完全不動(dòng)精子的生育力保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種精子生育力保存的方法，尤其是一種完全不動(dòng)精子的生育力保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，精液冷凍保存技術(shù)已有200多年的歷史。人的精液冷凍保存可以追溯到20世紀(jì)40年代末。精液冷凍保存在我國(guó)主要應(yīng)用于人類精子庫以及生育能力的保存。國(guó)內(nèi)外研究者通過幾十年對(duì)精液冷凍程序、冷凍稀釋液、解凍液等的篩選，已經(jīng)建立了較為成熟的精液冷凍保存體系。全國(guó)各生殖中心對(duì)人精液冷凍保護(hù)劑的需求量比較大，而市場(chǎng)上人精液冷凍保存劑幾乎全部被國(guó)外的生物公司所壟斷，國(guó)內(nèi)只有部分科研院所自行配置畜禽精液冷凍保護(hù)劑。國(guó)內(nèi)還沒有自行開發(fā)的人類精液冷凍保護(hù)劑應(yīng)用于臨床，并且現(xiàn)有的商品化的人類精液冷凍保存系統(tǒng)適合于人的正常精液，對(duì)少弱精的保存效果并不理想。
[0003]精子冷凍是保存男性生育力最有效的方法，已成為人類輔助生殖技術(shù)(ART)中必不可少的技術(shù)。許多研究表明，來源于射出、附睪穿刺(PESA)和睪丸穿刺(TESA)的精子經(jīng)冷凍保存及卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)后能獲得與新鮮精子相似的臨床結(jié)局。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，精子冷凍保存的前提需要有運(yùn)動(dòng)的精子。但是，對(duì)于完全不運(yùn)動(dòng)的精子是否有冷凍保存價(jià)值尚不清楚。
[0004]ICSI技術(shù)是目前治療嚴(yán)重男性不育的理想手段。有報(bào)道，應(yīng)用不運(yùn)動(dòng)精子行ICSI后可獲得臨床妊娠并生下健康后代，然而，其受精率、胚胎發(fā)育潛能明顯低于活動(dòng)精子。進(jìn)一步研究證實(shí)，不運(yùn)動(dòng)精子并不表明其已經(jīng)死亡，其存活的精子仍具有正常的受精能力。這提示，ICSI的基礎(chǔ)是需要有存活的精子。那么，如何快速、準(zhǔn)確、高效及安全地鑒別完全不動(dòng)精子中的存活狀態(tài)以確定是否適合冷凍保存及解凍后如何選擇存活精子進(jìn)行受精是關(guān)鍵。WHO第5版《人類精液檢查與處理操作手冊(cè)》中推薦低滲腫脹試驗(yàn)和伊紅染色用于診斷性評(píng)估精子的活力。然而，這兩種方法存在不足之處，前者操作較繁瑣且不適用于冷凍-解凍的精子，后者經(jīng)染色后即使鑒定為存活精子也無法再用于受精。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用激光照射精子尾膜時(shí)，存活的精子產(chǎn)生突然的應(yīng)急反應(yīng)，精子尾部卷曲，而死精子無這種現(xiàn)象，并且其應(yīng)用在新鮮和凍融后的完全不動(dòng)精子均有相似的現(xiàn)象。進(jìn)一步研究證明，激光照射精子尾部對(duì)精子頭部DNA并無損傷，并且精子尾部在受精過程中沒有實(shí)質(zhì)的意義。這提示，激光可能是一種安全有效地鑒別不動(dòng)精子存活狀態(tài)的有效方法。
[0005]傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，只有運(yùn)動(dòng)的精子適合冷凍保存。然而，有些不育患者精子的活動(dòng)率極低，甚至所有的精子都完全不運(yùn)動(dòng)，多見于精子原纖毛不動(dòng)癥和睪丸手術(shù)取精的患者。對(duì)于前者，臨床上常規(guī)的處理是丟棄射出的完全不動(dòng)精子，擇期改行睪丸穿刺取精嘗試尋找活動(dòng)精子。對(duì)于后者，如果穿刺出來的是完全不動(dòng)精子也極有可能被廢棄，擇期再行睪丸穿刺術(shù)。重復(fù)穿刺勢(shì)必增加了患者遠(yuǎn)期并發(fā)癥發(fā)生的機(jī)會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，如何有效地保存這些患者生育力是值得深思的問題。
[0006]常規(guī)的精子冷凍方法使用2ml的冷凍管，精液與冷凍液按I: I比例稀釋后經(jīng)液氮熏蒸后再投入液氮冷凍保存。由于冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)冰晶形成等因素會(huì)導(dǎo)致一定程度的精子損傷，采用目前傳統(tǒng)的冷凍方法凍存稀少精子復(fù)蘇率及回收率較低，復(fù)蘇后精子細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重，導(dǎo)致無法用于后續(xù)的輔助生殖治療。也有一些報(bào)道利用人類和小鼠的空透明帶冷凍稀少精子，但人卵透明帶較難獲得，且可能存在污染的問題，難以推廣應(yīng)用。冷凍環(huán)也有被應(yīng)用于稀少精子冷凍，但精子加載難度較大。臨床上，往往有些患者獲取的精子活力甚微，甚至完全不動(dòng)。因此，需迫切尋求一種穩(wěn)定、高效的冷凍完全不動(dòng)精子癥患者生育力的方法。
[0007]理論基礎(chǔ):
