一種蛇足石杉無菌苗的快速繁育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物無性繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種蛇足石杉無菌苗的快速繁育 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛇足石杉[Huperziaserrata(Thunb. )Trev.]，又名千層塔，為石杉屬多年生珍稀 藥用草本蕨類植物，因其體內(nèi)含有的次生代謝產(chǎn)物一一石杉堿甲被證明是一種高效、低毒、 可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑而倍受全球醫(yī)藥界的關(guān)注，并已將石杉堿甲制劑列 為治療老年癡呆癥的首選藥用于臨床與研究。
[0003] 自石杉堿甲問世以來，其資源問題一直沒有得到解決。首先，由于手性明顯，合成、 半合成均難度很大，雖能在實驗室初步成功，但成本上無法達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求；其次，人 們盡管在近緣植物尋找、孢子繁殖、人工栽培、組織培養(yǎng)及內(nèi)生真菌發(fā)酵等方面進(jìn)行了有益 探索，但收效甚少，基本上處于研發(fā)起步階段，不具備大規(guī)模商業(yè)化開發(fā)的價值。因此，目前 從蛇足石杉植物中提取是石杉堿甲的唯一來源。
[0004] 蛇足石杉雖然分布較廣，但它對生境要求較高，加之其植株矮小，石杉堿甲含量 低，生長周期長，資源恢復(fù)期長達(dá)15年。經(jīng)多年的極度采挖，野生資源遭到嚴(yán)重破壞，石杉 堿甲資源問題日益嚴(yán)峻。據(jù)統(tǒng)計全國現(xiàn)有的蛇足石杉儲量，尚不足以應(yīng)付10年的石杉堿甲 提取，嚴(yán)重制約了該藥的研究與應(yīng)用前景。
[0005] 隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加速及老年癡呆人群的逐年遞增，國內(nèi)外對石杉堿甲 的需求量日益增加，與之相對應(yīng)的野生資源越發(fā)匱乏，使得石杉堿甲市場供求矛盾的日益 凸顯。如何找到一個能夠在短期內(nèi)突破石杉堿甲制劑產(chǎn)業(yè)鏈資源瓶頸的蛇足石杉快速繁殖 技術(shù)途徑，已迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對蛇足石杉野生資源短缺，本發(fā)明的目的在于，提供一種蛇足石杉無菌苗快速 繁育培養(yǎng)的方法，以滿足市場需要。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。
[0008] -種蛇足石杉無菌苗的快速繁育方法，其具體操作步驟如下： (1)芽胞的采集與處理 采集飽滿、無病蟲害的蛇足石杉植株芽胞，流水沖洗處理〇. 5-1小時后，放入帶潤濕吸 水紙的培養(yǎng)器皿中，然后于4°C條件下低溫保存與處理。
[0009] (2)外植體表面消毒 將低溫保存與處理的芽胞置于超凈工作臺中，無菌水清洗2-3遍，無菌紙吸干表面水 分；然后浸泡于70%乙醇中30-60秒，無菌水清洗3-5遍；最后置于5%的次氯酸鈉溶液中消 毒8-10分鐘，無菌水清洗3-5遍。
[0010] (3)內(nèi)生菌殺滅培養(yǎng)與芽胞萌發(fā) 經(jīng)表面滅菌的外植體轉(zhuǎn)移至添加2-3g/l苯菌靈可濕粉DW50的改良Moore's(莫氏)液 體培養(yǎng)基中，置于20-23°C、光照強度500-10001x、光照時間12-14h/d條件下培養(yǎng)3-4周， 對外植體的內(nèi)生菌進(jìn)行殺滅與芽胞萌發(fā)培養(yǎng)。
[0011] (4)幼苗的繼代與增殖 將已滅菌的外植體轉(zhuǎn)至以苔蘚為基質(zhì)，添加改良Moore's培養(yǎng)液以及0. 015-0. 045mg/IIBA，0.3-0.9mg/lKT，0.25-0.75mg/lNAA的植物激素組合體系中，于20-23°C、光照時間 12-14h/d、相對濕度70-90%、光照強度1000-30001x條件下培養(yǎng)，每兩個月更換一次培養(yǎng) 基。
