一種提高煙草漂浮育苗種子發(fā)芽率和壯苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于煙草漂浮育苗領(lǐng)域和微生物應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及用植物根內(nèi)生真菌印 度梨形孢的菌體及其釋放在培養(yǎng)濾液中的物質(zhì)提高煙草漂浮育苗種子發(fā)芽率和壯苗的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前煙草集約化生產(chǎn)以育苗移栽為主，煙草集約化育苗以漂浮育苗為主。全國大 部分煙區(qū)集約化育苗期的氣溫低，導(dǎo)致種子發(fā)芽時間長，發(fā)芽率低。漂浮育苗時，煙苗密度 大，根系需氧量多，而育苗池中的營養(yǎng)液液面被聚苯乙烯格盤覆蓋，液面與空氣接觸面小， 營養(yǎng)液中的溶氧量小，對生長在水飽和基質(zhì)中的根系供氧不足，易使煙苗根系受低氧脅迫 而活力低，導(dǎo)致煙苗長勢弱，不夠健壯。漂浮成苗的煙草根系為水生根，移栽后要轉(zhuǎn)化為旱 生根，在轉(zhuǎn)化期間對干旱敏感。而且，我國大部分煙區(qū)在煙苗移栽時正值旱季，水分供應(yīng)和 煙苗的抗旱能力是煙苗移栽存活和煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的重要限制因素。煙苗根系發(fā)達(dá)、地上 苗健壯是煙苗移栽存活的關(guān)鍵因素。設(shè)法提高種子發(fā)芽率，培育根系發(fā)達(dá)的壯苗，是提高煙 草集約化生產(chǎn)效率的重要手段。
[0003]從枝菌根真菌能與80%以上的陸生植物共生，通過形成菌根幫助寄主植物吸收水 分和礦質(zhì)營養(yǎng)及抗逆。國內(nèi)外的研宄都發(fā)現(xiàn)某些從枝菌根真菌能促進(jìn)煙草吸收P、K和N， 提高煙苗的水分利用效率和耐旱性，降低煙草猝倒病、黑脛病和根黑腐病的發(fā)病率。但是， 從枝菌根真菌是專性活體營養(yǎng)真菌，人工培養(yǎng)從枝菌根真菌需要活體植物的根或發(fā)根，不 易大量培養(yǎng)，限制了在田間大規(guī)模應(yīng)用從枝菌根真菌。而且，在常規(guī)的煙草漂浮育苗條件 下，基質(zhì)水分飽和，營養(yǎng)液養(yǎng)分濃度高，抑制從枝菌根真菌孢子萌發(fā)、菌體生長和侵染寄主 植物，不利于形成菌根。在漂浮育苗生產(chǎn)中菌根化煙苗往往需要改變基質(zhì)和營養(yǎng)液成分和 漂浮育苗方式，如中國專利"烤煙菌根化漂浮育苗的營養(yǎng)液配方及其施用方法"（授權(quán)號CN 101213928B)，"以砂為基質(zhì)菌根化煙苗的生產(chǎn)方法"(CN101569284B)和"利用濕潤-漂浮育 苗方式生產(chǎn)菌根煙苗的方法"（CN102224787B)，均不利于標(biāo)準(zhǔn)化推廣和大規(guī)模應(yīng)用。
[0004]印度梨形抱（Piriformosporaindica)是一種屬于擔(dān)子菌（Basidiomycota) 蠟殼耳目（Sebacinales)的絲狀真菌，因從印度Thar沙漠分離得到且產(chǎn)生梨形狀的厚 垣孢子而得名（Verma等，1998,Mycologia90:896-903;樓兵干等，2007,植物保護(hù)學(xué)報(bào) 34:653-656)。印度梨形孢主要通過無性繁殖完成生活史，能在多種人工合成的固體培養(yǎng)基 上和液體培養(yǎng)基中（如培養(yǎng)真菌常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和植物組織培養(yǎng)用的MS培養(yǎng) 基）生長。印度梨形孢能定殖于植物根的表皮和皮層細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙，寄主范圍非常廣 泛，能定殖于苔蘚類，蕨類，裸子植物和被子植物，包括禾本科、十字花科、豆科和茄科等科 的重要農(nóng)作物，能幫助寄主植物吸收營養(yǎng)和抗逆，促進(jìn)植物的生長發(fā)育，提高果實(shí)和種子產(chǎn) 量。印度梨形孢促進(jìn)植物生長的機(jī)制主要是通過比根毛還細(xì)的根外菌絲幫助植物吸收P、N、 S等營養(yǎng)元素，還能通過分泌植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和調(diào)節(jié)植物內(nèi)源激素的水平來促進(jìn)植物的 生長發(fā)育。印度梨形孢幫助植物抗逆的機(jī)制涉及提高植物抗氧化能力，誘導(dǎo)抗逆基因表達(dá)， 誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性等（Oelmilller等，2009,Symbiosis49:1 - 17 ;宋鳳鳴等，2011， 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）37:1 -6 ;Franken，2012,AppliedMicrobiologyand Biotechnology96:1455 - 1464)〇
