一種含重組人prdx4蛋白的人精液冷凍保護(hù)劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于人精液冷凍保護(hù)劑領(lǐng)域。
[0002]
【背景技術(shù)】 陽00引據(jù)2012年忡國不孕不育現(xiàn)狀調(diào)研報告》顯示，中國不孕不育的發(fā)病率由20年前 的3%提高至15%，其中男性因素占30%~40%，男性不育已成為一嚴(yán)峻社會問題。目前，輔 助生殖技術(shù)是男性不育癥治療的重要手段，而精液冷凍保存是其中不可缺少的環(huán)節(jié)，其不 僅為無精子癥或男方有遺傳疾病的不育夫婦提供了生育可能，而且還為將要接受放化療的 腫瘤患者或有生育力保存要求的夫婦提供了生育保險。
[0004] 精液凍融過程中，大量活性氧自由基異常產(chǎn)生，而且凍融的過程破壞了精液中抗 氧化酶的活性，一邊的產(chǎn)生大大增加，一邊體內(nèi)自然存在的氧化應(yīng)激清除能力被削弱，最終 破壞了精漿中氧化與抗氧化的平衡，導(dǎo)致精子發(fā)生氧化應(yīng)激，使其活力減弱，DNA損傷，進(jìn)而 造成受精能力下降。因而，尋找有效的途徑預(yù)防或減少精子在凍融過程中受到的氧化損傷 具有重要意義。 陽〇化]優(yōu)化改良精液冷凍保護(hù)液是解決運(yùn)一問題的有效途徑，其中抗氧化劑是目前研究 比較熱口的方向。近年來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在精液冷凍保護(hù)液中添加酶類抗氧化劑巧日超氧化物 歧化酶、過氧化氨酶、谷脫甘膚過氧化物酶等）或非酶類抗氧化劑巧日牛橫酸、k肉堿、茶多 酪、維生素C、E等）等成分能夠抑制精子氧化損傷，提高復(fù)蘇后精子質(zhì)量?；痳oxiredoxins (PRDXs)是一新近發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶系，包含6個成員（PRDX1~6)，與傳統(tǒng)抗氧化酶相比，其具 有更高的活性。其中PRDX4具有分泌信號膚，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外。有研究 報道，PRDX4在人精漿及精子中含量豐富，并積極的與肥02反應(yīng)保護(hù)精子免受氧化損傷。此 外，Prdx4基因敲除小鼠顯示睪丸萎縮，并且精子DNA損傷增加?？梢?，PRDX4在精液抗氧化 防御中發(fā)揮重要作用，其可能是一潛在的更高效的精液冷凍保護(hù)液添加劑。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種含重組人P畑X4蛋白的人精液冷凍保護(hù)劑。
[0008] 具體的，所述人精液冷凍保護(hù)劑由重組人PRDX4蛋白和人精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液組 成，其中重組人PRDX4蛋白在每100ml人精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液中的添加量為5mg~20mg。
[0009] 具體的，所述人精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液為GEYC冷凍保護(hù)劑，每100ml的GEYC冷凍保 護(hù)劑中含有下列物質(zhì)：葡萄糖1.5g，巧樣酸S鋼二水1.3g，甘氨酸1.3g，甘油15ml，卵黃 20ml，余量為純化水。
[0010] 所述人P畑X4基因的GenBank登錄號為NM_006406. 1，人P畑X4蛋白的氨基酸序列 的登錄號為NP_006397. 1。本發(fā)明所用重組人PRDX4蛋白可W通過基因工程技術(shù)獲得。
[0011] 有研究報道，PRDX4在人精漿及精子中含量豐富，并積極的與肥02反應(yīng)保護(hù)精子 免受氧化損傷。此外，Prdx4基因敲除小鼠顯示睪丸萎縮，并且精子DM損傷增加。可見，PRDX4在精液抗氧化防御中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明將基因工程表達(dá)的重組人PRDX4蛋白作 為添加劑加入到GEYC冷凍保護(hù)劑中，W對抗精液冷凍保存過程中產(chǎn)生的自由基對精子的 氧化損傷，取得了優(yōu)于GEYC的保護(hù)效果。
[0012]
【具體實施方式】
[0013] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明： 實施例1 :重組人P畑X4蛋白的制備 根據(jù)編碼人PRDX4基因的序列設(shè)計并合成一對特異引物(上游引物：5'-tatccatatgtg ggagacagaggagag-3，，下游引物：5, -ttactcgagattcagtttatcgaaatac-3,），在上下游引物 5'端分別添加了酶切位點Ndel及化〇1。W常規(guī)方法抽提的人附睪mRNA進(jìn)行RT-PCR獲 得cDNA，再WcDNA為模板擴(kuò)增出人P畑X4基因。將擴(kuò)增出的人P畑X4基因片段經(jīng)Ndel及 化〇1雙酶切后，插入原核表達(dá)載體祀T32b( + )的Ndel及化〇1酶切位點之間，即得到表達(dá) 人P畑X4蛋白的原核表達(dá)載體祀T3化（ + )/P畑X4。再將該載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株化igamiB (DE3)，即得到表達(dá)人P畑X4蛋白的大腸桿菌基因工程菌。該工程菌表達(dá)的P畑X4蛋白在C 端帶有6個組氨酸的標(biāo)簽，W利于純化。挑取單克隆至含氨節(jié)青霉素的LB液態(tài)培養(yǎng)基中，37 度搖床培養(yǎng)至〇的。。=〇. 6~0. 8后，加入IPTG至終濃度0. 4mMW誘導(dǎo)P畑X4蛋白的表達(dá)，3~4h 后離屯、收集菌體。將菌體重懸于PBS中破碎后，將上清過儀親和層析柱進(jìn)行親和純化，最后 再用G-25脫鹽柱將蛋白置換到PBS中。BCA法測定蛋白濃度，0. 22微米無菌濾器過濾除菌 后可用于人精液冷凍保護(hù)劑的制備。一般制備的重組人P畑X4蛋白的濃度在2~3mg/ml左 -^5"〇
