一種小麥赤霉病擴展抗性的鑒定評價方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小麥赤霉病擴展抗性的鑒定評價方法，屬于植物病害技術領域。方法包括：(1)小麥赤霉病菌分生孢子的培養(yǎng)與接種液的制備；(2)塑料袋的選擇與準備；(3)小麥赤霉病菌接種液的接種與套袋保濕；(4)病情觀察、記載與統(tǒng)計等步驟。該方法采用透明塑料袋保濕，顯著提高了麥穗接種部位的環(huán)境濕度，并使其溫度更趨均衡，有利于赤霉病菌的侵入與定植，顯著提高了人工誘發(fā)田間小麥赤霉病的效果；且該方法簡單易行，既不需要大量人工投入，也不需要高成本的設施投入。
【專利說明】
一種小麥赤霉病擴展抗性的鑒定評價方法 一、
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及植物病害技術領域，尤其涉及一種簡易、高效、省力的田間人工接種誘 發(fā)小麥赤霉病的方法。 二、
【背景技術】
[0002] 小麥赤霉病(Gibberellazeae(Schw. )Perch.)廣泛分布于我國溫暖潮濕或半潮濕 地區(qū)，多發(fā)于長江上游、中下游及黃淮南片區(qū)，對小麥生產的危害甚大。該病害不僅會造成 小麥嚴重減產，更會惡化籽粒品質。赤霉病產生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒性強，食用 后會引起眩暈、發(fā)燒、惡心、嘔吐、腹瀉等急性中毒癥狀，影響免疫能力和降低生育能力等， 危害人畜健康。國際上發(fā)達國家規(guī)定一旦檢出毒素 DON就不能食用，DON食量超過2mg/kg便 不能作飼料。
[0003] 選育抗赤霉病的小麥優(yōu)良品種，是最有效及環(huán)保的防治小麥赤霉病方法。選育抗 赤霉病的小麥品種必須在赤霉病發(fā)生的情況下才能進行篩選。小麥赤霉病發(fā)生需要滿足以 下兩個條件:一是具有病原菌菌源，二是適宜的溫度、濕度條件。這兩個條件不滿足則不發(fā)， 滿足不充分則發(fā)病輕，滿足充分則發(fā)病重;赤霉病誘發(fā)方法很多，主要有自然誘發(fā)法和人工 誘發(fā)法兩類。自然誘發(fā)法是將小麥種植于適宜赤霉病發(fā)病的環(huán)境條件下誘發(fā)出赤霉病，但 由于自然條件變化無常，上述兩個發(fā)病條件可能無法同時滿足或滿足不充分，導致不發(fā)病 或輕發(fā)病，因此該方法使用較少。人工誘發(fā)法是指人工提供病原菌菌源和適宜的溫度、濕度 條件并誘發(fā)病害，由于該法發(fā)病條件穩(wěn)定且易于控制，基本能做到必發(fā)或重發(fā)。人工誘發(fā)方 法很多，代表性的方法有土表接種法和滴注接種法。土表接種法:在土表接種病原菌(帶赤 霉病菌的麥粒），由之產生子囊孢子并侵染麥穗引起發(fā)病。土表接種法一般需配合人工噴 霧，創(chuàng)造適宜發(fā)病環(huán)境才能高效地誘發(fā)赤霉病，但噴霧設施的投入成本較高。滴注接種法： 用注射器將病原菌接種液注入麥穗的小花中而引起發(fā)病，該法雖利用了麥穗小花內密閉環(huán) 境適宜發(fā)病的溫度、濕度條件，但容易受田間大環(huán)境的影響；而運用彌霧裝置，雖然保濕效 果良好，但對生育期不同的品種因彌霧處理而會引起不同選擇壓，難以反應品種間真實的 抗性差異。
[0004] 三、技術方案
[0005] 技術問題
[0006] 本發(fā)明目的是，針對人工單花滴注法發(fā)病程度易受田間氣候環(huán)境影響的缺陷，提 出一種簡易、省力、低成本的且能高效誘發(fā)赤霉病的人工誘發(fā)田間小麥赤霉病的方法。
[0007] 技術方案
[0008] -種小麥赤霉病擴展抗性的鑒定評價方法，該方法按以下步驟進行：
[0009] (1)小麥赤霉病菌分生孢子的培養(yǎng):選用玉蜀黍赤霉菌(6；11^6^1132636(3(31^.) Petch)有代表性強病力菌株3-4個為菌種，如在江蘇選取菌株F0301、F0609、R)98(^PF1126 作為代表性菌株進行接種試驗。因為不同的菌株之間其致病力存在著顯著差異，選擇有代 表性強致病菌株進行混合接種可以更有效地檢測品種的抗病性;將這些菌株在PDA固體培 養(yǎng)基上分別進行培養(yǎng)活化，利用圓盤取樣器從上述培養(yǎng)基中取3-5塊帶有赤霉菌株的roA固 體，放入150mL經過滅菌的綠豆湯液體培養(yǎng)基中，在25°C、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)4-5d后取 樣鏡檢，經紗布過濾后配制等比例的3-4個菌種的混合孢子液，濃度為50000個/mL;
