一種甘薯莖線蟲病室內(nèi)抗侵入性鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種甘薯莖線蟲病室內(nèi)抗侵入性鑒定方法，屬農(nóng)業(yè)植物保護(hù)領(lǐng)域，該方法選用表皮完好的待測(cè)薯塊，進(jìn)行表面消毒及高溫愈合處理；消毒后的線蟲懸浮液滴加到創(chuàng)可貼止血棉上，貼于待測(cè)薯塊表面，后用保鮮膜包裹保濕；將接種莖線蟲的薯塊在25℃，80％濕度條件下暗培養(yǎng)30d后取出，去除創(chuàng)可貼；沿接種位點(diǎn)橫切，測(cè)量薯塊橫截面周長及表皮層發(fā)病組織周長，再沿接種位點(diǎn)將薯塊縱切，測(cè)量薯塊長度及發(fā)病組織長度；計(jì)算發(fā)病組織面積與薯塊表面積比值及防治效果，根據(jù)平均防效進(jìn)行分級(jí)，評(píng)價(jià)甘薯品種的抗感特性。該鑒定方法科學(xué)有效，操作簡單，實(shí)驗(yàn)周期短，較好的避免接種線蟲的流失及固定侵入位點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確表現(xiàn)甘薯品種對(duì)莖線蟲病的侵入抗性。
【專利說明】
-種甘善莖線蟲病室內(nèi)抗侵入性鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種農(nóng)作物病蟲害抗侵入性鑒定方法，具體設(shè)及一種甘馨莖線蟲病室 內(nèi)抗侵入性鑒定方法，屬農(nóng)業(yè)植物保護(hù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國是世界最大的甘馨生產(chǎn)國，年均甘馨種植面積6500萬畝，鮮馨總產(chǎn)量達(dá)1.0億 噸W上。甘馨莖線蟲?。―itylenchus deshuctor Thorne)是我國北方馨區(qū)最為嚴(yán)重的病 害之一，通常可導(dǎo)致甘馨減產(chǎn)10-20 %，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50-60%，甚至絕收。此外，該病害在甘馨 收獲后儲(chǔ)藏期還可導(dǎo)致甘馨爛害，在育苗期引起爛床，為害時(shí)期涵蓋整個(gè)甘馨生育期。
[0003] 培育抗性品種一直是作物病害綜合防治中最為經(jīng)濟(jì)有效的手段，而抗性育種工作 的首要任務(wù)就是抗性資源的篩選。目前被廣泛采用的甘馨抗莖線蟲病抗性鑒定方法主要是 田間自然誘發(fā)法和室內(nèi)打孔接種法。前者易受到環(huán)境因素的影響，因此鑒定結(jié)果不穩(wěn)定，且 實(shí)驗(yàn)周期較長;后者在打孔接種時(shí)已經(jīng)破壞了甘馨表皮結(jié)構(gòu)，雖能準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)甘馨品種對(duì) 莖線蟲病的抗擴(kuò)展性，但無法評(píng)價(jià)抗侵入性。
[0004] 林茂松等(林茂松，賀麗敏，文玲，方中達(dá)，宋伯符.甘馨形態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)莖線蟲病的抗 性機(jī)制.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996.29(3): 8-12)曾采用將含有2000頭線蟲的懸浮液直接滴加到 馨塊表皮，后用脫脂棉吸附的方法評(píng)價(jià)甘馨對(duì)莖線蟲的抗侵入性。該方法的主要缺陷在于 線蟲液的流動(dòng)性會(huì)導(dǎo)致接種線蟲的大量流失及無法固定線蟲的侵染位點(diǎn)，降低了后續(xù)抗性 評(píng)價(jià)結(jié)果的可靠性。因此，研發(fā)一種有效的甘馨莖線蟲病抗侵入性鑒定方法對(duì)全面評(píng)價(jià)甘 馨品種的莖線蟲病抗性具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為滿足莖線蟲病抗性育種工作對(duì)抗侵入性鑒定方法的需求W及 克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種有效的甘馨莖線蟲病室內(nèi)抗侵入性鑒定方法。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種甘馨莖線蟲病室內(nèi)抗侵入性鑒定方法，包括W下步 驟：