[0008]精子膜完整性與精子代謝、頂體反應(yīng)、精子獲能及精卵融合密切相關(guān)。此外，精子膜功能完整性還與受精卵著床、胚胎植入密切相關(guān)。精子尾部細(xì)胞膜屬于半透膜，具有自動(dòng)調(diào)節(jié)膜內(nèi)外滲透壓平衡的能力。激光具有熱效應(yīng)，當(dāng)?shù)湍芰考す馍鋼艋顒?dòng)精子尾部時(shí)，由于局部溫度升高很可能發(fā)生蛋白質(zhì)變性而導(dǎo)致精子尾部細(xì)胞膜的流動(dòng)性、通透性改變。當(dāng)激光照射精子尾膜時(shí)，熱效應(yīng)使精子尾膜內(nèi)外的滲透壓不平衡，活精子的細(xì)胞膜處于完整的狀態(tài)，具備調(diào)節(jié)細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓平衡的能力，水分子可由膜外進(jìn)入膜內(nèi)；而死精子尾膜的通透性發(fā)生改變，喪失調(diào)節(jié)膜內(nèi)外滲透壓的能力，水分子無法進(jìn)入膜內(nèi)。激光的這一特性為胚胎學(xué)家從完全不動(dòng)精子中鑒別有活力精子用于ICSI提供了新思路。
[0009]人類精子在冷凍過程中需經(jīng)過與冷凍保護(hù)劑混合、冷凍預(yù)降溫、超低溫儲(chǔ)存以及解凍復(fù)溫等過程。這期間經(jīng)歷的理化效應(yīng)直接作用于精子影響精子的復(fù)蘇率。影響精子冷凍和復(fù)蘇的主要原因:一是細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，二是溶質(zhì)性損傷。-5°C?-80°C是細(xì)胞內(nèi)冰晶形成的危險(xiǎn)溫區(qū)，冰晶的形成損傷精子細(xì)胞膜和細(xì)胞器，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞外結(jié)冰可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外呈高滲狀態(tài)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，即溶質(zhì)性損傷。在冷凍過程中，液體可以形成晶體和玻璃體兩種狀態(tài)。液體在冷凍過程中究竟以何種狀態(tài)固化，主要由其本身的性質(zhì)以及冷凍過程中的降溫速率決定。玻璃化冷凍中，由于冷凍液體積較小，所以降溫十分迅速。在急速冷卻過程中，液體的粘度增加，當(dāng)粘度達(dá)到臨界值時(shí)即發(fā)生凝固化，形成不規(guī)則的玻璃樣固體，呈透明狀態(tài)，有效避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成。要實(shí)現(xiàn)玻璃化降溫必須要迅速，這就要求冷凍液的體積要盡可能的小，并且冷凍載體的導(dǎo)熱性能要好。因此，只需微量冷凍液的玻璃化冷凍方法可以最大限度地減少精子冷凍-解凍過程中的冷凍損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種完全不動(dòng)精子的生育力保存方法。
[0011 ]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0012]這種完全不動(dòng)精子的生育力保存方法，由以下步驟構(gòu)成:
[0013]①完全不動(dòng)精子冷凍方法:
[0014]收集完全不動(dòng)精子后，取小部分出來，用激光鑒定如有存活的精子即判為可冷凍保存，若無存活精子，則廢棄;將剩余精液吸至100?200yL(微升)，放入專用微量精子冷凍管內(nèi)，直接用低轉(zhuǎn)速的離心機(jī)離心；離心后去除上清液，然后再加入與精子沉淀1:1體積的精子冷凍液，混勻，使最終懸液的總體積為1yL;將裝有精子懸液的冷凍管置于距液氮面2-3cm處，熏蒸3?5min，然后直接投入液氮中冷凍保存;解凍時(shí)，直接將冷凍管投入到預(yù)熱好的37°C的水浴中，放置1min;最后將精子懸液吸出，放置于培養(yǎng)皿中，加入少許培養(yǎng)液稀釋后備ICSI即卵胞漿內(nèi)單精子注射；
[0015]②完全不動(dòng)精子冷凍前、后精子存活狀態(tài)的評(píng)估:
[0016]將獲取的不動(dòng)精子加入到Quinn’s-1020即受精液操作皿中，在視野下選擇形態(tài)較好的精子，在精子尾部靠近尾巴尖端處，用1.48μπι(微米)的二極管激光束照射精子尾部中下段，照射時(shí)間為2ms(毫秒)，如果激光射擊后，精子尾部立即出現(xiàn)明顯的卷尾現(xiàn)象，則判定為存活精子，對(duì)激光射擊無反應(yīng)不發(fā)生卷尾的為死精子;冷凍前和復(fù)蘇后分別計(jì)算不動(dòng)精子的存活率，以冷凍后的存活指數(shù)，來評(píng)價(jià)完全不活動(dòng)精子的冷凍效果；
[0017]對(duì)完全不動(dòng)精子的微量冷凍，其最終精子冷凍懸液的總體積僅為1yL;
[0018]上述的對(duì)完全不動(dòng)精子冷凍前、冷凍后的存活情況應(yīng)用激光進(jìn)行鑒定。
[0019]存活指數(shù)是冷凍后的存活率/冷凍前的精子存活率。
[0020]有益效果:
[0021]本發(fā)明首次證明完全不運(yùn)動(dòng)精子是可以冷凍保存的，冷凍后這些精子具有正常的體外受精能力；同時(shí)，建立了高效冷凍保存這部分特殊群體生育力的方法，這為完全不動(dòng)精子癥患者生育力保存提供新視野。
[0022]應(yīng)用本發(fā)明所述的方法，收集射出和睪丸穿刺獲取的完全不動(dòng)精子經(jīng)冷凍復(fù)蘇后仍獲得較高的存活率，總體的精子存活指數(shù)為0.83ο用激光篩選存活但完全不動(dòng)的冷凍精子進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子注射后能獲得與新鮮不動(dòng)