[0010] ⑵塑料袋的選擇與準備：購買長X寬X厚的尺寸大小為25cmX20cmX50wii的透 明塑料袋以及用于捆扎的塑料扎繩，選擇尺寸大小為25cmX2〇CmX5〇Mi的透明塑料袋可以 滿足同時套取5-10個等接種麥穗條件，既提高了工作效率，又避免了套取單個麥穗易折斷 的缺陷，也不會影響接種麥穗的正常光照需求。
[0011] (3)赤霉病菌接種液的接種與套袋保濕:在50%麥穗揚花時，選取步驟（1)的接種 液l〇yl滴注至穗中部小穗基部小花內。每個品種接種30個麥穗，剪取接種穗頂部小穗以上 的麥芒以示接種標記(代替每個接種麥穗都要掛牌的煩瑣步驟，以提高工作效率），用步驟 (2)準備的透明塑料袋套取株高相近5-10個接種穗，并用塑料扎繩在穗下節(jié)間處進行適度 捆扎，同時在接種行(小區(qū)）易觀察位置掛上標注接種日期的防水標簽，套袋保濕72h后去除 塑料袋；
[0012] ⑷觀察、記載與統(tǒng)計:在接種后第21天調查統(tǒng)計病小穗數(shù)與反應級，參照3個對照 品種的發(fā)病情況，所述3個對照品種分別為蘇麥3號、揚麥158和安農8455,其中蘇麥3號為抗 病對照、揚麥158為中抗對照，安農8455為感病對照，以平均反應級(Average Infection Rating)對參試材料進行赤霉病抗擴展性評價：
[0013] AIR= I：(病級X該反應級穗數(shù))/調查總穗數(shù)，
[0014] 其中AIR為平均反應級，
[0015]病穗反應級標準為：
[0016] 0級，接種小穗無可見發(fā)病癥狀；
[0017] 1級，僅接種小穗發(fā)病，或相鄰小穗發(fā)病，但病斑不擴展到穗軸；
[0018] 2級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗數(shù)占總小穗數(shù)的1/4以下；
[0019] 3級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗數(shù)占總小穗數(shù)的1/4~1/2;
[0020] 4級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗數(shù)占總小穗數(shù)的1/2以上，
[0021] 抗性分級標準：
[0022] 抗病Resistant(R) :AIR〈AIRck-R;
[0023] 中抗Moderately resistant(MR) :AIRck-r < AIR〈AIRck-mr;
[0024] 中感Moderately susceptible(MS) :AIRck-mr < AIR〈AIRck-s;
[0025] 感病Susceptible(S) :AIR 2 AIRck-s;
[0026] 其中，AIR為平均反應級;AIRck-r為抗病對照平均反應級;AIRCK-mr為中抗對照平均 反應級;AIRgk-s為感病對照反應級。
[0027]所述PDA固體培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克及水1000ml;制 備方法為：馬鈴薯洗凈、去皮、切絲，加500ml水煮沸15分鐘后，過濾，得馬鈴薯汁;在500ml水 中加瓊脂，煮至瓊脂溶解，過濾，得瓊脂液;將馬鈴薯汁與瓊脂液混合，并補充水至l〇〇〇ml， 再加入葡萄糖并加熱至溶解;裝瓶，在121°C下滅菌15分鐘即成。
[0028] 所述綠豆湯培養(yǎng)液配方為:綠豆50克，水1000ml;制備方法為:綠豆洗凈，加1000ml 水煮沸15分鐘后，過濾，得綠豆汁，補充水至1000ml，裝瓶，在121°C下滅菌15分鐘即成。 [0029]有益效果
[0030] 1、單花滴注法已經被廣泛應用于小麥赤霉病接種鑒定，但接種后保濕效果一直是 關系到鑒定成敗的關鍵。本發(fā)明提出的透明塑料袋套袋保濕法是一種利用接種穗自身呼 吸、蒸騰作用產生的水汽保持袋內的100%的相對濕度，以改善接種赤霉病菌麥穗所處環(huán)境 條件，提高環(huán)境濕度，使接種液中的水分保持更久，有利于赤霉病菌對麥穗的侵入與定植， 故能顯著提高人工誘發(fā)田間小麥赤霉病的人工接種誘發(fā)效果。
[0031] 2、本發(fā)明方法簡單易行，既不需要大量人工投入，也不需要高成本的設施投入，并 能高效保濕，不僅節(jié)省了彌霧所需的裝置和調節(jié)花期的繁重勞動，而且可在田間和溫室的 任何位置、任何時間靈活開展赤霉病接種鑒定，顯著提高了人工誘發(fā)田間小麥赤霉病的效 果，保證接種穗發(fā)病，真實反應參試材料的赤霉病擴展抗性。 四、
【附圖說明】
[0032] 圖1是透明塑料袋套袋保濕法在田間實施情況。 五、
【具體實施方式】
