一種常山胡柚快速無(wú)性繁殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種常山胡柚快速無(wú)性繁殖的方法，所述方法將消毒后的外植體接種至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在20～24℃，光照1000～1200lux條件下培養(yǎng)，每隔25～45天轉(zhuǎn)接一次，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2?3次，獲得叢生芽；將叢生芽切割為帶頂芽的個(gè)體后，接種至生根培養(yǎng)基，在24～26℃，光照1000～1200lux條件下培養(yǎng)30?60天，形成完整植株；利用本方法，一個(gè)幼胚經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，在3個(gè)月左右即可獲得至少6株以上的植株，具有很高的效率，能夠在短時(shí)間能繁殖獲得大量的常山胡柚實(shí)生苗，應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。
【專利說(shuō)明】
一種常山胡柚快速無(wú)性繁殖的方法 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種常山胡柚快速無(wú)性繁殖的方法。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 常山胡柚是中國(guó)柑橘屬的一個(gè)新種，為原產(chǎn)于浙江常山縣的特有雜柑類良種。其 果實(shí)飽滿，外觀呈鮮黃色;果粒呈金黃色，汁液飽滿;香味濃郁、味道酸甜適中、微甘;深受群 眾歡迎，體現(xiàn)了良好的經(jīng)濟(jì)效益。近年來(lái)種植園區(qū)加大了常山胡柚果園建設(shè)力度，種子面積 不斷擴(kuò)大；而且，更加重視胡柚的產(chǎn)量及果實(shí)質(zhì)量。常山胡柚經(jīng)多代繁殖后的果樹(shù)，不易保 存其母本的一些優(yōu)良性狀，所結(jié)果實(shí)出現(xiàn)味道不佳等情況;有些果農(nóng)常采用扦插繁殖，但扦 插的繁殖速度較慢，成活率不高，難以適應(yīng)常山胡柚生產(chǎn)發(fā)展的需要。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是提供一種快速繁殖常山胡柚的方法，本方法高效且便捷，可在較短 的時(shí)間內(nèi)獲得大量的優(yōu)良種苗，從而可建立起快速、高效、優(yōu)質(zhì)的種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)體系。這 既是果農(nóng)的迫切需求，也是現(xiàn)今市場(chǎng)的需求。
[0004] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0005] 本發(fā)明提供一種快速繁殖常山胡柚的方法，所述方法為：（1)外植體的獲取及誘導(dǎo) 培養(yǎng):選取長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的常山胡柚外植體消毒，獲得消毒后的外植體;將消毒后的 外植體接種至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)室中，在22~24°C，光照1000~12001UX條件 下培養(yǎng)，每隔25~45天轉(zhuǎn)接一次(優(yōu)選25天），轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2-3次，獲得叢生芽;所述叢生芽誘導(dǎo) 培養(yǎng)基為含6-BA 0.25~2.5mg/L+BRs 0.1mg/L+AgN03 lmg/1的MS改良培養(yǎng)基，所述MS改良 培養(yǎng)基為添加 PVP 0.5g/L+Arg 0.1g/L+Gln 0.5g/L的MS基本培養(yǎng)基；（2)生根培養(yǎng):將步驟 (1)獲得的叢生芽切割為帶頂芽的個(gè)體后，接種至生根培養(yǎng)基上，在22~24°C，光照1000~ 1200 lux條件下培養(yǎng)30-60天，形成完整植株;所述生根培養(yǎng)基為含0.1-0.2mg/L IAA的MS改 良培養(yǎng)基;所述MS改良培養(yǎng)基為添加 PVP 0.5g/L+Arg 0.1g/L+Gln 0.5g/L的MS基本培養(yǎng) 基。