[0005] 印度梨形孢具有從枝菌根真菌與植物共生的特性，能與從枝菌根真菌不能共生 的十字花科植物（如模式植物擬南芥）共生，又能用人工合成培養(yǎng)基培養(yǎng)。這些特性使 得印度梨形孢成了植物內(nèi)生真菌基礎(chǔ)研宄的模式生物，在大規(guī)模田間應(yīng)用上有比從枝 菌根真菌更廣闊的前景。最近，中國發(fā)明專利申請（CN201410092267、CN201410092269、 CN201410093085)公開了通過用過濾后的印度梨形孢菌絲懸浮液澆灌4葉期的煙苗，待印 度梨形孢定殖后移栽煙苗，從而降低煙葉中鉻、鎘、鉛含量的方法。
[0006] 但是，迄今還沒有論文報(bào)告過在漂浮育苗條件下印度梨形孢對煙草種子萌發(fā)和煙 苗生長發(fā)育的作用，也沒有專利申請公開過與煙草漂浮育苗規(guī)程配套的接種印度梨形孢的 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對目前煙草漂浮育苗種子發(fā)芽率低，煙苗水生 根受低氧脅迫且移栽后抗旱性弱的問題，針對從枝菌根真菌菌根化煙苗技術(shù)在大規(guī)模集約 化生產(chǎn)上的不足，提供一種用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)的根內(nèi)生真菌印度梨形孢的菌體及其釋放在 培養(yǎng)濾液中的物質(zhì)提高煙草漂浮育苗種子發(fā)芽率和壯苗的方法。
[0008] 為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案如下：
[0009] 提供一種提高煙草漂浮育苗種子發(fā)芽率和壯苗的方法，是將用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的 植物根內(nèi)生真菌印度梨形孢的菌體和培養(yǎng)濾液與煙草育苗基質(zhì)混勻，利用印度梨形孢的菌 體及其釋放在培養(yǎng)濾液中的物質(zhì)提高煙草漂浮育苗的種子發(fā)芽率并促進(jìn)煙苗生長和抗逆。
[0010] 上述方法包括以下步驟：
[0011] (1)用人工液體培養(yǎng)基培養(yǎng)印度梨形孢，獲得菌液；菌液包括菌體和培養(yǎng)濾液，菌 體包括印度梨形孢菌絲和孢子；
[0012] (2)將前述菌液與煙草育苗基質(zhì)（以下簡稱基質(zhì)）混勻得到菌液基質(zhì)混合物；
[0013] (3)將菌液基質(zhì)混合物裝入聚苯乙烯格盤后播種煙草，或者，按常規(guī)方法播種煙草 后覆蓋一薄層菌液基質(zhì)混合物；
[0014] (4)按常規(guī)方法進(jìn)行漂浮育苗、煉苗和移栽。
[0015] 作為優(yōu)選方案，所述步驟（1)中，所得印度梨形孢菌液中包括菌絲和孢子的菌體 鮮重達(dá)到每升大于50g，孢子的數(shù)量達(dá)到每升大于IXIO9個。
[0016] 作為優(yōu)選方案，所述步驟（2)中，所得菌液基質(zhì)混合物中菌體重量占基質(zhì)重量的 0.5% -5%，培養(yǎng)濾液重量占基質(zhì)重量的5% -20%。
[0017] 作為優(yōu)選方案，所述步驟（3)中，裝入聚苯乙烯格盤的菌液基質(zhì)混合物中菌體重 量占基質(zhì)重量的0.5% -2%;或者，按常規(guī)播種后覆蓋的菌液基質(zhì)混合物中菌體重量占基 質(zhì)重量的2% -5%。
[0018] 本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過程可以具體描述如下：
[0019] 提高煙草漂浮育苗種子發(fā)芽率和壯苗的方法，包括以下步驟：
[0020] (1)培養(yǎng)印度梨形孢
[0021] 用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)印度梨形孢以獲得菌液，菌液包括菌體和培養(yǎng)濾液，菌體包括 菌絲和孢子，培養(yǎng)程度控制為：使每升菌液抽濾后能獲得的菌體鮮重大于50g，每升菌液中 孢子的數(shù)量大于IXIO9個。
[0022] (2)混合印度梨形孢菌液與煙草育苗基質(zhì)
[0023] 將印度梨形孢菌液與基質(zhì)混勻，所得菌液基質(zhì)混合物中菌體的重量是基質(zhì)重量的 0.5% -5%，培養(yǎng)濾液的重量是基質(zhì)重量的5% -20%，所得菌液基質(zhì)混合物的最終含水 量為 30% -40%。
[0024] (3)接種印度梨形孢和播種煙草
[0025] 將步驟（2)所得菌液基質(zhì)混合物裝入聚苯乙烯格盤，在菌液基質(zhì)混合物表面播煙 草包衣種子，接種菌體的重量是基質(zhì)重量的0. 5% - 2%;或者，將沒有混合菌液的基質(zhì)裝入 聚苯乙烯格盤，在基質(zhì)表面播煙草包衣種子，然后在種子和基質(zhì)上覆蓋一層菌液基質(zhì)混合 物，覆蓋厚度約3_ ;接種菌體的重量是基質(zhì)重量的2% - 5%。
[0026] (4)按常規(guī)方式進(jìn)行漂浮育苗、煉苗和移栽。
[0027]本發(fā)明所述印度梨形孢（Piriformosporaindica)菌株是公眾可以從生物材料 樣品國際保藏單位購買到的生物材料，在美國Americantypeculturecollection保藏 庫的保藏編號是.ATCC、K. 204458?，在德國DeutscheSammlungvonMikroorgani