專(zhuān)利名稱(chēng)：改善植物抗凍能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)采用低溫馴化(cold-acclimating)植物和/或采用甜菜堿類(lèi)處理植物來(lái)提高植物的耐寒或抗凍能力的方法。
本發(fā)明還涉及一種通過(guò)采用甜菜堿類(lèi)處理植物來(lái)抑制其生長(zhǎng)或降低其生長(zhǎng)速度的方法。
本發(fā)明還涉及一種通過(guò)用甜菜堿類(lèi)處理改善植物種子低溫出芽率的方法。發(fā)明背景甜菜堿是一種無(wú)毒的滲壓劑(osmolyte)，一般認(rèn)為它在對(duì)抗環(huán)境影響，尤其是對(duì)抗鹽堿和干旱時(shí)對(duì)植物起到一定的保護(hù)作用(1，2)。該化合物主要在葉綠體中通過(guò)膽堿單氧酶和甜菜堿醛脫氫酶合成(1)。它可累積在不同細(xì)胞室中用來(lái)調(diào)節(jié)滲透平衡(3)并增加蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，防止蛋白變性(4)。體外實(shí)驗(yàn)表明甜菜堿可防止甜菜(Beta vulgaris)根的膜的熱變性(5)。研究發(fā)現(xiàn)甜菜堿可防止幾種較高等植物酶因加熱(6)、NaCl或KCl(7)所致的變性。甜菜堿還可以在一段時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定離體葉綠體的光合活性(8)并可防止NaCl對(duì)光合體系II抑制作用。令人感興趣的是對(duì)大麥葉外用25mM甜菜堿可以改善其經(jīng)聚乙二醇所造成的滲透壓(-10巴)處理后的恢復(fù)(10)。
由于已經(jīng)揭示出針對(duì)苛刻的環(huán)境條件，甜菜堿類(lèi)可對(duì)植物起到一定保護(hù)作用，現(xiàn)已將甜菜堿類(lèi)用于處理土壤，植物和種子。
WO95/35022公開(kāi)了用甜菜堿處理種子的方法，用以促進(jìn)秧苗的生長(zhǎng)并保護(hù)種子免受不良環(huán)境條件的影響。可浸泡并干燥或直接涂抹將甜菜堿置于種子之上。不良環(huán)境條件包括缺水，過(guò)量NaCl，極端的溫度或pH值以及重金屬的毒害。該發(fā)明未對(duì)溫度極限作解釋?zhuān)瑫r(shí)也未說(shuō)明其對(duì)低溫發(fā)芽率的有益之處。
WO96/07320公開(kāi)了采用甜菜堿提高葡萄產(chǎn)量的方法，溫度極限在3℃至30℃之間。
在WO96/41530中公開(kāi)了甜菜堿的不同組合物，用于使小麥，馬鈴薯和葡萄免受不良條件，包括3℃至30℃間溫度的影響。
對(duì)于冷凍溫度和低溫馴化，這些參考文獻(xiàn)并未作解釋。
在France Allard的論文中，可以看到對(duì)于小麥栽培品種Fredrick，三天6℃/2℃(白天/夜晚)的低溫馴化加上添加1000mM甜菜堿導(dǎo)致植物抗凍能力的改善，其中抗凍能力是采用-10℃下存活率的進(jìn)行衡量的。與對(duì)照相比，其存活率為83％，但僅采用1000mM甜菜堿處理時(shí)存活率僅為51％。該參考文獻(xiàn)沒(méi)有給出提高抗凍能力的最佳條件。采用大劑量甜菜堿(1000mM)顯示對(duì)植物有毒性，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)葉子上出現(xiàn)萎黃病。此外，栽培品種Fredrick的LT50(50％植物死亡時(shí)的致死溫度)為-17℃，在-10℃下進(jìn)行測(cè)量并不能說(shuō)明這種復(fù)合處理法提高抗凍能力的程度。文章也沒(méi)說(shuō)明對(duì)天生具有較低抗凍性能的栽培品種的作用。同時(shí)文章中也述及植物生長(zhǎng)速率的降低，并證實(shí)這一降低直接與甜菜堿的使用量成正比。當(dāng)對(duì)栽培品種Fredrick使用最大劑量1000mM時(shí)，與對(duì)照植物相比，生長(zhǎng)速率下降了29％。最后，在這篇文章中還論及蛋白WCOR410。指出當(dāng)對(duì)植物低溫馴化或增加外源性甜菜堿用量時(shí)發(fā)生蛋白WCOR410的累積。但該參考文獻(xiàn)并沒(méi)給出一段低溫馴化時(shí)間，這段時(shí)間足以導(dǎo)致最佳的Wcor410基因的表達(dá)并改善抗凍能力。
