鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細(xì)微種子快速計(jì)數(shù)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)，蘭科石斛屬多年生草本植物，常用中藥，為《中華人民共和國(guó)藥典》所收載。分布于我國(guó)秦嶺、淮河以南諸省區(qū)，生長(zhǎng)在高山峻嶺懸崖峭壁和巖石縫隙或深山古樹(shù)上。鐵皮石斛具有生津、止渴、鎮(zhèn)痛、消除水腫之功效，主治熱病陰虛、目暗、胃弱、聲音嘶啞等疾病，對(duì)聲帶疲勞、聲音嘶啞，恢復(fù)其美音有特殊療效。鐵皮石斛為瀕危物種，屬國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物，其新鮮莖及炒制烘干后的鐵皮楓斗都是名貴中藥材?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用和藥理研究證實(shí)，鐵皮石斛具有滋陰潤(rùn)肺、養(yǎng)胃生津、健腦明目、保肝寧心、清熱降火、補(bǔ)五臟之虛勞、輕身延年的神奇功效，對(duì)慢性疲勞綜合癥、肺病、冠心病、腎病、慢性肝病、高血壓、高血脂、高血糖、糖尿病、慢性胃病、干燥綜合癥、癌癥等疾病都有確切療效和調(diào)理康復(fù)作用；增強(qiáng)肌體免疫力、抗氧化、抗衰老，對(duì)煙酒過(guò)度、勞累過(guò)度、夜生活過(guò)度、用眼用腦過(guò)度、聲音嘶啞、口干舌燥、年老性體弱力衰陰虛等康復(fù)有特殊療效。
[0003]鐵皮石斛在自然狀態(tài)下發(fā)芽率不及5%，繁殖率非常低，多以分株法繁殖，難以滿足市場(chǎng)需求?，F(xiàn)在鐵皮石斛主要以種子為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)生產(chǎn)試管苗的方式進(jìn)行繁育。鐵皮石斛種子主要存在于蒴果中，蒴果長(zhǎng)約1.8?2.2cm、直徑0.5?0.8cm，內(nèi)含有幾萬(wàn)至十幾萬(wàn)粒種子，細(xì)小如粉塵狀，在顯微鏡下觀察到種子結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，僅有一個(gè)簡(jiǎn)單的胚及單層細(xì)胞的翹狀種皮結(jié)構(gòu)，無(wú)胚乳，種子長(zhǎng)X寬平均為126Χ84μπι。由于鐵皮石斛的種子很細(xì)微，很難把種子分離開(kāi)來(lái)，用常規(guī)方法難以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)蒴果所含種子量，且種子在自然狀態(tài)下不易保存，很容易失活。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種使用簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng)的鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法，以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)鐵皮石斛蒴果中的種子數(shù)量，為石斛育苗提供準(zhǔn)確的指導(dǎo)和參考。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)問(wèn)題:鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法，將鐵皮石斛的種子萌發(fā)生長(zhǎng)成小苗，通過(guò)計(jì)算小苗的數(shù)量得到種子的數(shù)量。
[0006]上述的鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法，將鐵皮石斛蒴果中的種子播在培養(yǎng)基表面使其萌發(fā)生長(zhǎng)成小苗。
[0007]培養(yǎng)基組成為MS+L 5mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA+200g/L 馬鈴薯浸出液 +20g/L 蔗糖+5g/L 瓊脂，ρΗ5.8。
[0008]小苗平均株高大于等于5.0mm。
[0009]上述鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法，包括以下步驟:
[0010]〈1>培養(yǎng)基制備
[0011]按配方制備培養(yǎng)基，并用直徑6cm、高10cm的平底玻璃瓶分裝，每瓶裝25ml，然后置121°C、1.lkg/cm2的壓力下滅菌20min，待用；
