一種豬精液的冷凍和解凍方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種豬精液的冷凍和解凍方法，包括豬精液的冷凍方法，豬精液的解凍方法以及豬精液的檢測(cè)，豬精液的冷凍方法包括以下步驟：采集種公豬精液并對(duì)其密度進(jìn)行測(cè)定，稀釋。將稀釋后的精液靜置，之后降溫平衡。降溫后的精液在14?15℃的溫度下離心處理。依次加入的稀釋液I，稀釋液II進(jìn)行分裝。分裝好的精液開(kāi)始進(jìn)行冷凍，液氮冷凍保存。解凍方法如下：迅速取冷凍的豬精液，溫度以50℃/min的速率從?140℃升至?5℃，再以3℃/min的速率從?5℃升至5℃解凍。本發(fā)明為普及推廣豬凍精在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了技術(shù)。
【專利說(shuō)明】
一種豬精液的冷凍和解凍方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于豬精液的冷凍保存技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種豬精液的冷凍和解凍方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬的人工授精(artificial inseminat1n，AI)技術(shù)，S卩利用人工方法采取公豬的精液，對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)檢查、稀釋保存等處理，再用器械將精液輸送到發(fā)情母豬生殖器官內(nèi)，使其受孕。人工授精可提高公豬的配種效能，與本交相比，人工授精時(shí)一頭優(yōu)秀種公豬每年配種的母豬可提高10?20倍。由于良種公豬利用率的提高，加速了品種改良，可給養(yǎng)豬生產(chǎn)和豬的育種帶來(lái)巨大的效益;減少公豬的飼養(yǎng)量，節(jié)省了飼養(yǎng)管理費(fèi)用;可克服自然交配的難點(diǎn)，如公、母豬體格相差太大和某些生殖道異常等困難;可擴(kuò)大優(yōu)秀公豬在時(shí)間和地域上的利用率，為優(yōu)秀種豬精液的交流提供了方便;此外，人工授精還可以有效防止公、母豬多種疫病接觸傳染的可能。正是由于人工授精在養(yǎng)豬生產(chǎn)中具有很多優(yōu)越性，使得這一技術(shù)在許多養(yǎng)豬發(fā)達(dá)國(guó)家得到大力推廣。然而，國(guó)內(nèi)外在豬的人工授精中所用的精液多為常溫(15?20°C )液態(tài)保存精液，配種時(shí)的精子活力較高(0.6?0.8)、配種母豬的受胎率較高(75%?85%)，但液態(tài)精液一是不能長(zhǎng)期保存(保存期一般在3?5天)，二是不便于遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，因此，無(wú)法充分發(fā)揮優(yōu)秀種公豬尤其是頂級(jí)種公豬的種用價(jià)值。
[0003]近年來(lái)，豬人工授精的研究重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)移到冷凍精液上。豬冷凍精液技術(shù)是指利用干冰(-79 0C )、液氮(-196 0C )等作冷卻源，將精液特殊處理后冷凍，保存在超低溫(-79 °C或-196°C)的狀態(tài)下，達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的，并且解凍后輸精達(dá)到較高受胎率的技術(shù)。