在專(zhuān)利公告CA2,104,142中，本發(fā)明的發(fā)明者們公開(kāi)了三個(gè)對(duì)低溫有響應(yīng)的基因的純化及其序列。其中之一為Wcor410。但在該專(zhuān)利中并沒(méi)有指出蛋白WCOR410是由甜菜堿按與甜菜堿使用量成正比的方式被誘導(dǎo)的，并且該蛋白有助于改善某些植物的抗凍能力。同時(shí)該專(zhuān)利也沒(méi)有說(shuō)明低溫馴化和施用甜菜堿聯(lián)合的好處。本發(fā)明的陳述現(xiàn)提供一種提高植物耐寒或抗凍能力的方法，包括如下步驟—在高于約0℃且不低于所述植物能耐受的最低溫度的溫度下馴化所述植物，其時(shí)間應(yīng)足以對(duì)所述植物誘導(dǎo)出最佳的耐寒或抗凍能力，和—向所述植物施用甜菜堿或其衍生物，如甘氨酸甜菜堿，其施用劑量應(yīng)足以對(duì)所述植物誘導(dǎo)出相同或不同的最佳耐寒或抗凍能力；合并低溫馴化和施用甜菜堿及其衍生物的步驟使所述植物的耐寒或抗凍能力高于單個(gè)步驟所誘導(dǎo)的最佳耐寒或抗凍能力。
優(yōu)選地，施用劑量不應(yīng)對(duì)所述植物造成不可接受的毒害作用，更優(yōu)選地，施用劑量對(duì)所述植物無(wú)毒。
任何植物都可從該方法中獲益，優(yōu)選植物為薔薇科植物，禾本科植物和禾本科干草，更優(yōu)選為玫瑰，草莓，高爾夫球場(chǎng)的草坪，大麥或小麥。
對(duì)于后兩種植物，低溫馴化的時(shí)間約為4周，施用方案是在濃度小于500mM、優(yōu)選約250mM的甘氨酸甜菜堿的溶液的存在下使這些植物生長(zhǎng)。
在春小麥變種Glenlea中，單獨(dú)各步驟的最佳抗凍能力按致使50％植物群體死亡的溫度(LT50)表示約為-8℃，兩步驟聯(lián)合使用時(shí)抗凍能力增加6℃而達(dá)到約-14℃的LT50，并且改善了植物在低溫或冷凍溫度下的光合作用能力和整體生理機(jī)能。
所述各步驟單獨(dú)和/或聯(lián)合采用時(shí)所誘導(dǎo)出的最佳抗凍能力至少部分是因基因Wcor410表達(dá)增多所致。
本發(fā)明也涉及至少降低植物生長(zhǎng)速率30％的方法，其中包含采用有效且不致死、優(yōu)選對(duì)植物無(wú)毒的劑量，對(duì)植物進(jìn)行甜菜堿或其衍生物處理的步驟。
在栽培春小麥品種Glenlea時(shí)，用500mM甘氨酸甜菜堿處理4天，其生長(zhǎng)速率降低約75％。
本發(fā)明的另一方面是一種抑制植物生長(zhǎng)的方法，其中包含用高劑量方式的甜菜堿及其衍生物處理所述植物的步驟，所用劑量甚至可起到除草作用。
本發(fā)明的另一方面是一種在高于約0℃且不低于所述植物種子能夠耐受的最低溫度的溫度下改善所述植物種子發(fā)芽率的方法，其包括對(duì)所述種子施用有效劑量的甜菜堿或其衍生物并使所述種子在所述溫度下發(fā)芽的步驟。發(fā)明描述以下通過(guò)具體實(shí)施方案及附圖描述本發(fā)明，其目的在于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述而非對(duì)其范圍進(jìn)行界定。附圖簡(jiǎn)述


圖1a)和b)。甜菜堿對(duì)栽培品種Glenlea FT的影響。
采用Perras和Sarhan所描述的再生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)(25)測(cè)量植物的存活率。
圖1a)-8℃冷凍后測(cè)得的存活率。
圖1b)通過(guò)不同溫度下冷凍不同樣本所得出的LT50。
