控制玉蜀黍和高粱的光周期敏感性的基因以及所述基因的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明整體涉及植物分子生物學(xué)。更具體地講，本發(fā)明涉及核酸，以及調(diào)節(jié)所述核酸的 表達(dá)，從而控制植物的光周期敏感性、開花時(shí)間和花/種子產(chǎn)生的方法。
【背景技術(shù)】 開花時(shí)間是一種重要的農(nóng)藝性狀，因?yàn)樗鼪Q定了適應(yīng)生長(zhǎng)區(qū)。大部分植物物種是響應(yīng) 于環(huán)境刺激而被誘導(dǎo)開花的，所述環(huán)境刺激諸如日照長(zhǎng)度和溫度。玉米是在墨西哥從其野 生原種大合草（小穎類玉米亞種（Zea mays ssp. parviglumis))馴化的，大合草開花需要 短日照?，F(xiàn)代農(nóng)藝學(xué)上重要的溫帶玉米是日照中性植物，因?yàn)槠涔庵芷诿舾行砸呀?jīng)在人類 針對(duì)玉米對(duì)處于長(zhǎng)夏日的北煒地區(qū)的適應(yīng)性進(jìn)行的人工選擇中失去。玉蜀黍熱帶系仍然保 留著對(duì)開花的短日照需求。
[0001] 來自熱帶系和亞熱帶系的玉蜀黍種質(zhì)資源是重要農(nóng)藝性狀的天然來源，所述農(nóng)藝 性狀諸如抗病性和昆蟲抗性，以及對(duì)非生物脅迫的耐受性。熱帶種質(zhì)資源用于在針對(duì)耐旱 性和產(chǎn)量提高的育種計(jì)劃中擴(kuò)大溫帶玉米的遺傳多樣性。然而，熱帶和亞熱帶變種的光 周期敏感性阻礙了種質(zhì)資源跨煒度自由和快速交換，并且為溫帶地區(qū)的育種計(jì)劃帶來問 題。光周期性已成為在溫帶地區(qū)的熱帶物種評(píng)估中的主要約束。由于光周期性，生長(zhǎng)于 溫帶環(huán)境中的熱帶栽培種的特征在于晚花、高大的軀干、較大的葉子、較大的穗和較低的 谷粒產(chǎn)量（Hallauer and Carena, in Handbook of Plant Breeding，Cereals，Springer 2009(Hallauer知Carena，載于植物育種手冊(cè)：谷類，斯普林格出版社，2009年出版）。為了 克服這些問題，在熱帶栽培種和溫帶栽培種之間雜交產(chǎn)生的群體的早熟育種中使用混合選 種法（mass selection)。然而，在早熟種的經(jīng)驗(yàn)性選擇中可能損失大量的熱帶種質(zhì)資源并 且可能消除有價(jià)值的等位基因。這將與增加遺傳多樣性和從外來的熱帶物種引入有用等位 基因的初始目標(biāo)偏離。如果已鑒定出控制光周期敏感性的基因，那么可通過使用標(biāo)記輔助 選擇（MS)或者基因輔助選擇（GAS)來克服這個(gè)問題。
[0002] 在分子水平，當(dāng)前對(duì)玉蜀黍的光周期敏感性控制的了解是十分有限的。本發(fā)明鑒 定了基因 ZmCCTlO (代表染色體10上的玉米（Zea mays) CCT結(jié)構(gòu)域），該基因用作熱帶玉蜀 黍的光周期響應(yīng)的主要調(diào)控因子。在熱帶系中，ZmCCTlO在非誘導(dǎo)性的長(zhǎng)日照條件下以晝行 性方式（diurnal manner)高度表達(dá)，但是在誘導(dǎo)性短日照條件下未檢測(cè)到該基因的表達(dá)。 因此在熱帶玉蜀黍中，ZmCCTlO通過在長(zhǎng)日照而非短日照下抑制開花時(shí)間基因來發(fā)揮作用。
[0003] 在溫帶栽培種中，ZmCCTlO已失去對(duì)開花時(shí)間的控制，這是因?yàn)閆mCCTlO的低表達(dá) 造成了對(duì)日照長(zhǎng)度的不敏感性。本發(fā)明鑒定與光周期敏感性相關(guān)的熱帶ZmCCTlO等位基因 的啟動(dòng)子序列中的遺傳變異。這些遺傳變異可用于在利用熱帶或外來種質(zhì)資源的育種計(jì)劃 中的標(biāo)記輔助選擇或者基因輔助選擇。
[0004] 本發(fā)明提出通過各種轉(zhuǎn)基因盒下調(diào)熱帶雜交種中的ZmCCTIO,從而使得熱帶種質(zhì) 資源的短日照需求無效，這將允許直接使用第一代Fl雜交種篩選有農(nóng)藝學(xué)價(jià)值的性狀。
【附圖說明】
[0005] 圖1。該ZmCCTlO基因模型由兩個(gè)外顯子和2. 3-kb的啟動(dòng)子區(qū)構(gòu)成。在該啟動(dòng)子 中存在兩個(gè)多態(tài)性區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域在熱帶系、溫帶系和野生玉蜀黍原始種大芻草之間變 化。
[0006] 圖2 (2A-2B)。來自玉蜀黍、大芻草、水稻和高粱的五種近源相關(guān)的CCT蛋白的多 肽比對(duì)。三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域被加框表示。第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域是新的未知功能結(jié)構(gòu)域。 該43個(gè)氨基酸的CCT結(jié)構(gòu)域位于C端，意味著光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白功能。用星號(hào)標(biāo)記推定的 DNA/RNA 結(jié)合基序 C-X2-C-Xn-H-X2-H。
