一種免疫細胞的儲存方法及細胞凍存液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞保存技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種免疫細胞的儲存方法及細胞凍存 液。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫細胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細胞，包括淋巴細胞、樹突狀細 胞、單核/巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞等。近年來腫瘤和病毒的免疫治療技術(shù)應(yīng)用于臨床， 可通過自體的免疫細胞經(jīng)體外刺激、培養(yǎng)、擴增然后回輸來提高患者的免疫力。免疫細胞治 療主要來自患者自身外周血，通過分離和收集得到外周血單個核細胞。但一般說來，接受免 疫細胞治療的群體主要為腫瘤或病毒感染人群，此類人群其本身的免疫細胞機能已十分低 下，分離出免疫細胞活性較低。因此人們可在自身免疫細胞活性強時，提前將健康細胞儲存 起來，以備將來治病之需。
[0003] 目前常用的做法是利用低溫凍存技術(shù)保存外周血單個核細胞，在需要時復(fù)蘇并誘 導(dǎo)培養(yǎng)為各種免疫細胞，但凍存過程會顯著改變細胞化學(xué)及物理環(huán)境，同時伴隨生物性損 傷的危險。現(xiàn)有技術(shù)使得復(fù)蘇的細胞活性不高，細胞存活率低，且目前凍存細胞的細胞凍存 液，大都含有動物血清，即含有相對人體來說的異種蛋白，增加了傳染病的風(fēng)險;現(xiàn)有技術(shù) 對儲存免疫細胞的細胞庫進行管理和追蹤，存在樣本數(shù)據(jù)信息易丟失及混亂等弊端，容易 造成免疫細胞樣本與數(shù)據(jù)信息不匹配，存在一定的安全隱患。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種簡單有效、 安全可靠、細胞復(fù)蘇活力高的免疫細胞的儲存方法及細胞凍存液。本發(fā)明的目的通過下述 技術(shù)方案實現(xiàn)： 一種細胞凍存液，按照體積百分比，包含以下組分： 無血清液體培養(yǎng)基 0~62% 青霉素和鏈霉素雙抗溶液 0.5~1.5% 二甲基亞砜 5~10% 自體血漿 30~92%， 上述體積百分比的總和為100%。
[0005] 進一步地，所述細胞凍存液，按照體積百分比，包括以下組分： 無血清液體培養(yǎng)基 7~55% 青霉素和鏈霉素雙抗溶液 0.8~1.2% 二甲基亞砜 5~10% 自體血漿 35~85%， 上述體積百分比的總和為100%。
[0006] 進一步地，所述細胞凍存液，按照體積百分比，包括以下組分： 無血清液體培養(yǎng)基 52% 青霉素和鏈霉素雙抗溶液 1% 二甲基亞砜 7% 自體血漿 40%。
[0007] 進一步地，所述無血清液體培養(yǎng)基為GIBCO的ABl-V培養(yǎng)基。
[0008] 進一步地，所述自體血漿的制備包括以下步驟:將人體外周血離心后，取出上層血 漿放入容器內(nèi)，在55~60°C溫度下滅活后，置于-18~-22°C溫度下凍存;然后在3~5°C條件 下離心即得到細胞凍存液用的自體血漿。
[0009] 進一步地，所述青霉素和鏈霉素雙抗溶液為GIBCO青霉素和鏈霉素雙抗溶液。 GIBCO青霉素和鏈霉素雙抗溶液每毫升包含10000單位青霉素(堿)和1000 OlIg鏈霉素(堿）， 利用0.85%鹽液形式的青霉素 G(鈉鹽)和硫酸鏈霉素，其抗菌譜包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰 性細菌。青霉素和鏈霉素雙抗溶液可保證細胞儲存過程中處于無菌狀態(tài)，且對免疫細胞無 不良影響，安全可靠。
[0010] 進一步地，所述二甲基亞砜為SIGMA型號為472301的二甲基亞砜。二甲基亞砜能提 高細胞膜對水的通透性，降低溶液的冰點，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減 少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。
