一樣能在防治農作物病蟲害中發(fā)揮作用，關于這方面的研究還未曾涉足，國內外未見有報道。為了能充分利用天然植物枸骨，發(fā)揮其對人類的最大作用，本發(fā)明對采自臨安天目山的活體枸骨組織進行內生真菌的分離研究，并將所分離到的內生真菌對部分常見植物真菌病害病原菌拮抗活性進行了檢測研究，該發(fā)明不僅為微生物源農藥的進一步研制和開發(fā)提供優(yōu)良的出發(fā)菌株同時也為利用枸骨內生真菌的天然活性物質開發(fā)農用抗生素提供理論依據和生產參數。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對化學農藥不安全與微生物源農藥種類較少的不足，提供一種從枸骨組織內分離篩選出的內生真菌-哈茨木霉菌株L；本發(fā)明的另一目的是提供利用該菌株L通過發(fā)酵提取其代謝產物制備成防治部分植物真菌病害的微生物農藥及其制備方法。
本發(fā)明枸骨內生真菌-哈茨木霉菌株L的分離、篩選與鑒定是于2006年5月在浙江臨安天目山采集的枸骨莖中，經表面消毒、內生真菌的分離、培養(yǎng)和發(fā)酵、活性測定以及對抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的篩選等步驟獲得并保存；經微生物分類學鑒定為哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum Rifai)，定名為哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登記號CGMCC No.1780。
枸骨內生真菌-哈茨木霉菌株L，其固體培養(yǎng)特征為菌落在PSA平板上25℃3-4天擴展9cm，初期白色稀疏，菌絲沿培養(yǎng)基表面匍匐生長，后形成黃綠色產孢區(qū)。反面無色。菌絲具隔，分枝。
其形態(tài)特征為分生孢子梗形成金字塔式的分枝輪廓，分枝末端的小梗束生、對生、互生或單生，瓶形，4.5-10×2.5-3.5μm；分生孢子球形、近球形，單個近無色，聚集時呈淡灰綠色，壁光滑，直徑2.5-3.0μm；厚垣孢子球形、近球形，無色，光滑，直徑5.5-7.0μm。
本發(fā)明所述的哈茨木霉菌株L，經發(fā)酵提取可獲得對部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的活性成分倍半萜類化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)。
本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現一種防治西瓜枯萎病、黃瓜枯萎病、黃瓜立枯病、菜豆炭疽病和番茄早疫病等植物真菌病害微生物農藥的制備方法，按以下步驟進行(1)菌種的活化培養(yǎng)將分離保存的枸骨內生真菌-哈茨木霉菌株L菌種移至試管內馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)斜面上，在28℃±1℃條件下，菌種活化培養(yǎng)96h，至試管斜面長滿綠色孢子；(2)種子液培養(yǎng)挑取少量活化培養(yǎng)孢子轉接至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，pH自然，每300mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液40mL，種子搖床培養(yǎng)溫度28℃±1℃，培養(yǎng)時間36h；(3)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)液為每1000mL中含有葡萄糖10g，蔗糖15g，牛肉膏10g，蛋白胨5g，MnCl215mg，CaCO32g，每300mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液40mL；配制后121℃滅菌20min，待冷卻至40℃在無菌條件下按體積百分含量5％～10％的接種量接種，在28℃±2℃條件下，培養(yǎng)4天；(4)發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢，收集發(fā)酵液，按常規(guī)化學方法提取、層析，分離純化獲得倍半萜類化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)，該化合物分子式為C17H24O4，結構式見下圖； (5)將純倍半萜類化合物配以農用藥物輔料，制備成多種劑型的農用藥物。
