專(zhuān)利名稱(chēng)：用于純化細(xì)胞、化學(xué)物質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多級(jí)電磁分離器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明要求1999年4月9日美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/128,627的優(yōu)先權(quán)。
本申請(qǐng)政府項(xiàng)目，NAS9-97027號(hào)合同的一部分。
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及定量分離細(xì)胞、化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、配體或其他顆粒的新方法，采用的是多級(jí)磁輔助分離技術(shù)(“MAGSEP”)。MAGSEP極其適合免疫研究和分析，藥物開(kāi)發(fā)、研究和加工，以及其他生物醫(yī)藥應(yīng)用?？捎肕AGSEP技術(shù)進(jìn)行與臨床、動(dòng)/植物研究相關(guān)的細(xì)胞分離。
現(xiàn)有技術(shù)描述幾乎所有的現(xiàn)有技術(shù)都可以歸為磁性過(guò)濾一類(lèi)，即將非磁性顆粒與磁性顆粒分離而不論磁性顆粒的磁化程度如何。例如，Miltenyl等在靜態(tài)試管或流動(dòng)通道內(nèi)用強(qiáng)力場(chǎng)梯度將以磁性顆粒(順磁性、超順磁性或鐵磁性)標(biāo)記的細(xì)胞吸附于試管壁或通道壁，從而將其俘獲。非磁性顆粒則沉降或流走，只留下磁性顆粒被俘獲，然后由力場(chǎng)中釋放得以收集。在美國(guó)專(zhuān)利5,053,344中，Zborowsky將一個(gè)類(lèi)似的過(guò)程定名為“磁泳”一磁截止。Liberti等在美國(guó)專(zhuān)利4,795,698中提出將細(xì)的鐵磁性磁極條伸入磁性顆粒懸浮液可將且僅將磁性顆粒吸附于磁極上；非磁性顆粒則游走或沉降分離，當(dāng)力場(chǎng)撤消時(shí)，所吸附的顆粒釋放進(jìn)入懸浮液，從而作為純凈細(xì)胞被收集。在一種類(lèi)似于層析的方法中，Ugelstad提出可在珠狀鐵磁性介質(zhì)或纖維周?chē)纬筛吡?chǎng)梯度，用以俘獲磁性顆粒標(biāo)記的細(xì)胞。其他還有一些此類(lèi)磁性過(guò)濾裝置，例如美國(guó)專(zhuān)利4,795,698和5,053,344。以上所述都是一種相似的、簡(jiǎn)單的兩分法，即將磁性顆粒與非磁性顆粒分開(kāi)，所用的都是高梯度磁場(chǎng)。
與本發(fā)明更接近的現(xiàn)有技術(shù)是Power等所述將低梯度力場(chǎng)施加于通道內(nèi)水平流動(dòng)的懸浮液根據(jù)磁標(biāo)記的磁化水平，通過(guò)磁標(biāo)記細(xì)胞的吸附，將其動(dòng)態(tài)亦即潛在地俘獲。然而，該方法僅用于二元分離。Winoto-Morbach等引入了“磁泳遷移率”的概念，意指有一個(gè)固有參數(shù)使得顆?？梢愿鶕?jù)其在力場(chǎng)梯度中的遷移速度而分離。遷移率即速度與驅(qū)動(dòng)力之比。在這一概念的實(shí)施方式之一即Zborowsky等的美國(guó)專(zhuān)利5,968,820中，對(duì)磁泳遷移率進(jìn)行了測(cè)定，美國(guó)專(zhuān)利5,974,901則提出大型永磁體磁極的顆粒懸浮液受控層流，顆粒會(huì)根據(jù)其磁泳遷移率發(fā)生偏轉(zhuǎn)。所述偏轉(zhuǎn)可被用作根據(jù)顆粒遷移率或磁化程度進(jìn)行回收的方法。Reddy等(1995)和Zborowsky等(1995)開(kāi)發(fā)出了直接評(píng)估不同磁性顆粒類(lèi)型磁化的分析方法。
與此競(jìng)爭(zhēng)的其他制備技術(shù)包括另一些不同類(lèi)型的分離方法，例如電泳和離心。電泳分離是讓物質(zhì)通過(guò)一個(gè)電場(chǎng)，根據(jù)細(xì)胞對(duì)一特定正電荷或負(fù)電荷的吸引力而發(fā)生分離。目前市場(chǎng)上的許多制造商只制造電泳設(shè)備。離心則是靠慣性力來(lái)分離細(xì)胞或其他物質(zhì)。較重的物質(zhì)受力向外移動(dòng)，而較輕的物質(zhì)則留在溶液的上層。這一過(guò)程的優(yōu)越性取決于待分離細(xì)胞是否能夠承受這樣的力，是否可以?xún)H根據(jù)其大小和/或密度進(jìn)行分離。該技術(shù)對(duì)細(xì)胞可能特別具有破壞性，因?yàn)楫?dāng)離心裝置將細(xì)胞推向容器壁時(shí)，細(xì)胞會(huì)受到很大的力。
美國(guó)專(zhuān)利5,974,901中，Zborowski等的方法是在含有細(xì)胞的區(qū)域施加一個(gè)近乎恒定的力場(chǎng)，例如磁場(chǎng)，從而使細(xì)胞在該力場(chǎng)中遷移。通過(guò)獲取該力場(chǎng)中顆粒(細(xì)胞)的一系列顯微圖像，可以測(cè)出其速度，并可以用軟件繪制出速度直方圖，如果所述力場(chǎng)為磁場(chǎng)，則該圖反映顆粒的磁化程度。該方法的用途之一是測(cè)定磁泳遷移率即顆粒速度與所施加的場(chǎng)強(qiáng)之比，由此可得出顆粒的其他物理及化學(xué)信息。本發(fā)明與Zborowski等的區(qū)別在于Zborowski等是基于磁性分布的顆粒分析，本發(fā)明則提供基于此類(lèi)特性的顆粒俘獲方法，以及根據(jù)磁泳遷移率的顆粒收集和分離方法，不限于Zborowski等單純的分析數(shù)據(jù)收集。