[0012]A、所述的改良Moore's培養(yǎng)基由下列物質(zhì)組成：50mg/L硫酸鎂（MgSO4 *7H20)、 25mg/L氯化鈣（CaCl2CH2O)、50mg/L磷酸氫二鉀（K2HPO4)、50mg/L氯化銨（NH4C1)、 5. 56mg/L硫酸亞鐵（FeSO4WH2O)、9. 3lmg/L乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTACH2O)、 0. 415mg/L碘化鉀（KI)、0? 125mg/L鉬酸鈉（Na2MoO4CH2O)、0? 012mg/L硫酸銅 (CuSO4*5H20)、0? 012mg/L氯化鈷（C〇C12*6H20)、11. 15mg/L硫酸錳（MnS04*H20)、4. 3mg/L 硫酸鋅（ZnS04*7H20)、20g/L蔗糖。
[0013]B、所述改良Moore's培養(yǎng)液高壓滅菌前調(diào)pH值為5. 6;培養(yǎng)液與苔蘚基質(zhì)滅菌條 件為：121°C、104kPa下滅菌 20min。
[0014] (5)試管苗的馴化培養(yǎng) 將種植基質(zhì)（原生土：腐殖土 ：木肩：菌渣=1:3:3:3)先用苯菌靈稀溶液滅菌，再在陽 光下暴曬處理8h;取繼代增殖培養(yǎng)2次的試管苗開瓶蓋馴化一周后，洗凈根部培養(yǎng)液，移植 到經(jīng)消毒滅菌處理過的種植基質(zhì)上，大棚培養(yǎng)1-2個月，即可獲得馴化苗，以備大田移栽。 大棚培養(yǎng)條件為：遮陽度60~90 %，溫度控制在20-30°C、相對濕度控制在70-90%。
[0015] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下幾個方面。
[0016] 1、芽胞是蛇足石杉上新生的無性繁殖芽，較根、莖、葉等外植體更易除菌，易于建 立蛇足石杉的無菌培養(yǎng)再生體系；同時，以芽胞作為外植體進(jìn)行快速繁殖，不必破損原植 物，有利于合理保護及可持續(xù)開發(fā)利用蛇足石杉野生資源，改善植物瀕危的局面。
[0017] 2、采用4°C低溫處理，促進(jìn)了芽胞快速萌發(fā)，其萌發(fā)率高達(dá)98%;以常規(guī)表面滅 菌結(jié)合高效滅菌劑苯菌靈進(jìn)行內(nèi)生菌殺滅培養(yǎng)，實現(xiàn)了芽胞滅菌與萌發(fā)的同步化，獲得了 95%左右的無菌萌發(fā)苗，并且有效地控制了外植體的褐化和白化。
[0018] 3、選擇改良Moore's培養(yǎng)基作為芽胞基本培養(yǎng)基，配以0.015-0. 045mg/lIBA， 0? 3-0. 9mg/lKT，0? 25-0. 75mg/lNAA的激素組合及苔蘚基質(zhì)，在20-23°C、光照強度 1000-30001x，光照時間12-14h/d、相對濕度70-90%的培養(yǎng)條件下，實現(xiàn)了蛇足石杉增殖、 生根同步化和快速繁殖。實驗結(jié)果表明：芽胞在上述條件下培養(yǎng)6個月，芽胞苗最高達(dá) 6. 9cm/株，根系生長快且生根數(shù)達(dá)7條/株，生物量增加6. 9倍/株。
[0019] 4、本發(fā)明方法獲得的試管苗移植至經(jīng)苯菌靈稀溶液滅菌，再在陽光下暴曬處理8h 的種植基質(zhì)（原生土：腐殖土 ：木肩：菌渣=1:3:3:3)上，大棚培養(yǎng)馴化1-2個月，在遮陽度 60~90%，溫度控制在20-30°C、相對濕度控制在70-90%的條件下，存活率可達(dá)96%以上，為 實現(xiàn)蛇足石杉的大規(guī)模工廠化育苗奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0020] 圖1飽滿、無病蟲害的芽胞。
[0021] 圖2芽胞滅菌與萌發(fā)。
[0022] 圖3轉(zhuǎn)接到苔蘚上的幼苗。
[0023] 圖4繼代增殖的小苗。
[0024] 圖5小植株已分叉且根系發(fā)達(dá)。
[0025] 圖6移栽基質(zhì)上的馴化植株。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但不僅限于此。
[0027] 實施例一 1.芽胞低溫處理及滅菌條件的優(yōu)化 9-10月，采集飽滿、無病蟲害的蛇足石杉植株芽胞，流水沖洗處理0. 5-1小時后，放入 帶潤濕吸水紙的培養(yǎng)器皿中（見附圖1)，然后置于4°C冰箱中低溫保存；將經(jīng)低溫處理的芽 胞置于超凈工作臺中，無菌水清洗2-3遍，無菌紙吸干表面水分；然后浸泡于70%乙醇中 30-60秒，無菌水清洗3-5遍；最后置于5%的次氯酸鈉溶液中消毒8-10分鐘，無菌水清洗 3-5 遍。
[0028] 經(jīng)表面滅菌的外植體轉(zhuǎn)移至添加苯菌靈可濕粉DW50的改良Moore's(莫氏)液體 培養(yǎng)基中，置于20-23°C、光照強度500-10001x、光照時間12-14h/d條件下培養(yǎng)3-4周，對 外植體的內(nèi)生菌進(jìn)行殺滅與芽胞萌發(fā)培養(yǎng)，試驗結(jié)果見下表1。
[0029] 表1不同低溫處理時間及滅菌劑濃度對芽胞萌發(fā)及滅菌效果的影響