京農(nóng)科728三系配套雜交種制種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種京農(nóng)科728三系配套雜交種制種方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 強優(yōu)勢雜交種的選育和推廣是提高玉米產(chǎn)量的重要途徑。利用常規(guī)的制種方法配 制雜交種需要對母本進(jìn)行人工去雄，不僅耗費大量的勞動力，增加種子生產(chǎn)成本，且存在由 于去雄不及時、不徹底影響種子質(zhì)量的潛在風(fēng)險。利用雄性不育系制種是保證種子純度提 高玉米產(chǎn)量的一種有效方法。
[0003] 早在上世紀(jì)五六十年代，國內(nèi)外就開始了對玉米不育化制種的研宄。細(xì)胞質(zhì)雄性 不育由于容易實現(xiàn)不育系、保持系和恢復(fù)系的配套，是玉米育種中利用的主要類型。細(xì)胞質(zhì) 雄性不育系可劃分為T、S和C型。60年代初，T型不育系引入我國。由于對玉米小斑病"T 小種"專化性侵染，T型不育系的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。70年代，我國育種工作者從國外引進(jìn) C型、S型不育系。C型不育系雖然不育性較穩(wěn)定、徹底，但其恢復(fù)系通常需要重新轉(zhuǎn)育，周 期長且步驟繁瑣，導(dǎo)致該型不育系在實踐中難以普及應(yīng)用。S型不育系是3種類型中最大的 一個組，已有研宄證明昌7-2等黃改系材料是其天然強恢復(fù)系。但S型不育系的育性因基 因型背景的不同而有較大差異，在特定的遺傳背景下育性高度穩(wěn)定。國內(nèi)優(yōu)良玉米雜交種 的父本多屬黃改種質(zhì)，因此充分利用S型不育系可以節(jié)省恢復(fù)系的轉(zhuǎn)育工作，是實現(xiàn)快速 不育化制種研宄和應(yīng)用的有效途徑。
[0004] 實現(xiàn)玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育化制種的關(guān)鍵是不育系、保持系和恢復(fù)系的選育。選育 不育系最常用的方法是回交轉(zhuǎn)育法，即用穩(wěn)定的不育系作非輪回親本，選擇優(yōu)良自交系作 輪回親本，進(jìn)行多代回交，育成不育性穩(wěn)定的優(yōu)良不育自交系，而原輪回親本便是該不育系 的保持系。但僅僅利用傳統(tǒng)的回交轉(zhuǎn)育方法，一般需回交5-6代，轉(zhuǎn)育周期較長，延緩了不 育化制種技術(shù)在玉米雜交種上的應(yīng)用。利用回交轉(zhuǎn)育方法進(jìn)行恢復(fù)系的選育比不育系更為 復(fù)雜，在回交的同時要進(jìn)行測交，以測交結(jié)果作為恢復(fù)系的選擇標(biāo)準(zhǔn)；或在回交轉(zhuǎn)育中利用 不育細(xì)胞質(zhì)提供育性的指標(biāo)性狀。由于選育過程相對繁瑣，在恢復(fù)系尚未育成或只有部分 恢復(fù)性的情況下，須將不育化的雜交種子與正常雜交種種子按適當(dāng)比例摻合使用，這就給 種子生產(chǎn)在技術(shù)和管理上提出了更高的要求。因此，如何加快不育系的選育速度、簡化恢復(fù) 系的選育過程，是目前雄性不育化制種技術(shù)亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種雜交制種的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：以玉米不育系S京MC01為不育系，玉米自交 系京MC01為保持系，玉米自交系京2416為恢復(fù)系，進(jìn)行三系配套制種，得到雜交種京農(nóng)科 728〇
[0007] 上述方法中，所述不育系S京MC01為按照包括如下步驟的方法轉(zhuǎn)育：
[0008] a)玉米不育系S京724做母本，京MC01做父本雜交，得到雄性不育雜交子代F1;
[0009] b)以所述雄性不育雜交子代匕為母本、與京MC01回交，得到雄性不育BCjf群體；
[0010] c)以所述雄性不育代單株為母本、與京MC01繼續(xù)回交，得到雄性不育此2代 群體；
[0011] d)以所述雄性不育BC2代單株為母本、與京MC01繼續(xù)回交，得到京MC01的雄性不 育系。