[0006] 進(jìn)一步，步驟（1)所述常山胡柚外植體為帶幼芽的幼莖、幼葉或幼果，更優(yōu)選所述 常山胡柚外植體為開(kāi)花后3個(gè)月的幼果，所述幼果在4°C放置3天后，取出用保鮮膜包裹并在 37°C放置60分鐘，用洗潔精洗凈浸泡5分鐘后，用蒸餾水沖洗干凈，獲得清洗后的幼果，剝?nèi)?幼胚，即為外植體。
[0007] 進(jìn)一步，步驟（1)所述外植體消毒方法為:用20-28g/L次氯酸鈉水溶液浸泡lOmin， 無(wú)菌水沖洗3-5次，用濾紙吸干表面水分，獲得消毒后的外植體。
[0008] 進(jìn)一步，步驟（1)所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含6-BA 0.25~0.75mg/L+BRs 0.1mg/L +AgN03 lmg/L的MS改良培養(yǎng)基。
[0009] 進(jìn)一步，步驟(2)所述生根培養(yǎng)基為含0.1-0.21^/1144的1^改良培養(yǎng)基或含0.1-0.2mg/L IAA+0.5mg/L 6-BA的MS改良培養(yǎng)基。
[0010] 進(jìn)一步，所述MS基本培養(yǎng)基終濃度組成為:NH4N03 1.65g/L、KN031.9g/L、CaCl2 · 2H2O 0.44g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、KH2P〇4 0.17g/L、KI 0.83mg/L、H3B03 5.2mg/L、 MgS〇4 · 7H20 22.3mg/L、ZnS〇4 · 7H2〇3.6mg/L、Na2Mo〇4 · 2H20 0.25mg/L、CuS〇4 · 5H20 0.025mg/L、CoCl2 · 6H2〇0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeS〇4 · 7H20 27.8mg/L、肌醇lOOmg/ L、甘氨酸2mg/L、鹽酸硫胺素0 · lmg/L、鹽酸吡咳醇0 · 5mg/L、煙酸0 · 5mg/L、鹿糖20~40g/L、 瓊脂粉3~12g/L，溶劑為水，pH為5 · 6~6 · 0。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:迄今為止，尚未見(jiàn)常山胡柚利用外 植體再生植株的任何研究報(bào)道，本發(fā)明為首次報(bào)道;而且，利用本方法，一個(gè)幼胚經(jīng)過(guò)培養(yǎng)， 在3個(gè)月左右即可獲得至少6株以上的植株，具有很高的效率，能夠在短時(shí)間能繁殖獲得大 量的常山胡柚實(shí)生苗，應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。本方法高效且便捷，可在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)獲得 大量的優(yōu)良種苗，從而可建立起快速、高效、優(yōu)質(zhì)的種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)體系。這既是果農(nóng)的迫 切需求，也是現(xiàn)今市場(chǎng)的需求。 (四）
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1幼葉培養(yǎng)后卷縮并愈傷化照片，A和B均為愈傷化的幼葉。
[0013]圖2常山胡柚幼莖培養(yǎng)膨大照片。
[0014]圖3幼胚培養(yǎng)形成的愈傷組織和叢生芽;A:愈傷組織;B:愈傷組織再生的叢生芽； C:幼胚直接再生的叢生芽。
[00? 5]圖4幼胚培養(yǎng)再生的完整植株;A:再生的完整植株;B:移栽成活的植株。 (五)
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此。
[0017] 實(shí)施例1:
[0018] (1)外植體的選擇和處理：
