專利名稱：羊“試管內(nèi)”雜交育種技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物工程技術，特別涉及動物的繁殖方法。
“試管家畜”技術，也叫家畜體外受精技術(In Vitro Fertilization,IVF)，是指通過人工操作使家畜的卵子和精子在體外條件下成熟和受精，并能夠發(fā)育為早期胚胎的技術。這項技術在家畜最早取得成功的是在1982年，美國的Brackett等(Bio.Reprod.,27:147-158)用高滲溶液處理牛精子，得到了世界首例體外受精的小牛。但他們所采用的精子獲能方法重復性很差，包括他們自己也未能得到重復的結(jié)果。1984年本專利申請者(旭日干)和日本學者花田章，首次利用鈣離子載體Ionophore A23187和咖啡因等化學藥物誘導山羊、綿羊及牛精子獲能均獲得成功，并利用此方法培育出世界首胎體外受精山羊(Bull Nippon Vet.and Zootech.Coll.,33:219-221)。后來這一方法在日本、英國、美國、中國和俄羅斯等多國的實驗室，在綿羊、牛和豬等多種家畜的實驗中取得成功，并在此基礎上逐步發(fā)展成為比較成熟的，可開發(fā)利用的生物高技術。
申請者自1987年起主持國家“863”高技術計劃項目“牛體外受精技術的研究與開發(fā)”，經(jīng)過“七五”基礎研究、“八五”應用研究和“九五”中試開發(fā)研究取得了重大進展。于1989年培育出了國內(nèi)首胎、首批“試管綿羊”(1989，內(nèi)蒙古大學學報，20:564-569)和“試管?！?1990，中國科學通報，21:1666-1667)。同時創(chuàng)造性地提出了利用屠宰家畜卵巢卵母細胞工廠化生產(chǎn)“試管胚胎”的技術路線，提出了牛體外受精技術產(chǎn)業(yè)化工藝流程，提出了利用羔羊卵子進行“試管內(nèi)雜交育種”的新概念，新技術。
本發(fā)明的目的是利用″試管內(nèi)雜交育種″的新概念、新技術，在綿、山羊可以在生殖細胞水平上進行品種間雜交，從而快速、低成本培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)新品種，并且培育新品種的周期比起常規(guī)育種要縮短1/2以上。
本發(fā)明的內(nèi)容目前在家畜育種中大多仍采用傳統(tǒng)的育種技術。這種技術最大的缺點就是育種周期長，往往需要十幾年、甚至幾十年的時間。我們利用幼齡母畜可以獲得很好的超數(shù)排卵效果的特點，將體外受精技術應用于羊的育種，縮短育種周期，這種研究方法目前在世界上尚無報道。
(1)對2-3月齡母羔羊利用FSH-LH進行超數(shù)排卵處理，用手術方法從卵巢表面回收卵母細胞。羔羊超排處理后，每只羔羊可以獲得50枚以上的卵子，充分發(fā)揮了母羊的繁殖潛力，而且對該母羊成年后的繁殖能力沒有任何損傷。
(2)將回收的卵母細胞在體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)成熟后，用其他品種的種公羊精子進行體外受精。
(3)將體外受精卵在體外發(fā)育培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)至2-細胞-囊胚期胚胎，移入受體母羊輸卵管或子宮內(nèi)。
(4)受體羊妊娠、產(chǎn)羔后獲得雜交F1代羔羊。
(5)F1代母羔羊2-3月齡后再次利用超數(shù)排卵的方法獲得卵母細胞，用于與其父本相同品系的公羊精子進行體外受精。
(6)經(jīng)體外受精后又可獲得體外受精胚胎。
