一種提高普通野生稻雜交后代花藥培養(yǎng)效率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種普通野生稻雜交后代花藥培養(yǎng)方法，屬植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。【背景技術(shù)】:
[0002]野生稻是稻屬中除了栽培稻(0.sativa L.)和非洲栽培稻(0.glaberrimaSteud.)以外的野生種類的總稱。普通野生稻屬于A’A’基因組，與栽培AA基因組遺傳距離相對較近，因此，普通野生稻是進(jìn)行水稻遠(yuǎn)緣雜交育種的優(yōu)良資源。
[0003]普通野生稻與栽培遠(yuǎn)緣雜交育種后代性狀瘋狂分離，要穩(wěn)定性狀，需要多代的反復(fù)回交、自交和選擇，即使在一年種植三季的海南地區(qū)育種也需要至少4-5年時間。采用水稻花粉培養(yǎng)能夠加快目標(biāo)性狀的純合，縮短育種年限。
[0004]水稻花藥培養(yǎng)是把發(fā)育到一定階段的花藥，通過無菌操作技術(shù)接種到人工配置的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)其花粉(小孢子)形成愈傷組織，進(jìn)而分化成完整的植株。在培養(yǎng)過程中染色體經(jīng)過自然或人工加倍后，成為純合的二倍體，這種染色體加倍產(chǎn)生的純和二倍體，在遺傳上非常穩(wěn)定，不發(fā)生性狀分離。
[0005]水稻花藥培養(yǎng)在育種上的利用體現(xiàn)在極早穩(wěn)定分離的后代，快速獲得純系，縮短育種年限，提高選擇效率。常規(guī)雜交后代需要到F5代以上，復(fù)交組合需要更多的代數(shù)性狀才能穩(wěn)定，而雜交F1代通過花藥培養(yǎng)在H2代即可篩選穩(wěn)定的品系，比常規(guī)雜交育種年限縮短
3-5年，甚至更多。水稻花藥培養(yǎng)在水稻種間的雜交育種中廣泛應(yīng)用于恢復(fù)系的選育，而在雜種優(yōu)勢固定方面可以獲得超親的純系，另外還可以創(chuàng)制原始材料、選育新品種、新不育系等。
[0006]目前，水稻花藥培養(yǎng)的主要問題是花藥愈傷組織誘導(dǎo)率低(僅為30%左右)，綠苗分化率低(僅為20%左右)，這嚴(yán)重阻礙著花藥培養(yǎng)技術(shù)在普通野生稻和栽培稻雜交育種實(shí)踐中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供了一種提高普通野生稻交后代花藥培養(yǎng)效率的方法，加快雜交后代性狀的純和穩(wěn)定，提高利用野生稻優(yōu)異基因進(jìn)行育種的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0008]本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中花藥培養(yǎng)效率低的問題，提供一種提高普通野生稻雜交后代花藥培養(yǎng)效率的方法，具體步驟如下:
[0009]a.外植體的選擇:外植體的選擇為田間取材，在晴天早晨露水未干時取幼穗，選取劍葉環(huán)和下一葉環(huán)之間距離為5-lOcm的稻穗，穗子不破口，保留兩片葉和葉鞘；田間取穗后立即放入盛有清水的桶中，以避免穗子失水；在實(shí)驗室中用70%酒精棉球擦拭葉片和葉鞘，再按照不同株系用保鮮膜包裹幼穗，置于4-6°C冰箱中低溫預(yù)處理7-10天；
[0010]b.外植體滅菌:取出預(yù)處理后的幼穗，挑選小穗花藥處于單核靠邊期的枝梗，即:花藥淡黃色，在穎殼內(nèi)雄蕊長度接近穎片長度的1/2，長粒型的接近2/5的稻穗；將幼穗葉片剝離后用體積百分比為70%的酒精棉球擦拭葉鞘，將枝梗剪為5-7厘米的段，用體積百分比為70%的酒精浸泡30秒進(jìn)行表面消毒，無菌蒸餾水沖洗4-5次，再用質(zhì)量體積百分比為0.1 %的升汞表面消毒8分鐘，其間不時上下?lián)u動滅菌瓶，最后用無菌蒸餾水沖洗4-5次；
[0011]C.花藥愈傷的液體懸浮誘導(dǎo):滅菌后將穗子從苞葉中剝離，放在無菌濾紙上吸干多余的水分，用剪刀剪去穎殼的上部，注意不要剪到花藥，用鑷子的尖部挑出花藥到誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中，每瓶30枚花藥；將接種花藥的三角瓶放到搖床中28°C、100-130轉(zhuǎn)/分鐘黑暗下懸浮培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)15-25天直至愈傷組織長出；花藥誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基為:N6基本培養(yǎng)基+2.4-D 2.0mg/L+天門冬氨酸1.0g/L+谷氨酰胺1.0g/L+酵母lg/L+蔗糖50g/L，PH為5.8 ；