[0019] 選擇常山胡柚的帶幼芽的幼莖、幼葉和幼果作為外植體。具體是，常山胡柚種植于 實(shí)驗(yàn)大棚中，適時(shí)澆水保持其生長(zhǎng)狀況良好。在胡柚的發(fā)芽期間，剪取獲得胡柚帶芽的幼 莖、幼葉。若無(wú)新芽，對(duì)胡柚進(jìn)行打頂處理，經(jīng)2周會(huì)長(zhǎng)出新芽，經(jīng)3-4周可獲得適合實(shí)驗(yàn)的幼 莖和幼葉。開(kāi)花后3個(gè)月左右的幼果，直徑大小在2-3cm的幼果，將幼果在4°C放置3天后，取 出用保鮮膜包裹并在37°C放置60分鐘，用洗潔精洗凈浸泡5分鐘后，用蒸餾水沖洗干凈，獲 得預(yù)處理后的幼果，在無(wú)菌操作臺(tái)上，剝出幼胚，大小在l_3mm。以未預(yù)處理的幼果為對(duì)照。
[0020] (2)外植體的消毒過(guò)程：
[0021] 分別將胡柚幼葉、帶芽的幼莖和幼胚用洗潔精洗凈浸泡5分鐘后，用蒸餾水沖洗干 凈，再用20_28g/L次氯酸鈉水溶液浸泡lOmin。然后用無(wú)菌水將處理后的材料清洗3-5次，用 濾紙吸干表面多余的水分，獲得消毒后的外植體。
[0022] (3)外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)：
[0023]在超凈工作臺(tái)上，將上述消毒后的外植體接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(叢生芽誘導(dǎo) 培養(yǎng)基為6-BA0 · 25~2 · 5mg/L+BRs 0 · lmg/L+AgN03 lmg/L+的MS改良培養(yǎng)基，其中6-BA的具 體含量見(jiàn)表1、表2和表3所示），每種叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種20個(gè)外植體。在溫度22 ± 2°C，光 照1000-12001ux條件下培養(yǎng)。每25天將外植體轉(zhuǎn)移到新的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，及時(shí)觀察 生長(zhǎng)變化情況并拍照記錄，轉(zhuǎn)接1次后，獲得叢生芽。同樣條件下，以6-BA0.25~2.5mg/L+ BRs 0.1mg/L+AgN03 lmg/L的MS基本培養(yǎng)基(6-BA含量見(jiàn)表1-表3)為對(duì)照。
[0024] (4)叢生芽的生根培養(yǎng)：
[0025]叢生芽切割為帶頂芽的個(gè)體后，接種至生根培養(yǎng)基，在24~26°C，光照1000~ 12001UX條件下培養(yǎng)30天左右，形成完整植株。
[0026] (5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0027]當(dāng)幼葉接種到表1、幼莖接種到表2、幼胚接種到表3所列出的不同激素配比6-BA0.25~2.5mg/L+BRs 0.1mg/L+AgN03 lmg/L的MS基本培養(yǎng)基上（未添加 PVP 0.5g/L+Arg 0.1g/L+Gln 0.5g/L的MS培養(yǎng)基），培養(yǎng)5天左右均出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，并最終停止生長(zhǎng)而枯死。 當(dāng)幼葉接種到表1、幼莖接種到表2、幼胚接種到表3所列出的不同激素配比叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基（6-BA 0.25~2.5mg/L+BRs 0.1mg/L+AgN03 lmg/L的MS改良培養(yǎng)基上，MS改良培養(yǎng)基為 添加 PVP 0.5g/L+Arg 0.1g/L+Gln 0.5g/L的MS培養(yǎng)基），培養(yǎng)5天左右，依然保持鮮綠狀態(tài)。 [0028] 采摘的幼果不經(jīng)過(guò)4°C低溫和37°C熱激處理，同步驟(2)的方法消毒后，剝?nèi)∮着?接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，即便培養(yǎng)到60天以上依然沒(méi)有萌發(fā)，萌發(fā)極其緩慢。而幼果放入 4°C3天后，取出用保鮮膜包裹放入37°C熱激處理60分鐘，再經(jīng)步驟(2)的方法消毒后，剝?nèi)?幼胚接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，2周左右即可見(jiàn)有萌發(fā)。
[0029] 因此，選擇6-BA0.25~2.5mg/L+BRs 0.1mg/L+AgN〇3 lmg/L的MS改良培養(yǎng)基上（添 加PVP 0.5g/L+Arg 0.1g/L+Gln 0.5g/L的MS培養(yǎng)基)作為幼葉、幼莖和幼胚培養(yǎng)誘導(dǎo)叢生 芽的培養(yǎng)基;幼果放入4°C3天后，取出用保鮮膜包裹放入37°C熱激處理60分鐘作為幼胚培 養(yǎng)前的預(yù)處理?xiàng)l件。
