長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法及肝星狀細(xì)胞的分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法及肝星狀細(xì)胞的分離方法，長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法包括；將供體麻醉，將供肝從供體切取出；將受體麻醉，切除肝臟，將供肝植入切除肝臟的受體中；計(jì)算長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的存活率。本發(fā)明施行長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植，觀察長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的變化，計(jì)算成活率。一種長(zhǎng)爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞的分離方法，包括：用水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉雄性長(zhǎng)爪沙鼠或選用剛剛死亡的雄性長(zhǎng)爪沙鼠，將供肝從供體切取出；從供肝中分離得到的肝星狀細(xì)胞。本發(fā)明分離方法能夠提高肝星狀細(xì)胞的產(chǎn)量和活率，可以保證HSCs純度。
【專利說明】
長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法及肝星狀細(xì)胞的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及長(zhǎng)爪沙鼠肝移植和細(xì)胞分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法及肝星狀細(xì)胞的分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]穩(wěn)定、可靠的肝移植動(dòng)物模型是臨床肝移植和免疫耐受研究的基礎(chǔ)。只有成熟穩(wěn)定的動(dòng)物模型作為技術(shù)平臺(tái)，器官移植和免疫耐受研究的發(fā)展才能有質(zhì)的飛躍。雖然大鼠肝移植模型是目前較為常用的動(dòng)物模型，但封閉群大鼠用于該模型，其穩(wěn)定性和重現(xiàn)性有待進(jìn)一步提高，而近交系大鼠模型穩(wěn)定性提高了，但由于資源相對(duì)匱乏，不易獲取，而且較為昂貴，因此進(jìn)一步尋求穩(wěn)定，易得的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝移植模型，對(duì)于研究工作的進(jìn)行至關(guān)重要。
[0003]小動(dòng)物肝移植模型目前最常用的手術(shù)方式有單套管法(S卩門靜脈行套管吻合)，雙套管法(門靜脈、肝下下腔靜脈行套管吻合，而肝上上腔靜脈采用縫合法)，三套管法(門靜脈、肝下下腔靜脈、肝上上腔靜脈均用套管吻合法)。單套管法最主要的缺點(diǎn)是無肝期及受體總體手術(shù)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，目前公認(rèn)這兩個(gè)時(shí)間的長(zhǎng)短是術(shù)后存活情況的關(guān)鍵，縮短手術(shù)期及無肝期可減輕受體血流動(dòng)力學(xué)、生化等方面的病理生理改變，減輕供肝的缺血再灌注損傷，因此，目前已經(jīng)較少采用該術(shù)式。而三套管法雖然能有效減少無肝期(較雙套管法平均縮短5?6分鐘)，但在該法中，肝上上腔靜脈較容易發(fā)生套管扭曲、脫落及血管通而不暢的并發(fā)癥。
[0004]長(zhǎng)爪沙鼠又稱蒙古沙鼠(Mer1nesUnguieulataus,Mongolian gerbil)，分類學(xué)上屬于嚙齒目、倉(cāng)鼠科、沙鼠亞科、沙鼠屬。近年來，作為重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，長(zhǎng)爪沙鼠在國(guó)內(nèi)的使用率越來越高，其應(yīng)用領(lǐng)域也不斷擴(kuò)大，國(guó)家“十一五”、“十二五”科技支撐計(jì)劃，相繼將長(zhǎng)爪沙鼠的標(biāo)準(zhǔn)化及其動(dòng)物模型開發(fā)納入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物領(lǐng)域重大資助項(xiàng)目。長(zhǎng)爪沙鼠由于其獨(dú)特的生理、解剖學(xué)和行為學(xué)特征，成為一種正在進(jìn)行開發(fā)有著廣闊應(yīng)用前景的多功能實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