中國(guó)是世界上第一養(yǎng)豬和豬肉生產(chǎn)大國(guó)，近幾年來(lái)，每年生豬存欄4.5?4.7億頭，其中，能繁母豬存欄0.48?0.51億頭，生豬出欄6.5?7.1億頭，豬肉總產(chǎn)4800?5400萬(wàn)噸，約占世界養(yǎng)豬總產(chǎn)的一半;尤其是近年來(lái)，我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)正在從傳統(tǒng)粗放散養(yǎng)方式向規(guī)?；s化飼養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)型，長(zhǎng)白、大白、杜洛克等快長(zhǎng)瘦肉型引進(jìn)豬種已經(jīng)成為規(guī)模化豬場(chǎng)飼養(yǎng)的主流品種，以常溫液態(tài)保存精液技術(shù)為主導(dǎo)的豬人工授精技術(shù)已經(jīng)被大面積的推廣和應(yīng)用到養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中。但在我國(guó)的養(yǎng)豬生產(chǎn)中，對(duì)于冷凍精液的研究與應(yīng)用所開(kāi)展的工作還很欠缺，因此，深入開(kāi)展此項(xiàng)技術(shù)的研究與應(yīng)用，不僅對(duì)于進(jìn)一步發(fā)揮人工授精技術(shù)的優(yōu)勢(shì)具有重要意義，而且對(duì)于開(kāi)展種豬的遺傳改良以及針對(duì)一些瀕危特有地方豬種資源的保存等方面也具有十分重要的戰(zhàn)略意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)，提供一種可有效提尚豬精液冷凍保存的質(zhì)量和效果的豬精液的冷凍和解凍方法。
[0005]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0006]—種豬精液的冷凍和解凍方法，包括豬精液的冷凍方法，豬精液的解凍方法以及豬精液的檢測(cè)，其特征在于，所述豬精液的冷凍方法包括以下步驟:
[0007]步驟一:采集優(yōu)秀的種公豬精液并對(duì)其密度進(jìn)行測(cè)定，然后在用稀釋劑稀釋該精液，稀釋精液的溫度條件為37.5-40 °C，稀釋至最終活精子數(shù)與公豬精液的比例為0.50-
0.51:1。
[0008]步驟二:將步驟一中稀釋后的精液在17.5-19.5 °C的室溫環(huán)境下靜置0.5_lh。
[0009]步驟三:將步驟二中的精液移入14_15°C的溫度條件下降溫平衡3h。
[0010]步驟四:取步驟三中的降溫后的精液800g在14_15°C的溫度下離心處理。
[0011]步驟五:先加入無(wú)甘油的稀釋液I，然后使溫度緩慢降至5°C平衡2h后，再加入含甘油的稀釋液II，然后用細(xì)管進(jìn)行分裝。
[0012]步驟六:取步驟五中分裝好的精液開(kāi)始進(jìn)行冷凍，精液所處環(huán)境初始溫度為5°C，之后以3°C/min的速率從5°C降到_5°C，再于_5 °C條件下保持Imin結(jié)晶，然后以50°C/min的速率從-5°C降到-140°C，最后將精液放入廣口液氮罐內(nèi)與液氮面距離5cm處熏蒸后投入液氮保存。
[0013]進(jìn)一步的，所述豬精液的解凍方法如下:迅速取出于液氮中保存的冷凍的豬精液，溫度以50 0C /min的速率從-140 °C升至_5 °C，再以3 °C /min的速率從-5 °C升至5 °C，解凍即可。
[0014]進(jìn)一步的，所述豬精液的檢測(cè):取解凍后的豬精液，通過(guò)電子生物顯微鏡和計(jì)數(shù)板對(duì)其精子活力、畸形率、有效精子數(shù)進(jìn)彳丁檢測(cè)。