本發(fā)明的有益效果一是本發(fā)明從枸骨中分離篩選出代謝物產量高、并對部分植物真菌病害病原菌具有較強抑制作用的內生真菌菌株-哈茨木霉菌株L，該菌株L與以往關于哈茨木霉的眾多報道存在有以下的不同之處，這為農業(yè)上防治植物真菌病害病原菌提供了一種微生物新菌株；其一，在菌株形態(tài)等特征上有明顯的不同如發(fā)明專利申請《一種哈茨木霉真菌菌株》(公開號CN 1554742A)中哈茨木霉菌落在PSA培養(yǎng)基上形態(tài)為羊絨狀，菌落老熟時暗綠色，形成明顯的突起直達培養(yǎng)皿頂部；分生孢子梗呈樹狀分枝。而本發(fā)明哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L在同樣的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后菌落不形成突起，產孢區(qū)為黃綠色，分生孢子單個近無色，聚集時呈淡灰綠色，分生孢子梗形成金字塔式的分枝輪廓。遲玉杰等(對哈茨木霉轉化子菌體形態(tài)觀察及抗藥性測定.哈爾濱工業(yè)大學學報，2002，34(6)784-788)報道的哈茨木霉菌株，孢子顏色為深綠色，平板反正面同色，菌落形態(tài)為棉絮狀；而本發(fā)明哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L菌落正面形成黃綠色產孢區(qū)，反面無色，正反面顏色完全不同。
其二，在利用哈茨木霉作為生防菌劑的抑制機理與利用方式有所不同以往研究大多是利用哈茨木霉菌株產生幾丁質酶，通過幾丁質酶降解真菌細胞壁的主要成分幾丁質從而達到殺菌的目的。也有的報道是直接利用哈茨木霉孢子并開發(fā)成哈茨木霉孢子制劑防治植物真菌病害，目前生產上常用的木霉菌劑多為活分生孢子制劑，已有許多商品化的木霉制劑問世，如以色列開發(fā)的哈茨木霉T39可濕性粉劑Trichodex，美國的Topshield(哈茨木霉T22)等。而本發(fā)明是通過哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L產生的活性成分倍半萜類化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)來達到抑菌的目的。
二是本發(fā)明提供了從枸骨內生真菌-哈茨木霉菌株L的發(fā)酵物中提取其代謝產物倍半萜類化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)，并進而制備成可防治植物真菌病害的微生物源農藥的制備方法；該農藥應用于植物真菌病害的防治，其效果較常規(guī)化學藥劑略優(yōu)(見試驗例表1)，為農用殺菌劑的開發(fā)增添了新的途徑。



圖1為用插片法在400倍顯微鏡下觀察到的哈茨木霉菌株L形態(tài)圖。
具體實施方式
實施例1(內生真菌哈茨木霉菌株L的分離與篩選)本發(fā)明于2006年5月在浙江臨安天目山采集的枸骨莖中，經表面消毒、內生真菌的分離、培養(yǎng)和發(fā)酵、活性測定以及對抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的篩選等步驟，從中獲得內生真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L，保存。
哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L抑菌活性測定取其發(fā)酵上清液1mL于無菌培養(yǎng)皿內，與9mL冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基迅速混勻，冷卻后在每個培養(yǎng)基平面分別放1個直徑為4mm的黃瓜枯萎病菌、菜豆炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、黃瓜立枯病菌和番茄早疫病菌等供試菌菌餅，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9cm)，置培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)36h，以無菌水處理作為對照，重復3次；采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率 測定結果表明哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L代謝產物對黃瓜枯萎病菌、菜豆炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、黃瓜立枯病菌和番茄早疫病菌的抑制率分別為53.8％、54.5％、43.8％100％和68％。
實施例2(哈茨木霉菌株L發(fā)酵代謝產物的制備方法)按以下步驟進行(1)菌種試管斜面活化培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)，其組分與含量為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g；先將馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然后用紗布過濾，再加葡萄糖和瓊脂，溶化后補足水至1L；在無菌條件下用接種針挑取少許哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L的菌種，至已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管(15×150mm)中，置培養(yǎng)箱內28℃±1℃，活化培養(yǎng)96h，至試管斜面長滿綠色孢子；(2)種子液培養(yǎng)種子培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，其組分與含量為馬鈴薯200g、葡萄糖20g；馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