【申請(qǐng)人】前期研究表明長(zhǎng)爪沙鼠脂質(zhì)代謝與人類相似，連續(xù)16周高脂飼料喂養(yǎng)，長(zhǎng)爪沙鼠可發(fā)生脂肪肝系列病變最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生，提示長(zhǎng)爪沙鼠在肝硬化方面的研究是很有價(jià)值的模型動(dòng)物，而肝移植是臨床上治療終末期肝硬化的根本解決辦法，因此，長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立將為終末期肝硬化疾病的肝移植治療與觀察提供動(dòng)物模型及技術(shù)支持。
[0005]另現(xiàn)有大量文獻(xiàn)表明，長(zhǎng)爪沙鼠對(duì)多種細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原體(如幽門螺旋桿菌、流行性出血熱病毒、布魯絲蟲等)的感染非常敏感，是理想的感染性疾病模型動(dòng)物。因此本文所建立的長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型將進(jìn)一步用于觀察長(zhǎng)爪沙鼠肝移植后的免疫反應(yīng)，填補(bǔ)長(zhǎng)爪沙鼠在器官移植中免疫學(xué)研究的空白。目前，國(guó)內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道長(zhǎng)爪沙鼠應(yīng)用于器官移植，故本文以長(zhǎng)爪沙鼠作為供、受體，為長(zhǎng)爪沙鼠在肝移植中的應(yīng)用搭建良好的技術(shù)平臺(tái)，填補(bǔ)該動(dòng)物在器官移植中的空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有不足，本發(fā)明的目的是提供一種長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，施行長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植，觀察長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的變化，計(jì)算成活率。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008]一種長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，包括；
[0009]I)將供體麻醉，將供肝從供體切取出；
[0010]2)將受體麻醉，切除肝臟，將供肝植入切除肝臟的受體中；
[0011]3)計(jì)算長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的存活率。
[0012]步驟I)中，所述的供體麻醉的條件為:采用100?140mg/kg氯胺酮腹腔注射，即采用100?140mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉后進(jìn)行供肝切取，進(jìn)一步優(yōu)選，采用120mg/kg氯胺酮腹腔注射。
[0013]將供肝從供體切取過程中，采用的膽管支架由硬膜外導(dǎo)管制成，兩端修成斜面，長(zhǎng)為4.0?6.0mm，外徑為0.8?1.2mm，進(jìn)一步優(yōu)選，長(zhǎng)為5.0mm，外徑為1.0mm。
[0014]將供肝從供體切取過程中，采用的血管套管由聚乙烯塑料管制成，血管套管包括套管體以及與所述套管體連接的套管柄，套管柄的長(zhǎng)度為1.5?2.5mm，門靜脈血管套管的內(nèi)徑為1.5?2.3mm，外徑為1.8?2.4mm，肝下下腔靜脈血管套管內(nèi)徑為2.2?2.6mm，外徑為2.4?3.2mm，進(jìn)一步優(yōu)選，套管柄的長(zhǎng)度為2.0mm，門靜脈血管套管的內(nèi)徑為1.8mm，外徑為2.1mm,肝下下腔靜脈血管套管內(nèi)徑為2.6mm，外徑為2.8mm。
[0015]將供肝從供體切取過程中，供體腹部被打開、暴露供肝后，用生理鹽水紗布覆蓋供肝。
[0016]將供肝從供體切取過程中，供體經(jīng)腹主動(dòng)脈用生理鹽水灌注至肝臟呈土黃色時(shí)即表示灌注良好。
[0017]將供肝從供體切取過程中，膽管支架和血管套管均放置在O?4°C的生理鹽水冰浴中進(jìn)行。
[0018]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的生理鹽水的溫度為O?4°C、含20?30U/ml肝素;灌注速度為2.0?3.0ml/min ；灌注用量為10?30ml。更進(jìn)一步優(yōu)選，所述的生理鹽水的溫度為O?4°C、含25U/ml肝素;灌注速度為2.5ml/min;灌注用量為20ml。
[0019]步驟2)中，所述的受體麻醉的條件為:采用40?60mg/kg氯胺酮腹腔注射聯(lián)合乙醚吸入聯(lián)合用藥麻醉，即采用40?60mg/kg氯胺酮腹腔注射聯(lián)合乙醚吸入聯(lián)合用藥麻醉下進(jìn)行切除肝臟、植入供肝的，進(jìn)一步優(yōu)選，采用50mg/kg氯胺酮腹腔注射聯(lián)合乙醚吸入聯(lián)合用藥麻醉。
[0020]—種長(zhǎng)爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞的分離方法，包括:
[0021]a)用水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉雄性長(zhǎng)爪沙鼠或選用剛剛死亡的雄性長(zhǎng)爪沙鼠，將供肝從供體切取出；
[0022]b)將供肝，先移入聯(lián)合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜和Glisson鞘，粉碎肝臟呈糊狀，再移入混合酶液，攪拌消化，得到攪拌消化后的產(chǎn)物；
[0023]c)向攪拌消化后的產(chǎn)物中加入第一 Hank’s液，過濾，得肝組織;然后向肝組織中加第二Hank’ s液，初步離心，得沉淀；用第三Hank’ s液重懸沉淀，再向其加入Nycodenz液混勾，再次離心，得渾濁帶，渾濁帶即為分離得到的肝星狀細(xì)胞。
[0024]本發(fā)明的分離方法，成功地分離了長(zhǎng)爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞，簡(jiǎn)便可行，并為進(jìn)一步研究HSC與肝纖維化的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，本發(fā)明方法能夠提高肝星狀細(xì)胞的產(chǎn)量和活率，可以保證HSCs純度，為進(jìn)一步研究肝星狀細(xì)胞在肝損傷后細(xì)胞基質(zhì)的沉積及纖維化的形成奠定了基礎(chǔ)。
[0025]步驟a)中，將供肝從供體切取過程中，采用的膽管支架由硬膜外導(dǎo)管制成，兩端修成斜面，長(zhǎng)為4.0?6.0mm，外徑為0.8?1.2mm，進(jìn)一步優(yōu)選，長(zhǎng)為5.0mm，外徑為1.0mm。
[0026]將供肝從供體切取過程中，采用的血管套管由聚乙烯塑料管制成，血管套管包括套管體以及與所述套管體連接的套管柄，套管柄的長(zhǎng)度為1.5?2.5mm，門靜脈血管套管的內(nèi)徑為1.5?2.3mm，外徑為1.8?2.4mm，肝下下腔靜脈血管套管內(nèi)徑為2.2?2.6mm，外徑為2.4?3.2mm，進(jìn)一步優(yōu)選，套管柄的長(zhǎng)度為2.0mm，門靜脈血管套管的內(nèi)徑為1.8mm，外徑為2.1mm,肝下下腔靜脈血管套管內(nèi)徑為2.6mm，外徑為2.8mm。
[0027]將供肝從供體切取過程中，供體腹部被打開、暴露供肝后，用生理鹽水紗布覆蓋供肝。
[0028]將供肝從供體切取過程中，供體經(jīng)腹主動(dòng)脈用生理鹽水灌注至肝臟呈土黃色時(shí)即表示灌注良好。
[0029]將供肝從供體切取過程中，膽管支架和血管套管均放置在O?4°C的生理鹽水冰浴中進(jìn)行。
[0030]所述的供肝從供體切取出具體包括以下步驟:
[0031]1、用水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉雄性長(zhǎng)爪沙鼠或選用剛剛死亡的雄性長(zhǎng)爪沙鼠，將雄性長(zhǎng)爪沙鼠仰臥位固定，消毒，腹部行十字切口，止血鉗夾住劍突向頭側(cè)牽引固定，充分暴露肝臟，以生理鹽水紗布覆蓋供肝，切斷鐮狀韌帶，以縫合線結(jié)扎緊貼著肝上下腔靜脈的左膈下靜脈；
[0032]I1、將肝臟翻向頭側(cè)，用棉簽游離胃小彎背腹側(cè)的乳頭葉和尾狀葉，暴露膽總管，在左右肝管匯合處下2.8?3.2mm處剪一V形切口，插入膽管支架，縫合線結(jié)扎固定，遠(yuǎn)端離斷膽總管；
[0033]II1、將腸道切斷后腹膜與右下葉間的聯(lián)系，從右腎靜脈以上水平游離肝下下腔靜脈，右腎動(dòng)脈，以縫合線結(jié)扎右腎靜脈及右腎上腺靜脈。
[0034]IV、暴露腹主動(dòng)脈及其分叉，從髂靜脈處穿刺，注射含肝素的生理鹽水，使全血肝素化，以頭皮針穿刺腎下端的腹主動(dòng)脈，并快速剪破左側(cè)膈肌進(jìn)胸，阻斷胸主動(dòng)脈，同時(shí)剪開胸段下腔靜脈，讓灌流液流出，供體鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈用O?4°C生理鹽水灌注，速度為2.0?
3.0ml/min，肝臟呈土黃色時(shí)即表示灌注良好；
[0035]V、鈍性分離肝動(dòng)脈，門靜脈及其分支，用縫合線結(jié)扎幽門靜脈，遠(yuǎn)端離斷，在幽門靜脈結(jié)扎線以下1.8?2.2mm處切斷門靜脈，切斷左腎靜脈水平的肝下下腔靜脈、右腎上腺靜脈及右腎靜脈，緊貼膈肌離斷肝上下腔靜脈，取出供肝，并置于O?4°C的生理鹽水中。之后將供肝用于肝星狀細(xì)胞的分離。
[0036]步驟2)中，所述的聯(lián)合酶液，由以下體積百分?jǐn)?shù)的組分組成:0.02%?0.08%的鏈酶蛋白酶和0.05 %?0.2 %的膠原酶以及余量的Hank ’ s液，進(jìn)一步優(yōu)選，由以下體積百分?jǐn)?shù)的組分組成:0.05%的鏈酶蛋白酶、0.1 %的膠原酶以及余量的Hank’ s液。
[0037]所述的灌注消化的條件為:35°C?39°C灌注消化5?20min;進(jìn)一步優(yōu)選，所述的灌注消化的條件為:37°C灌注消化lOmin。
[0038]所述的混合酶液，由以下體積百分?jǐn)?shù)的組分組成:0.02%?0.08%的鏈酶蛋白酶、
0.05%?0.2%的膠原酶、0.0005%?0.003%的DNaseI以及余量的Hank’s液。進(jìn)一步優(yōu)選為，由以下體積百分?jǐn)?shù)的組分組成:0.05%的鏈酶蛋白酶、0.1 %的膠原酶、0.001 %的DNaseI以及余量的Hank’s液。
[O O3 9 ]所述的攪拌消化的條件為:3 5 °C?3 9 °C攪拌消化1?2 O m i η;進(jìn)一步優(yōu)選，所述的攪拌消化的條件為:3 7 °C攪拌消化1?15m i η。
[0040]步驟3)中，第一Hank’s液、第二Hank’s液和第三Hank’s液均為Hank’s液，可采用現(xiàn)有技術(shù)。
[0041]所述的過濾采用80目?120目的鋼絲篩，進(jìn)一步優(yōu)選，所述的過濾采用100目鋼絲篩。
[0042]所述的初步離心的條件為:300g?400g、5min?20min，進(jìn)一步優(yōu)選，所述的初步離心的條件為:350g、10min。
[0043]所述的再次離心的條件為:2°C?6°C、1200g?1600g、13min?23min。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的再次離心的條件為:4°C、1400g、18min。
[0044]所述的Nycodenz液可選用20%Nycodenz液，由體積百分比20%的Nycodenz分離液和體積百分比80%的Hank’s液，即20%Nycodenz液由體積比20%:80%的Nycodenz分離液和Hank’s液制成。
[0045]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下改進(jìn)之處和有益效果:
[0046](I)為減少長(zhǎng)爪沙鼠在手術(shù)中的死亡率，麻醉深度(尤其是受體)的掌握是關(guān)鍵。常用的乙醚開放麻醉具有簡(jiǎn)單易操作的優(yōu)點(diǎn)，但具有誘導(dǎo)期長(zhǎng)，動(dòng)物反抗激烈，不易固定的缺點(diǎn)。本發(fā)明受體采用氯胺酮(50mg/kg，腹腔注射)與乙醚(吸入)聯(lián)合用藥的方法，可有效避免上述缺點(diǎn)。術(shù)中偶爾會(huì)出現(xiàn)麻醉過深可導(dǎo)致呼吸抑制，或阻斷肝上下腔靜脈時(shí)，鉗夾膈肌過多或下拉膈肌過猛，可造成呼吸驟停，此時(shí)采用1ml注射筒聯(lián)合胸腔按壓進(jìn)行類似人工呼吸的緊急搶救，效果理想。
[0047](2)套管/支架的選擇應(yīng)視動(dòng)物大小、血管/膽管粗細(xì)而異?？傮w原則是套管/支架在有一定硬度的條件下越薄越好，套管的內(nèi)徑與血管外徑接近，過細(xì)或過粗都會(huì)發(fā)生回流不暢，靜脈腔張開不全，甚至發(fā)生套管扭轉(zhuǎn)、脫落。為方便結(jié)扎固定，需要加刻橫槽。我們選用硬膜外導(dǎo)管和聚乙烯管分別作為套管和支架的材料，在加熱后拉伸出不同的直徑。
[0048](3)在血管的吻合/縫合過程中，必需要用生理鹽水沖洗管腔，可以防止血管壁粘連引起的血管狹窄，并用以排出氣泡，避免由于空氣栓塞導(dǎo)致的肝葉壞死，肝膿腫。在吻合膽管時(shí)亦應(yīng)沖洗管腔，可減少術(shù)后膽道梗阻的發(fā)生。在縫合/吻合過程中，生理鹽水的沖洗，還可使術(shù)野清晰，提高縫合/吻合的速度與質(zhì)量。
[0049](4)在肝移植術(shù)中，由于感染引起的腎功能、呼吸功能衰竭亦是術(shù)后死亡的主要原因。因此發(fā)明人在術(shù)中十分注重?zé)o菌操作。首先，手術(shù)器械、棉簽、紗布、手術(shù)衣等均經(jīng)過20min 121°C高壓滅菌。不可高壓的物品如套管、膽管支架等均用戊二醛浸泡消毒;冰塊亦用無菌手術(shù)巾包裹。其次手術(shù)在屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的超凈工作臺(tái)中完成。超凈工作臺(tái)按細(xì)胞無菌培養(yǎng)的有關(guān)規(guī)范進(jìn)行環(huán)境控制。整個(gè)手術(shù)實(shí)驗(yàn)室亦定期用萬潔進(jìn)行噴霧消毒并擦拭天花板與墻面，術(shù)前用紫外燈照射。以上措施可有效減少感染的發(fā)生。
[0050](5)長(zhǎng)爪沙鼠的肝臟極為嬌嫩，在供肝的獲取過程中的任何接觸均可造成局部微循環(huán)障礙，激活Kuffer細(xì)胞，釋放大量的ROS及炎癥因子，最終加重肝臟的缺血再灌注損傷。因此發(fā)明人在手術(shù)時(shí)動(dòng)作輕柔，對(duì)供肝的保護(hù)始終放在重要位置。
[0051](6)本發(fā)明提供了長(zhǎng)爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞的分離方法能夠提高肝星狀細(xì)胞的產(chǎn)量和活率，可以保證HSCs純度。
【附圖說明】
[0052]圖1為供體肝臟灌注過程中的照片；
[0053]圖2為供體肝臟修整過程中的照片；
[0054]圖3為供體肝臟套管插入與固定過程中的照片；
[0055]圖4為受體肝臟切除過程中的照片；
[0056]圖5為受體進(jìn)入無肝期的照片；
[0057]圖6為受體植入供肝過程中的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0058]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0059]實(shí)施例1:
[0060]1、材料與方法
[0061 ] 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:長(zhǎng)爪沙鼠，雄性，體重40?50g由浙江實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證 SCXK(浙)2014-0001;
[0062]飼養(yǎng)條件:實(shí)驗(yàn)過程在屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室中完成(空氣潔凈度萬級(jí)，換氣次數(shù)10?20次/小時(shí)，溫度20?26 °C，日溫差彡3 °C，相對(duì)濕度40?70 % )。使用許可證SYXK(浙)2014-
0008。長(zhǎng)爪沙鼠飼喂60Co滅菌的營(yíng)養(yǎng)配合飼料，飲用超濾水，籠器具、墊料等均經(jīng)121°C高壓滅菌，消毒20分鐘。
[0063]1.2實(shí)驗(yàn)器材:乙醚(杭州市化學(xué)試劑廠)、氯胺酮針(1001^/21111，杭州市第一制藥廠)，肝素注射液(5000U/2ml，杭州市第一制藥廠)，顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)藥器械廠)，縫合線(杭州華威醫(yī)療器械有限公司)均購(gòu)自華東醫(yī)藥股份有限公司。超凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)。
[0064]1.3術(shù)前準(zhǔn)備:供體和受體術(shù)前均禁食24h，自由飲水。供體體重約等于或略小于受體。供體采用120mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉，受體采用小劑量氯胺酮(50mg/kg)腹腔注射聯(lián)合乙醚吸入聯(lián)合用藥麻醉。手術(shù)在屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無菌操作。
[0065]1.3.1血管套管和膽管支架的制備
[0066]膽管支架長(zhǎng)5.0mm，外徑1.0mm，由硬膜外導(dǎo)管制成，兩端修成斜面。
[0067]門靜脈、肝下下腔靜脈套管由聚乙烯塑料管制成，包含2.0mm的套管柄和套管體。套管體上刻有橫紋，以方便結(jié)扎固定。門靜脈套管內(nèi)徑為1.8mm，外徑為2.1mm。肝下下腔靜脈套管內(nèi)徑為2.6mm，外徑為2.8mm。
[0068]1.3.2供肝切取、肝臟暴露
[0069]長(zhǎng)爪沙鼠備皮麻醉后仰臥位固定，消毒，腹部行大十字切口。止血鉗夾住劍突向頭側(cè)牽引固定，充分暴露肝臟，以生理鹽水紗布覆蓋供肝。切斷鐮狀韌帶，以8-0縫合線結(jié)扎緊貼著肝上下腔靜脈的左膈下靜脈。
[0070]1.3.3處理膽管與肝門
[0071 ]將肝臟翻向頭側(cè)，用棉簽游離胃小彎背腹側(cè)的乳頭葉和尾狀葉，暴露膽總管，在左右肝管匯合處下3.0mm處剪一 “V”形切口，插入膽管支架，5-0縫合線結(jié)扎固定，遠(yuǎn)端離斷膽總管。
[0072]1.3.4肝周血管的處理
[0073]將腸道推向左側(cè)，切斷后腹膜與右下葉間的聯(lián)系，從右腎靜脈以上水平游離肝下下腔靜脈，右腎動(dòng)脈，以8-0縫合線結(jié)扎右腎靜脈及右腎上腺靜脈。
[0074]1.3.5全血肝素化及肝灌流(圖1)
[0075]暴露腹主動(dòng)脈及其分叉，從髂靜脈處穿刺，注射含100U肝素的生理鹽水2ml(含50U/ml肝素)，使全血肝素化。以頭皮針穿刺腎下端的腹主動(dòng)脈，并快速剪破左側(cè)膈肌進(jìn)胸，阻斷胸主動(dòng)脈，同時(shí)剪開胸段下腔靜脈，讓灌流液流出。供體鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈用O?4°C20ml生理鹽水(含25U/ml肝素)灌注，速度為2.5ml/min，肝臟呈土黃色時(shí)即表示灌注良好。
[0076]鈍性分離肝動(dòng)脈，門靜脈及其分支，用8-0縫合線結(jié)扎幽門靜脈，遠(yuǎn)端離斷，在幽門靜脈結(jié)扎線以下2.0mm處切斷門靜脈，切斷左腎靜脈水平的肝下下腔靜脈、右腎上腺靜脈及右腎靜脈。緊貼膈肌離斷肝上下腔靜脈，取出供肝，并置于O?4°C的生理鹽水中。
[0077]1.3.5修肝及套管的安置(圖2，圖3)
[0078]修肝及套管的安置均在O?4°C的生理鹽水冰浴中進(jìn)行。去除門靜脈及肝下下腔靜脈周圍的脂肪組織，將自制套管管柄朝下，用顯微直顳將肝下下腔靜脈從套管中拉出，并將血管壁外翻套于套管上，用5-0的縫合線結(jié)扎固定。同法安裝門靜脈套管。在肝上下腔靜脈兩角用8-0帶針縫合線各吊一針，作為兩點(diǎn)式縫合的支持線，完畢后置于4°C冰箱保存。
[0079]1.3.6受體肝切除(圖4，圖5)
