一種毛竹胚乳培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及林木生物技術(shù)和細(xì)胞工程育種領(lǐng)域,特別涉及到毛竹胚乳培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]三倍體植物通常具有生長旺盛、抗逆性強(qiáng)、無籽等優(yōu)良性狀,三倍體培育是遺傳育種的重要途徑。相對(duì)于傳統(tǒng)地借助雜交創(chuàng)制三倍體而言,通過胚乳細(xì)胞培養(yǎng)再生三倍體具有周期短、效率高等優(yōu)點(diǎn);由于胚乳植物的染色體2/3來自母本,1/3來自父本,作為研究性狀遺傳規(guī)律的材料,也頗具價(jià)值;事實(shí)上,胚乳植物在形成三倍體植株的同時(shí),可以產(chǎn)生大量不同倍性的混倍體和非整倍體,可為育種提供豐富的不同倍性材料。自上世紀(jì)三十年代以來,植物胚乳培養(yǎng)的研究成為植物育種領(lǐng)域的重要技術(shù)之一:
[0003]1933年,Lampe and Mills首次報(bào)道開展玉米胚乳培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)(參考文獻(xiàn)I);
[0004]1965 年,Johri and Bho jwani 首次獲得 Exocarpos cupressiformis 的胚乳再生植株(參考文獻(xiàn)2);
[0005]此后,植物胚乳培養(yǎng)的研究吸引了國內(nèi)外眾多的科學(xué)家參與,并在眾多植物上獲得成功,主要有:
[0006]1978年,王大元等獲得普通的三倍體植株(參考文獻(xiàn)3);
[0007]1981年,孫敬三獲得大麥胚乳再生植株(參考文獻(xiàn)4);同年,桂耀林等培養(yǎng)獼猴桃胚乳獲得再生植株(參考文獻(xiàn)5);
[0008]1982年,王敬駒等獲得小黑麥雜種胚乳的再生植株(參考文獻(xiàn)6);
[0009]1990年,Gmitter等培養(yǎng)Citrus胚乳并獲得三倍體植株(參考文獻(xiàn)7);
[0010]1996年,Garg等培養(yǎng)Acacia nilotica的胚乳實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生獲得三倍體植株(參考文獻(xiàn)8);
[0011]迄今許多植物種類已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)胚乳培養(yǎng)和植株再生,特別是在麥類、玉米、水稻等農(nóng)業(yè)植物取得較大的成就,但是,同為禾本科的竹類植物,迄今未見有關(guān)于其胚乳培養(yǎng)的報(bào)道。造成這種現(xiàn)象的原因主要在于:1)與每年開花結(jié)實(shí)的林木樹種或者農(nóng)作物不同,竹子開花周期長達(dá)數(shù)十年,開花時(shí)間難以預(yù)測,胚乳獲得十分困難;2)竹子為粗放經(jīng)營的林木樹種,關(guān)于其開花生物學(xué)的研究比較薄弱,對(duì)開花后的受精時(shí)間、種胚發(fā)育過程也缺乏足夠的了解,故而難以獲得發(fā)育程度適宜的外植體;3)竹類植物以無性繁殖的方式繁衍,每年生筍長竹,人類更多地關(guān)注其筍竹產(chǎn)品的生產(chǎn),對(duì)于其科學(xué)研究的重視不夠。這些問題導(dǎo)致的共同后果就是竹類植物的種質(zhì)創(chuàng)新途徑匱乏,遺傳學(xué)和育種學(xué)的研究顯著滯后于其他植物,鑒于此種情況,本方面提供了一種毛竹胚乳培養(yǎng)的方法,從而為竹類植物的種質(zhì)創(chuàng)新增添新的技術(shù),這對(duì)推動(dòng)竹子遺傳育種領(lǐng)域的研究,具有相應(yīng)的理論意義和生產(chǎn)價(jià)值。
[0012]主要參考文獻(xiàn)
[0013]1.Lampe L,Mills C0.Growth and development of isolated endosperm andembryo of maize.Abstr Pap Bot Soc Boston,1933,32:235-243
[0014]2.Johri BM, Bhojwani SS.Growth responses of mature endosperm incultures,Nature,1965,208,1345-1347
[0015]3.王大元,張進(jìn)仁.從胚乳培養(yǎng)再生三倍體柑桔植株[J].中國科學(xué),1978,(4).
[0016]4.孫敬三,朱至清.大麥胚乳植株的誘導(dǎo)及其倍性.植物學(xué)報(bào),1981,23:262-265,
[0017]5.桂耀林,母錫金,徐廷玉,.獼猴桃胚乳培養(yǎng)分化出苗[J].植物雜志,1981,(6).