(7)將體外受精胚胎移入受體羊子宮內(nèi)，經(jīng)妊娠后獲得F2代羔羊。
(8)F2代母羔羊2-3月齡后，經(jīng)超數(shù)排卵處理回收卵母細胞，再次進行體外受精。
(9)體外受精后得到的胚胎又可用于胚胎移植。
(10)經(jīng)胚胎移植后可以獲得F3代羔羊。F3代羔羊通過橫交的方法固定其遺傳性狀，達到遺傳育種的目的。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果1．采用“試管內(nèi)”雜交育種工藝對羊進行育種可以極大地縮短育種周期。目前在羊的常規(guī)育種方法中，子代母羊通常2歲后才可以用于育種，因此育種周期十分長，培育出一個品種往往需要十幾年，甚至幾十年的時間。采用本工藝，子代母羊2-3個月即可用于育種，這樣就極大地縮短了育種過程中的世代間隔。在羔羊卵巢卵母細胞體外受精技術中，對羔羊進行超數(shù)排卵處理后，可以回收到50枚以上的卵母細胞，這一數(shù)量遠高于成年母羊10枚左右卵母細胞的超排效果，而且對羔羊成年后的生育能力無任何損傷。這一結(jié)果不但提前了母羊的繁殖時間，而且極大地提高了母羊的繁殖潛能，使卵巢卵母細胞得到了充分的利用，為育種過程提供了更為充分的遺傳資源。卵巢卵母細胞經(jīng)體外培養(yǎng)成熟、體外受精處理后，50％以上的卵子可以發(fā)育為可供胚胎移植的2-4細胞期胚胎，其中25％的胚胎經(jīng)移植后可妊娠產(chǎn)羔，這些研究結(jié)果為這一技術的應用提供了技術上的保證。
2．采用“式管內(nèi)”雜交育種工藝對羊進行育種可以降低育種成本。采用本工藝后顯著縮短了羊的世代間隔，使用于育種羊的飼養(yǎng)管理時間大大縮短，從而明顯地降低了育種過程的飼養(yǎng)管理費用。同時由于本工藝在縮短育種時間的同時又可顯著增加子代羔羊的數(shù)量，可以為育種過程提供更為充足的遺傳資源，從而避免了育種過程中子代羔羊數(shù)量不足的情況，否則還需投入大量的人力、物力和財力進行人工繁育，既增加了育種成本，又進一步延長了育種時間。
綜上所述，采用“試管內(nèi)”雜交育種工藝這一新的技術方法對羊進行育種是一種省時、省力、效果好的有效途徑。
附圖
為本發(fā)明的工藝流程圖。
實施例本實施例在內(nèi)蒙古自治區(qū)伊克昭盟恩格貝種羊場進行，對內(nèi)蒙古絨山羊進行雜交育種。選擇羊絨質(zhì)量好，但產(chǎn)絨量較低的阿爾巴斯絨山羊作為母本；選擇羊絨質(zhì)量一般，但產(chǎn)絨量較高的蓋縣絨山羊為父本。育種目的是培育出產(chǎn)絨量高、羊絨品質(zhì)好的新絨山羊品種。
對成年阿爾巴斯母羊用FSH+LH進行超數(shù)排卵處理，發(fā)情后用蓋縣公羊精液進行人工授精。人工授精后70小時左右采用手術方法從母羊輸卵管內(nèi)回收2~8細胞期胚胎，然后將這些胚胎移入同步發(fā)情的受體母羊輸卵管內(nèi)。受體母羊經(jīng)妊娠后即可產(chǎn)下數(shù)量較多的F1代羔羊。
對2-3月齡的F1代母羔羊利用FSH+LH的方法進行超數(shù)排卵，在LH注射后15-24小時采用手術方法回收卵母細胞。采卵液為PBS+BSA+10iu/ml肝素，用注射器從卵巢表面發(fā)育卵泡中吸取卵母細胞。將回收到的帶有完整卵丘細胞的卵母細胞培養(yǎng)于39℃,5％CO2的培養(yǎng)箱中，成熟培養(yǎng)液為TCM199+HCG+FCS+E2，成熟培養(yǎng)時間為20小時。將采自蓋縣公羊的新鮮精液用BO+2mM咖啡因的培養(yǎng)液離心洗滌兩次，然后用0.5μM Ionophore A23187處理1分鐘，加入含有卵母細胞的授精小滴中進行體外受精處理。授精處理后6-8小時將卵子移入發(fā)育培養(yǎng)系統(tǒng)中繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)育培養(yǎng)液為M199+FCS+丙酮酸鈉。將體外發(fā)育至2-8細胞期的胚胎移入受體羊輸卵管內(nèi)，受體母羊的經(jīng)妊娠后產(chǎn)下F2代羔羊。