NA，12天齡的未馴化對(duì)照植物；100，250和500指25℃下分別用100，250和500mM甜菜堿處理4天的植物；CA，6/2℃下低溫馴化30天的植物；CA100和CA250，分別為在100和250mM甜菜堿存在下于6/2℃下低溫馴化30天的植物。標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過(guò)±10％。
圖2a)和b)。甜菜堿對(duì)栽培品種Glenlea LT50的影響。
圖2a)-8℃下進(jìn)行的冷凍實(shí)驗(yàn)。
圖2b)-13℃下進(jìn)行的冷凍實(shí)驗(yàn)。
NA，12天齡的未馴化對(duì)照植物；250指用250mM甜菜堿處理4天的植物；CA，6/2℃下低溫馴化30天的植物；CA250為在250mM甜菜堿存在下于6/2℃下低溫馴化30天。
圖3，在春小麥栽培品種Glenlea中，相應(yīng)于不同甜菜堿濃度的WCOR410蛋白的累積量。
采用SDS-PAGE分離總蛋白(5μg)，轉(zhuǎn)移到一個(gè)硝化纖維膜上并用抗WCOR410抗體探測(cè)。NA，12天齡的未馴化對(duì)照植物；100、250和500指分別用100。250和500mM甜菜堿處理4天的植物；CA，低溫馴化的植物。
圖4a)，采用200mM甜菜堿游離堿水溶液按1L/m2在秋天每周處理一次，共處理三次的高爾夫球場(chǎng)草坪。對(duì)照區(qū)域僅噴水。圖中顯示第二年的早春在未處理的區(qū)域和甜菜堿處理的區(qū)域中草坪再生長(zhǎng)的情況。其上部為處理區(qū)域。注意在甜菜堿處理區(qū)域草坪再生長(zhǎng)和變綠迅速。這一結(jié)果反映出甜菜堿處理的草坪更好和更健康地過(guò)冬。
圖4b)，甜菜堿處理區(qū)域(上部)和未處理區(qū)域(底部)的近視圖。圖5a)和b)。反映甜菜堿對(duì)過(guò)冬和早春再生長(zhǎng)的影響的另一實(shí)施例。甜菜堿處理法與圖4中相同，但在使用時(shí)間更早的初秋進(jìn)行處理。兩區(qū)域在相同時(shí)間通氣。注意甜菜堿處理區(qū)域草坪密度更高。
圖5a)，甜菜堿處理過(guò)的區(qū)域。
圖5b)，噴水的對(duì)照區(qū)域。
甜菜堿指氮原子被完全或部分甲基化的氨基酸。甜菜堿是存在于植物和動(dòng)物體內(nèi)的天然產(chǎn)物，其可能的功能是作為一種滲壓劑調(diào)節(jié)劑，用于保護(hù)細(xì)胞免受滲透壓的損害。甜菜堿的基本結(jié)構(gòu)式為(CH3)x-N+-(CH2)y-COO-其中x可為1，優(yōu)選為2(對(duì)于環(huán)狀甜菜堿)，或者x為3(對(duì)于直鏈甜菜堿)，y至少為1。最常見(jiàn)的甜菜堿是甘氨酸衍生物，其中有三個(gè)甲基連在甘氨酸分子的氮原子上。表1列出了一些其它已知的甜菜堿類(lèi)，其中有一些可以買(mǎi)到
<p>采用兩種抗凍能力(FT)不同的小麥栽培品種，考查內(nèi)源性甜菜堿在低溫馴化中的作用。此外還進(jìn)行了單獨(dú)使用外源性甜菜堿對(duì)FT影響作用的研究，和低溫馴化聯(lián)合還進(jìn)行了其對(duì)與低溫有關(guān)的基因的表達(dá)和對(duì)光合作用活性的影響的研究。
為確定是否甜菜堿累積與FT增加相關(guān)，測(cè)量?jī)煞NFT不同的小麥品種中甜菜堿的含量(栽培品種Glenlea，LT50(50％植物致死溫度)為-8℃和栽培品種Fredrick，LT50為-17℃)。在這兩個(gè)栽培品種中，在非馴化的溫度24/20℃下生長(zhǎng)時(shí)甜菜堿含量降低，而在6/2℃的低溫馴化條件下生長(zhǎng)時(shí)甜菜堿含量增高。在低溫馴化前，抗凍能力強(qiáng)的栽培品種Fredrick中甜菜堿的基本含量要高30％(Fredrick中8.5μmol/g FW而Glenlea中6.5μmol/gFW)。在馴化期結(jié)束時(shí)(此時(shí)達(dá)到最大LT50)栽培品種Fredrick已積累了21.3μmol/gFW的甜菜堿，而栽培品種Glenlea為15.3μmol/gFW。以干重為計(jì)，栽培品種Fredrick已積累106.5μmol/g DW，而栽培品種Glenlea為82.7μmol/g DW。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甜菜堿含量的增加與這兩個(gè)栽培品種FT增加相關(guān)。在不同大麥栽培品種中也有類(lèi)似的與FT相關(guān)聯(lián)的甜菜堿的增加(11)。如果我們計(jì)算甜菜堿對(duì)細(xì)胞總重量摩爾滲透壓濃度(osmolality)的貢獻(xiàn)值，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)30天的低溫馴化后，甜菜堿對(duì)Glenlea和Fredrick的重量摩爾滲透壓濃度的貢獻(xiàn)僅分別為3.6％和4.5％。這一結(jié)果說(shuō)明甜菜堿的對(duì)總重量摩爾滲透壓濃度的貢獻(xiàn)非常低。但如Wyn Jones等人所建議的那樣(12)，這樣低的濃度需區(qū)域化方能作為滲透保護(hù)劑(osmoprotectant)而起重要作用。Matho等人(13)進(jìn)行的研究已經(jīng)表明，在菠菜葉細(xì)胞的液胞中不存在甜菜堿，它主要分布于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中。當(dāng)植物處于鹽堿作用下時(shí)，據(jù)估計(jì)在菠菜(14)和Sueda(8)葉綠體中甜菜堿的濃度可達(dá)300mM。這一濃度要比葉中甜菜堿的平均濃度約高20倍。甜菜堿在小麥中的分布尚未被確定，但如果我們假設(shè)低溫馴化時(shí)葉綠體中存在相同的濃度因子，甜菜堿的實(shí)際濃度可能非常大。由于我們估計(jì)在低溫馴化的Fredrick中甜菜堿僅供獻(xiàn)4.5％的重量摩爾滲透壓濃度，在葉綠體中濃度高20倍意味著甜菜堿貢獻(xiàn)了約90％的葉綠體的重量摩爾滲透壓濃度(或621mOsm)。這一濃度可能對(duì)葉綠體功能造成很大沖擊，因?yàn)轶w外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明甜菜堿可增加光合體系II(SPII；(5))的熱穩(wěn)定性并可抵制NaCl的抑制作用(9)。Krall等(16)已經(jīng)證明甜菜堿可穩(wěn)定磷酸烯酮丙酮酸羧化酶的活性四聚體形式，而該酶暴露于低溫之下一般形成無(wú)活性的二聚體形式。甜菜堿在葉綠體中的累積可能是一種重要的因素，它對(duì)低溫下葉綠體功能的維持起重要作用。值得注意的是耐寒的谷物如黑麥，小麥和大麥與敏感物種如水稻、稷和高梁相比，其基礎(chǔ)甜菜堿濃度要更高(11)。
為確定外源性甜菜堿是否對(duì)FT和低溫下光合作用的改善起作用，我們首先評(píng)價(jià)了植物累積甜菜堿的能力。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)?00mM甜菜堿中培養(yǎng)植物并測(cè)定不同時(shí)期葉子的重量摩爾滲透壓濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重量摩爾滲透壓濃度在最初兩天迅速增加，但以后穩(wěn)定下來(lái)(結(jié)果未給出)。我們采用不同濃度甜菜堿重復(fù)該實(shí)驗(yàn)并定量測(cè)定四天后葉子中累積的甜菜堿的量。采用(17)中的方法從1g葉組織中提取甜菜堿。采用Lerma等人的方法(18)進(jìn)行定量分析。為準(zhǔn)確進(jìn)行測(cè)量，在萃取操作前加入一種內(nèi)標(biāo)物?？紤]到各樣品中的組織水含量(平均含水82％)，將甜菜堿含量表達(dá)成mOsm/Kg H2O。采用研缽和研杵研磨的葉組織測(cè)量重量摩爾滲透壓濃度。于4℃在12,000g下將所得液體離心10min。采用寬范圍滲壓計(jì)(Wide Range Osmometer)測(cè)量上清液的滲透度。我們發(fā)現(xiàn)在所采用的所有濃度下甜菜堿均有效累積。當(dāng)暴露在濃度為118至590mM(100至500mM)的甜菜堿中時(shí)，累積的甜菜堿(用mOsm/Kg H2O表示)相當(dāng)于62％的外加甜菜堿。在更高濃度下甜菜堿可累積更多，但在500mM時(shí)葉尖部已明顯出現(xiàn)萎黃病。當(dāng)使用更高濃度甜菜堿時(shí)萎黃病則更為嚴(yán)重。