然后用紗布過濾，再加葡萄糖，溶化后補足水至1L，pH自然；每300mL三角瓶裝滅菌液體培養(yǎng)基40mL，并接入少許步驟(1)活化培養(yǎng)菌種孢子，置28℃±1℃，搖床培養(yǎng)36h，即為哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基為每1000mL中含有葡萄糖10g，蔗糖15g，牛肉膏10g，蛋白胨5g，MnCl215mg，CaCO32g，余量為水；每300mL三角瓶裝40mL發(fā)酵培養(yǎng)液，配制后121℃滅菌20min，待冷卻至40℃在無菌條件下，按體積百分含量5％～10％的接種量，接入哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L種子液，28℃±2℃，發(fā)酵培養(yǎng)4天；(4)發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢后收集發(fā)酵液，采用乙酸乙酯萃取，取上層，并在真空條件下濃縮至浸膏，而后上硅膠柱層析，以石油醚和乙酸乙酯(體積比10％～90％)洗脫，分離純化得倍半萜類化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)。
以下實施例3、4、5中所述的哈茨木霉菌株L代謝產物均為實施例2所制產品；所述產品的百分含量均為質量百分比。
實施例3(利用哈茨木霉菌株L發(fā)酵代謝產物制備成可濕性粉劑)其中白炭黑(上海富奇化工有限公司生產)
農乳0203-B(邢臺藍星助劑廠生產)木質素磺酸鈉(上海威呈化工有限公司生產)輕質碳酸鈣(上海大宇生化有限公司生產)產品含1.5％倍半萜類化合物Trichothec-9-en-4-o1，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)，加入2％的白炭黑作為吸附劑，并加入1％的農乳0203-B和3％的木質素磺酸鈉輔料，最后用輕質碳酸鈣補足到100％，混勻后，經氣流粉碎制成可濕性粉劑(以下內容中稱“產品A”)。
實施例4(利用哈茨木霉菌株L發(fā)酵代謝產物制備成微乳劑)。
其中甲醇(上海申興制藥廠生產)農乳601(邢臺藍星助劑廠生產)十二烷基磺酸鈉(上海盛眾精細化工有限公司生產)尿素(泰林化工集團公司生產)產品含1.5％的倍半萜類化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)，用5％的甲醇溶解，并加入2％農乳601和0.5％十二烷基磺酸鈉作為分散助劑，加入1％尿素作為防凍劑，最后用水補足到100％，35℃下混勻，經高剪切乳化器乳化分散后制成微乳劑(以下內容中稱“產品B”)。
實施例5(利用哈茨木霉菌株L發(fā)酵代謝產物制備成乳油)其中乙醇(上海申興制藥廠生產)農乳0204(邢臺藍星助劑廠生產)二甲苯(上海申興制藥廠生產)
產品2％的倍半萜類化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)，用4％的乙醇溶解，加入質量5％農乳0204-C作為乳化劑，最后用二甲苯補足到100％，攪拌混勻制成乳油(以下內容中稱“產品C”)。
試驗例(本發(fā)明產品與常規(guī)農藥防治效果對比試驗)將“產品A、B、C”對西瓜枯萎病、黃瓜枯萎病、黃瓜立枯病、菜豆炭疽病和番茄早疫病等植物病害進行防治試驗，以常規(guī)化學農藥、清水為對照，如表1所示，試制的農用殺菌劑“產品A、B、C”比常規(guī)化學農藥防治效果略優(yōu)。
表1產品A、B、C對幾種植物真菌病害防效統(tǒng)計表(藥效試驗均于2006年7月-9月在杭州市郊試驗農田進行)


“-”為未試驗。
權利要求
1.一種哈茨木霉菌株，其特征在于，命名為哈茨木霉(Trichodermaharzianum Rifai)菌株L，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日2006年8月14日，保藏登記號為CGMCC No.1780。
專利摘要
本發(fā)明涉及微生物技術領域：
，本發(fā)明所述的枸骨內生真菌是從臨安天目山采集的枸骨植物活體中采用內生真菌微生物分離技術分離獲得的，經微生物分類學鑒定，命名為哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L，該菌株己在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登記號為CGMCC No.1780。本發(fā)明最顯著的特征是該菌株液體發(fā)酵能夠產生對植物真菌病害病原菌有抑制作用的活性成分倍半萜類化合物Trichothec－9－en－4－ol，12，13－epoxy－，acetate，(4β)－(8CI，9CI)，是農業(yè)上重要的微生物資源。
文檔編號A01N63/04GKCN101037656SQ200710066843
公開日2007年9月19日 申請日期2007年1月25日
發(fā)明者俞曉平, 申屠旭萍 申請人:中國計量學院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan