具有粉紅色果實的番茄植物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及植物生物技術和植物育種的領域。本發(fā)明提供了的栽培番茄（Solanum lycopersicum)植物，其包含具有一個或多個突變的mybl2等位基因，所述突變導致產(chǎn)生突 變mybl2蛋白，其中所述突變mybl2蛋白在SEQIDN0:1或其變體中具有G50R氨基酸置換， 所述變體與SEQIDN0:1具有至少85%的氨基酸序列同一性；或者，其中所述突變mybl2蛋 白在SEQIDNO: 1或其變體中包含氨基酸61至338的缺失，所述變體與SEQIDNO: 1具有 至少85%的氨基酸序列同一性。本發(fā)明還提供了包含編碼本發(fā)明的突變mybl2蛋白的內(nèi)源 基因的番茄植物，其果實在果實發(fā)育的澄色后期和紅熟期顯示出無色的表皮并具有粉紅色 的外觀。此外，本發(fā)明提供了本發(fā)明的番茄植物的番茄果實、種子、花粉、植物部分和后代。 本發(fā)明還提供了運樣的番茄種子：本發(fā)明的植物可從其中生長，和/或本發(fā)明的突變mybl2 基因可從其中可獲得并可通過常規(guī)育種被引入任何其他番茄植物中，W生成其他產(chǎn)生粉紅 色果實的番茄植物。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的植物果實或由其組成的食品和食品產(chǎn) 品。本文還包括將本發(fā)明的植物、種子、植物組織和細胞和/或由運些制成的食品和/或飼 料產(chǎn)品與任何其他番茄植物、種子、組織、細胞、食品或飼料區(qū)分開的方法，由此檢測了突變 mybl2基因、mRNA(cDNA)和/或蛋白質(zhì)的存在。 陽00引本發(fā)明還提供了內(nèi)源性突變mybl2基因、mRNA(cDNA)和/或由所述基因編碼的mybl2蛋白，具有至少一個人工誘導的非轉(zhuǎn)基因突變；化及產(chǎn)生本發(fā)明的植物的方法。
【背景技術】
[0003] 番茄果實的表皮顏色是由Y基因決定。基因Y產(chǎn)生遍布果實表皮 細胞壁的獨特的黃色素，而其等位基因，y，在表皮壁中產(chǎn)生透明狀或無色狀 (E.W.Lindstrom, 1925,InheritanceinTomatoes,Genetics,issue10 (4)pp305 - 317)。 W04] 粉紅色番茄果實在亞洲非常流行用于食用。首次記載的粉紅色果實 是在帶有缺乏黃色素的透明表皮的果實中化inds化om, 1925,Inheritancein Tomatoes,Genetics,issue10 (4)pp305 - 317)。遺傳研究表明粉紅色果實是由1號染 色體上存在的單基因的隱性y(黃色）基因座造成，而紅色的果實具有顯性的Y等位基因 (Xindstrom1925)。所述Y基因已被鑒定為MYB12度allesteretal，見下文）。 陽〇化]番茄果實的顏色主要取決于類胡蘿h素和類黃酬。成熟番茄果實的紅色主要是由 于在果實成熟過程中產(chǎn)生的類胡蘿l·素全反式-番茄紅素的累積。除了番茄紅素，番茄果 實包含顯著水平的紫黃素（violaxanthin)和葉黃素（lutein)。在類胡蘿h素途徑中具有 突變的番茄植物具有改變的類胡蘿l·素組成，其導致不同的果實顏色，例如澄色（橘子0) 或黃色（r)果實（Xewinsohnetal. 2005TrendsFoodSciTechnol. ,Vol16pp407_415)。
[0006] 此外，類黃酬在決定番茄果實的顏色中起作用。類黃酬主要在果皮中積累，因為 果肉中的類黃酬途徑不活躍。番茄果皮中最豐富的類黃酬之一是黃色的抽配基查爾酬 (naringeninchalcone)。此外，已經(jīng)在番茄果實中鑒定出最多達70種不同的類黃酬。
[0007]Ballester等人進行了來源于番茄"Moneyberg"和野生種克梅留斯基番茄 (Solanumchmielewskii)之間的雜交的漸滲系（IL)群體的表型分析，其顯示出Ξ個具有 粉紅色果實顏色的IL。運些IL在1號染色體的短臂上具有純合型克梅留斯基番茄基因 滲入，與已知導致無色表皮的y(黃色）突變的位點一致，并因此在與紅色果肉結合時為粉 紅色的果實。該同一研究表明，粉紅色果實在果皮中缺少黃色類黃酬抽配基查爾酬的成熟 依賴性的累積一一該物質(zhì)在Moneyberg果實的表皮中隨成熟而增加，而類胡蘿h素水平不 受影響度allesteretal. 2010PlantPhysiology,vol15化P71-84)。在同一研究中， Ballesteretal.度allesteretal.2010PlantPhysiology,vol15化P77,右欄）公開 了 "推斷的獲自商業(yè)來源的粉紅色MYB12等位基因的氨基酸序列與紅色Moneyberg等位 基因相同"，表明了"在所有[由Ballesteretal.]測試的粉紅色表型中觀察到的失調(diào)的 MYB12基因表達，而非異常的MYB12[蛋白]功能，是粉紅色表型的主要原因"。使用基因沉 默研究遺傳作圖、分離分析和VIGS(病毒誘導的基因沉默）結果確認了粉紅色的運一原因。 [000引因此，到目前為止，現(xiàn)有的商業(yè)非-GM0無色皮（即粉紅色）y突變體的分析顯示在 mybl2等位基因和其啟動子序列中都沒有突變，運表明y突變體表型是由于調(diào)芐基因，即額 外的突變等位基因中的突變（Adatoetal2009PL0SGeneticsvol5issue12el000777)。
[0009] 盡管如此，目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)番茄果實的替代的非-GMO粉紅色突變體。
[0010]因此，需要產(chǎn)生粉紅色番茄果實的替代的、非-GM0的、栽培的番茄植物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，具有異常的MYB12蛋白質(zhì)功能，而非失調(diào)的MYB12基因表達 的番茄種的栽培植物產(chǎn)生粉紅色外觀的番茄果實?？紤]到Ballester et al. 2010和Adato et al. (2009)(在上文），運是非常令人驚奇的。
[0012] 因此，本發(fā)明設及番茄種的栽培植物，其包含具有一個或多個突變的mybl2等位 基因，所述突變導致產(chǎn)生突變mybl2蛋白，其中所述突變mybl2蛋白在SEQIDN0:1或其變 體中具有G50R氨基酸置換，所述變體與SEQIDNO: 1具有至少約85%的氨基酸序列同一 性；
[0013] 或者，其中所述突變mybl2蛋白在SEQIDNO: 1或其變體中包含氨基酸61至338 的缺失，所述變體與SEQIDNO: 1具有至少約85%的氨基酸序列同一性。
[0014] 在一個實施方案中，本發(fā)明設及本發(fā)明的栽培的番茄植物，其中基因組mybl2基 因中的所述突變導致所述植物的果實在果實發(fā)育的澄色期后期和紅熟期顯示出粉紅色外 觀。
[0015]一般忡定女
[0016] 術語"核酸序列"（或核酸分子）是指單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子，尤其是 編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的DNA。"分離的核酸序列"是指運樣的核酸序列，即其 不再處于分離出其的天然環(huán)境中，例如，在細菌宿主細胞中或者在植物細胞核或質(zhì)體基因 組中的核酸序列。
[0017] 術語"蛋白質(zhì)"或"多膚"可互換使用并且指的是由氨基酸鏈組成的分子，不管具體 的作用模式、大小、Ξ維結構或來源。因此，Mybl2蛋白的"片段"或"部分"仍可被稱為"蛋 白質(zhì)"。"分離的蛋白質(zhì)"用于指不再處于其天然環(huán)境中的蛋白質(zhì)，例如在體外或者在重組的 細菌或植物宿主細胞中。
[001引術語"基因"意指DM序列，其包含與適合的調(diào)節(jié)區(qū)（例如啟動子）可操作地連接 的區(qū)域（轉(zhuǎn)錄區(qū)），所述區(qū)域（轉(zhuǎn)錄區(qū)）在細胞中被轉(zhuǎn)錄為RNA分子（例如mRNA、hpRNA或 RNAi分子）。因此，基因可W包含若干個可操作地連接的序列，例如啟動子、含有例如參與 翻譯起始的序列的5'前導序列、（蛋白質(zhì)）編碼區(qū)（cDNA或基因組DNA)和含有例如轉(zhuǎn)錄 終止位點的3'非翻譯序列?；蚩蒞是內(nèi)源基因（在來源的種中）或是嵌合基因（例如 轉(zhuǎn)基因或同源轉(zhuǎn)基因（cis-gene))。
[0019]"基因的表達"是指其中與適合的調(diào)節(jié)區(qū)（特別是啟動子）可操作地連接的DM區(qū) 域轉(zhuǎn)錄為RNA的過程，所述RNA具有生物活性，即其能夠被翻譯為有生物活性的蛋白質(zhì)或膚 (或活性膚片段）或其本身具有活性（例如，在轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNAi中具有活性）。編 碼序列可W是有義方向的并編碼所需的、有生物活性的蛋白質(zhì)或膚、或活性膚片段。
[0020] "活性蛋白質(zhì)"或"功能性蛋白質(zhì)"是具有在體外（例如通過體外活性測定）和/或 在體內(nèi)（例如通過所述蛋白質(zhì)賦予的表型）可測量的蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)。"野生型'lybl2 蛋白質(zhì)是包含與沈QIDN0:1有至少約85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸 序列同一性的完全功能性蛋白質(zhì)（也稱為SEQIDN0:1的"變體"或"功能性變體"）。同 樣地，野生型Mybl2等位基因是編碼所述野生型蛋白質(zhì)或野生型功能性變體的等位基因。
[0021] 本文的"突變mybl2蛋白質(zhì)"是在編碼所述野生型Mybl2蛋白的核酸序列中包含 一個或多個突變的蛋白質(zhì)，由此所述突變導致（所述突變核酸分子編碼的）"功能降低"或 "功能喪失"的蛋白質(zhì)，運例如在體內(nèi)可測量的（例如通過所述突變等位基因賦予的經(jīng)修飾 的表型）。"功能降低的mybl2蛋白"或"活性降低的mybl2蛋白"或功能喪失的mybl2蛋 白是指突變mybl2蛋白，其導致無色的果實表皮或無色的皮，所述表皮或皮在與紅色番茄 果肉結合時使成熟果實呈現(xiàn)為粉紅色。 陽0巧"粉紅色番茄果實V'y突變體V'y表型"或"無色皮y表型/突變體"或"無色表皮" 或"無色皮"是指番茄果實、或能產(chǎn)生果實的番茄植物，其例如與黃色/澄色正常表皮（存在 于包含編碼SEQIDNO: 1的野生型Mybl2蛋白或功能變體的基因的一個或兩個拷貝的植物 的果實中）相比，具有更淺顏色（更少色素；更透明）的果實表皮，運導致在與紅色果肉結 合時果實的粉紅色外觀。由于mybl2突變是隱性的，只有包含純合形式的突變mybl2等位基 因的番茄植物的果實表皮才會具有無色的皮。通過觀察紅色期的果實和/或通過剝離表皮 并例如通過對著光源拿著表皮視覺評估表皮的色素沉著，可簡單地從視覺上比較果實表皮 的顏色?；蛘撸鏏datoetal.(見上文）或Ballesteretal.2010(見上文）中所述的測 定果皮組織中的總類黃酬含量或抽配基查爾酬水平。具體地，在材料與方法一一類黃酬和 類胡蘿l·素萃取和HPLC分析--中，Ballesteretal.參考了Bonietal. (2005)，Boni etal. (2005)在段落"通過HPLC-PDA萃取、分離和檢測酪酸和抗壞血酸"中記載了類黃酬 和檢測方法度onietal. (2005)的第 429 頁的左欄度onietal.化WPhytologist(2005) volume16化p427-438))。無色表皮mybl2突變體的表皮組織（皮）比野生型果實的皮包 含顯著更少的抽配基查爾酬，例如低于50mg/kg的皮鮮重，優(yōu)選在突變mybl2等位基因純合 型的果實中低于20、10、5、2或低于Img/kg的皮fw(鮮重）。
[0023] 表皮是指覆蓋植物的葉、花、果實和莖的單層細胞群。它在植物和外部環(huán)境之間形 成邊界。表皮發(fā)揮著若干功能，它防止失水、調(diào)節(jié)氣體交換、分泌代謝化合物并且（特別是 在根部）吸收水和礦物營養(yǎng)。
[0024] 正常/紅色番茄果實（即，包含編碼野生型Mybl2蛋白的基因的植物）的正常表 皮或表皮在成熟的紅熟期，由于果實表皮中黃色的類黃酬抽配基查爾酬的累積而具有黃色 /澄色，例如在紅色品種如Moneyberg、化sa化eetal、Tapa或TPAADASU，W及許多其他在除 了中國之外的國家中生長的番茄品種中。