與外源性甜菜堿用量成正比，甜菜堿累積降低了生長(zhǎng)速率。在所用最高濃度下，與對(duì)照植物相比，培養(yǎng)4天后生長(zhǎng)速率下降75％。與未馴化的對(duì)照植化相比(
圖1A)，生長(zhǎng)速率下降以及更為重要的甜菜堿細(xì)胞含量增加顯著提高了冷凍后的存活率。令人感興趣的是兩個(gè)栽培品種均可被甜菜堿所保護(hù)，但對(duì)于更抗凍的栽培品種在所有所用濃度下用甜菜堿所獲得的保護(hù)僅有很小的優(yōu)勢(shì)(未顯示)。甚至使用較低濃度的甜菜堿就可改善植物的存活率。在100mM，與未處理植物相比存活率改善5至6倍(
圖1A)。僅使用250mM的甜菜堿處理就足以使春小麥栽培品種Glenlea的FT從-3℃增至-8℃。4周低溫馴化后也可使該栽培品種獲得這一最大FT值(
圖1B)。將甜菜堿濃度增至更高使存活率又略有提高(500mM甜菜堿時(shí)存活率為55％；
圖1A)，但由于更高濃度甜菜堿所造成的毒性使得在其他實(shí)驗(yàn)中取消了后一種濃度。針對(duì)置于低溫馴化條件下抗凍能力較低的栽培品種Glenlea，我們已研究了是否在低溫馴化期間用甜菜堿處理可改善FT。
圖1A和1B顯示與未經(jīng)甜菜堿處理的低溫馴化植物相比，在低溫馴化期間用甜菜堿處理可大大改善植物的存活率。圖2顯示針對(duì)25℃下用甜菜堿處理或低溫馴化的植物的一個(gè)典型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。25℃下甜菜堿處理4天使植物L(fēng)T50達(dá)-8℃(通常該栽培品種所能達(dá)到的最大LT50)，而對(duì)于低溫馴化期間用甜菜堿處理的植物，-13℃對(duì)其影響不大(
圖1B所示其平均LT50估計(jì)為-14℃)。這些結(jié)果表明在暴露于甜菜堿的對(duì)照植物中所觀察到的FT改善可加和至低溫馴化的植物中。這一發(fā)現(xiàn)非常重要，因?yàn)檫@是第一次發(fā)現(xiàn)通常植物本身所固有的抗凍潛能被改善得如此之大。我們也評(píng)價(jià)了甜菜堿對(duì)改善大麥FT的能力，其中也發(fā)現(xiàn)低溫馴化時(shí)發(fā)生甜菜堿累積，并且發(fā)現(xiàn)低溫和甜菜堿聯(lián)合處理時(shí)，與小麥相似也能有效改善該物種的FT。
因此耐寒或抗凍能力的改善有望在幾乎所有的植物中觀察到，特別是禾本科或禾本科干草，更具體而言是谷類(lèi)如水稻，玉米，黑麥，小麥，大麥和燕麥。以下設(shè)置造成這種改善的條件。植物被在可耐受的最低溫度下馴化。在該低溫馴化之前、其間或末期施用甜菜堿。采用實(shí)驗(yàn)植物確定造成毒性的甜菜堿的劑量，以避免去評(píng)價(jià)對(duì)植物造成不可接受損害的劑量。我們希望甚至是對(duì)冷凍非常敏感的熱帶植物也可從這種聯(lián)合處理法中受益。
以外，由于植物生長(zhǎng)速率降至對(duì)照植物的25％，很明顯，如果在低溫馴化的末期施用甜菜堿(在場(chǎng)地中，這意味著在獲得最大生長(zhǎng)速率的秋天)這種作用可能不會(huì)損害植物。此外，該專(zhuān)利也可有利地用于生長(zhǎng)期的開(kāi)始或其間，用以降低多種植物的生長(zhǎng)速率。因此可將其作為一種生長(zhǎng)抑制劑而用于幾種農(nóng)藝操作中。在高爾夫球場(chǎng)上可找到一個(gè)特別有用的應(yīng)用，用于降低維護(hù)成本(這可降低一季中剪草的次數(shù))。在較高毒性或致死劑量下，甜菜堿甚至可作為除草劑進(jìn)行使用，用于抑制不需要的植物的生長(zhǎng)或?qū)⑺鼈儦⑺馈?br> 采用其它滲壓劑如NaCl或甘露醇可使?jié)B透度與甜菜堿處理增加得一樣高。但采用這些滲壓劑并不能明顯改善FT，說(shuō)明甜菜堿特異性地改善了FT。這些結(jié)果說(shuō)明LT50提高了6℃并不能僅用甜菜堿的滲壓劑作用來(lái)解釋(在250mM濃度下甜菜堿可使水的冰點(diǎn)下降0.32℃)。