美國(guó)專(zhuān)利5,968,820，Zborowski等的方法中，有一生物細(xì)胞混合物，細(xì)胞表面固定有一定數(shù)量的磁性顆粒，其數(shù)量與研究者所研究的受體的數(shù)量成正比，細(xì)胞因此在其懸浮所處的流動(dòng)物流中得以分離。所述物流在兩個(gè)磁極間流動(dòng)，其中的細(xì)胞以一定的速度向磁極偏轉(zhuǎn)，該速度取決于它們的磁泳遷移率，也就是取決于其磁化率，也就是取決于其受體密度。最后，分離后的細(xì)胞或顆粒在多個(gè)出口被收集成為若干級(jí)份，每一級(jí)份內(nèi)的細(xì)胞分別具有特定范圍內(nèi)的受體密度。與Zborowski等所述不同，本發(fā)明使用的是小室內(nèi)的靜態(tài)樣品，通過(guò)施加磁力使細(xì)胞或顆粒以一定的速度流出小室，該速度取決于它們的磁泳遷移率，也就是取決于其磁化率，也就是取決于其受體密度。
美國(guó)專(zhuān)利5,053,344，Zborowski等的系統(tǒng)中，在兩磁極間有一段空隙，其中，在重力或其他力的驅(qū)動(dòng)下，顆粒懸浮液流過(guò)一個(gè)有兩面平行壁的薄室。該室的位置使得懸浮液液流中的顆粒受到空間梯度磁力的作用。所述空間梯度磁力使得顆粒的俘獲根據(jù)它們的磁化率在一個(gè)平面上形成一定的空間分布，該過(guò)程稱(chēng)為“磁性記錄(ferrography)”。俘獲后，可以根據(jù)俘獲位置對(duì)懸浮液中的顆粒尤其是生物細(xì)胞進(jìn)行檢查，但不是根據(jù)其磁化率(如果用磁性標(biāo)記的配體顆粒，則也就是根據(jù)受體密度)對(duì)懸浮液中的顆粒進(jìn)行分離。該系統(tǒng)并沒(méi)有對(duì)懸浮液中的顆粒進(jìn)行分離收集，因此與本發(fā)明不同，本發(fā)明正是以分離和收集為目標(biāo)。
改進(jìn)分離活細(xì)胞和蛋白質(zhì)的技術(shù)因?yàn)樯锛夹g(shù)日益受到重視而變得越來(lái)越重要，因?yàn)榉蛛x常成為許多生物學(xué)方法中的限制因素。為了滿(mǎn)足上述需要，本發(fā)明提供了一種定量分離細(xì)胞、顆粒、配體、蛋白質(zhì)以及其他化學(xué)物質(zhì)的方法，使用的是磁力和/或電磁輔助分離法。
發(fā)明概述本發(fā)明裝置和方法可定量分離細(xì)胞、蛋白質(zhì)或其他顆粒，本發(fā)明采用多級(jí)磁力和/或電磁輔助分離技術(shù)(″MAGSEP″)。MAGSEP技術(shù)是一種可用于醫(yī)藥、化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物技術(shù)的分離技術(shù)。而且，本發(fā)明還涉及一種對(duì)共同合成分子混合物進(jìn)行分離并提純的方法，可由此制備具有不同大小、長(zhǎng)度、分子量和結(jié)構(gòu)元素的分組產(chǎn)物。然后對(duì)它們進(jìn)行與抗體、受體或其他結(jié)合成員的結(jié)合能力分析。上述收集過(guò)程可以生成一個(gè)配體文庫(kù)，其中包含所有結(jié)合成員的特異性配體，雖然某一序列的構(gòu)型數(shù)可能較多。該技術(shù)為細(xì)胞生物學(xué)家提供了一種用于研究分子識(shí)別作用的工具?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)包含已知序列和任意序列的組合文庫(kù)進(jìn)行篩選，從中獲得結(jié)合性強(qiáng)的配體。這樣的工具提供了識(shí)別和分離激動(dòng)劑、拮抗劑、酶抑制劑、病毒阻抑劑、抗原和其他藥物的方法。
在臨床使用單級(jí)或多級(jí)磁力和/或電磁分離器時(shí)，以逐漸減少的順磁性微珠標(biāo)記細(xì)胞，采用強(qiáng)度逐漸升高的力場(chǎng)，根據(jù)它們被標(biāo)記的程度進(jìn)行定量分離。受體上結(jié)合磁珠越多的細(xì)胞越能被弱力場(chǎng)吸引，磁珠越少的細(xì)胞則越不能被吸引，參見(jiàn)


圖1。這一原理確立了用一速率或平衡過(guò)程，根據(jù)細(xì)胞或其他顆粒磁力進(jìn)行分離(“分級(jí)”)的基礎(chǔ)。
電磁輔助方法在此前未能在商業(yè)上獲得重用的主要原因之一是所用設(shè)備的神秘性。其實(shí)際上相當(dāng)簡(jiǎn)單的物理機(jī)制被認(rèn)為過(guò)于復(fù)雜。另外還存在著對(duì)分離機(jī)制的誤解。除了不被了解之外，實(shí)際物理因素也曾經(jīng)是阻礙磁場(chǎng)輔助分離應(yīng)用的因素之一。要求磁珠與待分離物(separand)特異性吸附的大多數(shù)磁力輔助分離需要后續(xù)裝置去除不需要的顆粒。
本發(fā)明的多級(jí)電磁分離器大大簡(jiǎn)化了電磁場(chǎng)輔助分離過(guò)程，從而克服了上述障礙。所述分離器不需要凝膠、紙張等穩(wěn)定化基質(zhì)，也不需要密度梯度。該技術(shù)不需要液體強(qiáng)制流動(dòng)來(lái)進(jìn)行磁力分離。液體的反復(fù)轉(zhuǎn)移使流速降至最低，并為分離純化細(xì)胞和蛋白質(zhì)提供了更溫和更適合的環(huán)境。本發(fā)明的電磁分離技術(shù)還能夠自動(dòng)傾析污染性懸浮液。不需要的細(xì)胞或顆粒作為過(guò)程的副產(chǎn)物被滯留在相反的另一半室中。最終，儀器的終端用戶(hù)將發(fā)現(xiàn)僅需制備一種緩沖液即可提純并收集自動(dòng)分離的組分而無(wú)需復(fù)雜的泵送和真空操作，這帶來(lái)了效率的提高。