[0012]〈2>種子處理
[0013]鐵皮石斛蒴果依次用洗潔精水溶液浸泡5min、自來(lái)水沖洗15_30min，然后在超凈工作臺(tái)上放入lg/LHgCl2溶液中滅菌15min，無(wú)菌水沖洗5次后，無(wú)菌濾紙吸干果實(shí)表面水分，待用；
[0014]〈3>種子播種
[0015]將蒴果中的種子接入培養(yǎng)基表面；
[0016]〈4>種子培養(yǎng)
[0017]將接好的培養(yǎng)基放25°C培養(yǎng)室內(nèi)，在輔助光照10-12小時(shí)/天、光照強(qiáng)度15001ux條件下培養(yǎng)；
[0018]〈5>種子計(jì)數(shù)
[0019]待種子長(zhǎng)成小苗，平均株高達(dá)5.0mm，取出全部小苗計(jì)數(shù)，得到蒴果中種子的數(shù)量。
[0020]針對(duì)鐵皮石斛的種子很細(xì)微難于分離計(jì)數(shù)且不易保存的問(wèn)題，根據(jù)種子在蒴果中可保存較長(zhǎng)時(shí)間，生產(chǎn)上種子保存均采用蒴果保存的方式，發(fā)明人建立了一種鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法，將鐵皮石斛的種子萌發(fā)生長(zhǎng)成小苗，通過(guò)計(jì)算小苗的數(shù)量得到種子的數(shù)量。由于該法系將細(xì)微、難以采用常規(guī)的、直接肉眼分辨計(jì)數(shù)的鐵皮石斛蒴果中的種子播在培養(yǎng)基表面，利用配制培養(yǎng)基豐富的營(yíng)養(yǎng)成份，為鐵皮石斛種子萌發(fā)及生長(zhǎng)提供養(yǎng)料和水分，確保其蒴果保存的種子在培養(yǎng)基上基本可以成活(成熟種子99%在培養(yǎng)基上能萌發(fā)生長(zhǎng))，并讓種子萌發(fā)生長(zhǎng)成肉眼能清楚分辨和計(jì)數(shù)的一定大小的小苗(平均株高達(dá)5.0mm)，使之能直觀、簡(jiǎn)便計(jì)數(shù)，則通過(guò)計(jì)數(shù)小苗數(shù)量即可得到種子的數(shù)量。本發(fā)明使用簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng)、不需要借助其他較精密的顯微儀器設(shè)備，就可以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)鐵皮石斛蒴果中的種子數(shù)量，從而方便得出生產(chǎn)種苗的數(shù)量，這為大規(guī)模育苗和生產(chǎn)提供準(zhǔn)確的指導(dǎo)和參考。
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例
[0022]〈1>培養(yǎng)基制備
[0023]培養(yǎng)基組成為MS+L 5mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA+200g/L 馬鈴薯浸出液 +20g/L 蔗糖+5g/L 瓊脂，ρΗ5.8 ;
[0024]按配方制備培養(yǎng)基，并用直徑6cm、高10cm的平底玻璃瓶分裝，每瓶裝25ml，然后置121°C、1.lkg/cm2的壓力下滅菌20min，待用；
[0025]<2>種子處理
[0026]9月下旬至11月下旬，采收健康飽滿、無(wú)蟲(chóng)蛀、果皮稍變黃、未開(kāi)裂成熟的鐵皮石斛蒴果依次用洗潔精水溶液浸泡5min、自來(lái)水沖洗15_30min，去掉多余的果柄、果蒂等，然后在超凈工作臺(tái)上放入lg/LHgCl2溶液中滅菌15min，無(wú)菌水沖洗5次后，無(wú)菌濾紙吸干果實(shí)表面水分，待用；
[0027]<3>種子播種
[0028]在超凈工作臺(tái)，于蒴果的一端切一小口，輕輕地抖動(dòng)蒴果，將蒴果中的種子薄薄地、均勻地接入培養(yǎng)基表面；共播種10個(gè)蒴果，每個(gè)果一個(gè)編號(hào)，根據(jù)果實(shí)大小，每果播幾十瓶至百多瓶不等；
[0029]<4>種子培養(yǎng)
[0030]將接好的培養(yǎng)基放25°C培養(yǎng)室內(nèi)，在輔助光照10-12小時(shí)/天、光照強(qiáng)度15001ux條件下培養(yǎng)；
[0031]〈5>種子計(jì)數(shù)
[0032]在進(jìn)行鐵皮石斛試管苗培養(yǎng)過(guò)程中，種子先萌發(fā)生長(zhǎng)成原球莖，原球莖繼續(xù)培養(yǎng)就長(zhǎng)成根、莖、葉齊全的小苗，待粉狀的種子培養(yǎng)100天后，小苗平均株高達(dá)5.0mm(為原胚的35.9倍)，肉眼能很容易分辨，取出每個(gè)果的全部小苗，以20株為一組計(jì)數(shù)，就很容易得出各個(gè)蒴果中的種子量。