因此我們考查了甜菜堿是否可誘導(dǎo)多個(gè)已知與FT改善有關(guān)的基因。利用特殊的抗體和免疫印跡分析，我們考查了由低溫誘導(dǎo)的三種蛋白的表達(dá)，并利用諾慎分析法考查了其它三種低溫誘導(dǎo)的基因的表達(dá)。我們的結(jié)果顯示當(dāng)植物暴露于不同量的甜菜堿時(shí)，蛋白WCOR410(基因庫(kù)登記編號(hào)L29152)以濃度依賴(lài)的方式累積(圖3)。當(dāng)我們檢查WCS120(基因庫(kù)登記編號(hào)M93342)蛋白族或WCS19(基因庫(kù)登記編號(hào)L13437)蛋白的表達(dá)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)接觸甜菜堿后這些蛋白不累積(未顯示)。由于已知這兩個(gè)基因特異性地被低溫誘導(dǎo)而基因WCOR410可被低溫，鹽，和缺水誘導(dǎo)(19)，我們檢查了其它被干旱或鹽誘導(dǎo)的基因也可被甜菜堿誘導(dǎo)的可能性?；騑COR80(基因庫(kù)登記編號(hào)U73212)，WCOR413(基因庫(kù)登記編號(hào)U73216)，和WCOR825(基因庫(kù)登記編號(hào)U73215)僅略微受甜菜堿的誘導(dǎo)(未作顯示)。這些結(jié)果說(shuō)明WCOR410基因因接觸甜菜堿而特異性地誘導(dǎo)至高水平，并可作為FT改善的一個(gè)主要原因，其對(duì)FT的改善程度要優(yōu)于甜菜堿僅作為滲壓劑而能達(dá)到的FT改善水平。已發(fā)現(xiàn)WCOR410蛋白與質(zhì)膜有關(guān)。這是在維管組織的膜部分上豐度最高的蛋白(20)，對(duì)小麥來(lái)說(shuō)，維管組織是秧苗中已知的對(duì)冷凍最為敏感的區(qū)域(21)。
體外實(shí)驗(yàn)顯示甜菜堿可防護(hù)冷凍對(duì)類(lèi)囊體膜的影響(22)。而且在缺乏甘氨酸甜菜堿的玉米譜系中，高溫降低膜的穩(wěn)定性和抵抗光抑制的能力，同時(shí)也降低PSII電子傳遞的穩(wěn)定率(23)。這些結(jié)果說(shuō)明在低溫和高溫下甜菜堿可賦予更大的膜穩(wěn)定性。它也能在體外防止鹽對(duì)光合體系II的影響。由于甜菜堿一般在葉綠體中合成，如(8，14)中所建議的那樣它可能在這一細(xì)胞器中累積到較高的濃度。因此，我們?cè)u(píng)價(jià)了外源性使用甜菜堿對(duì)光抑制降低及氧排出的影響。
在生長(zhǎng)旺盛條件下的穩(wěn)定態(tài)光合作用中，與未經(jīng)處理的對(duì)照相比，春小麥和冬小麥暴露于250mM甜菜堿之下導(dǎo)致qP水平和PSII電子傳遞率(φe)有一個(gè)小的但是穩(wěn)定的增長(zhǎng)。因此，與未經(jīng)處理的對(duì)照相比，甜菜堿處理的春小麥和冬小麥秧苗顯示更強(qiáng)的防止PSII反應(yīng)中心被還原的能力。在甜菜堿處理的秧苗中，這一保持PSII反應(yīng)中心為氧化態(tài)的能力的加強(qiáng)與低溫(5℃)對(duì)光抑制(按24中的方法測(cè)量)影響力的下降相關(guān)。置于強(qiáng)光下(5℃ 2小時(shí)，1600μmolm-2·s-1)的經(jīng)250mM甜菜堿處理的植物的Fv/Fm是無(wú)光抑制對(duì)照植物的84±4％，而與之相比未經(jīng)甜菜堿處理的植物為72±2％。甜菜堿對(duì)光合作用機(jī)制的作用可改善植物在低溫下的生理狀態(tài)和功能，因此使植物更有效地利用可用能量來(lái)提高FT。
在初秋應(yīng)用甜菜堿可改善高爾夫球場(chǎng)草坪的性能進(jìn)而增加了越冬成活率。甜菜堿處理的草在春天再生長(zhǎng)迅速，說(shuō)明越冬存活率更高而且在春天有再生長(zhǎng)速率較高的更健康的植物。
基于以上結(jié)果和WO95/35022中的部分經(jīng)驗(yàn)，預(yù)計(jì)低溫下植物種子的發(fā)芽率也可得以改善。該方法將包含對(duì)種子施用有效量的甜菜堿或其衍生物并使其在低溫下發(fā)芽的步驟。所述低溫應(yīng)高于0℃但不低于植物種子能耐受的最低溫度。