磁力分離技術(shù)在其初期的應(yīng)用之一是新糖基結(jié)合體(neoglycoconjugate)研制。許多細(xì)胞、酶和外源凝集素都具有特定糖(“外源凝集素”表示“糖結(jié)合性蛋白質(zhì)”)的識(shí)別位點(diǎn)。通過(guò)將特定糖(寡糖或多糖)與磁珠表面結(jié)合，特定細(xì)胞、酶或外源凝集素可通過(guò)HMGS或MACS分離。這代表了MAGSEP的一種理想用途，因?yàn)?，不同的糖結(jié)合體可以不同的強(qiáng)度與磁珠連接，從而從混合物中分離出來(lái)，識(shí)別可強(qiáng)磁化微珠上糖結(jié)合體A的細(xì)胞可與識(shí)別可弱磁化微珠上糖結(jié)合體B的細(xì)胞相分離。而且，通過(guò)加入可競(jìng)爭(zhēng)磁性結(jié)合位點(diǎn)的游離糖的溶液，可釋放出被磁力俘獲的細(xì)胞，MAGSEP由此可最后收集到?jīng)]有微珠結(jié)合的細(xì)胞。
盡管有了以上最近的革新，仍需要能根據(jù)受體密度進(jìn)行的細(xì)胞分離方法。最近，研究實(shí)驗(yàn)室在科研中多用受體數(shù)量作為依賴(lài)性變量。在內(nèi)分泌學(xué)中，小鼠白細(xì)胞顯示β腎上腺素受體減少；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中，EGF受體的減少受培養(yǎng)物中細(xì)胞密度的調(diào)節(jié)，該密度可用魚(yú)精蛋白調(diào)節(jié)；在病毒學(xué)中，細(xì)胞表面上病毒進(jìn)入細(xì)胞所需皰疹病毒糖蛋白D受體數(shù)量是有限的；在腫瘤形成過(guò)程中，H-ras致癌基因可改變EGF-β受體的數(shù)量和類(lèi)型；在傳染病中，galanin受體水平與胰細(xì)胞的百日咳毒素抗性相關(guān)，已經(jīng)鑒定到一種白喉毒素受體結(jié)合蛋白。在神經(jīng)學(xué)中，受刺激腦細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)生阿片樣物質(zhì)κ受體調(diào)節(jié)；營(yíng)養(yǎng)學(xué)中，當(dāng)發(fā)生蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良時(shí)，肥大細(xì)胞會(huì)損失IgE受體，還發(fā)現(xiàn)存在著高密度的血管活性腸肽(VIP)受體。以上只是最新發(fā)現(xiàn)的少量舉例，這些清楚地表明，針對(duì)受體密度改變細(xì)胞的研究工具將大受歡迎。
已經(jīng)有了一些方法通過(guò)用免疫微珠配體標(biāo)記人類(lèi)循環(huán)系統(tǒng)中的細(xì)胞，然后用高磁力梯度技術(shù)特異性地對(duì)其進(jìn)行牽引。在目前的實(shí)踐中，這是一種二元分離方法，這種方法可因本發(fā)明的連續(xù)分離而得到改善。
使用磁力傳遞藥物是磁性顆粒分離技術(shù)的又一潛在用途。制成用于傳遞的磁化顆?；蚰z囊后，必需將弱磁化顆粒與磁化率最高的顆?；蚰z囊分離。由于要的是強(qiáng)磁化顆粒，所以一個(gè)重要的考慮因素是外部磁體與傳遞部位間的距離，以及不要誤送了弱磁化顆粒，這些顆粒若攜帶有藥物，將造成不良副作用。該技術(shù)可用于分離AIDS患者的T淋巴細(xì)胞特定亞型，或分離治療糖尿病的胰島細(xì)胞特定亞型。
診斷測(cè)試中，除進(jìn)行預(yù)純化細(xì)胞計(jì)數(shù)外還可進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，但后者的成本可高達(dá)前者的100倍。但本發(fā)明方法的低成本具有重大意義發(fā)展中國(guó)家AIDS護(hù)理的困擾在于難以進(jìn)行診斷檢測(cè)，因?yàn)槿狈M(jìn)行流動(dòng)計(jì)數(shù)的流式計(jì)數(shù)儀。采用多級(jí)電磁分離器的本發(fā)明解決了這些問(wèn)題，并可望為此類(lèi)全球性健康問(wèn)題提供解決手段。
理論上，磁輔助分離法不存在容量限制。它可以應(yīng)診斷所需而很小，也可以應(yīng)制備(例如細(xì)胞移植)所需而很大。后一種情況很重要，因?yàn)槎糠蛛x所需的高磁性柱(可能高達(dá)1m，力場(chǎng)強(qiáng)度高達(dá)1-2特斯拉)可用一個(gè)轉(zhuǎn)盤(pán)內(nèi)的多級(jí)分離室所取代，其中裝有中等強(qiáng)度的磁體和電磁體，參見(jiàn)圖2。
開(kāi)發(fā)用戶(hù)友好性、能夠根據(jù)顆粒表面配體數(shù)量分離顆粒的裝置看來(lái)是改進(jìn)磁輔助分離裝置方面最大的需要。在這方面，磁分離產(chǎn)業(yè)已獲得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)步，但目前的技術(shù)仍?xún)H限于二元分離。一個(gè)例子是Baxter Healthcare的Isolex-300磁力細(xì)胞分離器，它能通過(guò)使用單克隆抗體(MAB)包被的磁珠來(lái)選擇干/祖細(xì)胞。干細(xì)胞被選用于再生因化療或放療受損的骨髓。本發(fā)明的MAGSEP代表了一個(gè)技術(shù)躍進(jìn)，因?yàn)楸景l(fā)明最終可提供一種根據(jù)表面組成的細(xì)小差異進(jìn)行微分分離的可靠方法。
大多數(shù)基于配體(例如受體-抗體)的細(xì)胞分離方法是非此即彼的二元性的?，F(xiàn)在將磁力吸引作為速率過(guò)程與逆流分離相結(jié)合可以使磁力細(xì)胞分離成為一種定量技術(shù)，根據(jù)每個(gè)細(xì)胞上結(jié)合的配體數(shù)量進(jìn)行分離。根據(jù)各種細(xì)胞所結(jié)合的配體量，該方法可以是定性的，根據(jù)同種細(xì)胞各自所結(jié)合的配體量或高或低，它也可以是定量的。