[0080]與供肝同法暴露，游離肝臟，區(qū)別在于開腹切口略小，游離肝門內(nèi)結(jié)構(gòu)時(shí)應(yīng)盡量靠近肝臟，受體內(nèi)留有足夠長(zhǎng)度的膽道與血管，分離肝下下腔靜脈時(shí)則在右腎靜脈上緣水平。具體如下:腹部正中切口，用自制拉鉤暴露肝臟，向左側(cè)外移腸道并用生理鹽水紗布覆蓋。離斷鐮狀韌帶，縫扎左膈下靜脈，游離左三角韌帶，結(jié)扎離斷食管與左肝之間的交通支。同供肝方法暴露膽總管并結(jié)扎離斷，以8-0縫合線結(jié)扎肝動(dòng)脈。游離右腎靜脈平面之上的肝下下腔靜脈，遠(yuǎn)離下腔靜脈結(jié)扎右腎上腺靜脈叢。離斷右三角韌帶，游離肝上下腔靜脈，并在其后方放置一細(xì)橡皮條以備牽引。用動(dòng)脈夾先后阻斷右腎靜脈水平以上的肝下下腔靜脈以及幽門靜脈以上的門靜脈。于門靜脈分叉處注入2ml生理鹽水將肝內(nèi)血液驅(qū)入長(zhǎng)爪沙鼠體內(nèi)。牽引肝上預(yù)留的橡皮條，用動(dòng)脈夾阻斷肝上下腔靜脈，切斷近肝的肝上下腔靜脈、門靜脈和肝下下腔靜脈，移出原肝，密切注意后腹膜有無出血點(diǎn)。
[0081 ] 1.3.7供肝的植入(圖6)
[0082]從冰水浴中取出供肝，置入上腹部，調(diào)整供肝和受體，使肝上下腔靜脈處于最佳吻合位置。利用供肝肝上下腔靜脈的二根預(yù)埋縫合線，從左到右連續(xù)縫合血管后壁再到前壁，結(jié)束吻合前用生理鹽水沖洗管腔以排出氣泡。肝上下腔靜脈吻合完成后，將肝向頭側(cè)翻起，將門靜脈動(dòng)脈夾下移至脾靜脈水平處，用生理鹽水沖凈血管腔內(nèi)的血塊和氣泡，夾住供肝門靜脈套管柄，將門靜脈套管套入受體門靜脈內(nèi)，以5-0縫合線結(jié)扎固定。同法連接肝下下腔靜脈。開放受體門靜脈及肝上上、下腔靜脈，結(jié)束無肝期。輕拉受體膽總管，在近結(jié)扎處前剪一“V”形切口，將供肝膽總管支架插入受體膽總管內(nèi)，6-0縫合線結(jié)扎固定。將腸道放回原位，逐層關(guān)腹。術(shù)后保溫，單籠飼養(yǎng)，待恢復(fù)正常飲食方可合群。
[0083]2、結(jié)果
[0084]正式實(shí)驗(yàn)，共行長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植60例。手術(shù)成功52例。供體手術(shù)時(shí)間為34.56±5.1211^11，修肝及安置套管時(shí)間為15.43±2.7511^11，受體手術(shù)時(shí)間為58.37±8.5411^11，其中無肝期為23.66±4.47min。
[0085]實(shí)施例2
[0086]2、材料與方法
[0087]1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:長(zhǎng)爪沙鼠，雄性，體重40?50g由浙江實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證 SCXK(浙)2014-0001;
[0088]飼養(yǎng)條件:實(shí)驗(yàn)過程在屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室中完成(空氣潔凈度萬級(jí)，換氣次數(shù)10?20次/小時(shí)，溫度20?26 °C，日溫差彡3 °C，相對(duì)濕度40?70 % )。使用許可證SYXK(浙)2014-
0008。長(zhǎng)爪沙鼠飼喂60Co滅菌的營(yíng)養(yǎng)配合飼料，飲用超濾水，籠器具、墊料等均經(jīng)121°C高壓滅菌，消毒20分鐘。
[0089]2.2實(shí)驗(yàn)器材:乙醚(杭州市化學(xué)試劑廠)、氯胺酮針(1001^/21111，杭州市第一制藥廠)，肝素注射液(5000U/2ml，杭州市第一制藥廠)，顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)藥器械廠)，縫合線(杭州華威醫(yī)療器械有限公司)均購(gòu)自華東醫(yī)藥股份有限公司。超凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)。鏈霉蛋白酶E(Pronase E)，IV型膠原酶(TypeIV collagenase)，DNase
1、Nycodenz分離液購(gòu)自Sigma公司;DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。
[0090]2.3術(shù)前準(zhǔn)備:供體和受體術(shù)前均禁食24h，自由飲水。供體體重約等于或略小于受體。供體采用120mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉，受體采用小劑量氯胺酮(50mg/kg)腹腔注射聯(lián)合乙醚吸入聯(lián)合用藥麻醉。手術(shù)在屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無菌操作。
[0091 ] 2.3.1血管套管和膽管支架的制備
[0092]膽管支架長(zhǎng)5.0mm，外徑1.0mm，由硬膜外導(dǎo)管制成，兩端修成斜面。