[0033] 下面實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0034] 實施例1:(一種小麥赤霉病擴展抗性的鑒定評價方法）
[0035]該方法按以下步驟進行：
[0036] (1)小麥赤霉病菌分生孢子的培養(yǎng)：選用江蘇代表性玉蜀黍赤霉菌菌株F0301、 F0609、F0980和F1126為菌種;將這些菌株在PDA固體培養(yǎng)基上分別進行培養(yǎng)活化，利用圓盤 取樣器從上述培養(yǎng)基中取3-5塊帶有赤霉菌株的PDA固體，放入150mL經過滅菌的綠豆湯液 體培養(yǎng)基中，在25°C、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)4-5d后取樣鏡檢，經紗布過濾后配制等比例的 4個菌種的混合孢子液，濃度50000個/mL。其中：
[0037]所述PDA固體培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克及水1000ml;制 備方法為：馬鈴薯洗凈、去皮、切絲，加500ml水煮沸15分鐘后，過濾，得馬鈴薯汁;在500ml水 中加瓊脂，煮至瓊脂溶解，過濾，得瓊脂液;將馬鈴薯汁與瓊脂液混合，并補充水至l〇〇〇ml， 再加入葡萄糖并加熱至溶解;裝瓶，在121°C下滅菌15分鐘即成；
[0038] 所述綠豆湯培養(yǎng)液配方為:綠豆50克，水1000ml;制備方法為:綠豆洗凈，加1000ml 水煮沸15分鐘后，過濾，得綠豆汁，補充水至1000ml，裝瓶，在121°C下滅菌15分鐘即成； [0039] (2)塑料袋的選擇與準備:購買尺寸大小為25cmX 20cmX50WH(長X寬X厚）的透 明塑料袋以及用于捆扎的塑料扎繩。
[0040] (3)赤霉病菌接種液的接種與套袋保濕:在開花期即50%麥穗揚花時，選取步驟 (1)的接種液1 〇yl滴注至穗中部小穗基部小花內，每個品種接種30個麥穗，剪取接種穗頂部 小穗以上的麥芒以示接種標記，用步驟(2)準備的透明塑料袋套取株高相近5-10個接種穗， 并用塑料扎繩在穗下節(jié)間處進行適度捆扎，同時在接種行(小區(qū)）易觀察位置掛上標注接種 日期的防水標簽，套袋保濕72h后去除塑料袋。
[0041] (4)觀察、記載與統(tǒng)計:在接種后第21天的調查統(tǒng)計病小穗數(shù)與反應級，參照3個對 照品種的發(fā)病情況，所述3個對照品種分別為蘇麥3、揚麥158和安農8455,其中蘇麥3號為抗 病對照、揚麥158為中抗對照，安農8455為感病對照，以平均反應級對參試材料進行赤霉病 抗擴展性評價。
[0042] AIR= I：(病級X該反應級穗數(shù))/調查總穗數(shù)，
[0043] 其中AIR為平均反應級，
[0044] 病穗反應級標準為：
[0045] 0級，接種小穗無可見發(fā)病癥狀；
[0046] 1級，僅接種小穗發(fā)病，或相鄰小穗發(fā)病，但病斑不擴展到穗軸；
[0047] 2級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗數(shù)占總小穗數(shù)的1/4以下；
[0048] 3級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗數(shù)占總小穗數(shù)的1/4~1/2;
[0049] 4級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗數(shù)占總小穗數(shù)的1/2以上。
[0050] 抗性分級標準：
[0051 ]抗病Resistant(R) :AIR〈AIRck-R;
[0052] 中抗Moderately resistant(MR) :AIRck-r < AIR〈AIRck-mr;
[0053] 中感Moderately susceptible(MS) :AIRck-mr < AIR〈AIRck-s;
[0054] 感病Susceptible(S) :AIR 2 AIRck-s;
[0055] 其中，AIR為平均反應級;AIRck-r為抗病對照平均反應級;AIRCK-mr為中抗對照平均 反應級;AIRgk-s為感病對照反應級。
[0056] 實施例2:(-種小麥赤霉病擴展抗性的鑒定評價方法）
[0057]為了明確本發(fā)明實驗效果，