本發(fā)明目的之一是提供一種定量分離細(xì)胞、蛋白質(zhì)或其他顆粒的方法，使用的是多級(jí)磁力電磁輔助分離技術(shù)(″MAGSEP″)。
本發(fā)明的目的還在于提供一種分離共同合成分子混合物的方法，共同合成分子生成了多組不同種產(chǎn)物，各自具有不同的大小、長(zhǎng)度、(分子量)以及可用于分析其與抗體、受體或其他配體特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)元件，該方法提供了構(gòu)建配體文庫(kù)的手段，所述文庫(kù)可包含所有連接合成員的配體，從而為細(xì)胞生物學(xué)家提供一種研究分子識(shí)別作用的工具。
本發(fā)明的目的還在于提供一種由含有已知和任意序列的組合文庫(kù)識(shí)別并分離激動(dòng)劑、拮抗劑、酶抑制劑、病毒阻抑劑、抗原和其他藥物的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種進(jìn)行動(dòng)植物細(xì)胞和細(xì)胞組分磁力分級(jí)的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種平板組件，其中可安裝至少一塊，最好多塊磁體，電磁體和/或其組合，并具有一個(gè)支撐基底。
本發(fā)明的目的還在于設(shè)計(jì)能提供不同場(chǎng)強(qiáng)(1-1000mT)的電磁硬件和驅(qū)動(dòng)板。
本發(fā)明的目的還在于提供一種平板平動(dòng)指引系統(tǒng)。
本發(fā)明的目的還在于使本發(fā)明的電磁分離器能適配裝入ADSEP容器，用于宇航和遠(yuǎn)程用途。
本發(fā)明的目的還在于與數(shù)據(jù)管理及處理控制系統(tǒng)相結(jié)合。
本發(fā)明的目的還在于提供一種極性改變較快的電磁體用于強(qiáng)化混合。
本發(fā)明的目的還在于提供一種磁力恒定且具有確定磁通密度的電磁體。
本發(fā)明的目的還在于提供一種實(shí)施方式，其中，表面帶有受體的細(xì)胞可通過(guò)特定的化學(xué)物質(zhì)配體附著于有待本發(fā)明收集的磁性顆粒，所述的細(xì)胞表面受體可被抗體結(jié)合，所述配體例如與生物素反應(yīng)的親和素，與所述抗體化學(xué)結(jié)合的維生素。
本發(fā)明的目的還在于從合成的非均勻磁性顆粒群中選出均勻的磁性顆粒群用于細(xì)胞研究。
發(fā)明的目的還在于基于弱磁性顆粒遷移率低造成的差異性和選擇性來(lái)選擇高強(qiáng)度、均勻磁性顆粒用于定向藥物傳遞，將磁性微粒用于腸胃外定向藥物傳遞。
本發(fā)明的目的還在于采用一種平動(dòng)磁體為二極、四極或六極永磁體的方式，或磁體為二極、四極或環(huán)形電磁體的方式。
本發(fā)明的目的還在于采用這樣一種方式，其中的平動(dòng)磁體為一系列固定的任意極性電磁體，它們依次工作，從而將顆粒掃入一個(gè)共同的啟動(dòng)區(qū)帶。
本發(fā)明的目的還在于采用計(jì)算機(jī)和用戶(hù)軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)平動(dòng)磁體、吸持磁體(holding magnet)和轉(zhuǎn)盤(pán)傳遞系統(tǒng)的控制。
本發(fā)明的目的還在于采用這樣一種方式，其中，俘獲室和吸持磁體成直線(xiàn)排列，或排成其他幾何相對(duì)關(guān)系，例如環(huán)繞。
本發(fā)明的目的還在于采用這樣一種方式，其中，一個(gè)以上樣品室與各自的平動(dòng)磁體構(gòu)成俘獲室陣列。
本發(fā)明的目的還在于采用這樣一種方式，其中，本發(fā)明被用于分離磁性標(biāo)記的生物細(xì)胞。
本發(fā)明的目的還在于采用這樣一種方式，其中，本發(fā)明被用于選擇均勻的磁性微粒以用于細(xì)胞分離及其他生物化學(xué)分離過(guò)程。
本發(fā)明的目的還在于采用這樣一種方式，其中，本發(fā)明被用于選擇均勻的磁性微粒亞群，用于定向藥物傳遞。
本發(fā)明的目的還在于采用這樣一種方式，其中，本發(fā)明被用于所有需要根據(jù)磁泳遷移率亦即體積磁化率差異將磁性顆粒分級(jí)(分離)的過(guò)程。
本發(fā)明的目的還在于采用這樣一種方式，其中沒(méi)有采用平動(dòng)磁體。
后文描述有助于更充分地理解本發(fā)明的上述及其他目的。
附圖簡(jiǎn)述根據(jù)以下描述，結(jié)合附圖，可對(duì)本發(fā)明有更好的理解。附圖中，同一編號(hào)代表同一零部件。
圖1是通過(guò)特異性抗體結(jié)合于細(xì)胞受體上的磁珠；圖2顯示一種多級(jí)電磁分離器與假想的磁力層析柱的比較；圖3顯示一種單級(jí)磁力分離過(guò)程，其中與磁珠結(jié)合的細(xì)胞順著場(chǎng)強(qiáng)梯度被引向磁極；圖4是一種用于樣品俘獲的電磁分離器的剖視圖，顯示了平動(dòng)磁體和吸持磁體，以及相關(guān)裝置；圖5是實(shí)驗(yàn)室用電磁體分離裝置的透視圖，顯示了平板組件，電磁體組件，吸持磁體，和底座；圖6是一個(gè)平動(dòng)電磁體實(shí)施方式，顯示了不銹鋼的鐵芯和繞線(xiàn)；圖7顯示用于圖6實(shí)施方式的平板組件；圖8是圖6實(shí)施方式中平板組件進(jìn)樣口的透視圖；圖9是用于圖4實(shí)施方式的小室，還顯示了俘獲室和樣品室，以及吸持電磁體、固定用磁體、和平動(dòng)電磁體；
圖10是平板和小室的剖視圖，顯示樣品室的進(jìn)樣過(guò)程；
圖11是平板和小室的剖視圖，顯示小室相對(duì)于上平板轉(zhuǎn)動(dòng)的位置；
圖12是平板和小室的剖視圖，顯示樣品室內(nèi)顆粒排列的啟動(dòng)，即平動(dòng)磁體通電引起顆粒向板界面的移動(dòng)；