[0093]門靜脈、肝下下腔靜脈套管由聚乙烯塑料管制成，包含2.0mm的套管柄和套管體。套管體上刻有橫紋，以方便結(jié)扎固定。門靜脈套管內(nèi)徑為1.8mm，外徑為2.1mm。肝下下腔靜脈套管內(nèi)徑為2.6mm，外徑為2.8mm。
[0094]2.3.2供肝切取、肝臟暴露
[0095]長(zhǎng)爪沙鼠備皮麻醉后仰臥位固定，消毒，腹部行大十字切口。止血鉗夾住劍突向頭側(cè)牽引固定，充分暴露肝臟，以生理鹽水紗布覆蓋供肝。切斷鐮狀韌帶，以8-0縫合線結(jié)扎緊貼著肝上下腔靜脈的左膈下靜脈。
[0096]2.3.3處理膽管與肝門
[0097]將肝臟翻向頭側(cè)，用棉簽游離胃小彎背腹側(cè)的乳頭葉和尾狀葉，暴露膽總管，在左右肝管匯合處下3.0mm處剪一 “V”形切口，插入膽管支架，5-0縫合線結(jié)扎固定，遠(yuǎn)端離斷膽總管。
[0098]2.3.4肝周血管的處理
[0099]將腸道推向左側(cè)，切斷后腹膜與右下葉間的聯(lián)系，從右腎靜脈以上水平游離肝下下腔靜脈，右腎動(dòng)脈，以8-0縫合線結(jié)扎右腎靜脈及右腎上腺靜脈。
[0100]2.3.5全血肝素化及肝灌流
[0101]暴露腹主動(dòng)脈及其分叉，從髂靜脈處穿刺，注射含100U肝素的生理鹽水2ml(含50U/ml肝素)，使全血肝素化。以頭皮針穿刺腎下端的腹主動(dòng)脈，并快速剪破左側(cè)膈肌進(jìn)胸，阻斷胸主動(dòng)脈，同時(shí)剪開胸段下腔靜脈，讓灌流液流出。供體鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈用O?4°C20ml生理鹽水(含25U/ml肝素)灌注，速度為2.5ml/min，肝臟呈土黃色時(shí)即表示灌注良好。
[0102]鈍性分離肝動(dòng)脈，門靜脈及其分支，用8-0縫合線結(jié)扎幽門靜脈，遠(yuǎn)端離斷，在幽門靜脈結(jié)扎線以下2.0mm處切斷門靜脈，切斷左腎靜脈水平的肝下下腔靜脈、右腎上腺靜脈及右腎靜脈。緊貼膈肌離斷肝上下腔靜脈，取出供肝，并置于O?4°C的生理鹽水中。
[0103]2.3.6將供肝移入37 °C水浴中的250ml燒杯，循環(huán)灌注預(yù)溫至37 °C的聯(lián)合酶液50ml(聯(lián)合酶液由體積百分?jǐn)?shù)0.05%鏈霉蛋白酶E、0.1 % IV型膠原酶以及余量的Hank ’ s液組成)，消化肝臟10分鐘。在培養(yǎng)皿中去除肝包膜和Glisson鞘。將肝臟粉碎成糊狀，放入混合酶液(混合酶液由體積百分比0.05 %鏈霉蛋白酶E、0.1 % IV型膠原酶、0.001 % DNaseI以及余量的Hank’s液)中，37°C水浴用鑷子攪拌10?15min，使肝組織充分得到消化，得到消化好的肝組織。
[0104]將消化好的肝組織加入4°CHank’ s液50ml，用100目鋼絲篩過濾。濾過的肝組織分裝入兩支50ml離心管中，加Hank’s液至50ml，350g離心1min。取沉淀重懸于50ml Hank’s液中，再次350g離心lOmin。合并沉淀加50ml Hank’s液1ml重懸，吸取2ml置于1ml玻璃離心管中，加入3ml的20 %Nycodenz液(由體積比20 %: 80 %的Nycodenz分離液和Hank ’ s液制成)混勻，按此比例分裝完全部沉淀，每管液面覆蓋2ml Hank，s液，1400g，4°C離心18min，輕輕取出，不要搖動(dòng)液面，可見在Hank.s液下有一混濁帶。用16號(hào)針頭插入液面下此處抽吸混濁帶于1ml離心管，渾濁帶即為分離得到的肝星狀細(xì)胞。加DMEM培養(yǎng)液，900g離心lOmin，沉淀重懸于1ml左右DMEM培養(yǎng)液中，然后加入1.1Iml胎牛血清。計(jì)數(shù)細(xì)胞產(chǎn)量并且行臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)，判斷活力。
[0105]2.3.7細(xì)胞鑒定
[0106]325nm波長(zhǎng)紫外光激發(fā)細(xì)胞自發(fā)熒光。光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。免疫組織化學(xué)方法鑒定肝星狀細(xì)胞的Desmin(結(jié)蛋白)、A-SMA(a_平滑肌肌動(dòng)蛋白)的表達(dá)情況。表明得到的為肝星狀細(xì)胞(HSC)。
[0107]2.3.8 HSC的存活率與得率
[0108]采用Nycodenz密度梯度離心法分離長(zhǎng)爪沙鼠HSC，長(zhǎng)爪沙鼠平均體重為45克，每只鼠肝的細(xì)胞得率約為(0.7?0.8) X 17個(gè)。根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)，細(xì)胞活力為(99.6)%。