[0007] 1)莖線蟲分離及消毒:在田間采集發(fā)病馨塊，用淺盤法分離獲得莖線蟲懸浮液，將 獲得的莖線蟲懸浮液離屯、濃縮，棄上清，用消毒液對(duì)莖線蟲表面消毒化，用滅菌水清洗3次， 配成濃度為1000頭/ml的線蟲懸浮液，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[000引2)參試甘馨品種準(zhǔn)備:挑選表皮完好的待鑒定甘馨品種馨塊，清洗干凈后酒精消 毒，消毒后將待鑒定馨塊在35°C ,85-90%濕度環(huán)境下高溫愈合24h，消除馨塊表面的細(xì)微傷 口，高溫愈合后的馨塊置于已消毒的塑料箱中保存?zhèn)溆茫x取完好的栗子香馨塊進(jìn)行相同 處理，作為感病對(duì)照；
[0009] 3)接種鑒定：用移液器吸取20化1線蟲懸浮液滴加到創(chuàng)可貼的止血棉上，將帶有線 蟲的創(chuàng)可貼貼于馨塊中部表面，后用保鮮膜包裹保濕，接種線蟲后的馨塊置于消毒的塑料 箱中，在25°C ,80%濕度條件下暗培養(yǎng)30d，進(jìn)行調(diào)查評(píng)價(jià)；
[0010] 4)調(diào)查評(píng)價(jià):去除馨塊表面的保鮮膜及創(chuàng)可貼，測(cè)量馨塊外表面長度L，沿接種位 點(diǎn)將馨塊橫切，測(cè)量馨塊截面周長A，及馨塊表皮層內(nèi)發(fā)病組織的橫向長度a,再將馨塊沿接 種位點(diǎn)縱切，測(cè)量發(fā)病組織縱向長度1;
[0011] 5)防效計(jì)算方法:依據(jù)馨塊病健面積比R，即發(fā)病組織面積與馨塊表面積的比值評(píng) 價(jià)馨塊的發(fā)病程度，根據(jù)步驟4)的測(cè)量數(shù)據(jù)，病健面積比的計(jì)算方法為R = al/AL，防治效果 通過對(duì)照病健面積比與測(cè)試品種病健面積比的差值除W對(duì)照病健面積比進(jìn)行計(jì)算，具體計(jì) 算公式如下：
[0012]
[0013] 6)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):通過防效數(shù)值的范圍評(píng)價(jià)測(cè)試甘馨品種的抗性等級(jí)，具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 為：
[0014] 高抗:平均防效>80%;
[00巧]抗?。?0%《平均防效<80%;
[0016] 中抗:40%《平均防效<60% ;
[0017] 感病:20%《平均防效<40%;
[001引高感:平均防效<20%。
[0019] 作為改進(jìn)，所述步驟1)中莖線蟲懸浮液在8000巧m離屯、5min濃縮。
[0020] 作為改進(jìn)，所述步驟1)中消毒液含0.1 %硫酸鏈霉素和0.002 %放線菌酬。
[0021] 作為改進(jìn)，所述步驟2)中馨塊表面噴施75%的酒精消毒。
[0022] 作為改進(jìn)，所述步驟2)中采用的待鑒定種馨為徐18、徐781或鄭紅22。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:該鑒定方法科學(xué)有效，操作簡單，實(shí)驗(yàn)周 期短，且有效克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，能較好的避免接種線蟲的流失及固定侵入位點(diǎn);通過 創(chuàng)可貼將200頭莖線蟲固定接種于馨塊表皮，25°C下暗培養(yǎng)30天，計(jì)算防治效果，是科學(xué)有 效的甘馨莖線蟲病抗侵入性評(píng)價(jià)方法。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明方法在栗子香馨塊上的實(shí)施例：