圖13是平板和小室的剖視圖，顯示平動(dòng)電磁體的位置和顆粒的俘獲；
圖14是平板和小室的剖視圖，顯示上平板轉(zhuǎn)動(dòng)從而俘獲部分顆粒；
圖15是平動(dòng)磁體場(chǎng)強(qiáng)圖；
圖16所示為圖4實(shí)施方式的吸持磁體組件；
圖17所示為磁性微球體與非磁性微球體的分離；
圖18顯示平板組件的透視圖，該組件與平動(dòng)電磁站相接；
圖19是令收集板轉(zhuǎn)動(dòng)的MAGSEP的引導(dǎo)系統(tǒng)的透視圖；圖20是一種盒式處理裝置模件設(shè)計(jì)的透視圖；圖21是一個(gè)MAGSEP盒的透視圖，它具有與航空業(yè)準(zhǔn)用的“ADSEP”盒相同的組件，但容量不同；圖22是一種實(shí)施方式，其中的平動(dòng)磁體組件采用了多個(gè)四極磁體，它們層疊式排列，依次通電；圖23是一種實(shí)施方式，其中的平動(dòng)磁體組件由活動(dòng)四極磁體構(gòu)成；圖24是一種實(shí)施方式，其中采用四極或六極平動(dòng)磁體。
優(yōu)選實(shí)施方式的描述本發(fā)明是一種電磁分離器10，采用電磁輔助分離法定量分離細(xì)胞、蛋白質(zhì)、配體、化學(xué)物質(zhì)、抗原和其他顆粒物質(zhì)。本發(fā)明的多級(jí)電磁體(“MAGSEP”)10能夠進(jìn)行基于磁化率和磁泳遷移率的多級(jí)分離。電磁分離器10的優(yōu)選形式之一是一種多級(jí)逆流裝置，其中，底物或細(xì)胞用逐漸減少的順磁性磁珠標(biāo)記，并用逐漸增強(qiáng)的力場(chǎng)強(qiáng)度根據(jù)標(biāo)記程度進(jìn)行定量分離。所述電磁分離器10通過(guò)自動(dòng)進(jìn)行級(jí)份收集而提高了產(chǎn)物回收率，并可實(shí)現(xiàn)微分分離，而此前只可能進(jìn)行二元分離。該分離器可用于各種水性懸浮液，并可靈活適用于商業(yè)性用途和空間實(shí)驗(yàn)室。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)根據(jù)細(xì)胞表面抗原含量來(lái)分離大量免疫細(xì)胞、血細(xì)胞及其他分化細(xì)胞。而且，它還能夠根據(jù)磁化率和/或磁泳遷移率對(duì)樣品中的各組分進(jìn)行更高水平或純度的細(xì)分。而且，可以通過(guò)改變場(chǎng)強(qiáng)均勻俘獲磁化的細(xì)胞或其他底物。
磁泳作用力定義為-μm=VmBdBdZ]]>其中的B是俘獲磁體的力場(chǎng)強(qiáng)度，Vm是顆粒在力場(chǎng)中的速度。該速度是力場(chǎng)和顆粒及溶劑特性的函數(shù)Vm=2a2ΔxBdBaημ0dZ]]>所以，MAGSEP裝置中的各級(jí)分別選擇磁泳遷移率不同的顆粒。各級(jí)內(nèi)的顆粒則具有不同的遷移率分布。低力場(chǎng)強(qiáng)度將選擇遷移率高的顆粒，較高的力場(chǎng)強(qiáng)度則選擇遷移率較低的顆粒。所以，各級(jí)根據(jù)俘獲磁體的力場(chǎng)強(qiáng)度和顆粒停留時(shí)間具有各自的磁泳遷移率截留值。
方程(2)中，a是顆粒半徑，Δx是顆粒與介質(zhì)的磁化率差異，η是粘度，μ0是自由空間的磁導(dǎo)率。
運(yùn)用力場(chǎng)的細(xì)胞分離方法多被用作二元分離方法，分離
圖1所示基于特異性表面配體而結(jié)合和沒(méi)有結(jié)合磁性微球體的細(xì)胞。如圖所示，抗原結(jié)合于細(xì)胞受體位點(diǎn)，生物素與抗體結(jié)合。磁珠與親和素結(jié)合，后者則與生物素結(jié)合。由于表面具有抗體結(jié)合性受體的生物細(xì)胞可通過(guò)配體(例如與生物素反應(yīng)的親和素)與磁性顆粒結(jié)合，所以可將配體與抗體化學(xué)結(jié)合。
圖5顯示的是一種多級(jí)電磁分離器與一假象磁性層析柱比較。如前所述，MAGSEP裝置采用步進(jìn)轉(zhuǎn)動(dòng)分布和容器系統(tǒng)，可選擇、分離并儲(chǔ)存不同磁泳遷移率的顆粒。各級(jí)中的顆粒將具有不同的遷移率分布。低場(chǎng)強(qiáng)將選擇遷移率高的顆粒，高場(chǎng)強(qiáng)則選擇遷移率小的顆粒。所以，各級(jí)根據(jù)俘獲磁體的力場(chǎng)強(qiáng)度和顆粒停留時(shí)間具有各自的磁泳遷移率截留值。圖2顯示，移動(dòng)快的細(xì)胞其磁泳遷移率較大。于是，細(xì)胞根據(jù)其表面上的配體得以分離。
將磁力吸引作為一種速率過(guò)程與逆流分離相結(jié)合，細(xì)胞的磁力分離就可以成為根據(jù)每個(gè)細(xì)胞所結(jié)合配體的數(shù)量進(jìn)行分離的定量技術(shù)。若根據(jù)每種細(xì)胞所結(jié)合的配體量，該方法是定性的，若根據(jù)同種細(xì)胞不同個(gè)體上配體結(jié)合量的或多或少，則是定量的。
圖3顯示一種單級(jí)分離過(guò)程，其中，與磁珠結(jié)合的細(xì)胞順著場(chǎng)強(qiáng)梯度被引向磁極。圖中顯示了一個(gè)磁源，它可以是永磁體或電磁體，位于容器或小室的上方，在其中產(chǎn)生一個(gè)力場(chǎng)梯度，磁力牽引順磁性顆粒根據(jù)各自的磁泳遷移率而移動(dòng)。本發(fā)明的電磁分離裝置10可以進(jìn)行非常清楚的分離，其中，顆粒疏松地排列成層，磁性最強(qiáng)的顆粒位于小室的頂部，磁化率略低的懸浮于中部，沒(méi)有或幾乎沒(méi)有磁化的則懸浮于小室的底部。
例如，所有與磁化珠結(jié)合的待分離物(例如細(xì)胞或蛋白質(zhì))可以從均勻的懸浮液中被引向多級(jí)分離器的一個(gè)半室，而非磁性待分離物則仍然均衡地分配于上室和下室之間。讓非磁性顆粒靜置沉降一段時(shí)間。移動(dòng)上室至新鮮溶液上方，使之與分離后的細(xì)胞充分混合。在低重力條件下，可以不用沉降獲得以上結(jié)果，而采用稀釋法除去上室中的非磁性顆粒。