[0109]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，包括； 1)將供體麻醉，將供肝從供體切取出； 2)將受體麻醉，切除肝臟，將供肝植入切除肝臟的受體中； 3)計(jì)算長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的存活率。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步驟I)中，所述的供體麻醉的條件為:采用100?140mg/kg氯胺酮腹腔注射。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步驟I)中，將供肝從供體切取過程中，采用的膽管支架由硬膜外導(dǎo)管制成，兩端修成斜面，長(zhǎng)為4.0?6.0mm，外徑為0.8?1.2mm。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步驟I)中，將供肝從供體切取過程中，采用的血管套管由聚乙烯塑料管制成，血管套管包括套管體以及與所述套管體連接的套管柄，套管柄的長(zhǎng)度為1.5?2.5mm，門靜脈血管套管的內(nèi)徑為.1.5?2.3mm，外徑為1.8?2.4mm，肝下下腔靜脈血管套管內(nèi)徑為2.2?2.6mm，外徑為2.4?.3.2mm.5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步驟I)中，將供肝從供體切取過程中，供體腹部被打開、暴露供肝后，用生理鹽水紗布覆蓋供肝； 將供肝從供體切取過程中，供體經(jīng)腹主動(dòng)脈用生理鹽水灌注至肝臟呈土黃色時(shí)即表示灌注良好。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步驟I)中，所述的生理鹽水的溫度為O?4°C、含20?30U/ml肝素；灌注速度為2.0?3.0ml/min ；灌注用量為10?30ml。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步驟2)中，所述的受體麻醉的條件為:采用40?60mg/kg氯胺酮腹腔注射聯(lián)合乙醚吸入聯(lián)合用藥麻醉。8.一種長(zhǎng)爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞的分離方法，其特征在于，包括: a)用水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉雄性長(zhǎng)爪沙鼠或選用剛剛死亡的雄性長(zhǎng)爪沙鼠，將供肝從供體切取出； b)將供肝，先移入聯(lián)合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜和Glisson鞘，粉碎肝臟呈糊狀，再移入混合酶液，攪拌消化，得到攪拌消化后的產(chǎn)物； c)向攪拌消化后的產(chǎn)物中加入第一Hank’ s液，過濾，得肝組織;然后向肝組織中加第二Hank’s液，初步離心，得沉淀；用第三Hank’s液重懸沉淀，再向其加入Nycodenz液混勾，再次離心，得渾濁帶，渾濁帶即為分離得到的肝星狀細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的長(zhǎng)爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞的分離方法，其特征在于，步驟a)中，所述的供肝從供體切取出具體包括以下步驟: I、用水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉雄性長(zhǎng)爪沙鼠或選用剛剛死亡的雄性長(zhǎng)爪沙鼠，將雄性長(zhǎng)爪沙鼠仰臥位固定，消毒，腹部行十字切口，止血鉗夾住劍突向頭側(cè)牽引固定，充分暴露肝臟，以生理鹽水紗布覆蓋供肝，切斷鐮狀韌帶，以縫合線結(jié)扎緊貼著肝上下腔靜脈的左膈下靜脈； I1、將肝臟翻向頭側(cè)，用棉簽游離胃小彎背腹側(cè)的乳頭葉和尾狀葉，暴露膽總管，在左右肝管匯合處下2.8?3.2mm處剪一V形切口，插入膽管支架，縫合線結(jié)扎固定，遠(yuǎn)端離斷膽總管； II1、將腸道切斷后腹膜與右下葉間的聯(lián)系，從右腎靜脈以上水平游離肝下下腔靜脈，右腎動(dòng)脈，以縫合線結(jié)扎右腎靜脈及右腎上腺靜脈。 IV、暴露腹主動(dòng)脈及其分叉，從髂靜脈處穿刺，注射含肝素的生理鹽水，使全血肝素化，以頭皮針穿刺腎下端的腹主動(dòng)脈，并快速剪破左側(cè)膈肌進(jìn)胸，阻斷胸主動(dòng)脈，同時(shí)剪開胸段下腔靜脈，讓灌流液流出，供體鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈用O?4°C生理鹽水灌注，速度為2.0?3.0ml/min，肝臟呈土黃色時(shí)即表示灌注良好； V、鈍性分離肝動(dòng)脈，門靜脈及其分支，用縫合線結(jié)扎幽門靜脈，遠(yuǎn)端離斷，在幽門靜脈結(jié)扎線以下1.8?2.2mm處切斷門靜脈，切斷左腎靜脈水平的肝下下腔靜脈、右腎上腺靜脈及右腎靜脈，緊貼膈肌離斷肝上下腔靜脈，取出供肝。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK105941329SQ201610375000
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月30日
【發(fā)明人】樓琦, 石巧娟, 盧領(lǐng)群, 李巍, 郭紅剛, 杜江濤, 應(yīng)華忠
【申請(qǐng)人】浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院