[0018]6.王敬駒,陸文梁,匡柏健.小黑麥雜種胚乳的離體培養(yǎng)研究.植物學(xué)報(bào),1982,24:420-425.
[0019]7.Gmitter FG,Ling XB,Deng XX,1990.1nduct1n of triploid Citrus plantsfrom endosperm calli in vitr0.Theor Appl Genet,80,785—790
[0020]8.Garg L?Bhandari NN? Rani V?Bhojwani SS,1996.Somatic embryogenesis andregenerat1n of triploid plants in endosperm cultures of Acacia nilotica.PlantCell Rep,15,855-858
[0021]本發(fā)明的特點(diǎn)
[0022]限于竹類植物特殊的開花結(jié)實(shí)習(xí)性等原因,目前,國內(nèi)外尚未有關(guān)于竹類植物胚乳培養(yǎng)的研究報(bào)道。作為植物種質(zhì)創(chuàng)新的有效途徑之一,胚乳培養(yǎng)在多倍體培育、性狀遺傳、新品種選育等方面具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值,特別是對(duì)于竹類植物而言,胚乳培養(yǎng)作為其種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑之一,在其遺傳學(xué)和育種學(xué)領(lǐng)域具有重要的意義。通過參考稻麥等近緣物種的同類研究,經(jīng)過開展大量研究和實(shí)驗(yàn),進(jìn)行了重要技術(shù)創(chuàng)新,發(fā)明人掌握了毛竹胚乳培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù),在國際上首次公開毛竹胚乳培養(yǎng)的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0023]—種毛竹Phyllostachys edulis胚乳培養(yǎng)的方法,其特征包括:外植體的制備和消毒,外植體接種及愈傷組織誘導(dǎo),愈傷組織的分化成苗,以及壯苗、煉苗和移栽過程,具體步驟如下:
[0024](I)外植體的制備和消毒:對(duì)開花毛竹進(jìn)行人工授粉,于授粉后30-40d取發(fā)育飽滿的種子,放入存有冰袋的保溫箱中冷藏,運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,用4°C預(yù)冷的75%乙醇消毒Imin ;然后用4°C預(yù)冷的0.2%的次氯酸鈉消毒20-25min,期間不斷振蕩;最后用4°C預(yù)冷的無菌水沖洗5-7遍,用無菌紙吸干表面水分,備用;
[0025](2)外植體接種及愈傷組織誘導(dǎo):取消毒好的外植體,用鑷子小心地剝?nèi)?nèi)外稃片,然后用鑷子輕輕擠壓種胚使胚乳擠出,將胚乳接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,于4°C冰箱中過夜,次日置于26 V暗培養(yǎng)10-20d使胚乳上形成愈傷組織,每20-30d將愈傷組織在相同培養(yǎng)基上繼代一次;愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加l-5mg/L的2,4-D、
0.3-1.0mg/L的ZT、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、15g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖、10g/L的麥芽糖、8g/L的瓊脂粉,滅菌前調(diào)整PH = 5.8 ;
[0026](3)愈傷組織的分化:將胚乳愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上,26°C光培養(yǎng)20-30d,光照時(shí)間12h/d,光照強(qiáng)度1000-15001ux,部分愈傷組織分化成苗,形成再生植株;分化培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加0.5-2.0mg/L的ZT,0.5-2.0mg/L的IBA,0.5-2.0mg/L的NAA、30g/L的麥芽糖、8g/L的瓊脂;
[0027](4)壯苗、煉苗和移栽:將再生的小植株接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)30-40d,開瓶煉苗5-10d,取出小苗清洗根部的培養(yǎng)基,再用0.1 %的高錳酸鉀溶液清洗根部,然后將小苗栽植到滅菌的介質(zhì)中,遮陰散射光培養(yǎng)一個(gè)月后,幼苗成活;壯苗培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加 l_4mg/L 的 NAA、0.2-0.5mg/L 的 TDZ、8g/L 的瓊脂、30g/L 的蔗糖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合毛竹實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0029](I)對(duì)開花毛竹進(jìn)行人工授粉,于授粉后33d取發(fā)育飽滿的種實(shí),放入裝有冰袋的保溫箱中冷藏,運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,用4°C預(yù)冷的75%乙醇消毒Imin ;然后用4°C預(yù)冷0.2%次氯酸鈉消毒20min,期間不斷振蕩;最后用4°C預(yù)冷的無菌水沖洗5遍,用無菌紙吸干表面水分,備用;