[0007] 圖3。溫帶系和熱帶系的葉子中ZmCCTlO和ZCN8 (開花的激活因子）的晝行性表 達(dá)。在許可的短日照條件下，熱帶系中ZmCCTlO的轉(zhuǎn)錄非常低，而ZCN8表達(dá)非常高，其中表 達(dá)的峰值在黎明出現(xiàn)。在非許可的長(zhǎng)日照條件下，ZmCCTlO表達(dá)較高，其中表達(dá)的峰值在近 中午時(shí)出現(xiàn)，而ZCN8的轉(zhuǎn)錄非常低。該相反的、有規(guī)律的轉(zhuǎn)錄表明ZmCCTlO用作熱帶系中 的ZCN8的抑制因子。在日照中性的溫帶玉蜀黍中，在短日照和長(zhǎng)日照條件下，ZmCCTlO轉(zhuǎn) 錄均較低。在這兩種條件下溫帶系中的ZCN8表達(dá)一貫較高，這進(jìn)一步支持ZmCCTlO用作玉 蜀黍的光周期調(diào)控因子。
[0008] 圖4。溫帶Gaspe系中過度表達(dá)ZmCCTlO的轉(zhuǎn)基因植物顯示出典型的熱帶植物構(gòu) 型：較多的葉子、較長(zhǎng)和較寬的葉子、較粗的莖以及節(jié)間出現(xiàn)支柱根。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 對(duì)玉蜀黍光敏感性的當(dāng)前研宄是基于開花時(shí)間的QTL(數(shù)量性狀基因座）定位。鑒 定出四個(gè)主要的光周期敏感性基因座，并將主要的QTL定位至染色體10。本發(fā)明描述染色 體10上的QTL的cDNA分離并且該cDNA被指定為基因 ZmCCTIO。對(duì)推定蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分 析顯示該蛋白與水稻Ghd7的近親同源性，水稻Ghd7是長(zhǎng)日照條件下開花的抑制因子。
[0010] 本發(fā)明提供證據(jù)表明ZmCCTlO確實(shí)用作熱帶系的開花時(shí)間的抑制因子。在溫帶玉 蜀黍中，在造成日照中性習(xí)性的兩種日照長(zhǎng)度條件下ZmCCTlO均不表達(dá)。在高粱基因組中 鑒定出兩種同源基因。高粱是一種短日照植物。這些基因被命名為SbCCTl和SbCCT6,其代 表高粱（Sorghum bicolor) CCT染色體1和染色體6。溫帶玉蜀黍中ZmCCTlO基因的過度表 達(dá)產(chǎn)生了具有熱帶構(gòu)型的轉(zhuǎn)基因植物。
[0011] 對(duì)玉蜀黍中ZmCCTlO的轉(zhuǎn)基因操縱或者對(duì)高粱中的SbCCTl和SbCCT6的轉(zhuǎn)基因操 縱將允許在育種計(jì)劃中減少光周期敏感性和縮短開花時(shí)間。特別地，F(xiàn)l雜交種中玉蜀黍或 者高粱CCTlO基因的下調(diào)可用于提高種質(zhì)資源跨煒度的自由和快速交換。
[0012] 一種用于篩選植物群體以獲得對(duì)生物脅迫或非生物脅迫的改善耐受性的方法，所 述方法包括：
[0013] a.提供植物群體，其中所述植物的光周期敏感性由于內(nèi)源性基因的下調(diào)而改變， 其中所述內(nèi)源性基因編碼包含CONSTANS、CONSTANS-LIKE、TOCl(CCT)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；以 及
[0014] b.篩選所述植物群體以獲得對(duì)生物脅迫或非生物脅迫的改善耐受性。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施例中，具有降低的CCT基因表達(dá)的植物群體是在與不存在內(nèi)源性基因 下調(diào)的植物群體的正常生長(zhǎng)環(huán)境不同的植物生長(zhǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)的。在一個(gè)實(shí)施例中，該內(nèi)源 性基因編碼包含CCT結(jié)構(gòu)域的多肽，所述CCT結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO :3的CCT結(jié)構(gòu)域具有至 少90%同一*性。
[0016] 一種建立玉蜀黍植物的雜種優(yōu)勢(shì)育種群體的方法，該方法包括：
[0017] a.提供轉(zhuǎn)基因親本和光周期敏感性親本，其中該轉(zhuǎn)基因親本包括重組遺傳元件， 該遺傳元件能夠減少該光周期敏感性親本的光周期敏感性基因的表達(dá)，以及
[0018] b.使該轉(zhuǎn)基因親本與該光周期敏感性親本雜交，從而產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)育種群體。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施例中，該重組遺傳元件下調(diào)編碼包含CCT結(jié)構(gòu)域的多肽的內(nèi)源性基 因，該CCT結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO :3的CCT結(jié)構(gòu)域具有至少90%同一性。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)基因親本是轉(zhuǎn)基因雌性親本，以及該光周期敏感性親本是 非轉(zhuǎn)基因的雄性親本。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)基因親本就光周期敏感性而言為日照長(zhǎng)度中性的。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施例中，該光周期敏感性親本為熱帶系。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施例中，通過將該光周期敏感性親本與該轉(zhuǎn)基因親本雜交來選擇對(duì)生物 脅迫和非生物脅迫具有增強(qiáng)的耐受性的子代。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施例中，該非生物脅迫是干旱。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施例中，該生物脅迫耐受性是昆蟲抗性或者抗病性。