[0015]優(yōu)選地，所述豬精液冷凍方法步驟一中所述的稀釋劑配方為D-葡萄糖37.15g、檸檬酸三鈉6.00g、EDTA鈉鹽1.25g、碳酸氫鈉1.25g、氯化鉀0.75g、青霉素鈉0.60g、硫酸鏈霉素1.0Og或D-葡萄糖60.00g、檸檬酸三鈉3.70g、EDTA鈉鹽3.70g、碳酸氫鈉1.20g、硫酸鏈霉素0.50g、青霉素鈉50萬(wàn)單位。
[0016]優(yōu)選地，所述豬精液冷凍方法步驟五中的稀釋液I和稀釋液II的配方為:D-葡萄糖
11.58、檸檬酸三鈉11.6584014鈉鹽2.358、磷酸二氫鉀1.758、硫酸鏈霉素0.58、聚乙烯醇(PVP.Typell)l.0g、三羧甲基氨基甲醇(Tris)5.5g、檸檬酸4.1g、半盤(pán)氨酸0.07g、0EP(氨基-鈉十二烷基硫酸酯)0.4g、SDS(十二烷基硫酸鈉)0.3g、PGF2a 0.5g、維生素E0.5g、GSH(谷胱甘肽)0.5g、透明質(zhì)酸0.3g、N-乙?；?D-氨基葡糖0.5g。
[0017]經(jīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，采用本發(fā)明所提供的方法冷凍解凍豬精子后，精子在冷凍、解凍后的活力達(dá)到0.5以上，畸形等異常精子率不高于19%，發(fā)情母豬的配種受胎率達(dá)到66%以上，平均每頭母豬正常產(chǎn)仔數(shù)為9頭，達(dá)到了生產(chǎn)應(yīng)用的技術(shù)水平。經(jīng)生產(chǎn)實(shí)踐顯示，該豬精液的冷凍和解凍方法可以使精液得到長(zhǎng)期保存，使精液的使用不受時(shí)間和地域的限制，不受該公豬死亡、損失、采精間隔或繁殖不育的限制，有效提高了公豬的利用率，充分發(fā)揮優(yōu)良公豬的作用，降低活體保種的成本，防止優(yōu)良基因的漂變和傳染病的發(fā)生，利于深入開(kāi)展豬的聯(lián)合育種工作，獲得更大的遺傳進(jìn)展，在保護(hù)地方優(yōu)良品種與加快品種改良等方面具有重要的研究?jī)r(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方法并不局限于實(shí)施例所表示的范圍，該實(shí)施例僅限于說(shuō)明本發(fā)明，而并非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0019]—種豬精液的冷凍和解凍方法，包括豬精液的冷凍方法，豬精液的解凍方法以及豬精液的檢測(cè)，其豬精液的冷凍方法包括以下步驟:
[0020]步驟一:采集優(yōu)秀的種公豬精液并對(duì)其密度進(jìn)行測(cè)定，然后在用稀釋劑稀釋該精液，稀釋精液的溫度條件為37.5-40 °C，稀釋至最終活精子數(shù)與公豬精液的比例為0.50-
0.51:1。
[0021]步驟二:將步驟一中稀釋后的精液在17.5-19.5°C的室溫環(huán)境下靜置0.5-lh。
[0022]步驟三:將步驟二中的精液移入14_15°C的溫度條件下降溫平衡3h。
[0023]步驟四:取步驟三中的降溫后的精液800g在14_15°C的溫度下離心處理。
[0024]步驟五:先加入稀釋液I，然后使溫度緩慢降至5°C平衡2h后，再加入含甘油的稀釋液II，然后用細(xì)管進(jìn)行分裝。
[0025]步驟六:取步驟五中分裝好的精液開(kāi)始進(jìn)行冷凍，精液所處環(huán)境初始溫度為5°C，之后以3°C/min的速率從5°C降到_5°C，再于_5 °C條件下保持Imin結(jié)晶，然后以50°C/min的速率從-5°C降到-140°C，最后將精液放入廣口液氮罐內(nèi)與液氮面距離5cm處熏蒸后投入液氮保存。
[0026]豬精液的解凍方法如下:迅速取出于液氮中保存的冷凍的豬精液，溫度以50°C/min的速率從-140°C升至-5°C，再以3°C/min的速率從_5°C升至5°C，解凍即可。