【申請人】在2014-2015年度選取部分已知抗性水平品種 與即將通過江蘇省小麥新品種審定的新品系開展了小麥赤霉病抗擴展性鑒定試驗，結果顯 示本發(fā)明的"套袋保濕法"能高效誘發(fā)小麥赤霉病的發(fā)生，參試的20個品種的發(fā)病率均在 95%以上，平均反應級介于1.22~3.78之間（表1)。參考對照品種的赤霉病發(fā)生情況，對試 驗材料進行了初步的抗性評價，發(fā)現(xiàn)淮南麥區(qū)小麥品種(系）的赤霉病抗性介于抗或中抗的 水平，而淮北麥區(qū)小麥品種（系）的赤霉病抗性則介于感或中感水平，這與當前江蘇省小麥 生產實際情況相一致，其中寧麥9號、揚麥11、揚麥20、鄭麥9023和淮麥20等品種的評價結果 均與其已報道的抗性水平相符合，表明本發(fā)明可以廣泛地應用小麥赤霉病擴展抗性的鑒定 研究。
[0058]表1參試材料小麥赤霉病的抗病鑒定

【主權項】
1. 一種小麥赤霉病擴展抗性的鑒定評價方法，其步驟為： (1) 小麥赤霉病菌分生孢子的培養(yǎng)：選用玉蜀黍赤霉菌（Gibberellazeae( Schw .) Petch)有代表性強病力菌株3-4個為菌種，將這些菌株在PDA固體培養(yǎng)基上分別進行培養(yǎng)活 化，利用圓盤取樣器從上述培養(yǎng)基中取3-5塊帶有赤霉菌株的PDA固體，放入150mL經過滅菌 的綠豆湯液體培養(yǎng)基中，在25°C、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)4-5d后取樣鏡檢，經紗布過濾后配 制等比例的3-4個菌種的混合孢子液，濃度為50000個/mL; (2) 塑料袋的選擇與準備：購買長X寬X厚尺寸大小為25cm X 20cm X 50μπι的透明塑料 袋以及用于捆扎的塑料扎繩； (3) 赤霉病菌接種液的接種與套袋保濕:在50 %麥穗揚花時，選取步驟（1)的接種液10μ 1滴注至穗中部小穗基部小花內，每個品種接種30個麥穗，剪取接種穗頂部小穗以上的麥芒 以示接種標記，用步驟(2)準備的透明塑料袋套取株高相近5-10個接種穗，并用塑料扎繩在 穗下節(jié)間處進行適度捆扎，同時在接種行（小區(qū)）易觀察位置掛上標注接種日期的防水標 簽，套袋保濕72h后去除塑料袋； (4) 觀察、記載與統(tǒng)計:在接種后第21天的調查統(tǒng)計病小穗數(shù)與反應級，參照3個對照品 種的發(fā)病情況，所述3個對照品種分別為蘇麥3、揚麥158和安農8455,其中蘇麥3號為抗病對 照、揚麥158為中抗對照、安農8455為感病對照，以平均反應級對參試材料進行赤霉病抗擴 展性評價： AIR= Σ (病級X該反應級穗數(shù))/調查總穗數(shù)， 其中AIR為平均反應級； 病穗反應級標準為： 〇級，接種小穗無可見發(fā)病癥狀； 1級，僅接種小穗發(fā)病，或相鄰小穗發(fā)病，但病斑不擴展到穗軸； 2級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗數(shù)占總小穗數(shù)的1/4以下； 3級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗數(shù)占總小穗數(shù)的1/4~1/2; 4級，穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗數(shù)占總小穗數(shù)的1/2以上， 抗性分級標準： 抗病(R) :AIR〈AIRck-r; 中抗(MR) :AIRck-r < AIR〈AIRck-mr; 中感(MS) :AIRck-mr < AIR〈AIRck-s; 感病（S) :AIR 2 AIRck-s， 其中，AIR為平均反應級;AIRck-r為抗病對照平均反應級;AIRCK-mr為中抗對照平均反應 級;AIRgk-s為感病對照反應級。2. 根據(jù)權利要求1所述的小麥赤霉病擴展抗性的鑒定評價方法，其特征是，所述PDA固 體培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克及水1000ml;制備方法為：馬鈴薯洗 凈、去皮、切絲，加500ml水煮沸15分鐘后，過濾，得馬鈴薯汁;在500ml水中加瓊脂，煮至瓊脂 溶解，過濾，得瓊脂液;將馬鈴薯汁與瓊脂液混合，并補充水至1000ml，再加入葡萄糖并加熱 至溶解;裝瓶，在121°C下滅菌15分鐘即成。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的小麥赤霉病擴展抗性的鑒定評價方法，其特征是，所述綠 豆湯培養(yǎng)液配方為：綠豆50克，水1000ml;制備方法為：綠豆洗凈，加1000ml水煮沸15分鐘
【文檔編號】A01G7/00GK105850537SQ201610209821
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月6日
【發(fā)明人】吳紀中, 張巧鳳, 蔡士賓, 付必勝, 吳小有
【申請人】江蘇省農業(yè)科學院