[0026] -種篩選編碼ZmCCTlO多肽的基因的等位變異的方法，該ZmCCTlO多肽包含 CONSTANS、CONSTANS-LIKE、TOCl (CCT)結(jié)構(gòu)域，所述方法包括：對(duì)玉蜀黍基因組中調(diào)節(jié) ZmCCTlO多肽的表達(dá)水平的基因組區(qū)進(jìn)行測(cè)序，以及鑒定該ZmCCTlO基因的調(diào)控區(qū)中與 ZmCCTlOmRNA表達(dá)降低相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)等位變異。
[0027] -種調(diào)節(jié)植物的光周期敏感性的方法，該方法包括：
[0028] a.提供具有重組多核苷酸的光周期敏感性植物，該多核苷酸有效連接至啟動(dòng)子， 其中該多核苷酸下調(diào)編碼包含CONSTANS、CONSTANS-LIKE、TOCl (CCT)結(jié)構(gòu)域的多肽的內(nèi)源 性基因的表達(dá)；
[0029] b.通過下調(diào)該內(nèi)源性基因的表達(dá)來降低該植物的光周期敏感性。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施例中，該植物來自選自以下的植物：玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡諾 拉油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、粟、花生、甘鹿和可可。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。除非另外提出，否則本文所采用或所考慮的技術(shù)是本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。材料、方法和實(shí)例僅為示例性的而不是限制性的。以 下內(nèi)容以舉例說明的方式給出，而非意在限制本發(fā)明的范圍。
[0032] 下文將參照附圖更完整地描述本發(fā)明，其中示出了本發(fā)明的一些但并非全部實(shí)施 例。事實(shí)上，這些公開內(nèi)容可以多種不同形式呈現(xiàn)，不應(yīng)理解為受限于本文所述的實(shí)施例； 更確切地說，提供這些實(shí)施例以使得本發(fā)明將滿足適用的法律要求。類似的編號(hào)在全文中 是指類似的要素。
[0033] 借助前面的描述和隨附的附圖中給出的教導(dǎo)，這些公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員 將會(huì)想到本文所述公開內(nèi)容的許多修改形式和其他實(shí)施例。因此，應(yīng)當(dāng)了解，這些公開內(nèi)容 不限于所公開的特定實(shí)施例，并旨在將修改形式和其他實(shí)施例包括在所附權(quán)利要求的范圍 內(nèi)。雖然本文中采用特定術(shù)語，但所述術(shù)語僅在一般性和描述性意義上使用而并非用于限 制目的。
[0034] 除非另外指明，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用植物學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、分子生物 學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)處于本領(lǐng)域技能范圍內(nèi)。這類技 術(shù)在文獻(xiàn)中有完全的解釋。參見例如Langenheim and Thimann，BOTANY :PLANT BIOLOGY AND ITS RELATION TO HUMAN AFFAIRS，John Wiley (1982) (Langenheim 知 Thimann，《植物 學(xué)：植物生物學(xué)及其與人類事務(wù)的關(guān)系》，約翰威立出版社，1982年）；CELL⑶LTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS，vol. 1，Vasil，ed. (1984)(《植物細(xì)胞培養(yǎng)與體細(xì)胞 遺傳學(xué)》，第 1 卷，Vasil 編輯，1984 年）；Stanier，et al.，THE MICROBIAL WORLD，5th ed.， Prentice-Hall (1986) (Stanier等人，《微生物世界》，第5版，普倫蒂斯·霍爾出版社， 1986 年）；Dhringra and Sinclair，BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS，CRC Press (1985) (Dhringra知Sinclair，《植物病理學(xué)基本方法》，CRC出版社，1985年）；Maniatis，et al.， MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL(1982) (Maniatis 等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》， 1982 年）；DNA CLONING，vols. I and II，Glover，ed. (1985)(《DNA 克隆》，第 I 卷和第 II 卷，Glover 編輯，I985 年）；0LIG0NUCLE0TIDE SYNTHESIS，Gait，ed. (1984)(《寡核苷酸合 成》，Gait 編輯，1984 年）；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION，Hames and Higgins，eds. (1984) (《核