一種雙單倍體及化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合作用的芥菜型油菜育種方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種雙單倍體及化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合作用的芥菜型油菜育種方法，育種方法具體為：選取油菜花蕾，投入油菜單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；對(duì)得到的小孢子進(jìn)行暗培養(yǎng)，至得到子葉期胚狀體；將子葉期胚狀體經(jīng)MS固體分化培養(yǎng)基、1/2MS生根培養(yǎng)基培養(yǎng)后，移入營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)；將得到的單倍體植株，進(jìn)行加倍處理，移入田地栽培；對(duì)得到的種子進(jìn)行4代單株套袋自交，得到有穩(wěn)定性狀的雙單倍體種子；暗培養(yǎng)后得到油菜幼芽；對(duì)油菜幼芽進(jìn)行誘變處理，然后模擬日光培養(yǎng)，篩選出有高株高油抗旱性狀的油菜植株，移入田地進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行連續(xù)6代單株套袋自交，即得。本發(fā)明采用的育種方法制種效率高，制種年限短，制種性狀穩(wěn)定且具有特殊性狀。
【專利說(shuō)明】
一種雙單倍體及化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合作用的芥菜型油菜育種方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及油菜育種領(lǐng)域，具體涉及一種雙單倍體及化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合作用的芥菜型 油菜育種方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 油菜是世界范圍內(nèi)廣泛種植的油料作物之一，是世界食用植物油和植物蛋白的主 要來(lái)源之一，在國(guó)際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中占有重要地位。因此，油菜育種特別是優(yōu)質(zhì)油菜育種引起 了各國(guó)政府和科研工作者的高度重視。目前油菜的育種方式主要有雜交育種、誘變育種、雙 單倍體育種、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等。
[0003] 目前雜交育種是廣泛使用的油菜育種方法，需要數(shù)代子代培養(yǎng)，制種繁瑣，制種產(chǎn) 量難以得到保證，且面臨種子純度問(wèn)題，這也是影響雜交油菜增產(chǎn)潛力發(fā)揮的關(guān)鍵。轉(zhuǎn)基因 技術(shù)通過(guò)基因工程手段將外源性有益目標(biāo)基因片段嵌入到本物種可以表達(dá)的基因序列中， 從而得到具有一定優(yōu)良效果的種子，由于引入了外源性因素，存在較大的潛在物種風(fēng)險(xiǎn)，并 且基因工程手段技術(shù)要求很高，一般難以實(shí)施。誘變育種使用各種理化以及生物方法促使 本物種基因發(fā)生突變，但誘變育種發(fā)生誘變后子代性狀表現(xiàn)各異，難以掌控。雙單倍體育種 是通過(guò)使用化學(xué)試劑使植物染色體組型加倍，選育性狀優(yōu)秀的子代的育種方法。因此聯(lián)合 使用多種育種方法共同選育性狀的子代種子是本發(fā)明專利的著眼之處和創(chuàng)新特征。
[0004] 中國(guó)專利CN201310368027.1公開(kāi)了一種油菜的育種方法，包括步驟：以鎮(zhèn)油5號(hào)提 純復(fù)壯系為母本，以篩選出的遠(yuǎn)緣提純復(fù)壯系為父本，采用人工去雄雜交，生產(chǎn)出雜交種 子。但是該專利的雄性不育系植株無(wú)法克服自花授粉和非目標(biāo)父本的異花授粉，種子不純 問(wèn)題嚴(yán)重，造成產(chǎn)量連年下降，并且常規(guī)去雄雜交手術(shù)麻煩，收藏種子甚少，要通過(guò)多代加 繁種子，造成代數(shù)多嚴(yán)重退化的問(wèn)題。
[0005] 中國(guó)專利CN200910044252.3公開(kāi)了一種甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育方法， 選擇貴州野生油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育單株作母本，保持系甘藍(lán)型雙低油菜819做父本，通過(guò)遠(yuǎn) 緣雜交、連續(xù)回交，得到甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系，繁殖該不育系，得到甘藍(lán) 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系貴野IIA不育系，將貴野IIA不育系測(cè)交，得到恢復(fù)系778。但是該專利 制得的雄性不育系的制種時(shí)間長(zhǎng)，方法繁瑣，會(huì)出現(xiàn)低溫微粉從而導(dǎo)致雜交種出現(xiàn)不育株， 引起產(chǎn)量損失，容易產(chǎn)生種子賠付風(fēng)險(xiǎn)，而且制種繁瑣，制種產(chǎn)量難以得到保證。