[0014] 實施例2 :含重組人P畑X4蛋白的人精液冷凍保護(hù)劑的制備 準(zhǔn)確稱取葡萄糖1.5g，巧樣酸=鋼二水1.3g，甘氨酸1.3g，加純水至65ml，完全溶解 后，加入15ml甘油，混勻。再加入20ml卵黃(從新鮮雞蛋中抽取得到)，所制成的懸浮液置 56°C水浴中40分鐘，經(jīng)常攬拌，即制成人精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液，也是GEYC冷凍保護(hù)劑。冷卻 后的人精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液，按終濃度0.Img/ml的量加入實施例1得到的重組人PRDX4蛋 白，混勻，最后用0. 45ym無菌濾器過濾即制得含重組人PRDX4蛋白的人精液冷凍保護(hù)劑， 無菌分裝后，-70度保存，3個月內(nèi)使用。 陽0巧]實施例3冶重組人PRDX4蛋白的人精液冷凍保護(hù)劑用于人精液的冷凍保存 本發(fā)明選擇煙臺銃壞頂醫(yī)院生殖中屯、口診的50份精液樣本，精液參數(shù)符合世界衛(wèi)生 組織（WK)，2010)所規(guī)定的正常精液標(biāo)準(zhǔn)，年齡在28~35周歲，近期無致崎因素接觸史， 已生育正常后代。
[0016] 精液凍存及復(fù)蘇程序：將完全液化的精液與冷凍保護(hù)劑W2:1的體積比混勻后， 在30~35°C解育5分鐘，裝入冷凍管中。先置于4°C冰箱1小時，再將其懸于液氮蒸氣與空 氣的混合氣中（-80°C~-100°C) 15分鐘，然后投入液氮中。冷凍保存1個月后，37°C水浴 中復(fù)蘇5~10分鐘。
[0017] 每份新鮮精液液化后，分為3份做如下處理： (1)凍前組：直接檢查各精液參數(shù)，結(jié)果見表1 ; (2) 對照組：加入GEYC冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存，一個月后復(fù)蘇，檢查各精液參數(shù)，結(jié) 果見表1 ; (3) 實驗組：加入實施例2制備的人精液冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存，一個月后復(fù)蘇，檢 查各精液參數(shù)，結(jié)果見表1。
[0018] 對照組和實驗組數(shù)據(jù)用SPSS22. 0軟件進(jìn)行配對t檢驗統(tǒng)計學(xué)分析，P< 0. 05， 二者有統(tǒng)計學(xué)差異，說明加入含重組人PRDX4蛋白的人精液冷凍保護(hù)劑具有更好的保護(hù)效 果。
[0019] 表1冷凍前后各組精液參數(shù)比較分析
注：各項結(jié)果均W均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差表示； 對照組：加入GEYC冷凍保護(hù)劑；實驗組：加入含重組人P畑X4蛋白的人精液冷凍保護(hù) 劑； 與對照組比較，*:P<0. 05。
【主權(quán)項】
1. 一種人精液冷凍保護(hù)劑，其特征在于，所述人精液冷凍保護(hù)劑由重組人PRDX4蛋白 和人精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液組成，其中，重組人PRDX4蛋白在每100mL人精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液 中的添加量為5mg~20mg。2. 如權(quán)利要求1所述的含重組人PRDX4蛋白的人精液冷凍保護(hù)劑，其特征在于所述人 精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液為GEYC冷凍保護(hù)劑，每100mLGEYC冷凍保護(hù)劑含有下列物質(zhì)：葡萄糖 1.5g，檸檬酸三鈉二水1.3g，甘氨酸1.3g，甘油15ml，卵黃20ml，余量為純化水。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種含重組人PRDX4蛋白的人精液冷凍保護(hù)劑，所述的人精液冷凍保護(hù)劑由重組人PRDX4蛋白和人精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液組成，其中重組人PRDX4蛋白在每100ml人精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液中的添加量為5mg~20mg。每100ml的人精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液中含有下列物質(zhì)：葡萄糖？1.5g，檸檬酸三鈉二水1.3g，甘氨酸1.3g，甘油15ml，卵黃20ml，余量為純化水。本發(fā)明首次將重組人PRDX4蛋白用于人精液的冷凍保存，復(fù)蘇后的人精子活力、存活率及穿卵率均顯著高于對照組（使用未添加重組人PRDX4蛋白的人精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液），而DNA損傷率則低于對照組，證明添加重組人PRDX4蛋白能夠改善人精液冷凍保護(hù)基礎(chǔ)液對人精子的冷凍保存效果。
【IPC分類】A01N1/02
【公開號】CN105211054
【申請?zhí)枴緾N201510759002
【發(fā)明人】劉娟, 朱鵬
【申請人】劉娟, 朱鵬
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年11月10日