[0025] 圖中(A)甘馨品種栗子香表皮接種；（B)接種30d發(fā)病癥狀;（C)接種50d發(fā)病癥狀。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面通過附圖和實(shí)施例，對(duì)本 發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語與屬 于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同，本文中在本發(fā)明的說明書中所使用 的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。
[0027] 實(shí)施例一
[0028] -種甘馨莖線蟲病室內(nèi)抗侵入性鑒定方法，按如下步驟進(jìn)行：
[0029] 1)莖線蟲分離及消毒:在田間采集發(fā)病馨塊，用淺盤法分離獲得莖線蟲懸浮液，將 獲得的莖線蟲懸浮液在SOOOrpm離屯、5min濃縮，棄上清，加入含有0.1 %硫酸鏈霉素和 0.002%放線菌酬的消毒液對(duì)莖線蟲表面消毒化，用滅菌水清洗3次，配成濃度為1000頭/ml 的線蟲懸浮液，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0030] 2)參試甘馨品種準(zhǔn)備:分別挑選表皮完好的徐18、徐781、鄭紅22作為種馨，清洗干 凈后表面噴施75%的酒精消毒，消毒后將待鑒定馨塊在35°C ,85-90%濕度環(huán)境下高溫愈合 2地，消除馨塊表面的細(xì)微傷口，高溫愈合后的馨塊置于已消毒的塑料箱中保存?zhèn)溆?，選取 完好的栗子香馨塊進(jìn)行相同處理，作為感病對(duì)照；
[0031] 3)接種鑒定：用移液器吸取20化1線蟲懸浮液(含200頭莖線蟲)滴加到創(chuàng)可貼的止 血棉上，將帶有線蟲的創(chuàng)可貼貼于馨塊中部表面，后用保鮮膜包裹保濕，接種線蟲后的馨塊 置于消毒的塑料箱中，在25°C ,80%濕度條件下暗培養(yǎng)30d，進(jìn)行調(diào)查評(píng)價(jià)；
[0032] 4)調(diào)查評(píng)價(jià):去除馨塊表面的保鮮膜及創(chuàng)可貼，測(cè)量馨塊外表面長度化），沿接種 位點(diǎn)將馨塊橫切，測(cè)量馨塊截面周長(A)，及馨塊表皮層內(nèi)發(fā)病組織的橫向長度(a),再將馨 塊沿接種位點(diǎn)縱切，測(cè)量發(fā)病組織縱向長度(1);
[0033] 5)防效計(jì)算方法:依據(jù)馨塊病健面積比(R)，即發(fā)病組織面積與馨塊表面積的比值 評(píng)價(jià)馨塊的發(fā)病程度，根據(jù)步驟4)的測(cè)量數(shù)據(jù)，病健面積比的計(jì)算方法為R = al/AL，防治效 果通過對(duì)照病健面積比與測(cè)試品種病健面積比的差值除W對(duì)照病健面積比進(jìn)行計(jì)算，具體 計(jì)算公式如下：
[0034]
[0035] (6)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):通過防效數(shù)值的范圍評(píng)價(jià)測(cè)試甘馨品種的抗性等級(jí)，具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 為：
[0036] 高抗:平均防效>80%;
[0037] 抗病:60%《平均防效<80%;
[003引中抗:40%《平均防效<60% ;
[0039] 感病:20%《平均防效<40%;
[0040] 高感:平均防效<20%。
[0041] 采用本發(fā)明方法獲得徐18、徐781、鄭紅22在不同莖線蟲接種劑量下的抗侵入性鑒 定結(jié)果，具體如下表1所示。
[0042] 表1.甘馨品種莖線蟲病抗侵入性鑒定
[0043]
[0044] 結(jié)合表1、圖1，從上述列舉的鑒定結(jié)果可W看出：
[0045] ①利用創(chuàng)可貼將莖線蟲接種于甘馨馨塊表皮，能夠有效防止線蟲流失及固定線蟲 侵入位點(diǎn)，且對(duì)莖線蟲的侵入無影響。
[0046] ②莖線蟲侵入甘馨30d后內(nèi)主要在馨塊表皮層內(nèi)擴(kuò)展（圖1B)，侵入50d后已擴(kuò)展至 馨塊內(nèi)部（圖1C)。由于本方法目的在于鑒定甘馨品種的抗侵入性，所W選擇接種30d后調(diào)查 更為適宜。
[0047] ③當(dāng)線蟲接種劑量為50頭、100頭時(shí)，感病對(duì)照栗子香馨塊的平均病健面積比僅分 別為23.7 %和55.6 %，未達(dá)到理想發(fā)病程度;而接種劑量為200頭時(shí)，栗子香的平均病健面 積比為93.5%，達(dá)到作為感病對(duì)照的要求。因此，本鑒定方法選擇的線蟲接種劑量為200頭。