從這些觀察中可得出的一個(gè)重要結(jié)論是僅使用與該多基因性狀相關(guān)的一個(gè)或兩個(gè)主要基因(如Wcor410)就有可能增加FT。因此使植物這一基因轉(zhuǎn)化有可能增加冷凍敏感物種的FT。此外，我們的結(jié)果表明通過(guò)過(guò)度表達(dá)與FT過(guò)程相關(guān)的最重要的基因，可以使也具有一定程度FT的植物的FT按加和的方式得以改善。例如，在低溫啟動(dòng)子下過(guò)度表達(dá)甜菜堿脫氫酶和膽堿單氧酶可使甜菜堿在此時(shí)累積，從而有助于植物對(duì)抗霜凍。這種產(chǎn)生甜菜堿的作法對(duì)以前所建議的抗旱保護(hù)和本專(zhuān)利所述的FT的改善都造成大的農(nóng)藝學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)沖擊。此外本專(zhuān)利的結(jié)果也表明，在預(yù)計(jì)的霜凍或溫度突然下降前，可以采用外源性甜菜堿在短期內(nèi)增加冷凍敏感植物對(duì)低溫的抵抗力。
以上已詳細(xì)描述了本發(fā)明，很明顯在不背離本發(fā)明的精神及上述經(jīng)驗(yàn)的前題下可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)。這些改進(jìn)也處于所附權(quán)利要求所規(guī)定的范圍之內(nèi)。
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以下界定具有排他所有權(quán)或特權(quán)的本發(fā)明的實(shí)施方案。
權(quán)利要求
1.一種提高植物耐寒或抗凍能力的方法，包括步驟—在高于0℃但不低于所述植物能耐受的最低溫度的溫度下馴化所述植物，其時(shí)間應(yīng)足以對(duì)所述植物誘導(dǎo)出最佳的耐寒或抗凍能力，和—向所述植物施用包含甜菜堿或其衍生物的組合物，其施用劑量應(yīng)足以對(duì)所述植物誘導(dǎo)出相同或不同的最佳耐寒或抗凍能力；合并低溫馴化和施用甜菜堿或其衍生物的步驟使所述植物的耐寒或抗凍能力比由單個(gè)步驟所誘導(dǎo)的最佳耐寒或抗凍能力更高。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述劑量對(duì)所述的植物無(wú)毒。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述植物選自禾本科植物和禾本科干草。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述禾本科植物為大麥和小麥。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述低溫馴化的時(shí)間約為4周。
6.如權(quán)利要求1至4之一所述的方法，其中甜菜堿衍生物為甘氨酸甜菜堿。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中甜菜堿衍生物為甘氨酸甜菜堿。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的施用劑量是使所述的植物在有濃度低于約500mM的甘氨酸甜菜堿的溶液的存在下生長(zhǎng)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述濃度約為250mM。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述植物為春小麥品種Glenlea，其最佳抗凍能力以致使50％植物群體死亡的溫度(LT50)來(lái)表示約為-8℃。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述抗凍能力增加約6℃而達(dá)到-14℃的LT50。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中由所述各步驟單獨(dú)或聯(lián)合采用時(shí)所誘導(dǎo)出的最佳抗凍能力至少部分是因基因Wcor410表達(dá)增多所致。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中還導(dǎo)致了對(duì)所述植物在低溫下的光合作用能力和整體生理機(jī)能的改善。