[0006] 因此急需提高制種效率，縮短制種年限，制種性狀穩(wěn)定，制種具有特殊性狀的育種 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種雙單倍體及化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合作用的芥菜型油菜育種 方法，將育得的雙單倍體進(jìn)行化學(xué)誘變，產(chǎn)生高株高油性狀的突變純合子油菜植株，且大大 縮短了育種年限。
[0008] 本發(fā)明解決上述問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
[0009] -種雙單倍體及化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合作用的芥菜型油菜育種方法，包括以下步驟：
[0010] 步驟S01，選取單核晚期或者二核期的芥菜型油菜花蕾，用去菌水清洗2次~5次， 在1 °C~2°C的條件下，投入油菜單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h~8h，在350r/min~500r/min 的條件下進(jìn)行離心分離，得到小孢子；
[0011] 步驟S02，將步驟SO 1得到的小孢子懸浮在單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在1°C~3°C的溫 度條件下，暗培養(yǎng)4h~6h，至小孢子生長(zhǎng)為胚狀體時(shí)，在溫度為30°C~35°C，轉(zhuǎn)速為70r/min ~85r/min的條件下，調(diào)節(jié)單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為6.3~6.8，進(jìn)行暗培養(yǎng)，得到子葉期胚 狀體；
[0012] 步驟S03,將步驟S02得到的子葉期胚狀體接種至MS固體分化培養(yǎng)基，在28°C~32 °C的溫度條件下，用150W~350W氙燈模擬日光進(jìn)行培養(yǎng)，分化芽長(zhǎng)出后接種至1/2MS生根培 養(yǎng)基，生根、煉苗后移入營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)，得到單倍體植株；
[0013] 步驟S04,將步驟S03中得到的單倍體植株進(jìn)行優(yōu)選，用濃度為150mg/L~300mg/L 的秋水仙堿對(duì)優(yōu)選的單倍體植株的根系進(jìn)行加倍處理，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，篩選 出雙單倍體植株，移入田地進(jìn)行正常栽培，得到雙單倍體植株的種子；
[0014] 步驟S05,對(duì)步驟S04中得到的雙單倍體植株的種子進(jìn)行4代單株套袋自交，得到有 穩(wěn)定性狀的雙單倍體種子，備用；
[0015] 步驟S06，對(duì)步驟S05中得到的有穩(wěn)定性狀的雙單倍體種子在33 °C~36 °C的溫度條 件下，在KM-8P培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)20h~40h，至種子發(fā)芽，得到芽長(zhǎng)為2cm~3.5cm的油菜 幼芽，備用；
[0016] 步驟S07，對(duì)步驟S06中得到的芽長(zhǎng)為2cm~3.5cm的油菜幼芽，移入化學(xué)誘變培養(yǎng) 皿中進(jìn)行誘變處理60h~96h，再轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)皿中，模擬日光培養(yǎng)至芽長(zhǎng)為10cm~ 14cm的油菜幼苗，篩選出有高株高油抗旱性狀的油菜植株，移入田地進(jìn)行培養(yǎng)，保證無(wú)外來(lái) 花粉進(jìn)入，與其他油菜種植田至少距離2km，進(jìn)行連續(xù)6代單株套袋自交，即得穩(wěn)定高株高油 性狀的芥菜型油菜種子。
[0017]進(jìn)一步地，步驟S01中，去菌水為：雙氧水、二氧化氯、福爾馬林、乙酸酐、無(wú)水乙醇 中的任一種。
[0018] 進(jìn)一步地，步驟S01中，單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分及其濃度為:NH4N03、100mg/L~ 180mg/L，NH4CI、100mg/L ~150mg/L，Ca (N〇3) 2、200mg/L ~400mg/L，KC1、200mg/L ~450mg/L， NaH2P〇4、150mg/L ~350mg/L，MgCl2、200mg/L ~350mg/L，CuCl2、80mg/L ~120mg/L，F(xiàn)eCl2、 lOOmg/L ~160mg/L，NaBH4、250mg/L ~500mg/L，Zn (N〇3) 2、180mg/L ~350mg/L，ZnCl2、150mg/ L~2 lOmg/L，麥芽糖、lOOOOmg/L~13000mg/L，糊精、12000mg/L~16000mg/L，瓊脂、5000mg/ L ~lOOOOmg/L，谷氨酸、150mg/L ~200mg/L，苯丙氨酸、150mg/L ~200mg/L，脯氨酸、lOOmg/L ~150mg/L，維生素 K、20mg/L~80mg/L，異戊稀腺噪呤、15mg/L~30mg/L，磷酸吡咳胺、15mg/ L~70mg/L，生育三稀酸、25mg/L~100mg/L，硫胺素、30mg/L~90mg/L，煙酰胺、25mg/L~ 75mg/L，a_ 硫辛酸、40mg/L ~100mg/L。