[0030] 接種幼葉在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，在15天左右，少數(shù)葉片出現(xiàn)黃花死亡，部 分葉片出現(xiàn)卷縮，進(jìn)一步形成愈傷組織，培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。
[0031] 表1常山胡柚幼葉培養(yǎng)結(jié)果
[0032]
[0033]接種幼莖在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上后，在接種20-30天后，莖出現(xiàn)膨大情況，但未形 成明顯的愈傷組織，具體結(jié)果見(jiàn)表2和圖2。
[0034]表2常山胡柚幼莖培養(yǎng)結(jié)果
[0035]
[0036] 幼果經(jīng)過(guò)放入4°C3天后，取出用保鮮膜包裹放入37°C熱激處理60分鐘處理后，剝 取的幼胚消毒后接種在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)程中，幼胚在2周左右開(kāi)始萌發(fā)。幼 胚培養(yǎng)過(guò)程中，在較低濃度6-BA(0.25-0.75mg/L)條件下可以直接分化出叢生芽;而在較高 濃度6-ΒΑ(1.0-2.5mg/L)條件下，則僅脫分化為愈傷組織。而且，愈傷組織轉(zhuǎn)入含有較低濃 度6-BA( 0.25-0.75mg/L)的培養(yǎng)基上，也能再生出芽，結(jié)果見(jiàn)表3和圖3。
[0037]表3常山胡柚幼胚培養(yǎng)結(jié)果 [0038]
[0039] 此外，為驗(yàn)證BRs 0.1mg/L+AgN03 lmg/L是否促進(jìn)幼胚再生叢生芽，接種幼胚到添 加或不添加 BRs 0. lmg/L和AgN〇3 lmg/L的培養(yǎng)基上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果如表4。結(jié)果 表明BRs 0.1mg/L+AgN〇3 lmg/L具有顯著促進(jìn)幼胚再生叢生芽。
[0040] 表4 BRs和AgN〇3對(duì)幼胚培養(yǎng)的影響
[0041]
[0042] 實(shí)施例2
[0043] 將實(shí)施例1中預(yù)處理后的幼果分離的幼胚接種至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(6-BA0.5mg/L +BRs 0· lmg/L+AgN03 lmg/L的MS改良培養(yǎng)基），在22±2°C，光照 1000-12001ux條件下培養(yǎng) 30天左右，獲得叢生芽，經(jīng)過(guò)切割為帶頂芽的個(gè)體后，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(0.1-0.2mg/L IAA 的MS改良培養(yǎng)基或0.1-0.2mg/L IAA+0.5mg/L 6-BA的MS改良培養(yǎng)基，見(jiàn)表5)上，在溫度22 ±2°C，光照1000-12001UX條件下培養(yǎng)30天左右，最后形成完整植株。平均每個(gè)叢生芽經(jīng)過(guò) 切割后能形成6個(gè)以上植株。在MS改良培養(yǎng)基+0.1-0.2mg/L IAA，以及MS改良培養(yǎng)基+0.1-0.2mg/L IAA+0.5mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，均能生根。在30天左右，根長(zhǎng)可以達(dá)到2-3厘米，進(jìn) 一步形成完整植株。因此，一個(gè)幼胚經(jīng)過(guò)上述培養(yǎng)，在60天內(nèi)可以得到叢生芽，再經(jīng)過(guò)30天 左右可以得至少6株以上的完整植株，即1個(gè)幼胚在3個(gè)月左右即可獲得至少6株以上的完整 植株，具有時(shí)間短、效率高的特點(diǎn)。具體結(jié)果見(jiàn)表5和圖4。
[0044] 表5不同培養(yǎng)條件下叢生芽生根形成完整植株的結(jié)果