14.一種至少降低植物生長(zhǎng)速率30％、由此具有生長(zhǎng)抑制作用的方法，包括采用有效的施用劑量但不使所述植物致死的、含有甜菜堿或其衍生物的組合物處理所述植物的步驟。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述甜菜堿或其衍生物的施用劑量為對(duì)所述植物無(wú)毒。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述植物為高爾夫球場(chǎng)草。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述植物為春小麥品種Glenlea。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中施用劑量是在500mM的甘氨酸甜菜堿存在下使所述植物生長(zhǎng)4天，以導(dǎo)致生長(zhǎng)速率降低約75％。
19.一種殺滅植物的方法，其中包含采用具有除草作用的致死劑量的、含有甜菜堿或其衍生物的組合物處理所述植物的步驟。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述植物為雙子葉植物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述植物選自蒲公英，canola，紫花苜蓿，草莓和煙葉。
22.一種在高于0℃但不低于植物種子能耐受的最低溫度的溫度下刺激和改善所述植物種子發(fā)芽率的方法，包括對(duì)所述種子施以有效施用劑量的含有甜菜堿或其衍生物的組合物，并使所述種子在所述溫度下發(fā)芽的步驟。
23.一種改善植物對(duì)抗非生物逆境的方法，其中包含施用含有有效量甜菜堿或其衍生物的組合物的步驟。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述逆境包括干旱，鹽堿和低溫和冷凍溫度。
全文摘要
滲壓劑——甘氨酸甜菜堿的累積與小麥抗凍能力(FT)的增加有關(guān)。室溫下使用外源性甜菜堿使FT增加5℃以上。受處理的植物表現(xiàn)出一些低溫馴化植物的特征并表達(dá)一種響應(yīng)低溫的基因Wcor410,該基因編碼了一種主要的與蛋白有關(guān)的膜。將接觸低溫和甜菜堿結(jié)合起來(lái)可加和性地改善FT,其改善程度要大于植物本身抵抗霜凍的潛能。這一重要發(fā)現(xiàn)表明在預(yù)計(jì)的霜凍前,可以施用外源性甜菜堿而大大改善冷凍敏感植物的耐寒和抗凍能力。還公開(kāi)了一種至少降低植物生長(zhǎng)速率30%的方法,包括采用有效且不致死、優(yōu)選對(duì)所述植物無(wú)毒的甜菜堿或其衍生物的施用劑量,對(duì)所述植物進(jìn)行處理的步驟。當(dāng)在有500mM的甘氨酸甜菜堿存在下使春小麥變種Glenles生長(zhǎng)4天的情況下,其生長(zhǎng)速率降低約75%。本發(fā)明的另一方面是抑制植物生長(zhǎng)的方法,其中包含用高劑量的甜菜堿或其衍生物處理所述植物的步驟。在致死劑量下,該方法導(dǎo)致殺滅不需要的植物。本發(fā)明的另一方面是在高于0℃且不低于植物種子能耐受的最低溫度的溫度下改善所述植物種子發(fā)芽率的方法,包括對(duì)所述種子施以有效施用劑量的甜菜堿或其衍生物,并使所述種子在所述溫度下發(fā)芽的步驟。
文檔編號(hào)A01N37/44GK1275051SQ98808823
公開(kāi)日2000年11月29日 申請(qǐng)日期1998年7月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月3日
發(fā)明者弗朗斯·阿拉德, 法瑟·薩爾汗, 馬里奧·霍德 申請(qǐng)人:魁北克大學(xué)蒙特利爾分校