[0012]d.花藥愈傷的增殖培養(yǎng):待三角瓶中懸浮培養(yǎng)的花藥愈傷生長至l_2mm時，用80目已滅菌的篩網(wǎng)過濾，將篩網(wǎng)上的愈傷抖落到增殖培養(yǎng)基上，28°C、繼續(xù)黑暗培養(yǎng)10-15天，直至花藥愈傷長至3-5mm進(jìn)行分化培養(yǎng)；增殖培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+2.4-D 2.0mg/L+植物凝膠 3.8g/L，PH5.80
[0013]e.花藥愈傷組織分化培養(yǎng):將生長至3-5_的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行光照分化，光照條件為5000-6000Lux，光照周期為16小時/天，培養(yǎng)溫度為28°C，經(jīng)過20-30天分化苗長出；分化培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)基+6-BA 3.0mg/L+KTl.5mg/L+NAA 0.5mg/L+植物凝膠 3.8g/L，PH 為 5.8
[0014]f.分化苗即花培苗的生根培養(yǎng):將長至3-5cm的分化苗轉(zhuǎn)移到裝有生根培養(yǎng)基直徑2.5cm、長25cm的玻璃管中，光照條件為5000_6000Lux，光照周期為16小時/天，培養(yǎng)溫度為28°C，經(jīng)過10-15天分化苗根長出并長長；生根培養(yǎng)基為:1/2MS基本培養(yǎng)基+0.2mg/LNAA+ 植物凝膠 2.0g/L, PH 為 5.8 ;
[0015]g.花培苗煉苗、移栽:將根系生長較好的花培苗從生根培養(yǎng)基中輕輕拔出，用土 28 °C的溫水洗去根上的培養(yǎng)基，將苗放入市場購買的育苗基質(zhì)中，28 °C -30 °C光照培養(yǎng)7-15天，待花培苗長勢良好時移栽到大田。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:能夠大幅度提高普通野生稻雜交后代花藥培養(yǎng)中愈傷誘導(dǎo)率和成苗率，加快水稻育種進(jìn)程，提高水稻優(yōu)良品種的選育效率；為加速利用野生稻優(yōu)良基因選育水稻品種提供有力的技術(shù)支持。
【附圖說明】
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[0017]圖1為本發(fā)明實(shí)施例液體懸浮培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法誘導(dǎo)花藥愈傷效率比較。
[0018]圖2為本發(fā)明實(shí)施例液體懸浮培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法綠苗分化率比較。
【具體實(shí)施方式】
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[0019]實(shí)施例一:云南元江普通野生稻粳型雜交后代花藥懸浮培養(yǎng)
[0020]本實(shí)施例以云南元江普通野生稻粳型雜交后代F1-24作為試驗材料，采用本發(fā)明方法獲得了單倍體植株。實(shí)施過程如下:
[0021]I)外植體的選擇:在晴天早晨露水未干田間取幼穗，選取劍葉環(huán)和下一葉環(huán)之間距離為5cm的稻穗，穗子不破口，保留兩片葉和葉鞘，用體積百分比為70%酒精棉球擦拭葉片和葉鞘，再按照不同株系用保鮮膜包裹幼穗，置于6°C冰箱中低溫預(yù)處理7天。挑選小穗花藥處于單核靠邊期的枝梗，即:花藥淡黃色，在穎殼內(nèi)雄蕊長度接近穎片長度的1/2的稻穗進(jìn)行花藥愈傷誘導(dǎo)。
[0022]2)外植體滅菌:將幼穗葉片剝離后用體積百分比為70%的酒精棉球擦拭葉鞘，將枝梗剪為5厘米或7厘米的段，用體積百分比為70%的酒精浸泡30秒進(jìn)行表面消毒，無菌蒸餾水沖洗4次或5次，再用質(zhì)量體積百分比為0.1 %的升汞表面消毒8分鐘，其間不時上下?lián)u動滅菌瓶，最后用無菌蒸餾水沖洗4次或5次。
[0023]3)花藥愈傷液體懸浮誘導(dǎo):滅菌后將穗子從苞葉中剝離，放在無菌濾紙上吸干