[0027]豬精液的檢測(cè):取解凍后的豬精液，通過(guò)電子生物顯微鏡和計(jì)數(shù)板對(duì)其精子活力、畸形率、有效精子數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0028]豬精液冷凍方法步驟一中所述的稀釋劑配方為D-葡萄糖37.15g、檸檬酸三鈉6.00g、EDTA鈉鹽1.25g、碳酸氫鈉1.25g、氯化鉀0.75g、青霉素鈉0.60g、硫酸鏈霉素1.0Og或D-葡萄糖60.0Og、檸檬酸三鈉3.70g、EDTA鈉鹽3.70g、碳酸氫鈉1.20g、硫酸鏈霉素0.50g、青霉素鈉50萬(wàn)單位。
[0029]豬精液冷凍方法步驟五中所述的稀釋液I和稀釋液II的配方為:D-葡萄糖11.5g、檸檬酸三鈉11.65g、EDTA鈉鹽2.35g、磷酸二氫鉀1.75g、硫酸鏈霉素0.5g、聚乙烯醇(PVP.Typell)l.0g、三羧甲基氨基甲醇(Tris)5.5g、檸檬酸4.1g、半盤(pán)氨酸0.07g、0EP(氨基-鈉十二烷基硫酸酯)0.4g、SDS(十二烷基硫酸鈉)0.3g、PGF2a 0.5g、維生素E 0.5g、GSH(谷胱甘肽)0.5g、透明質(zhì)酸0.3g、N-乙?；?D-氨基葡糖0.5g。
[0030]豬精液稀釋后降溫的過(guò)程是精子代謝減少的適應(yīng)過(guò)程，需要數(shù)小時(shí)的冷凍平衡時(shí)間，但過(guò)慢的冷卻速度會(huì)使溶液的電解逐漸增高，導(dǎo)致精細(xì)胞膜脂蛋白復(fù)合體破壞和膜分解，當(dāng)細(xì)胞膜脫水收縮達(dá)到臨界最小體積時(shí)，細(xì)胞膜的滲透性產(chǎn)生不可逆的損傷，原來(lái)不能透過(guò)膜的溶質(zhì)變成可滲透性的，進(jìn)而造成細(xì)胞損傷或死亡，本發(fā)明在實(shí)際操作中得出冷凍時(shí)間以2.5?4.0h為宜，配好的稀釋液在4°C下停放過(guò)夜，可以達(dá)到更好的稀釋冷凍效果。
[0031]冷凍過(guò)程中的精子細(xì)胞不但要對(duì)保存狀態(tài)的低溫有耐受能力，而且要能經(jīng)受從射精時(shí)機(jī)體溫度到保存時(shí)的超低溫度的變化而不過(guò)度降低活力，后者比前者更顯得重要。每種細(xì)胞都有它理想的冷凍與解凍速率要求，冷凍速率太慢時(shí)，要保存的細(xì)胞易受高濃度溶解液的影響而死亡或遭到破壞(稱溶解液效應(yīng))；冷凍速率過(guò)快時(shí)，細(xì)胞內(nèi)液體易導(dǎo)致結(jié)冰現(xiàn)象。本發(fā)明在豬精液冷凍過(guò)程中，從5°C降到_5°C時(shí)，降溫速率為3°C/min，該速率不會(huì)對(duì)精子的漿膜導(dǎo)致很大的破壞，從_5°C降到_140°C，降溫速率采用50°C/min，該條件下精子可以快速通過(guò)危險(xiǎn)溫區(qū)(O?-60 °C)，提高了凍精解凍后的存活率。
[0032]本發(fā)明豬精液解凍時(shí)的原理恰好與冷凍相反，理論上講，冷凍/冷卻速率快的情況下，解凍速率也相應(yīng)加快，其程度視不同類型細(xì)胞而略有差異?？焖俳鈨鱿噍^慢速解凍對(duì)精子活力的恢復(fù)有利，精子與濃縮溶液及低溫保護(hù)劑接觸的時(shí)間較短，細(xì)胞內(nèi)外能較快地達(dá)到平衡而使精子的活力得以恢復(fù)。
[0033]本發(fā)明造價(jià)低廉、易推廣，且解凍方法簡(jiǎn)單易行，更易進(jìn)行人工授精，適合規(guī)?；a(chǎn)。