[0030](2)取消毒好的外植體,用鑷子小心地剝?nèi)?nèi)外稃片,然后用鑷子輕輕擠壓種胚使胚乳擠出,將胚乳接種到以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加3mg/L的2,4-D、0.5mg/L的ZT、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、15g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖、10g/L的麥芽糖、8g/L的瓊脂粉,滅菌前調(diào)整PH = 5.8的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,于4°C冰箱中過夜,次日置于26°C暗培養(yǎng)15d使胚乳上形成愈傷組織;
[0031](3)將胚乳愈傷組織接種到以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加0.5mg/L的ZT、1.0mg/L的IBA, 0.5mg/L的NAA、30g/L的麥芽糖、8g/L的瓊脂的分化培養(yǎng)基上,26°C光照培養(yǎng)25d,光照時(shí)間12h/d,光照強(qiáng)度15001UX,部分愈傷組織分化成苗,形成再生植株;
[0032](4)將再生的小植株接種到以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加2mg/L的NAA、0.2mg/L的TDZ、8g/L的瓊脂、30g/L的蔗糖的壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d,開瓶煉苗7d,取出小苗清洗根部的培養(yǎng)基,再用0.1 %的高錳酸鉀溶液清洗根部,然后將小苗栽植到滅菌的介質(zhì)中(山地黃壤土:蛭石:泥炭土 = I: I: I),遮陰散射光培養(yǎng)一個(gè)月后,幼苗成活。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種毛竹Phyllostachys edulis胚乳培養(yǎng)的方法,其特征包括:外植體的制備和消毒,外植體接種及愈傷組織誘導(dǎo),愈傷組織的分化成苗,以及壯苗、煉苗和移栽過程,具體步驟如下: (1)外植體的制備和消毒:對(duì)開花毛竹進(jìn)行人工授粉,于授粉后30-40d取發(fā)育飽滿的種子,放入存有冰袋的保溫箱中冷藏,運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,用4°C預(yù)冷的75%乙醇消毒Imin ;然后用4°C預(yù)冷的0.2%的次氯酸鈉消毒20-25min,期間不斷振蕩;最后用4°C預(yù)冷的無菌水沖洗5-7遍,用無菌紙吸干表面水分,備用; (2)外植體接種及愈傷組織誘導(dǎo):取消毒好的外植體,用鑷子小心地剝?nèi)?nèi)外稃片,然后用鑷子輕輕擠壓種胚使胚乳擠出,將胚乳接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,于4°C冰箱中過夜,次日置于262暗培養(yǎng)10-20d使胚乳上形成愈傷組織,每20-30d將愈傷組織在相同培養(yǎng)基上繼代一次;愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加l-5mg/L的2,4-D、.0.3-1.0mg/L的ZT、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、15g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖、10g/L的麥芽糖、8g/L的瓊脂粉,滅菌前調(diào)整PH = 5.8 (3)愈傷組織的分化:將胚乳愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上,26°C光培養(yǎng)20-30d,光照時(shí)間12h/d,光照強(qiáng)度1000-15001ux,部分愈傷組織分化成苗,形成再生植株;分化培養(yǎng)基是以 MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加 0.5-2.0mg/L 的 ZT、0.5-2.0mg/L 的 ΙΒΑ、0.5-2.0mg/L 的 NAA、.30g/L的麥芽糖、8g/L的瓊脂: (4)壯苗、煉苗和移栽:將再生的小植株接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)30-40d,開瓶煉苗.5-10d,取出小苗清洗根部的培養(yǎng)基,再用0.1 %的高錳酸鉀溶液清洗根部,然后將小苗栽植到滅菌的介質(zhì)中,遮陰散射光培養(yǎng)一個(gè)月后,幼苗成活;壯苗培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加 l-4mg/L 的 NAA、0.2-0.5mg/L 的 TDZ、8g/L 的瓊脂、30g/L 的蔗糖。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種毛竹Phyllostachys?edulis胚乳培養(yǎng)的方法,它是通過對(duì)毛竹未成熟胚乳進(jìn)行適宜消毒后,首先在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上形成愈傷組織,然后在增殖培養(yǎng)基上繼代,繼而在分化培養(yǎng)基上形成再生植株,最后經(jīng)壯苗培養(yǎng)、煉苗后移栽成活。本發(fā)明解決了毛竹胚乳培養(yǎng)的技術(shù)難題,為實(shí)現(xiàn)毛竹的倍性育種提供了技術(shù)支撐,也為其他竹類植物的相關(guān)研究提供了有價(jià)值的參考。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號(hào)】CN105075864
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510566151
【發(fā)明人】袁金玲, 顧小平, 岳晉軍, 吳曉麗
【申請(qǐng)人】中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年9月8日