專利名稱：控制昆蟲的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過提供可直接用于植物的蛋白質(zhì)或由微生物在其上產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或者通過用遺傳工程方法修飾植物以產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)來控制植物昆蟲感染的方法，本發(fā)明還涉及在所述方法中有用的微生物和植物。本發(fā)明背景使用包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的天然產(chǎn)物是熟知的控制許多昆蟲害蟲的方法。例如，用蘇云金芽孢桿菌(B.t.)內(nèi)毒素控制鱗翅目和鞘翅目昆蟲害蟲。生產(chǎn)這些內(nèi)毒素的基因已被導入并已由各種植物，包括棉花、煙草、番茄表達。然而，還存在一些對B.t.內(nèi)毒素不敏感的經(jīng)濟上重要的昆蟲害蟲。這些重要害蟲的例子有棉象蟲(BWV)、Anthonomus grandis和南瓜十二星葉甲(CRW)(條葉甲屬)。另外，其他用于控制對B.t.內(nèi)毒素敏感的昆蟲的不同基因產(chǎn)物，如果不是致死的，則對于抗性處理也是重要的。
在植物中發(fā)現(xiàn)了其他幾種已知的殺蟲蛋白質(zhì)，包括植物凝血素、淀粉酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。在以高劑量使用時，它們會影響昆蟲的生長和發(fā)育[Boulter et al.，1989；Broadway and Duffey，1986；Czapla and Lang，1990Gatehouse et al.，1986；Heusing et al.，1991；Ishimoto and K.Kitamura，1989；Nurdock et al.，1990；Shukle and Murdock，1983]，但不會提供由B.t.蛋白質(zhì)所給予的急性致死性。
本發(fā)明的一個目的是提供能控制BWV、CRW或其他昆蟲害蟲的蛋白質(zhì)和生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)所用的基因。本發(fā)明的另一目的是提供遺傳構(gòu)建體和將所述遺傳物質(zhì)插入微生物和植物細胞的方法。本發(fā)明的另一目的是提供含所述遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化微生物和植物。本發(fā)明概述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)馬鈴薯貯存蛋白(patatin)(馬鈴薯塊莖的主要貯存蛋白質(zhì))可以控制各種昆蟲，包括玉米幼芽根葉蛼(WCRW)、Diabrotica virgifera、southern corn rootworm(SCRW)、Diabrotica undecimpunctata和棉象蟲(BWV)、Anthonomusgrandis。馬鈴薯貯存蛋白對于一些幼蟲是致死的，并會阻礙幸存者的生長以致防止或嚴重延緩了幼蟲的成熟，從而使其無法繁殖。可以將這些已知具有酯酶(脂?；饷?活性的蛋白質(zhì)直接用于植物或用其他方式轉(zhuǎn)導，例如通過使用已轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)所述酶的植物-定殖微生物，或者用相似轉(zhuǎn)化后的植物本身。
馬鈴薯貯存蛋白是在馬鈴薯[Gaillaird，1971；Racusen1984；Andrews et al.，1988]和其他植物，尤其是茄形(solanaceous)植物[Ganal et al.，1991；Vancanneyt et al.，1989]中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)家族。在馬鈴薯中，馬鈴薯貯存蛋白主要是在塊莖中發(fā)現(xiàn)的，在其他植物器官中的水平很低[Hofgen and Willmitzer，1990]。已檢測了幾種馬鈴薯貯存蛋白同工酶的酯酶底物特異性[Hofgen andWillmitzer，1990；Racusen，1986]。
以前已由Mignery等人(1984)、Mignery等人(1988)、Stiekema等人(1988)和其他人分離了編碼馬鈴薯貯存蛋白的基因。Rosahl等人(1987)將其轉(zhuǎn)移到煙草植物中，并觀察了馬鈴薯貯存蛋白的表達。這表明可以由植物異源表達馬鈴薯貯存蛋白。
相似地，可以分離馬鈴薯貯存蛋白基因，然后將其插入適當?shù)霓D(zhuǎn)化載體盒中，然后(1)用所述盒轉(zhuǎn)化植物一定殖微生物，當用于植物時，所述微生物表達生產(chǎn)馬鈴薯貯存蛋白的基因，由此控制昆蟲，或者(2)將所述盒摻入植物基因組中，然后通過表達基因并生產(chǎn)馬鈴薯貯存蛋白可保護其自身免受昆蟲的攻擊。另外，可以轉(zhuǎn)化或培育植物以共表達一種或多種編碼控制昆蟲的蛋白質(zhì)的B.t.基因。這就使植物要么(1)抵御較多種類的害蟲和/或要么(2)對一些害蟲有兩種作用模式，這是抗性處理中的一種重要手段。轉(zhuǎn)化后表達B.t.基因的植物實例公開在歐洲專利公開No.0，385，962中，相當于美國系列申請?zhí)?76,661,1990，2，1 2申請[Fischhoff等人](該文獻摻入本文作為參考)。另外，由于已經(jīng)表明蛋白酶抑制劑提高其他殺蟲蛋白的活性，所以可以轉(zhuǎn)化或者培育植物以便共表達蛋白酶抑制劑基因，如編碼馬鈴薯木瓜蛋白酶抑制劑[Rodis and Hoff，1984]或大豆胰蛋白酶抑制劑[參見Ryan的有關(guān)綜述，1990]的那些基因。
結(jié)合上文內(nèi)容，根據(jù)本發(fā)明的目的之一，提供控制植物昆蟲感染的方法，包括提供有效量的殺蟲馬鈴薯貯存蛋白供昆蟲攝食。通過提供植物-定殖微生物可完成該方法，所述微生物已被轉(zhuǎn)化來表達馬鈴薯貯存蛋白基因，然后導入植物，表達所述基因，并提供殺蟲有效量的馬鈴薯貯存蛋白。也可以用DNA分子經(jīng)遺傳工程方法轉(zhuǎn)化待保護植物來實現(xiàn)該方法，所述DNA分子含有(i)在植物細胞中起作用的啟動子，以引起RNA序列的產(chǎn)生；(ii)編碼馬鈴薯貯存蛋白的結(jié)構(gòu)編碼序列；(iii)在所述植物細胞中起作用的3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)，以促使多腺苷酸核苷酸加到RNA序列的3’末端。其中所述啟動子對于所述結(jié)構(gòu)編碼序列而言是異源的，而且其中所述啟動子與所述結(jié)構(gòu)編碼序列經(jīng)操作相連，所述結(jié)構(gòu)編碼序列依次與所述非轉(zhuǎn)譯區(qū)可操作相連。優(yōu)選地是植物將以約0.1-0.5％的總蛋白質(zhì)水平表達馬鈴薯貯存蛋白。
本發(fā)明還提供用遺傳工程方法轉(zhuǎn)化的昆蟲抗性玉米、棉花、番茄和馬鈴薯植物。
本文所用的術(shù)語“控制昆蟲感染”指或者通過致死性、延緩幼蟲的發(fā)育(發(fā)育障礙)，或者降低繁殖效率來減少引起有益產(chǎn)率降低的昆蟲數(shù)量。本文所用的術(shù)語“殺蟲的”指或者通過致死性，延緩幼蟲的發(fā)育(發(fā)育障礙)，或者降低繁殖效率來減少導致有益產(chǎn)率降低的昆蟲數(shù)量。
本文所用的術(shù)語“結(jié)構(gòu)編碼序列”指編碼多肽的DNA序列，所述多肽由細胞在將DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后轉(zhuǎn)譯成所需的多肽而得到。
本文所用的術(shù)語“馬鈴薯貯存蛋白”指一種植物蛋白質(zhì)，與SEQID NO31)(下文所示)編碼的蛋白質(zhì)有75％或更高同源性，或者更優(yōu)選的是至少80％同源性，或甚至更優(yōu)選的是至少85％的同源性。該術(shù)語包括由經(jīng)設(shè)計用于提高單子葉植物中的表達而合成的DNA序列產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的詳細描述馬鈴薯貯存蛋白是在馬鈴薯[Gaillaird，1971；Racusen，1984；Andrews et al.，1988]和其它植物，特別是茄形植物[Ganal etal.，1991；Vancanneyt et al.，1989]中發(fā)現(xiàn)的酯酶家族。在馬鈴薯中，主要在塊莖中發(fā)現(xiàn)了馬鈴薯貯存蛋白，但它也以很低的水平存在于其它的植物器官中[Hofgen and Willmitzer，1990]。已經(jīng)檢測了幾種馬鈴薯貯存蛋白同工酶的酯酶底物特異性[Hofgen andWillmitzer，1990；Racusen，1986]，發(fā)現(xiàn)有廣泛的底物特異性，表明這些酶對底物有限制。使用所有植物衍生的馬鈴薯貯存蛋白和其等同物(兩者均在本文詳細公開)和同源蛋白質(zhì)，無論是得自天然DNA序列還是合成DNA序列，只要是為了控制植物昆蟲感染的目的均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
來自馬鈴薯的粗馬鈴薯貯存蛋白制品可從市場上購買。例如，Sigma Chemical Company，St，Louis，MO提供由Sigma標為酸性磷酸酶(P-1146和P-3752)或腺苷三磷酸雙磷酸酶(A-9149)的馬鈴薯蛋白質(zhì)制品。也需要馬鈴薯塊莖并可用文獻中描述的方法(Racusen and Foote，1980；Park et al.，1983)制備蛋白質(zhì)提取物。生物效能檢測人工食物的生物檢測在與Marrone等人1985描述的用于SCRW的相似瓊脂食物上，通過覆蓋檢測樣品完成抗SCRW、BWV、馬鈴薯甲蟲(CPB)和歐洲玉米螟(ECB)幼蟲的活性檢測。將蛋白質(zhì)溶解在4-5ml 10mM HEPES，pH7.5中，然后使用3500分子量的截止試管在這種相同的緩沖液中透析來制備試驗樣品。在26℃用處理過的食物喂養(yǎng)新生幼蟲，然后在5或6天評估死亡率和生長障礙。表1列出了P-3752(Sigma)的檢測結(jié)果。表明這種粗馬鈴薯制劑有廣譜殺蟲活性。
表1速率 死亡率/發(fā)育障礙％* SCRWBWV CPBECB0.01X 0 11 0 00.03X 0*20*0 130.10X 19**20**6 0*0.30X 6*****46**13*6*1.00X 6***73**13**6**a*＝輕微發(fā)育障礙(大小降低約30-40％)**＝中度發(fā)育障礙(大小降低約50-80％)***＝嚴重發(fā)育障礙(大小降低＞90％)對接觸5天后的SCRW(表2)和接觸6天后的ECB(表3)進行精確定量的重量測量，結(jié)果列于下文。在攝入含P-3752的食物時，發(fā)育中的SCRW幼蟲與對照相比體重減少92％，ECB幼蟲與對照相比體重減少62％。
表2處理平均存活重量(修正值)重量減輕％死亡率％ Tris 4.00mg(0.60)a--對照水平--P-37520.30mg(0.03)a92 6a平均存活重量在95％顯著不同(一個因子的ANOVA)。
表3處理平均存活重量(修正值)重量減輕％死亡率％ Tris 5.39mg(0.49)a--對照水平--P-37522.05mg(0.27)a62 7a平均存活重置在95％顯著不同(一個因子的ANOVA)。
通過熱不穩(wěn)定性，硫酸銨沉淀，分子大小分離和蛋白酶敏感性實驗確定具有抗Southern corn rootworm(SCRW)和棉象蟲(BWV)活性的P-3752殺蟲組分的蛋白質(zhì)性質(zhì)。
為了證實P-3752的作用歸因于攝取馬鈴薯貯存蛋白的直接效果而不是抗喂養(yǎng)反應引起的間接效果，用ECB和SCRW完成食物選擇研究。這項選擇研究的結(jié)果表明對以P-3752和Tris處理的食物為食沒有明顯的偏好。就Tris處理的食物而言，似乎無法廢除P-3752處理的食物。
-項P-3752抗SCRW的長期(25天)試驗利用了第2齡幼蟲，并將幾個存活昆蟲轉(zhuǎn)移到新鮮處理的食物上。這項研究結(jié)束時，所有對照幼蟲均已化蛹。相反，50％的處理幼蟲死亡而另外的50％其體重僅比開始時的增加16％(2.48mg對2.14mg)。這表明抑制了幼蟲發(fā)育，而不僅僅是延緩。由于幼蟲無法發(fā)育到成蟲，從昆蟲控制的角度看，這具有重要的結(jié)果。因此后代SCRW的數(shù)量將會減少。
僅在實驗室實驗中使用了第2齡幼蟲階段的玉米幼芽根葉蛼(WCRW)幼蟲。為了檢測P-3752抗WCRW的作用，用第2齡SCRW幼蟲設(shè)計了平行試驗。P-3752的處理分別導致SCRW和WCRW第2齡幼蟲僅增加13％和11％的重量。在7天內(nèi)，對照SCRW增重474％和WCRW增加200％。這表明馬鈴薯貯存蛋白的抗WCRW活性大致等于其抗SCRW的活性。
P-3752對煙青蟲(TBW)、煙芽夜蛾、甜菜夜蛾(BAW)、玉米穗蛾、棉紅鈴蟲和煙草天蛾有較低的活性，在相同的濃度其發(fā)育障礙率為1-1.5，而對SCRW的發(fā)育障礙速率為3。P-3752對小地老虎的發(fā)育障礙速率為2.5(在上文表1中定義了發(fā)育障礙速率)。在所試驗的濃度，對桃蚜沒有活性。植物組織生物檢測(1)馬鈴薯將1g粗P-3752溶于4ml 25mM Tris，pH7.5緩沖液中，然后通過0.2μm膜透析并過濾。加入TritonX-100以得到0.1％的溶液。將馬鈴薯葉浸在酶制劑中，放在培養(yǎng)皿中沾濕的濾紙上。放入CPB幼蟲，于27℃將平板培養(yǎng)3天。P-3752處理的馬鈴薯葉導致CPB幼蟲發(fā)育障礙并進食減少。試驗結(jié)果是，與P-3752處理的葉相比，作為對照葉的葉組織明顯減少。(2)玉米和棉花從瓊脂板中取出黑墨西哥甜玉米愈傷組織(BMS)或棉花愈傷組織，然后轉(zhuǎn)移到50ml離心試管中。使愈傷組織成漩渦并用IEC Clinical離心機以8檔離心5分鐘。緩緩倒出上清液，將30ml2％的液體瓊脂加到含15ml愈傷組織的50ml試管中。完全混合后，將食物移到-檢測arena中進行昆蟲生物檢測。將透析過的P-3752作為-種食物覆蓋物加入(以20％體積)，然后如上所述完成檢測。
用粗P-3752或25mM Tris，pH7.5緩沖液真空浸潤[Inflt]切開的玉米根和莖，將對照樣品全部組織浸沒在Iris緩沖液中。將約10-15片根或3片莖組織放在24孔組織培養(yǎng)平板的孔中，重復4次。每孔加入4個新生SCRW幼蟲。將試驗物在26℃培養(yǎng)4天，在此時對死亡率和平均幼蟲重量進行觀察，結(jié)果列于表4。
表4組織 昆蟲 死亡率％ 重量減少％ 真空浸潤的玉米根 SCRW90 44真空浸潤的玉米莖 SCRW51 52處理的BMS愈傷組織SCRW24 51處理的BMS愈傷組織WCRW023處理的BMS愈傷組織ECB 033處理的棉花愈傷組織 BWV60 沒有數(shù)據(jù)因此，當P-3752與植物組織被共同攝取時，保持了對所有四種昆蟲(SCRW、BWV、CPB和ECB)的殺蟲活性。這些食物研究表明，當用其營養(yǎng)僅由植物組織(根、莖、愈傷組織或葉)組成的食物檢測時，馬鈴薯貯存蛋白是有殺蟲活性的。作用模式研究下面的研究表明馬鈴薯貯存蛋白(P-3752的殺蟲活性組分)對昆蟲本身有直接作用，而且在上述實驗中表明的活性不可能是活性組分對攝取前昆蟲食物的作用。食用效果研究將1gP-3752溶于10ml 25mM Tris pH7.6的緩沖液中，然后在MWCO 12-14,000試管中對同樣的緩沖液透析。0.2μm過濾后，在加入昆蟲前4天，將50μl等份試樣加到兩個平板上的昆蟲食物中。兩個平板均在27℃培養(yǎng)4天。培養(yǎng)后，將-個平板加熱到80℃，經(jīng)1小時使酶失活。將50μl等份試樣加到第三個平板上。因此，用培養(yǎng)過的、培養(yǎng)＋加熱的和未培養(yǎng)過的平板進行SCRW生物檢測。
在食物預培養(yǎng)研究中，SCRW活性如下未培養(yǎng)過的P-3752——6***培養(yǎng)過的P-3752——0**培養(yǎng)過、加熱過的P-3752——0*在食品培養(yǎng)期間，損失了一部分活性，而加熱處理造成活性的完全損失。這樣的數(shù)據(jù)與直接的攝取后作用模式-致，并且當與植物組織檢測-起考慮時，對不同昆蟲的可變性表明蛋白質(zhì)對SCRW和其它昆蟲的活性不是飲食的作用。蛋白質(zhì)鑒定已經(jīng)純化、部分定序并描述了來自P-3752的殺蟲活性組分的特征。已鑒定出該活性劑為馬鈴薯貯存蛋白，來自馬鈴薯的脂?；饷讣易?。蛋白質(zhì)分離用四種方法純化P-3752的SCRW生物活性組分。
用陰離子交換層析純化SCRW活性-先用Q-Sepharose(Pharmacia)陰離子交換層析，接著經(jīng)MONO-Q(HR5/5，Pharmacia)陰離子交換層析純化P-3752的SCRW-活性組分。在SCRW活性部分中的蛋白質(zhì)水平表明用蛋白質(zhì)濃度為31PPm的食物可達到觀察到的**生長障礙。SDS-PAGE表明在活性部分中存在三種主要的蛋白質(zhì)帶(Mr42,000、～26,000和～16,000)。
SCRW活性的5步純化-用5個連續(xù)的純化步驟從P-3752中純化SCRW活性組分。有膜大小分離、硫酸銨沉淀、Q-Sepharose IEC、S-Sepharose IEC和P-200IEC。最純的SCRW活性部分的SDS-PAGE表明蛋白質(zhì)帶在Mr42,000、～26,000和～16,000 。
經(jīng)等電聚焦純化生物活性-按制造商的說明，在RF3蛋白質(zhì)分離器(Rainin)上連續(xù)跑2次，純化SCRW生物活性馬鈴薯蛋白質(zhì)。 SCRW活性部分的SDS-PAGE圖與從5步純化和陰離子交換純化的活性部分中觀察到的圖相似。IEF凝膠表明，蛋白質(zhì)從pH4.6到5.1分離，與報道的馬鈴薯貯存蛋白的pH范圍(Racusen和Foote，1980)一致。
通過在RF3上在一窄pH范圍(pH4-5)連續(xù)等電聚焦以分離馬鈴薯貯存蛋白同工酶。按預期的，在蛋白質(zhì)的pH4.6-5.1時，看到一生物活性峰。這些部分有不同的同工酶模式和不同水平的生物活性。在這些部分中生物活性的范圍從80ppm劑量的0死亡率，*-**發(fā)育障礙到512ppm。有些生物活性部分僅有2種主要的同工酶，表明對于生物活性并不需要復雜模式的同工酶。
用天然PAGE純化-在自然條件下電泳P-3752，分離出酯酶活性的(用α-乙酸萘酯為底物)三聯(lián)帶。凝膠純化的酯酶陽性物質(zhì)有抗SCRW活性，產(chǎn)生1.5*發(fā)育障礙。該物質(zhì)的SDS-PAGE揭示出主帶在Mr42,000、～26,000和～16,000，與以前用其它純化方法觀察到的圖相同。這進一步證實馬鈴薯貯存蛋白是來自馬鈴薯的殺蟲組分。氨基酸序列在陰離子交換純化和5步純化方法的SCRW活性層析部分中，得到了所有蛋白質(zhì)帶(Mr42,000、～26,000和～16,000)的NH2-末端氨基酸序列?？傊玫搅嘶钚圆糠种兴袔У男蛄匈Y料。大部分帶與15-氨基酸序列在NH2-末端(SEQ ID NO1)或一種馬鈴薯貯存蛋白同工酶的內(nèi)部序列(SEQ ID NO7)。(Stiekemaet al.，1988)有＞85％的同源性。一個17KD帶與報告過的馬鈴薯貯存蛋白NH2-末端序列的開始8個氨基酸有75％的同源性。另-17KD帶與公開過的馬鈴薯貯存蛋白NH2-末端序列的開始8個氨基酸有＞85％的同源性。這些帶表示馬鈴薯貯存蛋白的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。NH2-末端和內(nèi)部序列兩者位置1和3上氨基酸的可變性清楚地表明了同工酶的存在。
N-末端氨基酸序列 公開過的序列KLEEMVTVLSIDGGG(SEQ ID NO1)帶1(42kD)XLGEMVTVLSIDGGG(SEQ ID NO2)帶2(28kD)TLGEMVTVLSIDGGG(SEQ ID NO3)帶3(26kD)TLGEMVTVLSIDGGG(SEQ ID NO4)帶4(24kD)KLXEMVTVLSIDGGG(SEQ ID NO5)帶5a(17kD)XXEEMVTV (SEQ ID NO6)內(nèi)部序列(氨基酸位置224) 公開過的序列SLDYKQMLLLSLGTG(SEQ ID NO7)帶5b(17kD)KLDVKQML (SEQ ID NO8)帶6(16kD)SLXYKQMLLLSLGTG(SEQ ID NO9)帶7(15kD)SLNYKQMLLLSLGTG(SEQ ID NO10)酯酶活性進行幾個實驗以檢測SCRW活性部分中的酯酶活性。
α-乙酸萘酯底物如果SCRW活性部分(來自5步純化法)表現(xiàn)出酯酶活性，就用SDS-PAGE(10-20％)來確定。在凝膠的兩半上，負裁加熱的和未加熱的SCRW活性部分。在未加熱的樣品中觀察到一個酯酶陽性帶，Mr為55,000。加熱的樣品有原來的Mr42,000帶，但沒有55,000帶。這個結(jié)果與馬鈴薯貯存蛋白酯酶活性的電泳遷移性的文獻報告一致[Racusen，1984]。在加熱的樣品中未觀察到Mr55,000帶，表明在SDS中加熱處理降低了酯酶活性。在加熱樣品沒有Mr55,000帶的情況下，用考斯馬染色觀察到原來看到的Mr42,000帶。
對-硝基苯基底物特異性研究-檢測一系列的對-硝基苯酯(C-2、C-4、C-6、C-8、C-10、C-12、C-14和C-16)以確定底物特異性。與其它酯相比，對-硝基C-8和C-10酯對于大多數(shù)被測馬鈴薯貯存蛋白的酯酶活性來說，始終是最佳底物。
脂酯底物-檢測SCRW活性純化部分(來自5步純化方法)水解幾種脂的能力。將每種脂溶解，然后與一份SCRW活性純化部分一起培養(yǎng)。通過使用三種溶劑顯色系統(tǒng)的TLC(Pernes et al.，1980)分析樣品。四種脂表現(xiàn)出由TLC作的修飾痕跡。這些包括油?；苎蚜字?、二油酰L-α-卵磷脂、1-單亞麻酰-外消旋-甘油和二油精(Sigma)。與亞油和油脂肪酸標準比較，在這些脂/活性部分反應混合物的有機提取物中，鑒定出在Rf0.37的新TLC點為游離脂肪酸。因此，SCRW活性物質(zhì)對這四種脂酯有酯酶活性。
從用玉米根喂養(yǎng)的第3齡幼蟲中取出WCRW的中腸。提取中腸脂，溶解，然后在中腸pH(pH6.55)與SCRW活性純化部分一起培養(yǎng)。通過使用上述方法的TLC來分析樣品。表明純化的SCRW活性部分在中腸pH時，對WCRW中腸磷脂有酯酶活性。這說明了有關(guān)馬鈴薯貯存蛋白殺蟲活性的可能的作用模式。馬鈴薯貯存蛋白的其它來源由于全部初步實驗均是用P-3752(一種市售的來自MinnesotaRusset var.Kranz馬鈴薯塊莖的酶制劑(Sigma)，因此，有必要說明從新鮮的馬鈴薯塊莖也能再找到有殺蟲活性的馬鈴薯貯存蛋白，基本按文獻(Racusen and Foote，1980；Park et al.，1983)中的描述制備塊莖提取物。分析3種市售馬鈴薯栽培品種(Russet，Desiree和LaChipper)和7種野生品種(S.kurtzianum，S.berthaultii，S.tarijense，S.acaule，S.demissum，S.cardiophyllum和S.raphanifolium全部得自Inter-RegionalPotato Introduction Station，USDA，ARS，Sturgeon Bay，WI)。通過SDS-PAGE和Western印跡分析，所有提取物均是馬鈴薯貯存蛋白陽性；由C-10酯酶檢測，所有的均是酯酶陽性；而且所有的均對SCRW有殺蟲活性，即發(fā)育障礙率為2-3，見表5。這說明可以從數(shù)種塊莖中分離有殺蟲活性的馬鈴薯貯存蛋白，預期這一整組蛋白質(zhì)的許多成員都有殺蟲特性。
表5品種[Prot] ΔO.D./min·mLSCRWa(mg/mL) 1X 0.1XS.acaule 26.682,500 2 1S.berthaultii23.129 3 1S.cardiophyllum 14.6 89 2.51.5S.demissum 35.3 375,0003 1.5S.kurtzianum25.0 2,700 2.51S.raphanifolium 33.7 3,725 3 2S.tarijense 27.2 1008 2.51
a以幼蟲發(fā)育障礙表示SCRW活性1＝輕微發(fā)育障礙(大小減小30-40％)，2＝中度發(fā)育障礙(大小減小50-80％)，3＝嚴重發(fā)育障礙(大小減?。?0％)。
生物檢測S.berthaultii，S.kurtzianum和S.tarijense提取物抗另外兩種靶昆蟲CPB和ECB的活性。在表6中總結(jié)了生物檢測數(shù)據(jù)。注意到這些提取物對CPB幾乎沒有活性，而在1X速率，造成ECB幼蟲中度至嚴重的發(fā)育障礙。然而，由在0.1X對ECB完全沒有活性表明，ECB幼蟲對這些提取物的敏感性略低于SCRW幼蟲。
表6品種 CPBa ECBa1X0.1X 1X0.1XS.berthaultii 0 0 3 0S.kurtzianum 1 0 2.5 0Starijense0 0 3 0a幼蟲發(fā)育障礙用Southern分析檢測9種不同植物基因組DNA與馬鈴薯貯存蛋白的蛋白質(zhì)同源性。用α-32p標記的SEQ ID NO11探針檢測的Southern印跡表明在幾種其它植物品種內(nèi)有同源序列。在玉米、番茄、甜菜、大米和馬鈴薯中得到強烈信號。在該實驗中不能分辨單條帶但在所有這些種中，涂片大小和其強度相似。在夏南瓜、大豆和canola中也看到弱信號，并在各品種的DNA表現(xiàn)為少量不連續(xù)的帶。可能由于正如在凝膠的溴化工錠染色中見到的，負載的DNA量更少，因此在本實驗所用的條件下，黃瓜和擬南芥屬用馬鈴薯貯存蛋白探針沒有可檢測的雜交。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易得到這些同源蛋白質(zhì)的DNA序列，并用已知方法插入植物或其它生物中。在例如由桿狀病毒或E.coli異源表達后，最易檢測所述蛋白質(zhì)的殺蟲特性。因此，可以用已知方法經(jīng)常量實驗得到可用于本發(fā)明方法的其它蛋白質(zhì)，并于此后用來配備給植物以保護其免于昆蟲感染。遺傳鑒定有幾個研究人員已克隆了馬鈴薯貯存蛋白基因。由Mignery等人公開的序列稱為GM203。它有一個不完全的信號序列。Mignery等人(1988)鑒定了一個基因組克隆，稱為PS20，包括GM203，并含有一完整的信號序列。用PS20的信號序列和GM203編碼部分的cDNA構(gòu)建SEQID NO11，下文稱為PatA+。在轉(zhuǎn)譯終止密碼子后緊接著一個NcoI限制位點和一個EcoRI位點。馬鈴薯栽培品種Russet Burbank從馬鈴薯栽培品種Russet Burbank的塊莖中分離20個cDNA，并定序。推測的氨基酸序列表明這些cDNA編碼11種不同的馬鈴薯貯存蛋白同工酶。這11種蛋白質(zhì)與PatA+，SEQ ID NO11相比有約82％到100％的同一性，其不同可見于全長cDNA的許多不同位置。在表7中列出了編碼11種不同馬鈴薯貯存蛋白同工酶的11種不同代表性的cDNA序列。通過使用引物SEQ ID NO26和SEQ ID NO27(分別相當于編碼信號序列開始幾個密碼子的5’核苷酸和編碼序列的3’末端)的PCR方法生產(chǎn)cDNA，以用于以后的克隆操作，“＋”號表示包含了天然信號編碼序列。有些cDNA不含完整的天然信號編碼序列，而只從使用引物SEQ ID NO32和SEQ ID NO27的相似PCR方法得到了成熟蛋白質(zhì)編碼序列。這些用下面的“m”表示。
表7同工酶序列鑒別號PatA+SEQ ID NO11PatAmSEQ ID NO14PatB+SEQ ID NO16PatC+SEQ ID NO17PatDmSEQ ID NO18PatE+SEQ ID NO19PatEmSEQ ID NO2OPatFmSEQ ID NO21PatG+SEQ ID NO22PatHmSEQ ID NO15PatImSEQ ID NO23PatL+SEQ ID NO24PatM+SEQ ID NO25Solanum berthaultii反轉(zhuǎn)錄塊莖mRNA，然后通過使用引物SEQ ID NO26和SEQ ID NO27(上述的)的PCR，分離來自二倍體馬鈴薯S.berthaultii的馬鈴薯貯存蛋白cDNA。完成多個獨立的PCR反應以避免因擴增過程引起的重復克隆的分離。
將共14種馬鈴薯貯存蛋白cDNA部分定序，所有14種cDNA(稱Patl到Pat14)似乎有一特有的核苷酸序列，說明在S.berthaultii塊莖中至少表達14種不同的馬鈴薯貯存蛋白mRNA。Pat3+的序列是SEQ ID NO28。Pat10+的序列是SEQ ID NO29。推測的氨基酸序列表明14種cDNA編碼至少11種不同的蛋白質(zhì)?？傊瑏碜許.berthaultii塊莖的cDNA序列很相似。在共367個殘基中，僅12個氨基酸位置有序列可變性。表8中列出了在這些位置的每個位置上出現(xiàn)的氨基酸。這些位置中的5個位置上，只有一個帶一特有殘基的變異體克隆。這種改變可能反映了mRNA之間的實際差異，或者可能是由PCR過程中產(chǎn)生的錯誤引起的。在其它7個位置，有更大的可變性；至少兩種cDNA有一個可變的氨基酸。這9種不同氨基酸序列組的每一個在這7個位置均有一獨特的殘基型。在有些情況下，變化是保守的，如在位置164從Thr變?yōu)镾er。在另外的情況下，有更大的差異，如在位置148導入Pro。
表8cDNA氨基酸差異的位置89 96 106 113 120 123 148 164 187 200PAT3+ GLN LEU GLN TYR GLU VAL ALA ALA THR ASP ASPPAT4+ GLN SER ASP HIS GLU VAL ALA PRO SER ASP VALPAT5+ GLN SER ASP HIS GLU VAL ALA PRO THR ASP ASPPAT7+ GLN LEU GLN TYR GLU VAL ALA ALA THR ASN ASPPAT8+ LYS SER GLY TYR LYS VAL ALA PRO THR ASP ASPPAT9+ LYS SER ASP TYR LYS VAL ALA PRO THR ASP ASPPAT10+ GLN SER ASP HIS GLU VAL THR PRO THR ASP ASPPAT11+ GLN SER ASP HIS GLU ALA ALA ALA THR ASP ASPPAT12+ GLM SER GLY HIS GLU VAL ALA ALA THR ASP ASPPATA+ HIS --- SER --- TYR GLU VAL ALA ALA THR GLU ASPSolanum cardiophyllum用從上述Solanum cardiophyllum塊莖分離的mRNA經(jīng)PCR得到10個cDNA克隆。根據(jù)每個克隆的至少75％的長度得到核苷酸序列。一個稱為Pat17+的克隆的全長序列是SEQ ID NO30、SEQ ID NO31是加工后的成熟形式Pat17m。這些S.cardiophyllum克隆幾乎是相同的，僅有隨機的核苷酸序列改變，可能是實際差異或者PCR錯誤。但在位置54和519，觀察到幾個克隆有相同的變化，說明它們不是由擴增過程造成的。這些位置的核苷酸模式說明至少代表了4種不同的mRNA。在這一套cDNA克隆中，來自兩組的mRNA被分離了幾次，而另兩組的mRNA只分離了一次。
S.cardiophyllum克隆被推測的氨基酸序列也極為相似。有8個氨基酸序列組，每一個與其它序列僅有一個殘基不同。編碼與Patl7+序列相同的氨基酸序列的cDNA克隆被回收了2次，而其它7個cDNA(Patl8+、19+、20+、21+、22+、23+和24+)含一個特有的殘基。遺傳轉(zhuǎn)化按上文所討論的，可從各種植物源分離馬鈴薯貯存蛋白基因。可以用這些基因中的一種或多種轉(zhuǎn)化細菌細胞或植物細胞以便能生產(chǎn)馬鈴薯貯存蛋白并完成本發(fā)明的方法。下面將給出如何用各種馬鈴薯貯存蛋白的序列完成這一目的的實施。馬鈴薯貯存蛋白的cDNA的加工為了將馬鈴薯貯存蛋白基因摻入適用于在異源宿主細胞中表達馬鈴薯貯存蛋白的載體中，必需在該基因末端附近導入適當?shù)南拗莆稽c。這樣誘變的目的是為了得到包括蛋白質(zhì)編碼序列和最小非編碼側(cè)序列的盒，并摻入有用的限制位點以移動這些盒。設(shè)計這些盒以便可以移動包括信號肽或只有成熟編碼序列的完整編碼序列。對于PatAm，設(shè)計兩種誘變引物以產(chǎn)生這些盒。SEQ ID NO12的誘變是用兩個氨基酸(Met-Ala)取代成熟蛋白質(zhì)N-末端的Lys，并導入-NcoI位點，SEQ ID NO13加入了第二個終止密碼子和一個EcoRI位點。
所得的修飾序列鑒定為PatAm，SEQ ID NO14。對于所有其它cDNA，用PCR和上述的引物SEQ ID NO26和SEQ ID NO27或引物SEQ ID NO32和SEQ ID NO27進行相似的修飾并導入限制位點。在E.coli中表達馬鈴薯貯存蛋白將編碼PatAm(SEQ ID NO14)的DNA序列插入pMON5766，一個得自pBR327(Soberon et al.，1980)的E.coli表達裁體，帶有recA啟動子和G10前導序列(Olin et al.，1989)。將所得的載體pMON19714轉(zhuǎn)移到E.coli菌株JM101中，隨后生產(chǎn)PatAm，由Western印跡分析和使用對-硝基苯C-10酯的酯酶活性加以證實。
將Pat17m及PatAm的DNA編碼序列分別插入得自pMON6235的E.coli表達載體中，它帶有AraBAD啟動子(當細胞在阿拉伯糖中生長時可誘導)、G10前導序列和氨芐青霉素抗性基因。將含有Pat17m的所得載體pMON25213和含PatAm的pMON25216導入E.coli菌株JM101。
由轉(zhuǎn)化的E.co1i表達馬鈴薯貯存蛋白。但它被分隔在折光體(refractile body RBs)中。用完整的細胞和溶解的RB進行SCRW檢測。結(jié)果列于表9。
表9樣品重復次數(shù) 完整細胞 溶解的RBs(pMON)SCRW活性1SCRW活性119714 Am1 2.5 nt2 1.5 1.025216 Am1 1.0 02 01.025213 17m1 3.0 3.022 1.5 0.5
1用幼蟲發(fā)育障礙表示SCRW活性1＝輕微發(fā)育障礙(大小減小30-40％)，2＝中度發(fā)育障礙(大小減小50-80％)，3＝嚴重發(fā)育障礙(大小減?。?0％)。
2該樣品的死亡率是81％。在植物定殖細菌中表達馬鈴薯貯存蛋白為了控制昆蟲，還需在植物定殖細菌中表達一種或多種馬鈴薯貯存蛋白，然后將這種細菌用于植物。由于昆蟲以植物為食，因此，它會攝取由植物寄生菌生產(chǎn)的毒性劑量的馬鈴薯貯存蛋白。植物寄生菌可以是在植物表面生活的那些細菌，如假單胞菌屬或土壤桿菌屬菌種，或生活在植物維管結(jié)構(gòu)中的內(nèi)寄生菌如Clavibacter種。對于表面寄生菌，可以將馬鈴薯貯存蛋白基因插入能在這些革蘭氏陰性宿主中復制的寬宿主范圍載體中。所述載體實例是IncQ不可兼容性類的pKT231(Bagdasarian et al.，1981)或IncP類的pVK100(Knauf，1982)對于內(nèi)寄生菌，可通過同源重組或?qū)⒒驌饺肽茉谶@些內(nèi)寄生菌中進行染色體插入的適當轉(zhuǎn)座子上，從而將馬鈴薯貯存蛋白基因插入染色體。在桿狀病毒中表達馬鈴薯貯存蛋白將馬鈴薯貯存蛋白基因作為NcoI/EcoRI片段克隆到桿狀病毒供體載體pMON14327(參見未決的US.Serial Number 07/941，363，1992.9.4申請，該文獻摻入本文作為參考)中。供體載體pMON14327含有一個氨芐青霉素抗性基因、Tn7轉(zhuǎn)座子的左和右臂、在這兩臂之間有一慶大霉素抗性基因、強的桿狀病毒多角體蛋白啟動子和一個多接頭。桿狀病毒穿梭載體或桿狀質(zhì)粒(bacmid)由重組到AcNPV病毒基因組上的lacZ基因和卡那霉素抗性基因碼內(nèi)的mini-attTn7位點組成。借助四環(huán)素抗性輔助質(zhì)粒pMON7124，通過將馬鈴薯貯存蛋白或Gus基因和標記基因轉(zhuǎn)座到病毒基因組中可得到重組AcNPV病毒(Luckowet al.，1993)。將下列基因插入pNON14327中表7中所列的基因和Pat3+、Pat10+及Pat17+。
完成US.Serial No.07/941，363和Lockow等人的過程后，從上述基因生產(chǎn)大量的馬鈴薯貯存蛋白。由Western印跡分析和使用對-硝基苯C-10酯的酯酶活性確定馬鈴薯貯存蛋白的存在。除PatAm外，為了進行SCRW生物檢測，每種同工酶至少按比例擴大兩次。PatE+和PatEm發(fā)酵物始終幾乎沒有或沒有馬鈴薯貯存蛋白表達，所有其它同工酶似乎均在生物檢測可接受的水平表達了。但是，未確定與馬鈴薯相比，桿狀病毒中馬鈴薯貯存蛋白蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后加工的性質(zhì)。用Pat17+、PatB+、PatDm、PatIm、PatL+、Pat3+觀察到由桿狀病毒表達的同工酶抗SCRW的生物活性。
確定了多種同工酶(由桿狀病毒生產(chǎn)的)對昆蟲生長和發(fā)育的影響。將11種Russet同工酶的等份試樣與一種樣品結(jié)合進行抗SCRW、ECB、小地老虎和TBW的生物檢測。結(jié)合10-15mg每一種Q-Sepharose純化的同工酶，除僅能得到1.7mg的PatDm外，這種混合物在TBW檢測中導致100％的死亡率，對ECB重量減少93％。因此，分開檢測每種同工酶對TBW和ECB的作用。與裁體對照幼蟲相比，以用同工酶PatC+、PatL+和PatIm處理的食物為食的TBW和ECB表現(xiàn)出明顯的發(fā)育障礙(≥75％)和/或死亡。PatB+和PatDm對TBW發(fā)育的影響分別為69％和78％。植物基因構(gòu)建以雙鏈DNA形式存在的植物基因的表達涉及由RNA聚合酶從一條DNA鏈轉(zhuǎn)錄為信使RNA(mRNA)隨后在核內(nèi)加工mRNA初級轉(zhuǎn)錄物。這種加工涉及一個3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)，將多腺苷酸核苷酸加到RNA的3’末端。DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA由通常稱為“啟動子”的一個DNA區(qū)域調(diào)節(jié)。該啟動子區(qū)含有指示RNA聚合酶與DNA相連的堿基序列，并引發(fā)以一條DNA鏈為模板的mRNA的轉(zhuǎn)錄以得到相應RNA鏈。
在文獻中已描述了許多在植物細胞中有活性的啟動子。所述啟動子可由植物或植物病毒得到，包括但不限于膽脂堿合成酶(NOS)和章魚堿合成酶(OCS)啟動子(由土壤桿菌腫瘤誘導質(zhì)粒攜帶)、花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子、來自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞單位(ssRUBISCO，一種豐富的植物多肽)的光可誘導啟動子和無花果花葉病毒(FMV)35S啟動子。已用所有這些啟動子得到了已在植物中表達的各種類型的DNA(參見如PCT公開WO84/02913)。人們也可將表達限制在對昆蟲攻擊敏感的特定植物部位。例如，可以用根特異性啟動子將表達限制在根部或者用根增強的啟動子增加活性蛋白在根部的水平。對食根昆蟲敏感的植物來說，這是優(yōu)選的。
特定的植物啟動子在單子葉植物中更有效。例如，在WO9/09948中描述的大米肌動蛋白啟動子對于在玉米中表達是有效的。在EP0342926中描述的玉米遍在蛋白質(zhì)(ubiquitin)啟動子也可用于單子葉植物。
如果需要可以修飾在本發(fā)明DNA構(gòu)建體(即嵌合植物基因)中所用的啟動子以影響其控制特性。例如，可將CaMV35S啟動子與在沒有光時抑制ssRUBISCO表達的ssRUBICO基因部分連接以得到在葉中有活性而在根中沒有活性的啟動子。按本文所述，所得的嵌合啟動子也可使用。
從這種描述的意義上來說，“CaMV35S”啟動子因此包括CaMV35S啟動子的變異體，如通過與操縱子區(qū)相連，隨機或控制誘變等而得到的啟動子。此外，可以改變啟動子以包含多個可提高基因表達的“增強子序列”。已由kay等人(1987)報告了所述增強子序列的實例。
所選的特定啟動子應能引起酶編碼序列的充分表達以生產(chǎn)出有效量的馬鈴薯貯存蛋白。優(yōu)選的啟動子是CaMVE35S啟動子(增強的CaMV35S)。
由本發(fā)明DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的RNA還包含5’非轉(zhuǎn)譯前導序列。可從所選的啟動子得到該序列以表達基因，并且可以特異性對其進行修飾以提高mRNA的轉(zhuǎn)譯。也可從病毒RNA，從適宜的真核基因或者合成的基因序列得到5’非轉(zhuǎn)譯前導區(qū)。本發(fā)明不限于其中非轉(zhuǎn)譯區(qū)得自與啟動子序列相伴的5’非轉(zhuǎn)譯區(qū)的構(gòu)建體。
如上文所述，本發(fā)明嵌合植物基因的3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)含有一個在植物中起作用的多腺苷酸信號，以使腺苷酸核苷酸加到RNA的3’末端。優(yōu)選的3’區(qū)的實例是(1)含土壤桿菌腫瘤誘導(Ti)質(zhì)?；颍缒懼瑝A合成酶(NOS)基因的多腺苷酸信號的3’轉(zhuǎn)錄的非轉(zhuǎn)譯區(qū)和(2)類似大豆7s貯存蛋白質(zhì)基因和豌豆ssRUBISCO E9基因的植物基因[Fischhoff et al]。位置含上述馬鈴薯貯存蛋白盒的載體在植物細胞的細胞質(zhì)或液泡中表達活性蛋白。這就需將大部分或全部馬鈴薯貯存蛋白引入植物分泌途徑。為了達到這一目的，最好使用來自細菌或植物基因的信號序列，但預期的植物基因是優(yōu)選的。所述信號序列的實例是來自內(nèi)蛋白酶B基因(Koehler and Ho)和煙草PRlb基因(Cornelissen et al.，)的那些序列。在EP公開0385962中公開的pMON10824是一種經(jīng)設(shè)計用于表達鱗翅目活性B.t.kurstaki蛋白質(zhì)的植物轉(zhuǎn)化載體。在pMON10824中，B.t.k.編碼序列與PR1b信號序列加成熟PR1b編碼序列的10個氨基酸融合。為了得到其中PR1b信號與馬鈴薯貯存蛋白基因融合的載體，用BglII和NcoI切割pMON10824，然后分離含PR1b信號的小BglII-NcoI片段。在連接反應中，將小BglII-NcoI pMON10824片段與來自pMON19714的10kb NcoI-EcoRI片段和BamHI-EcoRI消化的pMON19470(Brown et al.)混合。該反應構(gòu)建一個質(zhì)粒，其中馬鈴薯貯存蛋白編碼序列與來自PR1b基因的分泌信號融合，并受CaMV35S啟動子和用于單子葉植物表達的內(nèi)含子的控制。對于雙子葉植物的基因表達，可進行相似的反應?？蓪㈦p子葉植物表達載體的NotI-NotI片段插入下文所述的雙子葉植物轉(zhuǎn)化載體中，然后轉(zhuǎn)移到無防御的土壤桿菌宿主中，用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物。因此，可以得到生產(chǎn)將馬鈴薯貯存蛋白分泌到細胞外空間的植物。
可將該單子葉植物質(zhì)粒的NotI-NotI片段插入玉米轉(zhuǎn)化載體(如上述的pMON18181)以生產(chǎn)分泌馬鈴薯貯存蛋白的玉米植物。
有利的是指導馬鈴薯貯存蛋白定位到另一細胞區(qū)葉綠體中。通過包含在葉綠體傳遞肽(CTP)的N-末端，可將蛋白質(zhì)移到葉綠體。已知能使異源蛋白質(zhì)定位于葉綠體的一種CTP來自擬南芥屬的RUBISCO小亞單位基因，稱為ats1A。已構(gòu)建了這種傳遞肽的變異體，它編碼傳遞肽、成熟RUBISCO序列的23個氨基酸加一個重復的傳遞肽裂解位點，以成功地進行B.t.k.蛋白質(zhì)的葉綠體定位。Brown等人描述的pMON19642含有與GOX基因融合的Arabidopsis atslA傳遞肽，并可用某構(gòu)建用于馬鈴薯貯存蛋白葉綠體定位的載體。pMON19643用EcoRI完全和NcoI部分消化，分離大(4.0kb)片段。在連接反應中，來自pMON19714的NcoI-EcoRI片段與pMON19643的大片段混合。該反應構(gòu)建了一個質(zhì)粒，其中馬鈴薯貯存蛋白編碼序列與帶成熟RUBISCO的23個氨基酸的擬南芥屬傳遞肽融合，而且該質(zhì)粒由CaMVE35S啟動子控制。可構(gòu)建另一相似質(zhì)粒，用FMV35S啟動子取代上述啟動子。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到無防御能力的土壤桿菌宿主中，用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物。另外，按上述，將NotI-NotI片段克隆到玉米轉(zhuǎn)化載體中。因此，可以得到生產(chǎn)位于葉綠體中的馬鈴薯貯存蛋白。植物轉(zhuǎn)化和表達經(jīng)任何適當?shù)姆椒ň蓪⒑景l(fā)明結(jié)構(gòu)編碼序列的嵌合植物基因插入植物基因組。適宜的植物轉(zhuǎn)化載體包括得自土壤桿菌Ti質(zhì)粒的那些載體，以及例如由Herrera-Estrella(1983)、Bevan(1983)，Klee(1985)和EPO公開0120516(Schilperoort et al.)公開的那些，除得自土壤桿菌的Ti或根誘導(Ri)質(zhì)粒的植物轉(zhuǎn)化載體外，也可以用其它方法將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體插入植物細胞。所述方法可包括，例如，使用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA吸收的化學物質(zhì)，經(jīng)顯微發(fā)射彈轟擊(microprojectile bombardment)的游離DNA釋放和使用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化。馬鈴薯貯存蛋白在煙草細胞中的瞬時表達對于轉(zhuǎn)化雙子葉植物特別有用的質(zhì)粒盒載體是pMON11794。表達盒pMON11794由CaMVE35S啟動子、牽牛Hsp705’非轉(zhuǎn)譯前導序列，包括NOS基因的多腺苷酸信號的3’末端組成。pMON11794包括用于插入編碼序列的NcoI和EcoRI位點，位于植物基團表達盒側(cè)翼的NotI-NotI位點。
將PatA(SEQ ID NO11)、PatB+(SEQ ID NO16)、PatC+(SEQ ID NO17)和PatG+(SEQ ID NO22)各插入pMON11794以分別得到pMON19745、pMON19742、pMON19743、pMON19744。將每個載體均經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)至煙草原生質(zhì)體中。由Western印跡分析確定轉(zhuǎn)化煙草細胞進行的馬鈴薯貯存蛋白表達。雙子葉植物(dicots)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化已由Rosahl等人報告了用馬鈴薯貯存蛋白基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化雙子葉植物。在葉和莖特異性啟動子的控制下，用馬鈴薯貯存蛋白基因轉(zhuǎn)化煙草。馬鈴薯貯存蛋白得以表達。
將pMON19745的NotI-NotI片段插入pMON17227(由Barry等人在WO92/04449中公開并描述的Ti質(zhì)粒，該文獻摻入本文作為參考)以得到pMON22566。該載體含有由Barry描述的用于選轉(zhuǎn)化植物的甘草膦抗性基因。相似地用SEQ ID NO16、SEQ ID NO17和SEQ IDNO22分別得到載體pMON22563、22564和22565。
將這些載體導入無防御能力的土壤桿菌ABI中，并用于轉(zhuǎn)化組織培養(yǎng)中的番茄外植體。篩選甘草膦抗性并植物再生后，回收表達馬鈴薯貯存蛋白的所有植株。由Western印跡分析確定馬鈴薯貯存蛋白基因的表達，初步結(jié)果表明表達水平在總蛋白質(zhì)的0.1到0.5％之間。使用昆蟲幼蟲進行生物檢測。馬鈴薯貯存蛋白在玉米細胞中的瞬時表達將上述的pMON9729的1kb NcoI-EcoRI片段插入pMON19433(在Wo93/19189和未決美國專利申請系列No.07/855,857(1992，3，19申請)(Brown等人)中描述的，該文獻摻入本文作為參考)。用NotI消化所得的質(zhì)粒pMON19731，將所得片段插入也由Brown等人描述的pMON10081中以得到pMON19740。將該質(zhì)粒按Sheen，1991所述電穿孔到玉米葉原生質(zhì)體中。用Western印跡分析確定轉(zhuǎn)化的玉米原生質(zhì)體對馬鈴薯貯存蛋白的表達。
為了得到馬鈴薯貯存蛋白的細胞質(zhì)表達，將pMON19714的NcoI-EcoRI片段插入pMON19433以得到pMON19730。將pMON19730的NotI片段插入pMON10081，將所得的質(zhì)粒pMON19739電穿孔到玉米葉原生質(zhì)體中，由Western印跡分析確定生產(chǎn)的馬鈴薯貯存蛋白。
在玉米原生質(zhì)體中還表達帶有或不帶靶信號的Pat17。將編碼蛋白質(zhì)Pat17+(成熟Pat17蛋白質(zhì)和其自己關(guān)于液泡靶目標的信號序列)的1.1kb NcoI-EcoRI片段(SEQ ID NO30)插入pMON19648中。因此，pMON19761含有CaMVE35S啟動子、Hsp70內(nèi)含子、Pat17+基因和用于玉米細胞中表達的NOS終止子。
為了得到用于細胞質(zhì)表達的裁體，用編碼pMON25213的Pat17m蛋白質(zhì)(SEQ ID NO31)的NcoI-EcoRI片段代替pMON19761中的Pat17+序列以形成構(gòu)建體pMON25223。
通過將含有pMON19643(Brown et al.)的擬南芥(Arabidopsisthaliana)SSUla基因(Timko et al.)的葉綠體傳遞肽(CTP)的0.3kb XbaI-NcoI片段和pMON25213 Pat17m的1Kb NcoI-EcoRI兩個片段插入pMON19761(XbaI-EcoRI)而得到pMON25224。因此，pMON25224含有CaMVE35S啟動子、Hsp7O內(nèi)含子、CTP/Pat17m編碼序列和NOS終止子。
為了達到在細胞外的目標，將編碼分泌蛋白質(zhì)細胞外信號肽的內(nèi)蛋白質(zhì)酶B cDNA(Koehler and Ho)的5’末端與pMON25213的Pat17m基因相連。用拼接重疊延伸技術(shù)(Horton et al.)得到含嵌合基因的BglII-EcoRI片段，然后將其插入pMON19761(BamHI-EcoRI)以得到pMON25225 。
將所有這些構(gòu)建體電穿孔到玉米葉原生質(zhì)體中用Western印跡分析確定Par17+的表達。用馬鈴薯貯存蛋白基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化玉米從pMON19653和pMON19643(Brown et al.)構(gòu)建玉米轉(zhuǎn)化載體pMON18181。該構(gòu)建體含CaMVE35S啟動子、Hsp70內(nèi)含子、CP4甘草膦選擇標記和NOS終止子組成的盒CaMVE35S啟動子、Hsp70內(nèi)含子、GOX甘草膦選擇標記、NOS終止子和一個NotI位點(用于插入含馬鈴薯貯存蛋白基的基因表達盒)組成的盒。將SEQ ID NO11和SEQ ID NO30各作為NotI-NotI片段插入pMON18181以分別得到pMON19746和pMON19764。
按Brown等人所述，通過使用biolistic顆粒槍的胚發(fā)生組織培養(yǎng)轟擊法插入這些載體。用甘草膦抗性篩選轉(zhuǎn)化的細胞，并再生完整的植株。用Western印跡分析，酯酶活性檢測，和/或昆蟲抗性檢測證實昆蟲抗性植物表達基因的水平為總蛋白質(zhì)的0.1-0.5％。合成基因用于提高單子葉植物的表達已經(jīng)證明修飾編碼序列可提高其它殺蟲蛋白質(zhì)基因如蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素序列(Fischhoff and Perlak；WO93/07278，Ciba-Geigy)的表達。因此修飾編碼序列以提高馬鈴薯貯存蛋白在植物，特別是玉米中的表達。在SEQ ID NO33中列出了修飾過的Pat17序列。合成含SEQ ID NO33的DNA片段并將其插入玉米表達盒載體，如pMON19470(Brown et al.)。然后將玉米表達盒插入pMON18181或其它含有玉米轉(zhuǎn)化可選擇標記基因的玉米植物轉(zhuǎn)化載體中，就可得到表達Pat17+的完整玉米植株。從上述可以看出，本發(fā)明完全可得到上述的所有結(jié)果和目的以及本發(fā)明顯而易見并且其內(nèi)在的優(yōu)點。應理解某種特征和輔助結(jié)合具實用性，而且不參考其它特征和輔助結(jié)合也可使用。這由權(quán)利要求實現(xiàn)并在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在不超出本發(fā)明范圍的情況下，可以完成許多可能的實施方案，因此，本文所列的所有物質(zhì)均是說明性的而沒有限制意義。
似乎具體并單獨說明了每篇文獻或?qū)＠麚饺氡疚淖鳛閰⒖迹傊菊f明書中的所有文獻和專利摻入本文作為參考。
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序列表(1)一般資料(i)申請人(A)名稱Monsanto Company(B)街道800 North Lindbergh Boulevard(C)城市St.Louis(D)州Missouri(E)國家美利堅合眾國(F)郵編63167(G)電話(314)694-3131(H)電傳(314)694-5435(ii)發(fā)明題目控制昆蟲的方法(iii)序列數(shù)33(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy disk(B)計算機IBM PC兼容的(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/031146(B)申請日12-MAR-1993(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度15個氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Leu Glu Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Leu Gly Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Thr Leu Gly Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Thr Leu Gly Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Lys Leu Xaa Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO6Xaa Xaa Glu Glu Met Val Thr Val1 5(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Ser Leu Asp Tyr Lys Gln Met Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Lys Leu Asp Tyr Lys Gln Met Leu1 5(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度15個氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Ser Leu Xaa Tyr Lys Gln Met Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Ser Leu Asn Tyr Lys Gln Met Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度1171個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TATTTTTTAT GATATTAGCA ACTACTAGTT60CAACATGTGC TAAGTTGGAA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120AGGGAATCAT TCCAGCTATC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA 180ATAATAAAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA AGTACAGGAG 240GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCCA 300AAGATATTGT ACCCTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCATAT TTTTAATTAT AGTGGTTCAA 360TTATTGGCCC AATGTATGAT GGAAAATATC TTCTGCAAGT TCTTCAAGAA AAACTTGGAG 420AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGCCATCTC AAGCTTTGAC ATCAAAACAA 480ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAAGTC TCCAGAATTG GATGCTAAGA 540TGTATGACAT ATGCTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAATATA TTTTCCTCCA CATTACTTTA 600TTACTCATAC TAGTAATGGT GATATATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT GGTGTTGCTA 660CTGTTGGTGA TCCGGCGTTA TTATCCCTTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC 720CAGCATTTTC TTCAATTAAG TCATTGGATT ACAAGCAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA 780CTGGCACTAA TTCAGAGTTT GATAAAACAT ATACAGCACA AGAGGCAGCT AAATGGGGTC 840CTCTACGATG GATGTTAGCT ATACAGCAAA TGACTAATGC AGCAAGTTCT TACATGACTG 900ATTATTACAT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC GTCATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC 960AAGAAAATGC ATTAACAGGC ACAACTACTG AAATGGATGA TGCGTCTGAG GCTAATATGG 1020AATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAACATTAT TGAAGAAACC AGTTTCCAAA GACAGTCCTG 1080AAACCTATGA GGAAGCTCTA AAGAGGTTTG CAAAATTGCT CTCTGATAGG AAGAAACTCC 1140GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TGATAGAATT C 1171(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(合成的)(xi)序列描述SEQ ID NO12CATGTGCTCT AGAAGATCTC CACCATGGCG TTGGAAG(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(合成的)(xi)序列描述SEQ ID NO13GCTTCTTATT GATAGAATTC AAGGTC(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度1105個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14CCATGGCGTT GGAAGAAATG GTGACTGTTC TTAGTATTGA TGGAGGTGGA ATTAAGGGAA60TCATTCCAGC TATCATTCTC GAATTTCTTG AAGGACAACT TCAGGAAGTG GACAATAATA 120AAGATGCAAG ACTTGCAGAT TACTTTGATG TAATTGGAGG AACAAGTACA GGAGGTTTAT 180TGACTGCTAT GATAACTACT CCAAATGAAA ACAATCGACC CTTTGCTGCT GCCAAAGATA 240TTGTACCCTT TTACTTCGAA CATGGCCCTC ATATTTTTAA TTATAGTGGT TCAATTATTG 300GCCCAATGTA TGATGGAAAA TATCTTCTGC AAGTTCTTCA AGAAAAACTT GGAGAAACTC 360GTGTGCATCA AGCTTTGACA GAAGTTGCCA TCTCAAGCTT TGACATCAAA ACAAATAAGC 420CAGTAATATT CACTAAGTCA AATTTAGCAA AGTCTCCAGA ATTGGATGCT AAGATGTATG 480ACATATGCTA TTCCACAGCA GCAGCTCCAA TATATTTTCC TCCACATTAC TTTATTACTC 540ATACTAGTAA TGGTGATATA TATGAGTTCA ATCTTGTTGA TGGTGGTGTT GCTACTGTTG 600GTGATCCGGC GTTATTATCC CTTAGCGTTG CAACGAGACT TGCACAAGAG GATCCAGCAT 660TTTCTTCAAT TAAGTCATTG GATTACAAGC AAATGTTGTT GCTCTCATTA GGCACTGGCA 720CTAATTCAGA GTTTGATAAA ACATATACAG CACAAGAGGC AGCTAAATGG GGTCCTCTAC 780GATGGATGTT AGCTATACAG CAAATGACTA ATGCAGCAAG TTCTTACATG ACTGATTATT 840ACATTTCTAC TGTTTTTCAA GCTCGTCATT CACAAAACAA TTACCTCAGG GTTCAAGAAA 900ATGCATTAAC AGGCACAACT ACTGAAATGG ATGATGCGTC TGAGGCTAAT ATGGAATTAT 960TAGTACAAGT TGGTGAAACA TTATTGAAGA AACCAGTTTC CAAAGACAGT CCTGAAACCT 1020ATGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGGAAGAAA CTCCGAGCAA 1080ACAAAGCTTC TTATTGATAG AATTC1105(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度1106個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO15CCATGGCGTT GGAAGAAATG GTGACTGTTC TTAGTATTGA TGGAGGTGGA ATTAAGGGAA60TCATTCCAGC TACCATTCTC GAATTTCTTG AAGGACAACT TCAGGAAGTG GACAATAATA 120AAGATGCAAG ACTTGCAGAT TACTTTGATG TAATTGGAGG AACAAGTACA GGAGGTTTAT 180TGACTGCTAT GATAACTACT CCAAATGAAA ACAATCGACC CTTTGCTGCT GCCAAAGATA 240TTGTACCCTT TTACTTCGAA CATGGCCCTC ATATTTTTAA TTATAGTGGT TCAATTATTG 300GCCCAATGTA TGATGGAAAA TATCTTCTGC AAGTTCTTCA AGAAAAACTT GGAGAAACTC 360GTGTGCATCA AGCTTTGACA GAAGTTGCCA TCTCAAGCTT TGACATCAAA ACAAATAAGC 420CAGTAATATT CACTAAGTCA AATTTAGCAA AGTCTCCAGA ATTGGATGCT AAGATGTATG 480ACATATGCTA TTCCACAGCA GCAGCTCCAA TATATTTTCC TCCACATTAC TTTATTACTC 540ATACTAGTAA TGGTGATATA TATGAGTTCA ATCTTGTTGA TGGTGGTGTT GCTACTGTTG 600GTGATCCGGC GTTATTATCC CTTAGCGTTG CAACGAGACT TGCACAAGAG GATCCAGCAT 660TTTCTTCAAT TAAGTCATTG GATTACAAGC AAATGTTGTT GCTCTCATTA GGCACTGGCA 720CTAATTCAGA GTTTGATAAA ACATATACAG CACAAGAGGC AGCTAAATGG GGTCCTCATC 780GATGGATGTT AGCTATACAG CAAATGACTA ATGCAGCAAG TTCTTACATG ACTGATTATT 840ACATTTCTAC TGTTTTTCAA GCTGGTCATT CACAAAACAA TTACCTCAGG GTTCAAGAAA 900ATGCATTAAC AGGCACAACT ACTGAAATGG ATGATGCGTC TGAGGCTAAT ATGGAATTAT 960TAGTACAAGT TGGTGAAAAA TTATTGAAGG AACCAGTTTC CAAAGACAGT CCTGAAACCT 1020CTGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGAAAGAAA CTCCGAGCAA 1080ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC 1106(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度1172個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO16CCATGGCAAC TACTAAATCT GTTTTAGTTT TATTTTTTAT GATATTAGCA ACTACTAGTT 60CAACATGTGC TACGTTGGGA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120AGGGAATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA 180ATAATAAAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA AGTACAGGAG 240GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCCA 300AAGATATTGT ACCTTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCATAT TTTTAATTCT AGTGGTTCAA 360TTTTTGGCCC AATGTATGAT GGAAAATATT TTCTGCAAGT TCTTCAAGAA AAACTTGGAG 420AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGCCATCTC AAGCTTTGAC ATCAAAACAA 480ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAAGTC TCCAGAATTG GATGCTAAGA 540TGAATGACAT ATGCTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAACATA TTTTCCTCCA CATTACTTTG 600TTACTCATAC TAGTAATGGA GATAAATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT GCTGTTGCTA 660CTGTTGGTGA TCCGGCGTTA TTATCCCTTA GCGTTCGAAC GAAACTTGCA CAAGTGGATC 720CAAAATTTGC TTCAATTAAG TCATTGAATT ACAACGAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA 780CTGGCACTAA TTCAGAGTTT GATAAAACAT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTC 840CTCTACGATG GATATTAGCT ATACAGCAAA TGACTAATGC AGCAAGTTCT TACATGACTG 900ATTATTACCT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC GTCATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC 960AAGAAAATGC ATTAACAGGC ACAACTACTG AAATGGATGA TGCGTCTGAG GCTAATATGG 1020AATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAAAATTAT TGAAGAAACC AGTTTCCAAA GACAGTCCTG 1080AAACCTATGA GGAAGCTCTA AAGAGGTTTG CAAAATTGCT CTCTGATAGG AAGAAACTCC 1140GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC1172(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長度1175個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO17CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TAATTGTTAT GATATTAGCA ACTACTAGTT60CAACATTTGC TTCGTTGGAA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120AGGGAATCAT TCCGGGTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG AAAATGGACA 180ATAATGCAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA AGTACAGGAG 240GTTTATTGAC TTCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCCA 300ATGAAATTGT ACCTTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCATAT TTTTAATTCT AGGTACTGGC 360CAATTTTTTG GCCAAAATAT GATGGAAAAT ATCTTATGCA AGTTCTTCAA GAAAACCTTG 420GAGAAACTCG TGTGCATCAA GCTTTGACTG AAGTTGCCAT CTCAAGCTTT GACATCAAAA 480CAAATAAGCC AGTAATATTC ACCAAGTCAA ATTTAGCAAA GTCTCCAGAA TTGGATGCTA 540AGATGTATGA CATATGTTAT TCCACAGCAG CAGCTCCAAC ATATTTTCCT CCACATTACT 600TTACTACTAA TACTATTAAT GGAGATAAAT ATGAGTTCAA TCTTGTTGAT GGTGCTGTTG 660CTACTGTTGC TGATCCGGCG TTATTATCCA TTAGCGTTGC AACGAGACTT GCAGAAAAGG 720ATCCAGCATT TGCTTCAATT AGGTCATTGA ATTACAAAAA AATGTTGTTG CTCTCATTAG 780GCACTGGCAC TACTTCAGAG TTTGATAAAA CATATACAGC AGAAGAGACA GCTAAATGGG 840GTGCTATACA ATGGATGTTG GTTATACAGC GAATGACTGA TGCAGCAAGT TCTTACATGA 900CTGATTATTA CCTTTCTACT GTTTTTCAAG CTCAAAATTC ACAAAAGAAT TACCTCAGGG 960TTCAAGAAAA TGCGTTAACA GGCACAACTA CTGAAATGGA TGATGCTTCT GAGGCTAATA 1020TGGAATCATT AGTACAAGTT GGTGAAAATT TATTGAAGAA ACCAGTTCCC AAAGACAATC 1080CTGAAACCTA TGAGGAAGCT CTAAAGAGGT TTGCAAAATT GCTTTCTGAT AGGAAGAAAC 1140TTCGAGCAAA CAAAGCTTCT TATTAATGAG AATTC 1175(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長度1106個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO18CCATGGCGTT CGAAGAAATG GTGACTGTTC TTAGTATTGA