[0019] 進(jìn)一步地，步驟S02中，調(diào)節(jié)單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為：采用濃度為0.15mol/L~ 0 · 30mol/L的HC1溶液和濃度為0 · 15mol/L~0 · 30mol/L的Κ0Η溶液調(diào)節(jié)單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的 pH值。
[0020] 進(jìn)一步地，步驟S03中，1/2MS生根培養(yǎng)基，還需添加2mg/L~5mg/L的IBA和lmg/L~ 2.511^/1^的2,40。
[0021]進(jìn)一步地，步驟S03中，營(yíng)養(yǎng)土的原料成分及其重量份為:石英砂50份~80份、碳化 娃25份~50份、高嶺土35份~75份、石膏粉20份~45份、木肩45份~85份、白Μ土30份~60 份、丙酸鈣50份~90份、硅膠顆粒25份~50份、麥麩麩皮70份~120份。
[0022] 進(jìn)一步地，步驟S04中，加倍處理的時(shí)間為15h~30h。
[0023] 進(jìn)一步地，步驟S07中，化學(xué)誘變培養(yǎng)皿的成分及其濃度為：丙烯酰胺80mg/L~ 120mg/L，氣胺苯醇 50mg/L ~140mg/L，硝基苯 60mg/L ~130mg/L，苯胺 65mg/L ~130mg/L，苯 基偶氮_2_萘酸70mg/L~140mg/L，3_甲基黃噪呤120mg/L~200mg/L，己內(nèi)酰胺100mg/L~ 180mg/L，環(huán)磷酰胺90mg/L~170mg/L，二溴甘露醇140mg/L~230mg/L，環(huán)己亞硝脲130mg/L ~270mg/L，N_異丙基-(2-甲基肼基）120mg/L~200mg/L，雙氯甲醚80mg/L~180mg/L，二甲 氨基偶氮苯85mg/L~200mg/L，氨基甲酸乙酯95mg/L~250mg/L，丁基輕甲苯85mg/L~ 170mg/L，哌磺氯苯酸 105mg/L ~240mg/L，硫脲啼啶 90mg/L ~180mg/L，6_ 疏基噪呤 100mg/L ~150mg/L，乙醇 2000mg/L ~4500mg/L。
[0024] 更進(jìn)一步地，化學(xué)誘變培養(yǎng)皿的成分及其最佳濃度為:丙烯酰胺100mg/L，氯胺苯 醇95mg/L，硝基苯95mg/L，苯胺100mg/L，苯基偶氮-2-萘酸105mg/L，3-甲基黃噪呤160mg/L， 己內(nèi)酰胺140mg/L，環(huán)磷酰胺130mg/L，二溴甘露醇185mg/L，環(huán)己亞硝脲200mg/L，N-異丙基-(2-甲基肼基）160mg/L，雙氯甲醚130mg/L，二甲氨基偶氮苯145mg/L，氨基甲酸乙酯175mg/ L，丁基輕甲苯130mg/L，哌磺氯苯酸175mg/L，硫脲啼啶135mg/L，6_疏基噪呤125mg/L，乙醇 3300mg/L〇
[0025] 進(jìn)一步地，步驟S07中，模擬日光培養(yǎng)具體為:在溫度28°C~33°C，光照強(qiáng)度20001x ~35001x的條件下，每天日照12h~14h。
[0026] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0027] 1.本發(fā)明采用單倍體育種與化學(xué)誘變育種聯(lián)合育種，提高了育種的質(zhì)量和育種的 效率，使得通過(guò)單倍體育種得到的油菜純合體，在通過(guò)化學(xué)誘變得到有特殊性狀的油菜種 子，且這種有特殊性狀的油菜種子也是純合體，有利于油菜種子優(yōu)良性狀的保持與傳遞；
[0028] 2.本發(fā)明采用的單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，富含多種無(wú)機(jī)鹽、氨基酸以及各種糖類物質(zhì)， 能夠?yàn)樾℃咦用劝l(fā)成胚狀體提供必要的物質(zhì)能量來(lái)源，補(bǔ)充植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所必需的 各種微量兀素，提尚小抱子的發(fā)芽率；
[0029] 3.本發(fā)明采用的化學(xué)誘變培養(yǎng)基，由多種有機(jī)化合物復(fù)配而成，具有很強(qiáng)的生化 效果，能夠有效的誘導(dǎo)油菜幼芽發(fā)生性狀突變，有良好的化學(xué)誘變的效果。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明可以由權(quán)利要求限定和覆蓋的 多種不同方式實(shí)施。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] -種雙單倍體及化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合作用的芥菜型油菜育種方法 [0033] 包括以下步驟：