[0012] 上述方法中，在步驟b)和C)之間，還包括BCi代分子鑒定的步驟，所述BCi代分子 鑒定為利用40對SSR核心引物中在S京724和京MC01間存在差異的11對引物umc2105k3、 phi053k2、bnlg2291k4、bnlg2305k4、umcl545y2、umcll25y3、bnlg240kl、umc2160k3、 umcl936k4、umcl231k4和phi041y6分別對所述雄性不育1^代群體單株進(jìn)行PCR擴增，選 擇與京MC01遺傳相似度在96-97. 5%的單株；
[0013] 所述選擇與京MC01遺傳相似度在96-97. 5%的代單株的方法包括如下步驟： 比對BCjf單株的SSR圖譜和采用同樣的引物擴增京MC01的SSR圖譜，計算遺傳相似度； [0014]所述遺傳相似度計算公式：[1-差異等位基因數(shù)A2X比較總位點數(shù)）]X 100%
[0015] 所述差異等位基因數(shù)為用SSR核心引物擴增得到的所述雄性不育代單株SSR 譜帶帶型與所述京MC01的SSR譜帶帶型不一致的等位基因數(shù)目；所述比較總位點數(shù)為40。
[0016] 在步驟c)和d)之間，還包括BC2代分子鑒定的步驟，所述BC 2代分子鑒定為用引 物A對所述雄性不育BC2R群體單株進(jìn)行PCR擴增，選擇擴增圖譜與用同樣引物A對所述 京MC01進(jìn)行PCR擴增得到的圖譜相同的雄性不育此 2代單株；
[0017]所述引物A為BC2代單株對應(yīng)的母本BCi代與京MC01相比擴增帶型不同的SSR引 物；
[0018] 所述核心引物umc2105k3是由序列表中序列9所示的單鏈DNA分子和序列表中序 列10所示的單鏈DNA分子組成；
[0019] 所述核心引物phi053k2是由序列表中序列11所示的單鏈DNA分子和序列表中序 列12所示的單鏈DNA分子組成；
[0020] 所述核心引物bnlg2291k4是由序列表中序列15所示的單鏈DNA分子和序列表中 序列16所示的單鏈DNA分子組成；
[0021] 所述核心引物bnlg2305k4是由序列表中序列19所示的單鏈DNA分子和序列表中 序列20所示的單鏈DNA分子組成；
[0022] 所述核心引物umcl545y2是由序列表中序列25所示的單鏈DNA分子和序列表中 序列26所示的單鏈DNA分子組成；
[0023] 所述核心引物umcll25y3是由序列表中序列27所示的單鏈DNA分子和序列表中 序列28所示的單鏈DNA分子組成；
[0024] 所述核心引物bnlg240kl是由序列表中序列29所示的單鏈DNA分子和序列表中 序列30所示的單鏈DNA分子組成；
[0025] 所述核心引物umc2160k3是由序列表中序列65所不的單鏈DNA分子和序列表中 序列66所示的單鏈DNA分子組成；
[0026] 所述核心引物umcl936k4是由序列表中序列67所不的單鏈DNA分子和序列表中 序列68所示的單鏈DNA分子組成；
[0027] 所述核心引物umcl231k4是由序列表中序列75所示的單鏈DNA分子和序列表中 序列76所示的單鏈DNA分子組成；
[0028] 所述核心引物phi041y6是由序列表中序列77所示的單鏈DNA分子和序列表中序 列78所示的單鏈DNA分子組成。
[0029] 上述方法中，為了減少工作量，在步驟b)和c)之間的代分子鑒定前還包括Bq 代表型鑒定的步驟，所述代表型鑒定為選取所述雄性不育BC i代群體中表型與京MC01 一致的單株；
[0030] 在步驟C)和d)之間的bc2代分子鑒定前還包括bc2代表型鑒定的步驟，所述bc2 代表型鑒定為選取所述雄性不育BC2代群體中表型與京MC01 -致的BC 2代單株。
[0031] 上述表型與所述玉米京MC01 -致為表型與玉米京MC01完全相同或接近；表型具 體為株高、穗位高、株型、雄穗分枝數(shù)和/或果穗性狀等。
[0032] 上述方法中，所述不育系S京724為按照包括如下步驟的方法選育：以玉米S型細(xì) 胞質(zhì)雄性不育系MD32 CGMCC No. 8657為供體、玉米自交系京724為受體，進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，得 到京724的雄性不育系S京724。
[0033] 上述方法中，所述回交次數(shù)為3次。
[0034] 上述方法中，所述回交轉(zhuǎn)育包括如下步驟：
[0035] 1)以玉米雄性不育系MD32 CGMCC No. 8657為供體、玉米自交系京724為受體，雜 交，得到雄性不育雜交子代F1;
[0036] 2)以雄性不育雜交子代匕為母本與京724回交，得到雄性不育BC群體；
[0037] 3)以雄性不育代單株為母本與京724繼續(xù)回交，得到雄性不育此2代群體；
[0038] 4)以雄性不育BC2代單株為母本與京724繼續(xù)回交，得到京724的雄性不育系S 京 724。
[0039] 上述方法