[0034]對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施例的上述說(shuō)明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明，對(duì)實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的實(shí)施例，而是要符合與本文所公開(kāi)的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種豬精液的冷凍和解凍方法，包括豬精液的冷凍方法，豬精液的解凍方法以及豬精液的檢測(cè)，其特征在于，所述豬精液的冷凍方法包括以下步驟: 步驟一:采集優(yōu)秀的種公豬精液并對(duì)其密度進(jìn)行測(cè)定，然后在用稀釋劑稀釋該精液，稀釋精液的溫度條件為37.5-400C，稀釋至最終活精子數(shù)與公豬精液的比例為0.50-0.51:1。 步驟二:將步驟一中稀釋后的精液在17.5-19.5 °C的室溫環(huán)境下靜置0.5-lh。 步驟三:將步驟二中的精液移入14-15 °C的溫度條件下降溫平衡3h。 步驟四:取步驟三中的降溫后的精液SOOg在14-15°C的溫度下離心處理。 步驟五:先加入無(wú)甘油的稀釋液I，然后使溫度緩慢降至5°C平衡2h后，再加入含甘油的稀釋液II，然后用細(xì)管進(jìn)行分裝。 步驟六:取步驟五中分裝好的精液開(kāi)始進(jìn)行冷凍，精液所處環(huán)境初始溫度為5 0C，之后以3°C/min的速率從5°C降到_5°C，再于_5°C條件下保持Imin結(jié)晶，然后以50°C/min的速率從_5°C降到_140°C，最后將精液放入廣口液氮罐內(nèi)與液氮面距離5cm處熏蒸后投入液氮保存。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬精液的冷凍和解凍方法，其特征在于，所述豬精液的解凍方法如下:迅速取出于液氮中保存的冷凍的豬精液，溫度以50 °C /min的速率從-140 °C升至-5°C，再以3°C/min的速率從-5°C升至5°C，解凍即可。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬精液的冷凍和解凍方法，其特征在于，所述豬精液的檢測(cè)如下:取解凍后的豬精液，通過(guò)電子生物顯微鏡和計(jì)數(shù)板對(duì)其精子活力、畸形率、有效精子數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬精液的冷凍和解凍方法，其特征在于，所述豬精液冷凍方法步驟一中所述的稀釋劑配方為:D-葡萄糖37.15g、檸檬酸三鈉6.00g、EDTA鈉鹽1.25g、碳酸氫鈉I.25g、氯化鉀0.75g、青霉素鈉0.60g、硫酸鏈霉素1.0Og或D-葡萄糖60.00g、檸檬酸三鈉3.70g、EDTA鈉鹽3.70g、碳酸氫鈉1.20g、硫酸鏈霉素0.50g、青霉素鈉50萬(wàn)單位。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬精液的冷凍和解凍方法，其特征在于，所述豬精液冷凍方法步驟五中的稀釋液I和稀釋液11的配方為:D-葡萄糖11.5g、檸檬酸三鈉11.65g、EDTA鈉鹽2.358、磷酸二氫鉀1.758、硫酸鏈霉素0.58、聚乙烯醇(？￥?.了7?611)1.(^、三羧甲基氨基甲醇(Tri s) 5.5g、梓檬酸4.1g、半盤(pán)氨酸0.07g、OEP (氨基-鈉十二燒基硫酸酯)0.4g、SDS(十二烷基硫酸鈉)0.3g、PGF2a 0.5g、維生素E 0.5g、GSH(谷胱甘肽)0.5g、透明質(zhì)酸0.3g、N_乙?；?D-氨基葡糖0.5g。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK106070184SQ201610374193
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】吳衍嶺, 陳憲彬, 劉晶, 喬富興, 彭興泉, 袁震, 侯磊
【申請(qǐng)人】山東鑫基牧業(yè)有限公司