[0034]步驟S01，選取單核晚期或者二核期的芥菜型油菜花蕾，用二氧化氯去菌水清洗2 次，在1°C的條件下，投入油菜單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h，在350r/min的條件下進(jìn)行離心 分離，得到小孢子。其中單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分及其濃度為：NH4N03、lOOmg/L，NH4CI、 100mg/L，Ca (N〇3) 2、200mg/L，KC1、200mg/L，NaH2P〇4、150mg/L，MgCl 2、200mg/L，C11CI2、80mg/ L，F(xiàn)eC 12、1 OOmg/L，NaBH4、250mg/L，Zn (N〇3) 2、180mg/L，ZnC 12、150mg/L，麥芽糖、1 OOOOmg/L， 糊精、12000mg/L，瓊脂、5000mg/L，谷氨酸、150mg/L，苯丙氨酸、150mg/L，脯氨酸、100mg/L， 維生素 K、20mg/L，異戊烯腺嘌呤、15mg/L，磷酸吡哆胺、15mg/L，生育三烯酚、25mg/L，硫胺 素、30mg/L，煙酰胺、25mg/L，a-硫辛酸、40mg/L。
[0035]步驟S02,將步驟SOI得到的小孢子懸浮在單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在1°C的溫度條件 下，暗培養(yǎng)4h，至小孢子生長(zhǎng)為胚狀體時(shí)，在溫度為30 °C，轉(zhuǎn)速為70r/min的條件下，采用濃 度為0.15mol/L的HC1溶液和濃度為0.15mol/L的Κ0Η溶液調(diào)節(jié)單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為 6.3，進(jìn)行暗培養(yǎng)，得到子葉期胚狀體。
[0036]步驟S03,將步驟S02得到的子葉期胚狀體接種至MS固體分化培養(yǎng)基，在28 °C的溫 度條件下，用150W氙燈模擬日光進(jìn)行培養(yǎng)，分化芽長(zhǎng)出后接種至1/2MS生根培養(yǎng)基，生根、煉 苗后移入營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)，得到單倍體植株。其中1/2MS生根培養(yǎng)基中還需添加2mg/L的IBA和 lmg/L的2,4D。其中營(yíng)養(yǎng)土的原料成分及其重量份為：石英砂50份、碳化硅25份、高嶺土 35 份、石膏粉20份、木肩45份、白堊土30份、丙酸鈣50份、硅膠顆粒25份、麥麩麩皮70份。
[0037]步驟S04,將步驟S03中得到的單倍體植株進(jìn)行優(yōu)選，用濃度為150mg/L的秋水仙堿 對(duì)優(yōu)選的單倍體植株的根系進(jìn)行加倍處理15h，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，篩選出雙單倍 體植株，移入田地進(jìn)行正常栽培，得到雙單倍體植株的種子。
[0038]步驟S05,對(duì)步驟S04中得到的雙單倍體植株的種子進(jìn)行4代單株套袋自交，得到有 穩(wěn)定性狀的雙單倍體種子，備用。
[0039]步驟S06,對(duì)步驟S05中得到的有穩(wěn)定性狀的雙單倍體種子在33 °C的溫度條件下， 在KM-8P培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)20h，至種子發(fā)芽，得到芽長(zhǎng)為2cm的油菜幼芽，備用。
[0040]步驟S07,對(duì)步驟S06中得到的芽長(zhǎng)為2cm的油菜幼芽，移入化學(xué)誘變培養(yǎng)皿中進(jìn)行 誘變處理60h，再轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)皿中，在溫度28°C，光照強(qiáng)度20001x的條件下，每天日 照12h，培養(yǎng)至芽長(zhǎng)為10cm的油菜幼苗，篩選出有高株高油抗旱性狀的油菜植株，移入田地 進(jìn)行培養(yǎng)，保證無(wú)外來(lái)花粉進(jìn)入，與其他油菜種植田距離2km，進(jìn)行連續(xù)6代單株套袋自交， 即得穩(wěn)定高株高油性狀的芥菜型油菜種子。其中化學(xué)誘變培養(yǎng)皿的成分及其濃度為:丙烯 酰胺80mg/L，氯胺苯醇50mg/L，硝基苯60mg/L，苯胺65mg/L，苯基偶氮-2-萘酸70mg/L，3-甲 基黃噪呤120mg/L，己內(nèi)酰胺100mg/L，環(huán)磷酰胺90mg/L，二溴甘露醇140mg/L，環(huán)己亞硝脲 130mg/L，N-異丙基-(2-甲基肼基）120mg/L，雙氯甲醚80mg/L，二甲氨基偶氮苯85mg/L，氨基 甲酸乙酯95mg/L，丁基輕甲苯85mg/L，哌磺氯苯酸105mg/L，硫脲啼啶90mg/L，6-疏基噪呤 100mg/L，乙醇 2000mg/L。
[0041 ] 實(shí)施例2
