一種采用花生發(fā)根培養(yǎng)北方根結(jié)線蟲的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種根結(jié)線蟲的培養(yǎng)方法，具體地說是涉及一種采用花生發(fā)根培養(yǎng)北方根結(jié)線蟲的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]花生是世界上廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物之一，是我國(guó)第二大食用植物油和蛋白質(zhì)資源。我國(guó)北方地區(qū)主要是北方根結(jié)線蟲對(duì)花生生產(chǎn)危害嚴(yán)重，尤其是花生大省山東，發(fā)病面積最大，損失最嚴(yán)重。受害的花生一般減產(chǎn)在20 % -30 %左右，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70 % -80 %，甚至絕收(徐秀娟，2009)?；ㄉ€蟲病是花生生產(chǎn)上的重要病害，迄今為止，仍不能很好的控制線蟲病的發(fā)生和危害。
[0003]根結(jié)線蟲侵染花生后，刺激巨型細(xì)胞產(chǎn)生，導(dǎo)致花生的根活力下降，阻礙對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和運(yùn)輸。同時(shí)可引起花生葉綠素含量減少，光合強(qiáng)度下降。根結(jié)線蟲侵染花生以后在侵染的第3d引起花生呼吸強(qiáng)度提高，隨后則明顯降低。這些生理變化都導(dǎo)致了花生的代謝失常和生理紊亂，最終導(dǎo)致植株矮小、黃化，甚至枯萎死亡(賓淑英，1999)。目前對(duì)花生北方根結(jié)線蟲病的研究局限在植物病理方面，對(duì)北方根結(jié)線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳特性和代謝途徑方面缺乏研究，原因是缺乏北方根結(jié)線蟲的單外源高效連續(xù)培養(yǎng)體系和缺乏能反映出線蟲和寄主的互相作用的真實(shí)情況的研究體系。
[0004]由于植物寄生線蟲、植物宿主和環(huán)境之間的關(guān)系是極其復(fù)雜的，難以評(píng)估在土壤中所發(fā)生的變化。無(wú)菌培養(yǎng)條件下研究它們之間的關(guān)系可以反映出植物寄生線蟲和植物宿主相互作用真實(shí)情況，為一種良好的方法。要研究北方根結(jié)線蟲，首先要培養(yǎng)得到大量一致的線蟲群體。目前植物寄生線蟲的無(wú)菌培養(yǎng)多采用在愈傷組織或離體根上單外源培養(yǎng)，是研究植物寄生線蟲生化和遺傳發(fā)育特性上常用的方法，缺點(diǎn)在于愈傷組織和離體根透明性差，不便于觀察，不能繼代培養(yǎng)，影響實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性。這就要求盡快研究出北方根結(jié)線蟲的單外源高效連續(xù)培養(yǎng)體系，為開展花生抗線蟲病的研究提供重要技術(shù)平臺(tái)。
[0005]目前，在花生北方根結(jié)線蟲病抗性鑒定方法研究方面缺乏一個(gè)簡(jiǎn)單、直觀方便、重復(fù)性好以及不受自然環(huán)境影響的抗性鑒定方法。
[0006]病地自然誘發(fā)鑒定，受自然條件影響大，每年發(fā)病情況都不一樣，周期長(zhǎng)，費(fèi)工，占地面積大。室內(nèi)人工接種鑒定方法雖具有快速等特點(diǎn)，但和生長(zhǎng)實(shí)踐不符合，只能鑒定品種抗擴(kuò)展特性。
[0007]發(fā)根農(nóng)桿菌能誘導(dǎo)大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物，發(fā)根農(nóng)桿菌所含Ri質(zhì)粒的T-DNA通過整合進(jìn)入植物核基因組，并穩(wěn)定表達(dá)引起宿主植物發(fā)根。用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染花生而獲得的發(fā)根生長(zhǎng)速度快，具有激素自主性，分化水平高，遺傳特性穩(wěn)定，合成能力較強(qiáng)，易于繼代培養(yǎng)。發(fā)根具有正常根組織結(jié)構(gòu)，符合植物內(nèi)寄生線蟲的生長(zhǎng)環(huán)境，因此更能反映出線蟲和寄主互相作用的真實(shí)情況。