[0025] 功能降低的mybl2蛋白可通過"部分敲除突變mybl2等位基因"（例如，在其核酸 序列中包含一個或多個突變的野生型Mybl2等位基因）的轉(zhuǎn)錄和翻譯來獲得。在一方面， 運種部分敲除突變mybl2等位基因是包含一個或多個突變的野生型Mybl2等位基因，所述 突變優(yōu)選地導致產(chǎn)生其中至少一個保守的和/或功能性的氨基酸被另一個氨基酸置換W 使得生物活性顯著降低但不完全消失的mybl2蛋白。但是，番茄Mybl2等位基因中的其他 突變（例如一個或多個無義、錯義、剪接位點或移碼突變）也可W導致功能降低的mybl2蛋 白，并且運種功能降低的蛋白與野生型Mybl2蛋白相比，可W有一個或多個氨基酸被替換、 插入或缺失。突變等位基因可W是"天然突變"等位基因（其是天然存在的突變等位基因， 例如，沒有人工應用誘變劑的情況下而自發(fā)產(chǎn)生的）或"誘導突變"等位基因（其是由人工 干預誘導的，例如，通過誘變）。
[00%] 編碼蛋白質(zhì)的核酸分子中的"突變"是與野生型序列相比一個或多個核巧酸的改 變，例如通過一個或多個核巧酸的替換、缺失或插入。"點突變"是單個核巧酸的替換，或單 個核巧酸的插入或缺失。
[0027]"無義"突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的（點）突變，由此一個密碼子變?yōu)榻K止 密碼子。運導致在mRNA中存在提前終止密碼子并導致截短的蛋白。截短的蛋白可能具有 降低的功能或喪失功能。
[002引"錯義"或非同義突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的（點）突變，由此一個密碼子 變?yōu)榫幋a不同氨基酸的密碼子。所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可能具有降低的功能或喪失功能。
[0029] "剪接位點"突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的突變，由此前mRNA(pre-mRNA)的 RNA剪接發(fā)生改變，產(chǎn)生了具有與野生型不同的核巧酸序列的mRNA和具有與野生型不同的 氨基酸序列的蛋白質(zhì)。所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可能具有降低的功能或喪失功能。
[0030] "移碼"突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的突變，由此mRNA的讀碼框發(fā)生改變，產(chǎn) 生不同的氨基酸序列。所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可能具有降低的功能或喪失功能。
[0031] 調(diào)節(jié)序列（例如基因的啟動子）中的突變是例如通過一個或多個核巧酸的替換、 缺失或插入造成的與野生型序列相比的一個或多個核巧酸的改變，從而導致例如產(chǎn)生減少 的或不產(chǎn)生所述基因的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0032] "沉默"是指下調(diào)或完全抑制祀基因或基因家族的基因表達。
[0033] 基因沉默方法中的"祀基因"是運樣的基因或基因家族（或基因的一個或多個具 體等位基因）：當嵌合沉默基因（或"嵌合RNAi基因"）被表達并且例如產(chǎn)生沉默RNA轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物（例如能夠沉默內(nèi)源祀基因表達的dsRNA或發(fā)夾RNA)時，其內(nèi)源性基因表達被下調(diào)或 完全抑制（沉默）。在誘變方法中，祀基因是待突變的內(nèi)源基因，導致基因表達的改變（降 低或喪失）或所編碼的蛋白質(zhì)的功能的改變（降低或喪失）。
[0034] 本文使用的術語"可操作地連接"是指處于功能性關系中的多核巧酸元