[0045]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種常山胡柚快速無(wú)性繁殖的方法，其特征在于所述方法為：（1)外植體的獲取及誘 導(dǎo)培養(yǎng):選取長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的常山胡柚外植體消毒，獲得消毒后的外植體;將消毒后 的外植體接種至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在20~24°C，光照1000~12001UX條件下培養(yǎng)，每隔 25~45天轉(zhuǎn)接一次，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2-3次，獲得叢生芽;所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含6-BA 0.25~ 2.5mg/L+BRs 0.1mg/L+AgN03 lmg/L的MS改良培養(yǎng)基，所述MS改良培養(yǎng)基為添加 PVP 0.5g/ L+Arg 0. lg/L+Gln 0.5g/L的MS基本培養(yǎng)基；（2)生根培養(yǎng):將步驟（1)獲得的叢生芽切割為 帶頂芽的個(gè)體后，接種至生根培養(yǎng)基，在24~26°C，光照1000~12001ux條件下培養(yǎng)30-60 天，形成完整植株;所述生根培養(yǎng)基為含〇. 1-0.2mg/L IAA的MS改良培養(yǎng)基，所述MS改良培 養(yǎng)基為添加 PVP 〇.5g/L+Arg 0· lg/L+Gln 0.5g/L的MS基本培養(yǎng)基。2. 如權(quán)利要求1所述常山胡柚快速無(wú)性繁殖的方法，其特征在于步驟（1)所述常山胡柚 外植體為帶幼芽的幼莖、幼葉或幼果。3. 如權(quán)利要求1所述常山胡柚快速無(wú)性繁殖的方法，其特征在于步驟（1)所述常山胡柚 外植體為開(kāi)花后3個(gè)月的幼果。4. 如權(quán)利要求3所述常山胡柚快速無(wú)性繁殖的方法，其特征在于所述幼果在4 °C放置3 天后，取出用保鮮膜包裹并在37 °C放置60分鐘，用洗潔精洗凈浸泡5分鐘后，用蒸餾水沖洗 干凈，獲得清洗后的幼果，剝?nèi)∮着?，即為外植體。5. 如權(quán)利要求1所述常山胡柚快速無(wú)性繁殖的方法，其特征在于步驟（1)所述外植體消 毒方法為：用20-28g/L次氯酸鈉水溶液浸泡lOmin，無(wú)菌水沖洗3-5次，用濾紙吸干表面水 分，獲得消毒后的外植體。6. 如權(quán)利要求1所述常山胡柚快速無(wú)性繁殖的方法，其特征在于步驟（1)所述叢生芽誘 導(dǎo)培養(yǎng)基為含6-BA 0.25~0.75mg/L+BRs 0.1mg/L+AgN〇3 lmg/L的MS改良培養(yǎng)基。7. 如權(quán)利要求1所述常山胡柚快速無(wú)性繁殖的方法，其特征在于步驟(2)所述生根培養(yǎng) 基為含0.1-0.211^/11六六+0.511^/16-8六的]^改良培養(yǎng)基。8. 如權(quán)利要求1所述常山胡柚快速無(wú)性繁殖的方法，其特征在于所述MS基本培養(yǎng)基終 濃度組成為：NH4NO3 1.65g/L、KN03 1.9g/L、CaCl2.2H20 0.44g/L、MgS〇4*7H20 0.37g/L、 KH2PO4 0.17g/L、KI 0.83mg/L、H3B03 5.2mg/L、MgS〇4*7H20 22.3mg/L、ZnS〇4*7H20 3.6mg/ L^Na2Mo〇4 · 2H20 0.25mg/L^CuS04 · 5H20 0.025mg/L^CoCl2 · 6H2O 0.025mg/L^Na2EDTA 37.3mg/L、FeS〇4 · 7H20 27.8mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸2mg/L、鹽酸硫胺素 O.lmg/L、鹽酸吡 哆醇0 · 5mg/L、煙酸0 · 5mg/L、蔗糖20~40g/L、瓊脂粉3~12g/L，溶劑為水，pH為5 · 6~6 · 0。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK106035087SQ201610430004
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月16日
【發(fā)明人】李亞菲, 向太和, 李琳潔, 周世怡, 馮咪, 林幼荷
【申請(qǐng)人】杭州師范大學(xué)