[0011] 本發(fā)明的細胞凍存液添加人自體血漿，人自體血漿與血清成分相似，亦含有免疫 細胞生長所需的各種細胞因子及營養(yǎng)物質(zhì)，且屬于免疫細胞分離的副產(chǎn)物，方便獲取，不存 在異源性，避免了外源血清存在的安全隱患;細胞凍存液中加入青霉素和鏈霉素雙抗溶液， 可保證免疫細胞儲存過程的無菌狀態(tài)，提高安全性。
[0012] -種免疫細胞的儲存方法，包括以下步驟： (1) 外周血單個核細胞分離和收集:取Ficoll淋巴細胞分離液，然后將事先制備的細胞 懸液加入到Ficoll淋巴細胞分離液的上層進行離心處理；吸取白膜層細胞，加入PBS混勻 后，計算單個核細胞總數(shù)與細胞活力并進行離心處理;棄上清液，加入PBS混勻后再次離心， 棄上清液后，收集得外周血單個核細胞； (2) 加入細胞凍存液:根據(jù)所得外周血單個核細胞總數(shù)與細胞活力計算結(jié)果，在步驟 (1)收集得到的外周血單個核細胞中加入細胞凍存液后混勻，處理后得到細胞重懸液，取樣 做微生物檢測； (3) 細胞凍存:將細胞重懸液分裝入凍存袋中，再將凍存袋裝入凍存袋盒中，進行程序 降溫至-78~-82°C后轉(zhuǎn)至-196Γ液氮罐凍存。經(jīng)檢測合格后出具儲存合格報告。
[0013] 進一步地，所述步驟⑶中，細胞重懸液的細胞密度為5 X IO6~2 X 107/mL。
[0014] 進一步地，所述免疫細胞的儲存方法，還包括以下步驟： (4) 細胞庫樣本的監(jiān)控和追蹤:采用同體芯片智能系統(tǒng)記錄細胞儲存位置、溫度及細胞 來源信息，建立細胞庫，對細胞庫樣本進行實時監(jiān)控和追蹤。
[0015] 進一步地，所述步驟(4)具體為：當(dāng)所述步驟(3)將細胞重懸液分裝入凍存袋后，于 凍存袋上貼上記錄細胞信息的標(biāo)簽，并置于已負(fù)載芯片的凍存袋盒中，應(yīng)用芯片讀取器讀 取芯片并錄入同體芯片智能系統(tǒng)，且對芯片負(fù)載的細胞樣本在系統(tǒng)中進行信息編輯以確保 細胞樣本與芯片信息正確對應(yīng)，將凍存袋盒置于程序化冷凍儀內(nèi)進行程序降溫后，再將凍 存袋盒置于同樣已負(fù)載芯片的凍存架，放入液氮罐中儲存。采用該方法能對細胞庫樣本進 行實時監(jiān)控及追蹤。
[0016] 進一步地，所述免疫細胞的儲存方法，還包括以下步驟： (5)復(fù)蘇細胞的培養(yǎng):將液氮凍存的細胞重懸液的單個核細胞復(fù)蘇后，用CIK細胞培養(yǎng) 基重懸，加入到已預(yù)先用抗⑶3單抗和retronectin包被好的培養(yǎng)容器中，添加包裹有IFN-γ因子的緩釋微囊;之后置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，且培養(yǎng)過程中調(diào)整細胞密度為5X IO 5~2 X IO6AiLmL;視細胞生長情況補液，擴大培養(yǎng)，并計數(shù);共培養(yǎng)16~18天。優(yōu)選地，培養(yǎng) 時間為17天，有利于CIK細胞的擴增和成熟，以獲得足夠多的細胞，減少因不同受試者細胞 活性差異因起細胞擴增數(shù)目不足。
[0017] 進一步地，所述CIK細胞培養(yǎng)基為A頂-V培養(yǎng)基，含有濃度為1000IU/mL的IL-2,濃 度為160 IU/mL的硫酸慶大霉素。IL-2可刺激和維持T細胞的分化增殖，刺激自然殺傷(NK)細 胞的增殖和活化，誘導(dǎo)淋巴因子活化殺傷(LAK)細胞。硫酸慶大霉素為氨基糖苷類抗生素， 對各種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有良好的抗菌作用，可使誘導(dǎo)增殖的細胞符合微 生物檢測指標(biāo)符合要求且不影響細胞的生長。
[0018] 抗⑶3單抗和retronectin聯(lián)合包被培養(yǎng)CIK細胞，retronectin可參與細胞的分增 殖化以及附著、伸展，抵抗淋巴細胞增殖過程中由于高度活化所誘發(fā)的的細胞凋亡，并進一 步促進了抗CD3單抗與CIK細胞的附著和接觸，提高了 CIK細胞的培養(yǎng)效率。
[0019] 進一步地，所述緩釋微囊的粒徑為20-50μπι，可使IFN-γ因子的結(jié)構(gòu)得到較好的保 護。
[0020] 進一步地，所述緩釋微囊包括以下質(zhì)量百分比的組分：IFN-γ因子9-11%、肝素 1-2%、海藻酸鈉 14-16%、碳酸鋅1-3%，余量為生物相容性聚合物。
[0021] 海藻酸鈉