[0033]結(jié)果:10個(gè)蒴果中的種子數(shù)量分別為71500個(gè)、43500個(gè)、44500個(gè)、26600個(gè)、35196 個(gè)、53762 個(gè)、133100 個(gè)、95800 個(gè)、85300 個(gè)、75600 個(gè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法，其特征在于將鐵皮石斛的種子萌發(fā)生長(zhǎng)成小苗，通過(guò)計(jì)算小苗的數(shù)量得到種子的數(shù)量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法，其特征在于將鐵皮石斛蒴果中的種子播在培養(yǎng)基表面使其萌發(fā)生長(zhǎng)成小苗。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法，其特征在于:所述培養(yǎng)基組成為 MS+L 5mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA+200g/L 馬鈴薯浸出液 +20g/L 蔗糖 +5g/L 瓊脂，pH5.8。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法，其特征在于:所述小苗平均株高大于等于5.0mmο5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法，其特征在于包括以下步驟: <1>培養(yǎng)基制備 按配方制備培養(yǎng)基，并用直徑6cm、高10cm的平底玻璃瓶分裝，每瓶裝25ml，然后置121°C、1.lkg/cm2的壓力下滅菌20min，待用； <2>種子處理 鐵皮石斛蒴果依次用洗潔精水溶液浸泡5min、自來(lái)水沖洗15-30min，然后在超凈工作臺(tái)上放入lg/LHgCl2溶液中滅菌15min，無(wú)菌水沖洗5次后，無(wú)菌濾紙吸干果實(shí)表面水分，待用； <3>種子播種 將蒴果中的種子接入培養(yǎng)基表面； <4>種子培養(yǎng) 將接好的培養(yǎng)基放25°C培養(yǎng)室內(nèi)，在輔助光照10-12小時(shí)/天、光照強(qiáng)度15001uX條件下培養(yǎng)； <5>種子計(jì)數(shù) 待種子長(zhǎng)成小苗，平均株高達(dá)5.0mm，取出全部小苗計(jì)數(shù)，得到蒴果中種子的數(shù)量。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鐵皮石斛種子的小苗計(jì)數(shù)法，將鐵皮石斛的種子萌發(fā)生長(zhǎng)成小苗，通過(guò)計(jì)算小苗的數(shù)量得到種子的數(shù)量。由于該法系將細(xì)微、難以采用常規(guī)的、直接肉眼分辨計(jì)數(shù)的鐵皮石斛蒴果中的種子播在培養(yǎng)基表面，利用配制培養(yǎng)基豐富的營(yíng)養(yǎng)成份，為鐵皮石斛種子萌發(fā)及生長(zhǎng)提供養(yǎng)料和水分，確保其蒴果保存的種子在培養(yǎng)基上基本可以成活，并讓種子萌發(fā)生長(zhǎng)成肉眼能清楚分辨和計(jì)數(shù)的一定大小的小苗，使之能直觀、簡(jiǎn)便計(jì)數(shù)，則通過(guò)計(jì)數(shù)小苗數(shù)量即可得到種子的數(shù)量。本發(fā)明使用簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng)、不需要借助其他較精密的顯微儀器設(shè)備，就可以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)鐵皮石斛蒴果中的種子數(shù)量，從而方便得出生產(chǎn)種苗的數(shù)量，這為大規(guī)模育苗和生產(chǎn)提供準(zhǔn)確的指導(dǎo)和參考。
【IPC分類】A01H4/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105325297
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510781009
【發(fā)明人】蒙愛(ài)東, 閆志剛, 林偉, 繆劍華, 黃名塤
【申請(qǐng)人】廣西壯族自治區(qū)藥用植物園
【公開(kāi)日】2016年2月17日
【申請(qǐng)日】2015年11月13日