[0048] ④通過本方法對(duì)不同甘馨品種的莖線蟲病抗侵入性進(jìn)行鑒定，篩選出部分具有抗 性的甘馨品種，證明本鑒定方法是有效的甘馨莖線蟲病抗侵入性鑒定方法。
[0049] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換或改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種甘薯莖線蟲病室內(nèi)抗侵入性鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 莖線蟲分離及消毒:在田間采集發(fā)病薯塊，用淺盤法分離獲得莖線蟲懸浮液，將獲得 的莖線蟲懸浮液離心濃縮，棄上清，用消毒液對(duì)莖線蟲表面消毒lh，用滅菌水清洗3次，配成 濃度為1000頭/ml的線蟲懸浮液，4 °C保存?zhèn)溆茫? 2) 參試甘薯品種準(zhǔn)備:挑選表皮完好的待鑒定甘薯品種薯塊，清洗干凈后用75%酒精 消毒，消毒后將待鑒定薯塊在35°C，85-90%濕度環(huán)境下高溫愈合24h，消除薯塊表面的細(xì)微 傷口，高溫愈合后的薯塊置于已消毒的塑料箱中保存?zhèn)溆茫x取完好的栗子香薯塊進(jìn)行相 同處理，作為感病對(duì)照； 3) 接種鑒定：用移液器吸取200μ1線蟲懸浮液滴加到創(chuàng)可貼的止血棉上，將帶有線蟲的 創(chuàng)可貼貼于薯塊中部表面，后用保鮮膜包裹保濕，接種線蟲后的薯塊置于消毒的塑料箱中， 在25°C，80%濕度條件下暗培養(yǎng)30d，進(jìn)行調(diào)查評(píng)價(jià)； 4) 調(diào)查評(píng)價(jià):去除薯塊表面的保鮮膜及創(chuàng)可貼，測(cè)量薯塊外表面長度L，沿接種位點(diǎn)將 薯塊橫切，測(cè)量薯塊截面周長A，及薯塊表皮層內(nèi)發(fā)病組織的橫向長度a，再將薯塊沿接種位 點(diǎn)縱切，測(cè)量發(fā)病組織縱向長度1; 5) 防效計(jì)算方法:依據(jù)薯塊病健面積比R，即發(fā)病組織面積與薯塊表面積的比值評(píng)價(jià)薯 塊的發(fā)病程度，根據(jù)步驟4)的測(cè)量數(shù)據(jù)，病健面積比的計(jì)算方法為R=al/AL，防治效果通過 對(duì)照病健面積比與測(cè)試品種病健面積比的差值除以對(duì)照病健面積比進(jìn)行計(jì)算，具體計(jì)算公 式如下： 對(duì)照病健面積比-品種病健面積比 防治效果=--X 100% 對(duì)照病健面積比 6) 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):通過防效數(shù)值的范圍評(píng)價(jià)測(cè)試甘薯品種的抗性等級(jí)，具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為： 高抗:平均防效彡80 %; 抗病:60%彡平均防效<80 %; 中抗:40%彡平均防效<60 %; 感病:20%彡平均防效<40 %; 高感:平均防效<20 %。2. 如權(quán)利要求1所述一種甘薯莖線蟲病室內(nèi)抗侵入性鑒定方法，其特征在于，所述步驟 1)中莖線蟲懸浮液在8000rpm時(shí)離心5min濃縮。3. 如權(quán)利要求1所述一種甘薯莖線蟲病室內(nèi)抗侵入性鑒定方法，其特征在于，所述步驟 1) 中消毒液含〇. 1 %硫酸鏈霉素和〇. 002 %放線菌酮。4. 如權(quán)利要求1所述一種甘薯莖線蟲病室內(nèi)抗侵入性鑒定方法，其特征在于，所述步驟 2) 中薯塊表面噴施75%的酒精消毒。5. 如權(quán)利要求1所述一種甘薯莖線蟲病室內(nèi)抗侵入性鑒定方法，其特征在于，所述步驟 2)中采用的種薯為徐18、徐781或鄭紅22。
【文檔編號(hào)】A01G7/06GK105875231SQ201610225321
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月12日
【發(fā)明人】徐振, 謝逸萍, 孫厚俊, 趙永強(qiáng), 楊冬靜, 張成玲, 孫明芳, 孫楊
【申請(qǐng)人】江蘇徐州甘薯研究中心