[0008]常用的發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)花生外植體毛狀根誘導(dǎo)能力存在差異。Fabric1等采用3種發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834、R1000、EHA105均誘導(dǎo)出毛狀根。Kim等采用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834、A4、R1000、R1200、R1601等菌株誘導(dǎo)發(fā)根。國(guó)內(nèi)姚慶收等采用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601誘導(dǎo)，子葉沒有誘導(dǎo)出毛狀根，葉片誘導(dǎo)率達(dá)65.6%，莖干誘導(dǎo)毛狀根生長(zhǎng)緩慢。劉杰等采用發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060和ATCCl 1325誘導(dǎo)發(fā)根，葉片最高誘導(dǎo)率為53.3%。
[0009]Verdejo S.等發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的植株具有側(cè)根增多、易于次培養(yǎng)等特點(diǎn)，在用馬鈴薯和番茄的發(fā)根培養(yǎng)瓜哇根結(jié)線蟲獲得較好的效果。Elsen A.等發(fā)根體系研究了菌根真菌和咖啡短體線蟲的相互作用。Kifle S.等用甜菜發(fā)根體系來(lái)研究轉(zhuǎn)抗根部專性寄生物基因的表達(dá)。Narayanan R.A.用大豆發(fā)根體系研究大豆孢囊線蟲特性，表明用發(fā)根體系可以鑒定大豆抗孢囊線蟲基因。Plovie E.等研究了用番茄發(fā)根體系鑒定番茄抗線蟲特性。肖翔等進(jìn)行了胡蘿卜發(fā)根培養(yǎng)甘薯莖線蟲體系的研究。阮龍等做了用甘薯、胡蘿卜發(fā)根體系培養(yǎng)馬鈴薯腐爛線蟲的研究。
[0010]多年來(lái)發(fā)根一直被用于維持線蟲的常規(guī)培養(yǎng)和研究植物與寄生物之間的相互關(guān)系。運(yùn)用發(fā)根體系檢測(cè)植物對(duì)線蟲抗性，已經(jīng)在甜菜、大豆、馬鈴薯、番茄和甘薯等作物上使用，但運(yùn)用花生發(fā)根體系培養(yǎng)北方根結(jié)線蟲還沒有人嘗試。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]基于上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種采用花生發(fā)根培養(yǎng)北方根結(jié)線蟲的方法。
[0012]本發(fā)明所采用的技術(shù)解決方案是:
[0013]—種采用花生發(fā)根培養(yǎng)北方根結(jié)線蟲的方法，包括以下步驟:
[0014]a花生毛狀根的制備
[0015]al選取粒大飽滿的花育45號(hào)種子，經(jīng)消毒處理，然后用無(wú)菌刀在無(wú)菌濾紙上剝?nèi)シN皮，接種于無(wú)激素的MSB5培養(yǎng)基上培養(yǎng)；
[0016]a2無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取低溫凍存的發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株，在LB+50mg/L Kan的固體平板上化線接種，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落后挑取I個(gè)單菌落轉(zhuǎn)入1mlLB液體培養(yǎng)基中，于搖床內(nèi)暗培養(yǎng)復(fù)蘇；取0.05ml該菌液于1ml LB液體培養(yǎng)基中再次活化，使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；