[0042] -種雙單倍體及化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合作用的芥菜型油菜育種方法
[0043] 包括以下步驟：
[0044]步驟S01，選取單核晚期或者二核期的芥菜型油菜花蕾，用乙酸酐去菌水清洗5次， 在2°C的條件下，投入油菜單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h，在500r/min的條件下進(jìn)行離心分 離，得到小孢子。其中單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分及其濃度為:NH4N03、180mg/L，NH4CI、150mg/ L，Ca(N03)2、400mg/L，KCl、450mg/L，NaH2P04、350mg/L，MgCl2、350mg/L，CuCl2、120mg/L， FeCh、160mg/L，NaBH4、500mg/L，Zn (N〇3) 2、350mg/L，ZnCl 2、21 Omg/L，麥芽糖、13000mg/L，糊 精、16000mg/L，瓊脂、lOOOOmg/L，谷氨酸、200mg/L，苯丙氨酸、200mg/L，脯氨酸、150mg/L，維 生素 K、80mg/L，異戊稀腺噪呤、30mg/L，磷酸吡咳胺、70mg/L，生育三稀酸、100mg/L，硫胺素、 90mg/L，煙酰胺、75mg/L，a_ 硫辛酸、100mg/L。
[0045]步驟S02,將步驟SOI得到的小孢子懸浮在單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在3°C的溫度條件 下，暗培養(yǎng)6h，至小孢子生長(zhǎng)為胚狀體時(shí)，在溫度為35 °C，轉(zhuǎn)速為85r/min的條件下，采用濃 度為0 · 30mol/L的HC1溶液和濃度為0 · 15mol/L~0 · 30mol/L的Κ0Η溶液調(diào)節(jié)單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng) 基的pH為6.8,進(jìn)行暗培養(yǎng)，得到子葉期胚狀體。
[0046]步驟S03,將步驟S02得到的子葉期胚狀體接種至MS固體分化培養(yǎng)基，在32 °C的溫 度條件下，用350W氙燈模擬日光進(jìn)行培養(yǎng)，分化芽長(zhǎng)出后接種至1/2MS生根培養(yǎng)基，生根、煉 苗后移入營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)，得到單倍體植株。其中1/2MS生根培養(yǎng)基中還需添加5mg/L的IBA和 2.5mg/L的2，4D。其中營(yíng)養(yǎng)土的原料成分及其重量份為:石英砂50份~80份、碳化硅25份~ 50份、高嶺土35份~75份、石膏粉20份~45份、木肩45份~85份、白堊土30份~60份、丙酸鈣 50份~90份、硅膠顆粒50份、麥麩麩皮70份~120份。
[0047] 步驟S04,將步驟S03中得到的單倍體植株進(jìn)行優(yōu)選，用濃度為300mg/L的秋水仙堿 對(duì)優(yōu)選的單倍體植株的根系進(jìn)行加倍處理30h，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，篩選出雙單倍 體植株，移入田地進(jìn)行正常栽培，得到雙單倍體植株的種子。
[0048] 步驟S05,對(duì)步驟S04中得到的雙單倍體植株的種子進(jìn)行4代單株套袋自交，得到有 穩(wěn)定性狀的雙單倍體種子，備用。
[0049]步驟S06,對(duì)步驟S05中得到的有穩(wěn)定性狀的雙單倍體種子在36 °C的溫度條件下， 在KM-8P培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)40h，至種子發(fā)芽，得到芽長(zhǎng)為3.5cm的油菜幼芽，備用。
[0050]步驟S07,對(duì)步驟S06中得到的芽長(zhǎng)為3.5cm的油菜幼芽，移入化學(xué)誘變培養(yǎng)皿中進(jìn) 行誘變處理60h~96h，再轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)皿中，在溫度33°C，光照強(qiáng)度35001x的條件下， 每天日照14,培養(yǎng)至芽長(zhǎng)為14cm的油菜幼苗，篩選出有高株高油抗旱性狀的油菜植株，移入 田地進(jìn)行培養(yǎng)，保證無(wú)外來(lái)花粉進(jìn)入，與其他油菜種植田距離3km，進(jìn)行連續(xù)6代單株套袋自 交，即得穩(wěn)定高株高油性狀的芥菜型油菜種子。其中化學(xué)誘變培養(yǎng)皿的成分及其濃度為:丙 稀酰胺120mg/L，氯胺苯醇140mg/L，硝基苯130mg/L，苯胺130mg/L，苯基偶氮-2-萘酸140mg/ L，3-甲基黃噪呤200mg/L，己內(nèi)酰胺180mg/L，環(huán)磷酰胺170mg/L，二溴甘露醇230mg/L，環(huán)己 亞硝脲270mg/L，N-異丙基-(2-甲基肼基）200mg/L，雙氯甲醚180mg/L，二甲氨基偶氮苯 200mg/L，氨基甲酸乙酯250mg/L，丁基輕甲苯170mg/L，哌磺氯苯酸240mg/L，硫脲啼啶 18〇11^凡，6-疏基噪呤15〇11^凡，乙醇450〇11^/匕 [0051 ] 實(shí)施例3