優(yōu)選實(shí)施方式通過(guò)在同一平板組件中使用多個(gè)樣品室來(lái)實(shí)現(xiàn)多級(jí)分離。在分離過(guò)程中，平動(dòng)電磁體和吸持電磁體的場(chǎng)強(qiáng)是可變的。
圖4是本發(fā)明多級(jí)電磁分離器10的透視圖。MAGSEP單元10的上平板26與下平板24以協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)動(dòng)方式接合，下平板24由多個(gè)支撐腿22支承，上平板26中至少有1個(gè)(最好多個(gè))上收集室27，它們與下平板24和其中的下樣品室38液體相通，室38內(nèi)由脂、蠟或其他潤(rùn)滑劑和/或密封劑形成一密封層。該圖還顯示了一個(gè)平動(dòng)電磁體40，平動(dòng)系統(tǒng)42，吸持磁體44(在本實(shí)施例中，它是一塊永磁體)帶冷卻風(fēng)扇的吸持電磁體46，平板轉(zhuǎn)動(dòng)系統(tǒng)48，和平板定位微鈕50。
圖5所示是一個(gè)商品化的裝置，其中，上平板26由聚碳酸酯等聚合物制成，安裝在軸承33上，由夾緊螺栓29緊固。支撐腿22換成了側(cè)板23，形成一個(gè)底座。下平板24是不銹鋼制成的。吸持磁體步進(jìn)馬達(dá)帶動(dòng)平板26轉(zhuǎn)動(dòng)。吸持電磁體46懸于管27上方。電磁體35位于底座內(nèi)。底座安裝在機(jī)箱37上，機(jī)箱上有電源開(kāi)關(guān)39，110VAC插座41，流通口43，指示燈45和冷卻風(fēng)扇47。
更具體地說(shuō)，該實(shí)驗(yàn)室裝置包括一臺(tái)計(jì)算機(jī)和軟件，由電子組件箱和處理單元構(gòu)成。電子組件有數(shù)個(gè)接口，包括110VAC電源、電源開(kāi)關(guān)，RS 232接口和狀態(tài)指示燈。該處理單元接受來(lái)自110AC連接件的電源。電源由電源開(kāi)關(guān)開(kāi)啟?？刂扑鎏幚韱卧腜C通過(guò)RS232信號(hào)連接件工作。電源、平動(dòng)電磁體、吸持磁體和平板轉(zhuǎn)動(dòng)的狀態(tài)以GUI顯示。
單個(gè)處理單元由上平板和下平板，平板轉(zhuǎn)動(dòng)系統(tǒng)，電磁體，電磁體平動(dòng)系統(tǒng)和吸持磁體組件構(gòu)成。各板通過(guò)一個(gè)錐形滾柱軸承栓接在一起，使得各板能夠相對(duì)轉(zhuǎn)動(dòng)。板之間貼合界面形成一個(gè)密封層將液體隔開(kāi)。在處理過(guò)程中，下室可以與多達(dá)15個(gè)上室對(duì)齊。兩相步進(jìn)馬達(dá)通過(guò)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)系統(tǒng)使上平板轉(zhuǎn)動(dòng)，所述轉(zhuǎn)動(dòng)系統(tǒng)與位于上平板下表面的內(nèi)部齒輪嚙合。平動(dòng)電磁體安裝于平動(dòng)系統(tǒng)上，使得電磁體可沿下室垂直平動(dòng)。向電磁體傳遞定量電流，形成與下室相交的力場(chǎng)。平動(dòng)電磁體的場(chǎng)強(qiáng)可以設(shè)定為0至1400高斯(在磁極表面測(cè)得)或其他選定范圍。電磁體平動(dòng)系統(tǒng)帶動(dòng)電磁體沿下室上下移動(dòng)。平動(dòng)速度可以設(shè)定為5μm/s至2000μm/s或其他選定范圍。吸持磁體組件由安裝在連接步進(jìn)馬達(dá)的機(jī)械臂上的永磁體構(gòu)成。步進(jìn)馬達(dá)帶動(dòng)裝有吸持磁體的機(jī)械臂轉(zhuǎn)動(dòng)，使得吸持磁體位于接受處理的小室的上方。
如圖6所示，一種優(yōu)選的平動(dòng)電磁體40有一個(gè)C-1018不銹鋼鐵芯42，繞以818匝26號(hào)銅線(xiàn)，形成一個(gè)在兩端之間具有空氣隙44的碟形。它接收來(lái)自電子組件的0至2.16Amps的電流。力場(chǎng)強(qiáng)度可設(shè)定為0-1500高斯(在磁極表面測(cè)得)。電磁體系統(tǒng)使電磁體沿下室28上下移動(dòng)。平動(dòng)速度可設(shè)定為120-250＿。
如圖4所示，吸持磁體組件44由固定在連接步進(jìn)馬達(dá)31的機(jī)械臂19上的永磁體構(gòu)成。步進(jìn)馬達(dá)帶動(dòng)裝有吸持磁體44的機(jī)械臂19轉(zhuǎn)動(dòng)，使得吸持磁體44位于接受處理的上室27上方。
使用方法MAGSEP 10的作用是分離懸浮于液體中的可磁化物質(zhì)。如圖4所示的一種應(yīng)用方式可描述如下讓上平板26和下平板24處于進(jìn)樣位置(步進(jìn)半步)，將液體樣品加入上室27和下室28。上室27轉(zhuǎn)動(dòng)到下室28正上方的位置，兩管對(duì)齊。平動(dòng)電磁體40通電到設(shè)定的電流值，從下室28的底部平動(dòng)到平板24與26的界面。平動(dòng)電磁體40斷電，吸持電磁體46通電到設(shè)定值，特定遷移率范圍內(nèi)的顆粒于是被引入上收集室27的頂部。最后，吸持電磁體46斷電，僅由吸持永磁體44將收集到的樣品顆粒保持在管27的頂部，同時(shí)，上平板26轉(zhuǎn)動(dòng)，從而俘獲樣品中的集得顆粒?？梢詫?duì)多達(dá)15個(gè)俘獲室27重復(fù)以上過(guò)程或加以改變后重復(fù)。
圖7是平板組件的剖視圖，其中，下平板24和上平板26的協(xié)動(dòng)接合，樣品室28與上方的收集室27與機(jī)械臂19上的吸持磁體孔44對(duì)齊。