將2-3月齡的F2代母羔羊按上述方法再次進行體外受精處理，獲得體外受精胚胎后移入受體母羊輸卵管內(nèi)，經(jīng)妊娠后產(chǎn)下F3代羔羊。
F3代羔羊發(fā)育至成年期后(2歲)，即可進行橫交以固定其遺傳特性，達到育種的初步目的。
權利要求
1.羊試管內(nèi)雜交育種技術，其特征是采取下列步驟；(1)對2-3月齡母羔羊利用FSH-LH進行超數(shù)排卵處理，用手術方法從卵巢表面回收卵母細胞，羔羊超排處理后，每只羔羊可以獲得50枚以上的卵子；(2)將回收的卵母細胞在體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)成熟后，用其他品種的種公羊精子進行體外受精；(3)將體外受精卵在體外發(fā)育培養(yǎng)性系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)至2-細胞-囊胚期胚胎，移入受體羊輸卵管或子宮內(nèi)；(4)受體羊妊娠、產(chǎn)羔后獲得雜交F1代羔羊；(5)F1代母羔羊2-3月齡后再次利用超數(shù)排卵的方法獲得卵母細胞，用于與其父本相同品系的公羊精子進行體外受精；(6)經(jīng)體外受精后又可獲得體外受精胚胎；(7)將體外受精胚胎移入受體羊子宮內(nèi)，經(jīng)妊娠后獲得F2代羔羊；(8)F2代母羔羊2-3月齡后經(jīng)超數(shù)排卵處理回收卵母細胞，再次進行體外受精；(9)體外受精后得到的胚胎又可用于胚胎移植；(10)經(jīng)胚胎移殖后可以獲得F3代羔羊；F3代羔羊通過橫交的方法固定其遺傳性狀，達到遺傳育種目的。
2.如權利要求1所述的羊試管內(nèi)雜交育種技術，其特征是步驟1中利用FSH-LH進行超數(shù)排卵，在LH注射后15-24小時采用手術方法回收卵母細胞，采卵液為PBS+BSA+10IU/ml肝素。
3.如權利要求1所述的羊試管內(nèi)雜交育種技術，其特征是步驟2中將回收的卵母細胞培養(yǎng)于39℃、5％CO2的培養(yǎng)液中，成熟培養(yǎng)液為TCM199+HCG+FCS+E2，成熟培養(yǎng)時間為20小時，種公羊精子用BO+2mM咖啡因的培養(yǎng)液離心洗滌兩次，然后用0.5μMIOnophoreA23187處理1分鐘，加入含有卵母細胞的受精小滴中進行體外受精。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術,本發(fā)明利用幼齡母畜超數(shù)排卵處理,用手術方法從卵巢表面回收卵母細胞在體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)然后,用其他品種的種公羊精子進行體外受精,受精卵體外培養(yǎng)后移入受體羊子宮內(nèi),求得F1代雜交羔羊,同樣方法求得F2代羔羊F3代羔羊,通過橫交方法固定遺傳性狀,這種育種方法可縮短育種周期,降低育種成本。
文檔編號A01K67/027GK1226378SQ9910329
公開日1999年8月25日 申請日期1999年4月1日 優(yōu)先權日1999年4月1日
發(fā)明者旭日干 申請人:旭日干