[0052] 一種雙單倍體及化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合作用的芥菜型油菜育種方法
[0053] 包括以下步驟：
[0054]步驟S01，選取單核晚期或者二核期的芥菜型油菜花蕾，用無(wú)水乙醇去菌水清洗4 次，在1.5°C的條件下，投入油菜單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7h，在430r/min的條件下進(jìn)行離 心分離，得到小孢子。其中單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分及其濃度為:NH4N03、140mg/L，NH4C1、 125mg/L，Ca (N〇3) 2、300mg/L，KC1、325mg/L，NaH2P〇4、250mg/L，MgCh、275mg/L，CuCl 2、100mg/ L，F(xiàn)eCh、130mg/L，NaBH4、375mg/L，Zn (N〇3) 2、265mg/L，ZnCl2、180mg/L，麥芽糖、11500mg/L， 糊精、14000mg/L，瓊脂、7500mg/L，谷氨酸、175mg/L，苯丙氨酸、175mg/L，脯氨酸、125mg/L， 維生素 K、50mg/L，異戊烯腺嘌呤、23mg/L，磷酸吡哆胺、45mg/L，生育三烯酚、65mg/L，硫胺 素、60mg/L，煙酰胺、50mg/L，a-硫辛酸、70mg/L。
[0055]步驟S02,將步驟SOI得到的小孢子懸浮在單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在2°C的溫度條件 下，暗培養(yǎng)5h，至小孢子生長(zhǎng)為胚狀體時(shí)，在溫度為32 °C，轉(zhuǎn)速為78r/min的條件下，采用濃 度為0.23m〇VL的HC1溶液和濃度為0.23mol/L的Κ0Η溶液調(diào)節(jié)單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為 6.5，進(jìn)行暗培養(yǎng)，得到子葉期胚狀體。
[0056]步驟S03,將步驟S02得到的子葉期胚狀體接種至MS固體分化培養(yǎng)基，在30 °C的溫 度條件下，用250W氙燈模擬日光進(jìn)行培養(yǎng)，分化芽長(zhǎng)出后接種至1/2MS生根培養(yǎng)基，生根、煉 苗后移入營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)，得到單倍體植株。其中1/2MS生根培養(yǎng)基中還需添加3.5m g//L的IBA 和1.8mg/L的2,4D。其中營(yíng)養(yǎng)土的原料成分及其重量份為:石英砂65份、碳化硅38份、高嶺土 55份、石膏粉33份、木肩65份、白堊土45份、丙酸鈣70份、硅膠顆粒38份、麥麩麩皮95份。 [0057]步驟S04,將步驟S03中得到的單倍體植株進(jìn)行優(yōu)選，用濃度為225mg/L的秋水仙堿 對(duì)優(yōu)選的單倍體植株的根系進(jìn)行加倍處理23h，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，篩選出雙單倍 體植株，移入田地進(jìn)行正常栽培，得到雙單倍體植株的種子。
[0058]步驟S05,對(duì)步驟S04中得到的雙單倍體植株的種子進(jìn)行4代單株套袋自交，得到有 穩(wěn)定性狀的雙單倍體種子，備用。
[0059]步驟S06,對(duì)步驟S05中得到的有穩(wěn)定性狀的雙單倍體種子在35 °C的溫度條件下， 在KM-8P培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)30h，至種子發(fā)芽，得到芽長(zhǎng)為2.8cm的油菜幼芽，備用。
[0060]步驟S07,對(duì)步驟S06中得到的芽長(zhǎng)為2.8cm的油菜幼芽，移入化學(xué)誘變培養(yǎng)皿中進(jìn) 行誘變處理78h，再轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)皿中，在溫度31°C，光照強(qiáng)度27501x的條件下，每天 日照13h，培養(yǎng)至芽長(zhǎng)為12cm的油菜幼苗，篩選出有高株高油抗旱性狀的油菜植株，移入田 地進(jìn)行培養(yǎng)，保證無(wú)外來(lái)花粉進(jìn)入，與其他油菜種植田距離5km，進(jìn)行連續(xù)6代單株套袋自 交，即得穩(wěn)定高株高油性狀的芥菜型油菜種子。其中化學(xué)誘變培養(yǎng)皿的成分及其濃度為:丙 稀酰胺l〇〇mg/L，氯胺苯醇95mg/L，硝基苯95mg/L，苯胺100mg/L，苯基偶氮-2-萘酸105mg/L， 3-甲基黃噪呤160mg/L，己內(nèi)酰胺140mg/L，環(huán)磷酰胺130mg/L，二溴甘露醇185mg/L，環(huán)己亞 硝脲200mg/L，N-異丙基-(2-甲基肼基）160mg/L，雙氯甲醚130mg/L，二甲氨基偶氮苯145mg/ L，氨基甲酸乙酯175mg/L，丁基輕甲苯130mg/L，哌磺氯苯酸175mg/L，硫脲啼啶135mg/L，6_ 巰基嘌呤125mg/L，乙醇3300mg/L。
[0061 ] 實(shí)驗(yàn)例