圖8更具體地顯示了上平板26內(nèi)的進(jìn)樣口，該進(jìn)樣口與上收集室27液體相通。分離前后都由平板組件承載樣品。一種優(yōu)選的平板組件由聚碳酸酯上平板，不銹鋼下平板和一個(gè)聚碳酸酯樣品室28構(gòu)成。上平板與下平板用一個(gè)夾緊螺栓接合，上平板可轉(zhuǎn)動(dòng)。上平板至少有一個(gè)(最好多個(gè))被稱(chēng)為收集室27的小室，如圖所示是15個(gè)。樣品室28固定于下平板24的開(kāi)孔內(nèi)。這使得收集室27可以在樣品室28上方轉(zhuǎn)動(dòng)，從而允許樣品室28內(nèi)的顆粒轉(zhuǎn)移到收集室27內(nèi)。然后，收集室27可以從樣品室上方轉(zhuǎn)開(kāi)，從而俘走收集室內(nèi)的顆粒。夾緊螺栓的壓力使得上平板與下平板壓合密封。
圖9-14顯示了用本發(fā)明進(jìn)行的顆粒分級(jí)分離過(guò)程。
如圖9所示，顯示了俘獲室28，樣品室38，吸持電磁體46，吸持永磁體44和平動(dòng)電磁體40的位置。
圖10顯示向樣品室28內(nèi)加入細(xì)胞等選擇性結(jié)合了磁性顆粒的物質(zhì)。如
圖11所示，上平板26相對(duì)于下平板24和樣品室28轉(zhuǎn)動(dòng)到一個(gè)整步位置。如
圖12所示，平動(dòng)電磁體40通電，并向兩板的界面移動(dòng)，該圖顯示樣品室28內(nèi)顆粒排列的啟動(dòng)階段。必需指出的是，進(jìn)樣順序可以是提升電磁體40，上平板26進(jìn)半步，然后帶動(dòng)帶有磁體的上收集室27到位，或者帶動(dòng)所述管的上室27和磁體40到位，然后抬升樣品室28。
圖13顯示平動(dòng)電磁體的最終位置以及顆粒的俘獲，其中，平動(dòng)電磁體40停止移動(dòng)并斷電，吸持電磁體46通電，其力場(chǎng)與永磁體44的偶合。最后，如
圖14所示，上平板26轉(zhuǎn)動(dòng)從而帶走作為處理樣品的顆粒中的選定級(jí)份。
圖15是例如圖4所示平動(dòng)電磁體40的場(chǎng)強(qiáng)圖。
如
圖16所示，用俘獲或吸持電磁體46或程控電磁體牽引樣品越過(guò)板的界面進(jìn)入上室27的頂部。
用永磁體44保持俘獲的樣品停留于俘獲室27的頂部，防治它落入板的界面而夾在板24與26之間。可以通過(guò)改變永磁體44的大小和材質(zhì)來(lái)改變其力場(chǎng)強(qiáng)度。
圖17顯示一個(gè)通過(guò)多級(jí)磁泳過(guò)程將磁性微粒與非磁性微粒分離的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)從含90％1-2_____磁性微球體(animosphere，Polysciences Inc.，)和10％6.0μm非磁性球體(IDC)的混合物開(kāi)始。這些顆?？梢詰腋≡诟鞣N液體中；然而，通常使用的是水、聚乙二醇或乙醇。給6個(gè)室配備磁極面場(chǎng)強(qiáng)為10-375mT的磁體。以2.54cm為梯度建立場(chǎng)強(qiáng)梯度，換算成mT/m。在各室的停留時(shí)間為15分鐘，平均移動(dòng)距離為3mm。根據(jù)以上數(shù)據(jù)估算7個(gè)室各自的磁泳遷移率，得該圖所示的結(jié)果。
如圖所示，80.1％的磁性顆粒俘獲在6號(hào)室中，對(duì)應(yīng)于0.6mm/N-S的遷移率，只有2.8％的非磁性顆粒被俘獲。磁性球體的“純度”達(dá)90-99.6％。
圖18是一個(gè)平動(dòng)電磁體臺(tái)的外部平板組件的剖視圖，所示平板組件100包括平動(dòng)電磁體臺(tái)102(最好每個(gè)樣品板104有3個(gè))，它與樣品板104接合，樣品板104以可轉(zhuǎn)動(dòng)方式與多個(gè)室106液體相通，這些室形成并排列于收集板108的外緣，板108與吸持磁體(電磁體)146協(xié)作接合。
圖19是MAGSEP用于轉(zhuǎn)動(dòng)收集板的引導(dǎo)系統(tǒng)的剖視圖，其中，盤(pán)蓋110裝在平板組件100上，100與蝸輪112接合，112的斜角接觸齒輪114與軸承座116連接。所述組件可轉(zhuǎn)動(dòng)地安裝于基座組件119上，該基座有軸承座圈凸緣(relief)118，和位置探測(cè)器120，其中，基座119形成盤(pán)122，它與精密蝸桿126的軸124機(jī)械連接，蝸桿126與活動(dòng)連軸節(jié)128相連，后者由步進(jìn)馬達(dá)130驅(qū)動(dòng)。該引導(dǎo)(indexing)系統(tǒng)位于由外殼134和外殼蓋136形成的筒體或盒體132內(nèi)，它們?nèi)鐖D20所示那樣包住平板組件，圖20是一種盒式處理裝置模件設(shè)計(jì)的透視圖。
如圖21所示，MAGSEP盒可用于設(shè)計(jì)包括更多相同或不同所述盒單元的處理模件。
圖22-24顯示了另一種實(shí)施方式，即采用層疊式磁體系統(tǒng)，其中，一系列二極、四極或環(huán)性磁體，一般為3、4個(gè)，沿MAGSEP兩板裝置的上部柱形室層疊。它們從最底下的開(kāi)始順次通電，用以向上加速(即顆粒物理學(xué)上所用的磁感應(yīng)加速器)顆粒，直到它們達(dá)到Earnshaw定理所規(guī)定的不穩(wěn)定點(diǎn)，此時(shí)，關(guān)閉第一力場(chǎng)，啟動(dòng)第二力場(chǎng)，通過(guò)磁泳(1995年Zborowski等的美國(guó)專(zhuān)利)繼續(xù)向上的俘獲過(guò)程，使顆粒不會(huì)粘附于器壁。
圖22是一種層疊的、依次通電的多個(gè)四極磁體的平動(dòng)磁體組件，還包括一個(gè)樣品室，分離電磁體，收集室和吸持電磁體。