TGGAGGTGGA ATTAAGGGAA60/TCATTCCGGC TACCATTCTC GAATTTCTTG AAGGACAACT TCAGGAAGTG GACAATAATA 120AAGATGCAAG ACTTGCAGAT TACTTTGATG TAATTGGAGG AACAAGTACA 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TCAGGAAATG GACAATAATG 120CAGATGCAAG ACTTGCAGAT TACTTTGATG TAATTGGAGG AACAAGTACA GGAGGTTTAT 180TGACTGCTAT GATAAGTACT CCAAATGAAA ACAATCGACC CTTTGCTGCT GCCAAAGAAA 240TTGTACCTTT TTACTTCGAA CATGGCCCTC AGATTTTTAA TCCTAGTGGT CAAATTTTAG 300GCCCAAAATA TGATGGAAAA TATCTTATGC AAGTTCTTCA AGAAAAACTT GGAGAAACTC 360GTGTGCATCA GGCTTTGAGA GAAGTTGTCA TCTCAAGCTT TGACATCAAA ACAAATAAGC 420CAGTAATATT CACTAAGTCA AATTTAGCAA ACTCTCCAGA ATTGGATGCT AAGATGTATG 480ACATAAGTTA TTCCACAGCA GCAGCTCCAA CATATTTTCC TCCCCATTAC TTTGTTACTA 540ATACTAGTAA TGGAGATGAA TATGAGTTCA ATCTTGTTGA TGGTGCTGTT GCTACTGTTG 600CTGATCCGGC GTTATTATCC ATTAGCGTTG CAACGAGACT TGCACAAAAG GATCCAGCAT 660TTGCTTCAAT TAGGTCATTG AATTACAAAA AAATGCTGTT GCTCTCATTA GGCACTGGCA 720CTACTTCAGA GTTTGATAAA ACATATACAG CAAAAGAGGC AGCTACCTGG ACTGCTGTAC 780ATTGGATGTT AGTTATACAG AAAATGACTG ATGCAGCAAG TTCTTACATG ACTGATTATT 840ACCTTTCTAC TGCTTTTCAA GCTCTTGATT CAAAAAACAA TTACCTCAGG GTTCAAGAAA 900ATGCATTAAC AGGCACAACT ACTGAAATGG ATGATGCTTC TGAGGCTAAT ATGGAATTAT 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(A)長度45個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(合成的)(xi)序列描述SEQ ID NO32CCATCTAGAA GATCTCCACC ATGGCGTTGG GAGAAATGGT GACTG(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長度1164個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO33ATGGCCACCA CCAAGAGCTT CCTCATCCTG ATCTTCATGA TCCTGGCCAC CACCAGCAGC60ACCTTCGCCC AGCTCGGCGA GATGGTGACC GTGCTCTCCA TCGACGGCGG TGGCATCAGG 120GGCATCATCC CGGCCACCAT CCTGGAGTTC CTGGAGGGCC AACTCCAGGA GATGGACAAC 180AACGCCGACG CCCGCCTGGC CGACTACTTC GACGTGATCG GTGGCACCAG CACCGGCGGT 240CTCCTGACCG CCATGATCTC CACTCCGAAC GAGAACAACC GCCCCTTCGC CGCTGCGAAG 300GAGATCGTCC CGTTCTACTT CGAACACGGC CCTCAGATTT TCAACCCCTC GGGTCAAATC 360CTGGGCCCCA AGTACGACGG CAAGTACCTT ATGCAAGTGC TTCAGGAGAA GCTGGGCGAG 420ACTAGGGTGC ACCAGGCGCT GACCGAGGTC GTCATCTCCA GCTTCGACAT CAAGACCAAC 480AAGCCAGTCA TCTTCACCAA GTCCAACCTG GCCAACAGCC CGGAGCTGGA CGCTAAGATG 540TACGACATCT CCTACTCCAC TGCTGCCGCT CCCACGTACT TCCCTCCGCA CTACTTCGTC 600ACCAACACCA GCAACGGCGA CGAGTACGAG TTCAACCTTG TTGACGGTGC GGTGGCTACG 660GTGGCGGACC CGGCGCTCCT GTCCATCAGC GTCGCCACGC GCCTGGCCCA GAAGGATCCA 720GCCTTCGCTA GCATTAGGAG CCTCAACTAC AAGAAGATGC TGCTGCTCAG CCTGGGCACT 780GGCACGACCT CCGAGTTCGA CAAGACCTAC ACTGCCAAGG AGGCCGCTAC CTGGACCGCC 840GTCCATTGGA TGCTGGTCAT CCAGAAGATG ACGGACGCCG CTTCCAGCTA CATGACCGAC 900TACTACCTCT CCACTGCGTT CCAGGCGCTT GACTCCAAGA ACAACTACCT CCGTGTTCAG 960GAGAATGCCC TCACTGGCAC CACGACCGAG ATGGACGATG CCTCCGAGGC CAACATGGAG 1020CTGCTCGTCC AGGTGGGTGA GAACCTCCTG AAGAAGCCCG TCTCCGAAGA CAATCCCGAG 1080ACCTATGAGG AAGCGCTCAA GCGCTTTGCC AAGCTGCTCT CTGATAGGAA GAAACTCCGC 1140GCTAACAAGG CCAGCTACTA ATGA 1164
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改6.權(quán)利要求5的方法，其中所說的結(jié)構(gòu)編碼序列包括SEQ IDNO30或SEQ ID NO31。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所說植物是玉米，而所述結(jié)構(gòu)編碼序列是合成的，以提高在單子葉植物中的表達。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述結(jié)構(gòu)編碼序列包括SEQ ID NO32。
9.一種由權(quán)利要求5的方法產(chǎn)生的植物，其中在基因組中包括一種或多種表達B.t.內(nèi)毒素的基因。
10.一種由權(quán)利要求9的植物產(chǎn)生的種子或種子部分。
權(quán)利要求
1.一種控制因食植物昆蟲引起的植物感染的方法，包括提供有效量的殺蟲馬鈴薯貯存蛋白供所述昆蟲攝取。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述馬鈴薯貯存蛋白是由施用于植物后生產(chǎn)所述馬鈴薯貯存蛋白的植物定殖微生物提供的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中通過表達摻入在所述植物中的馬鈴薯貯存蛋白基因而提供所述馬鈴薯貯存蛋白，所述植物的親本細胞預先經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化。
4.權(quán)利要求3的方法，其中的所述植物是棉花、玉米、番茄或馬鈴薯。
5.一種生產(chǎn)經(jīng)遺傳工程方法轉(zhuǎn)化的、表達有效殺蟲量的馬鈴薯貯存蛋白之昆蟲抗性植物的方法，包括步驟(a)將含下列組分的重組雙鏈DNA分子插入植物細胞的基因組；(i)在植物細胞中引起RNA序列產(chǎn)生的啟動子；(ii)編碼馬鈴薯貯存蛋白的結(jié)構(gòu)編碼序列；(iii)在所述植物細胞中使多腺苷酸核苷酸加到RNA序列3’末端的3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)，其中所述啟動子對于所述結(jié)構(gòu)編碼序列來說是異源的，而且其中所述啟動子與所述結(jié)構(gòu)編碼序列經(jīng)操作相連，所述結(jié)構(gòu)編碼序列與所述非轉(zhuǎn)譯區(qū)依次相連；(b)得到轉(zhuǎn)化的植物細胞；和(c)從轉(zhuǎn)化的植物細胞再生經(jīng)遺傳工程方法轉(zhuǎn)化的表達有效殺蟲量馬鈴薯貯存蛋白之植物其中所述啟動子就所述結(jié)構(gòu)編碼序列而言是異源的，而且其中所述植物選自棉花、玉米、番茄和馬鈴薯。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述結(jié)構(gòu)編碼序列含有SEQ ID NO30或SEQ ID NO31。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述植物是玉米，而所述結(jié)構(gòu)編碼序列是合成的，以提高在單子葉植物中的表達。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述結(jié)構(gòu)編碼序列含有SEQ ID NO32。
9.一種由權(quán)利要求5的方法產(chǎn)生的植物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中在基因組中包括一種或多種表達B.t.內(nèi)毒素的基因。
11.一種由權(quán)利要求9的植物產(chǎn)生的種子或種子部分。
全文摘要
馬鈴薯貯存蛋白主要通過阻礙幼蟲的生長防止其成熟和繁殖來控制昆蟲。將編碼一種或多種這些蛋白質(zhì)的基因克隆到載體中以轉(zhuǎn)化植物定殖微生物或植物，由此得到控制昆蟲感染的方法。
文檔編號A01H5/00GK1119027SQ94191451
公開日1996年3月20日 申請日期1994年3月2日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月12日
發(fā)明者S·M·布朗, J·T·格林普萊, B·G·埃薩, M·G·詹寧斯, E·B·利懷恩, J·P·佩塞爾 申請人:孟山都公司