[0062]對(duì)分別根據(jù)實(shí)施例1~3的育種方法制備的芥菜型油菜，標(biāo)號(hào)為Y1、Y2、Y3，作為實(shí) 驗(yàn)組;對(duì)普通市售的芥菜型油菜，標(biāo)記為Υ0,作為對(duì)照組。通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的育 種效果進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1所示。
[0063]表1育種效果測(cè)試結(jié)果
[0064]
[0065] 結(jié)果：由對(duì)比結(jié)果可知，實(shí)施例1~3所育的芥菜型油菜植株與對(duì)照組芥菜型油菜 相比，其開(kāi)花期長(zhǎng)，植株高大，種子出油率提高，且耐受低溫范圍增大。
[0066] 結(jié)論:通過(guò)雙單倍體及化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合育種方法獲得的芥菜型油菜表現(xiàn)出開(kāi)花時(shí)間 長(zhǎng)、耐受低溫能力優(yōu)、株高長(zhǎng)等特點(diǎn)，并且油菜種子出油率明顯高于同類普通作物，具有較 高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。
[0067] 以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、 等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雙單倍體及化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)合作用的芥菜型油菜育種方法，其特征在于，包括以下 步驟： 步驟SOI，選取單核晚期或者二核期的芥菜型油菜花蕾，用去菌水清洗2次~5次，在1°C ~2°C的條件下，投入油菜單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h~8h，在350r/min~500r/min的條件 下進(jìn)行離心分離，得到小孢子； 步驟S02，將步驟SO 1得到的小孢子懸浮在單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在1°C~3°C的溫度條 件下，暗培養(yǎng)4h~6h，至小孢子生長(zhǎng)為胚狀體時(shí)，在溫度為30°C~35°C，轉(zhuǎn)速為70r/min~ 85r/min的條件下，調(diào)節(jié)單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為6.3~6.8，進(jìn)行暗培養(yǎng)，得到子葉期胚狀 體； 步驟S03，將步驟S02得到的子葉期胚狀體接種至MS固體分化培養(yǎng)基，在28°C~32°C的 溫度條件下，用150W~350W氙燈模擬日光進(jìn)行培養(yǎng)，分化芽長(zhǎng)出后接種至1/2MS生根培養(yǎng) 基，生根、煉苗后移入營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)，得到單倍體植株； 步驟S04，將步驟S03中得到的單倍體植株進(jìn)行優(yōu)選，用濃度為150mg//L~300mg//L的秋 水仙堿對(duì)優(yōu)選的單倍體植株的根系進(jìn)行加倍處理，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，篩選出雙 單倍體植株，移入田地進(jìn)行正常栽培，得到雙單倍體植株的種子； 步驟S05,對(duì)步驟S04中得到的雙單倍體植株的種子進(jìn)行4代單株套袋自交，得到有穩(wěn)定 性狀的雙單倍體種子，備用； 步驟S06,對(duì)步驟S05中得到的有穩(wěn)定性狀的雙單倍體種子在33°C~36°C的溫度條件 下，在KM-8P培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)20h~40h，至種子發(fā)芽，得到芽長(zhǎng)為2cm~3.5cm的油菜幼 芽，備用； 步驟S07,對(duì)步驟S06中得到的芽長(zhǎng)為2cm~3.5cm的油菜幼芽，移入化學(xué)誘變培養(yǎng)皿中 進(jìn)行誘變處理60h~96h，再轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)皿中，模擬日光培養(yǎng)至芽長(zhǎng)為10cm~14cm的 油菜幼苗，篩選出有高株高油抗旱性狀的油菜植株，移入田地進(jìn)行培養(yǎng)，保證無(wú)外來(lái)花粉進(jìn) 入，與其他油菜種植田至少距離2km，進(jìn)行連續(xù)6代單株套袋自交，即得穩(wěn)定高株高油性狀的 芥菜型油菜種子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟S01中，所述去菌水為:雙氧水、二 氧化氯、福爾馬林、乙酸酐、無(wú)水乙醇中的任一種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟S01中，所述單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的 