[0017]a3當(dāng)農(nóng)桿菌的A600nm = 0.6?0.8時(shí)采用發(fā)根農(nóng)桿菌A4侵染步驟al無(wú)菌培養(yǎng)6d的花育45號(hào)花生子葉誘導(dǎo)毛狀根，擴(kuò)繁繼代培養(yǎng)毛狀根；
[0018]b北方根結(jié)線蟲懸液及卵懸液的制備
[0019]bl選取北方根結(jié)線蟲病發(fā)病嚴(yán)重，蟲癭多的花生根，用剪刀剪成小段，浸沒入NaCLO溶液中，將花生根段弄碎，并攪拌，制成混合液；
[0020]b2將混合液倒入組合篩上，組合篩自上而下依次為40目、200目、325目和500目，用噴壺形成薄霧噴灑40目篩上的混合物，使線蟲和卵從根組織內(nèi)移到表面，噴淋后期使用無(wú)菌水；噴淋后，取出325目篩，用無(wú)菌水自篩的一側(cè)向另一側(cè)噴淋沖洗，使線蟲集中一側(cè)，然后再用少量無(wú)菌水從篩背面沖洗篩上物，收集液體到容器獲得根結(jié)線蟲懸液；取出500目篩，用無(wú)菌水自篩的一側(cè)向另一側(cè)噴淋沖洗，使線蟲集中一側(cè)，然后再用少量無(wú)菌水從篩背面沖洗篩上物，收集液體到容器獲得卵懸液；
[0021]c北方根結(jié)線蟲的接種與培養(yǎng)
[0022]無(wú)菌條件下，將制備好的根結(jié)線蟲懸液或卵懸液，均勻接至花生毛狀根培養(yǎng)皿，盒蓋靜置，用膜封口，培養(yǎng)獲得大量蟲卵和二齡幼蟲。
[0023]優(yōu)選的，步驟al中消毒處理過程如下:先用自來(lái)水沖洗花育45號(hào)種子20_30min，然后于無(wú)菌條件下，用濃度為75%的酒精浸泡0.5-lmin，再在0.1 %升汞中浸泡15min，最后用無(wú)菌水洗滌3?4次，每次3-5min。
[0024]步驟al中，所述培養(yǎng)基優(yōu)選無(wú)激素的MSB5培養(yǎng)基，即為MS無(wú)機(jī)鹽+B5有機(jī)成分(簡(jiǎn)稱MSB5)，大體包括:MS大量+MS微+MS鐵鹽+B5有機(jī)+蔗糖30g/L+瓊脂粉10g/L，pH值為6.00當(dāng)然上述用于花育45號(hào)種子接種的培養(yǎng)基本領(lǐng)域技術(shù)人員也可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行常規(guī)選擇。
[0025]優(yōu)選的，步驟a2中:所述發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株在_20°C低溫冰箱中凍存；所述恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度控制在28 °C;所述LB液體培養(yǎng)基中添加有50mg/L Kan ;所述搖床內(nèi)培養(yǎng)條件為溫度28°C，轉(zhuǎn)速180r/min。
[0026]優(yōu)選的，步驟bl中:將蟲癭多的花生根剪成Icm小段；所述NaCLO溶液的濃度為I % ;所述攪拌時(shí)間為lOmin。
[0027]優(yōu)選的，步驟c中:選取根結(jié)線蟲懸液Iml或卵懸液Iml接至花生毛狀根培養(yǎng)皿；所述盒蓋靜置時(shí)間為Ih ;所述培養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)時(shí)間為42d。
[0028]本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:
[0029]本發(fā)明方法繁殖率高、操作簡(jiǎn)單、不易污染、應(yīng)用范圍廣、實(shí)用性強(qiáng)，解決了難以獲得純化的大量根結(jié)線蟲的問題，且避免了盆栽實(shí)生苗接種繁殖根結(jié)線蟲方法的費(fèi)時(shí)、占據(jù)大量空間、受季節(jié)等自然和環(huán)境條件限制以及易被其他生物污染等不足。與常規(guī)寄主根系外植體培養(yǎng)法相比，毛狀根系外植體更有利于根結(jié)線蟲的侵染繁殖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0031]實(shí)施例1