成分及其濃度為:NH4NO3、100mg/L ~180mg/L，NH4CI、100mg/L ~150mg/L，Ca (N〇3) 2、200mg/L ~400mg/L，KCl、200mg/L~450mg/L，NaH2P04、150mg/L~350mg/L，MgCl2、200mg/L~350mg/ L，CuCh、80mg/L ~120mg/L，F(xiàn)eCh、lOOmg/L ~160mg/L，NaBH4、250mg/L ~500mg/L，Zn (NO3 )2、 180mg/L~350mg/L，ZnCl2、150mg/L~210mg/L，麥芽糖、lOOOOmg/L~13000mg/L，糊精、 12000mg/L ~16000mg/L，瓊脂、5000mg/L ~lOOOOmg/L，谷氛酸、150mg/L ~200mg/L，苯丙氛 酸、150mg/L ~200mg/L，脯氨酸、lOOmg/L ~150mg/L，維生素 K、20mg/L ~80mg/L，異戊稀腺噪 呤、15mg/L~30mg/L，磷酸吡咳胺、15mg/L~70mg/L，生育三稀酸、25mg/L~100mg/L，硫胺 素、30mg/L ~90mg/L，煙酰胺、25mg/L ~75mg/L，a_ 硫辛酸、40mg/L ~100mg/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟S02中，所述調(diào)節(jié)單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng) 基的pH為：米用濃度為0 · 15mol/L~0 · 30mol/L的HC1溶液和濃度為0 · 15mol/L~0 · 30mol/L 的K0H溶液調(diào)節(jié)單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟S03中，所述1/2MS生根培養(yǎng)基，還 需添加2mg/L~5mg/L的 IBA 和 lmg/L~2.5mg/L的 2,4D。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟S03中，所述營(yíng)養(yǎng)土的原料成分及 其重量份為：石英砂50份~80份、碳化硅25份~50份、高嶺土 35份~75份、石膏粉20份~45 份、木肩45份~85份、白堊土30份~60份、丙酸鈣50份~90份、硅膠顆粒25份~50份、麥麩麩 皮70份~120份。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟S04中，所述加倍處理的時(shí)間為 15h~30h。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟S07中，所述化學(xué)誘變培養(yǎng)皿的成 分及其濃度為：丙稀酰胺80mg/L~120mg/L，氯胺苯醇50mg/L~140mg/L，硝基苯60mg/L~ 130mg/L，苯胺 65mg/L ~130mg/L，苯基偶氮-2-萘酸 70mg/L ~140mg/L，3_ 甲基黃噪呤 120mg/ L ~200mg/L，己內(nèi)酰胺 100mg/L ~180mg/L，環(huán)磷酰胺 90mg/L ~170mg/L，二溴甘露醇 140mg/L ~230mg/L，環(huán)己亞硝脲130mg/L~270mg/L，N_異丙基-(2-甲基肼基）120mg/L~200mg/L，雙 氯甲醚80mg/L~180mg/L，二甲氨基偶氮苯85mg/L~200mg/L，氨基甲酸乙酯95mg/L~ 250mg/L，丁基輕甲苯85mg/L~170mg/L，哌磺氯苯酸105mg/L~240mg/L，硫脲啼啶90mg/L~ 180mg/L，6_ 疏基噪吟 100mg/L ~150mg/L，乙醇2000mg/L ~4500mg/L。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的育種方法，其特征在于，所述化學(xué)誘變培養(yǎng)皿的成分及其最佳 濃度為：丙稀酰胺l〇〇mg/L，氯胺苯醇95mg/L，硝基苯95mg/L，苯胺100mg/L，苯基偶氮-2-萘 酸105mg/L，3-甲基黃噪呤160mg/L，己內(nèi)酰胺140mg/L，環(huán)磷酰胺130mg/L，二溴甘露醇 185mg/L，環(huán)己亞硝脲200mg/L，N_異丙基-(2-甲基肼基）160mg/L，雙氯甲醚130mg/L，二甲氨 基偶氮苯145mg/L，氨基甲酸乙酯175mg/L，丁基輕甲苯130mg/L，哌磺氯苯酸175mg/L，硫脲 啼啶 135mg/L，6_ 疏基噪呤125mg/L，乙醇 3300mg/L。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，步驟S07中，所述模擬日光培養(yǎng)具體 為:在溫度28°C~33°C，光照強(qiáng)度20001x~35001x的條件下，每天日照12h~14h。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK105830925SQ201610224821
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月12日
【發(fā)明人】周常
【申請(qǐng)人】周常