圖23是一種活動(dòng)四極磁體組件，包括一個(gè)分離電磁體，樣品室，收集室和吸持電磁體。
圖24是一種四極或六極平動(dòng)電磁體。
其他應(yīng)用本發(fā)明還可以用作“磁層析”的工具。俘獲可以是“等度”俘獲，即各級(jí)的磁場(chǎng)強(qiáng)度相等，或者是“梯度”俘獲，即磁體的場(chǎng)強(qiáng)隨級(jí)數(shù)升高而增強(qiáng)。在后一種情況的一種典型應(yīng)用中，第一級(jí)沒(méi)有磁體也沒(méi)有上室，其作用是在轉(zhuǎn)移開(kāi)始前將細(xì)胞混合物攪拌均勻。第二級(jí)沒(méi)有磁體，用于從一個(gè)小體積的上室向細(xì)胞懸浮液中加入磁性顆粒，讓它們混合并反應(yīng)。第三級(jí)的上室內(nèi)有一塊很弱的磁體，其體積與下室相近，它只吸引磁化程度最高的細(xì)胞，即磁性配體的受體最多的細(xì)胞。第四級(jí)上室內(nèi)的磁體強(qiáng)于第三級(jí)，吸引磁化程度較弱的細(xì)胞，以此類(lèi)推，倒數(shù)第二級(jí)是最強(qiáng)的磁體，在此將俘獲受體最少的細(xì)胞。最后一級(jí)也沒(méi)有磁體，其中將是轉(zhuǎn)移后最終留下的所有完全沒(méi)有磁化的細(xì)胞。在重力條件下，如果轉(zhuǎn)移時(shí)間足夠長(zhǎng)，未被俘獲的細(xì)胞將因重力沉降而進(jìn)入位置較低的室。如果沒(méi)有重力，則未被俘獲的細(xì)胞將在每次轉(zhuǎn)移時(shí)留在上室和下室中；然而，每次轉(zhuǎn)移的不斷混合可帶走各室中未被俘獲的細(xì)胞。
另一個(gè)例子是，將DYNABEADS M-280與2μm非磁化微球體混合。在分離前后進(jìn)行微分計(jì)數(shù)(庫(kù)爾特顆粒計(jì)數(shù)器或血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀)，用于測(cè)定純化因數(shù)和分離度。為了測(cè)定分離方法對(duì)實(shí)際細(xì)胞的效率，用梯度力場(chǎng)強(qiáng)度(隨級(jí)數(shù)升高而增強(qiáng))分離帶有不同數(shù)量磁珠的細(xì)胞。處理的底物是氨基順磁性顆粒(例如Polyscience#19524)標(biāo)記的醛固定的人紅細(xì)胞，紅細(xì)胞預(yù)先經(jīng)兩次不同水平的神經(jīng)氨酸苷酶處理，將原表面負(fù)電荷降低30％，60％和0％(對(duì)照)。所得的三組紅細(xì)胞與氨基順磁性微球靜電結(jié)合，在多級(jí)電磁分離器10中分離成三個(gè)組分。
以上的詳細(xì)描述是為了便于清楚地理解本發(fā)明，不應(yīng)將其視為不必要的限定，因?yàn)?，根?jù)以上所述，符合本發(fā)明宗旨和范圍的修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
磁泳作用力定義為-μm=VmBdBdZ]]>其中的B是俘獲磁體的力場(chǎng)強(qiáng)度，Vm是顆粒在力場(chǎng)中的速度。該速度是力場(chǎng)和顆粒及溶劑特性的函數(shù)Vm=2a2ΔxBdBaημ0dZ]]>所以，MAGSEP裝置中的各級(jí)分別選擇磁泳遷移率不同的顆粒。各級(jí)內(nèi)的顆粒則具有不同的遷移率分布。低力場(chǎng)強(qiáng)度將選擇遷移率高的顆粒，較高的力場(chǎng)強(qiáng)度則選擇遷移率較低的顆粒。所以，各級(jí)根據(jù)俘獲磁體的力場(chǎng)強(qiáng)度和顆粒停留時(shí)間具有各自的磁泳遷移率截留值。
圖7顯示用于圖5實(shí)施方式的平板組件；圖8是圖5實(shí)施方式中平板組件進(jìn)樣口的透視圖；圖9是用于圖4實(shí)施方式的小室，還顯示了俘獲室和樣品室，以及吸持電磁體、固定用磁體、和平動(dòng)電磁體；
圖10是平板和小室的剖視圖，顯示樣品室的進(jìn)樣過(guò)程；
圖11是平板和小室的剖視圖，顯示小室相對(duì)于上平板轉(zhuǎn)動(dòng)的位置；
圖12是平板和小室的剖視圖，顯示樣品室內(nèi)顆粒排列的啟動(dòng)，即平動(dòng)磁體通電引起顆粒向板界面的移動(dòng)；
圖13是平板和小室的剖視圖，顯示平動(dòng)電磁體的位置和顆粒的俘獲；
圖14是平板和小室的剖視圖，顯示上平板轉(zhuǎn)動(dòng)從而俘獲部分顆粒；
圖15是平動(dòng)磁體場(chǎng)強(qiáng)圖；
圖16所示為圖4實(shí)施方式的吸持磁體組件；
圖17所示為磁性微球體與非磁性微球體的分離；
圖18顯示平板組件的透視圖，該組件與平動(dòng)電磁站相接；
圖19是令收集板轉(zhuǎn)動(dòng)的MAGSEP的引導(dǎo)系統(tǒng)的透視圖；圖20是一種盒式處理裝置模件設(shè)計(jì)的透視圖；圖21是一個(gè)MAGSEP盒的透視圖，它具有與航空業(yè)準(zhǔn)用的“ADSEP”盒相同的組件，但容量不同；圖22是一種實(shí)施方式，其中的平動(dòng)磁體組件采用了多個(gè)四極磁體，它們層疊式排列，依次通電；圖23是一種實(shí)施方式，其中的平動(dòng)磁體組件由活動(dòng)四極磁體構(gòu)成；圖24是一種實(shí)施方式，其中采用四極或六極平動(dòng)磁體。
優(yōu)選實(shí)施方式的描述本發(fā)明是一種電磁分離器10，采用電磁輔助分離法定量分離細(xì)胞、蛋白質(zhì)、配體、化學(xué)物質(zhì)、抗原和其他顆粒物質(zhì)。本發(fā)明的多級(jí)電磁體(“MAGSEP”)10能夠進(jìn)行基于磁化率和磁泳遷移率的多級(jí)分離。電磁分離器10的優(yōu)選形式之一是一種多級(jí)逆流裝置，其中，底物或細(xì)胞用逐漸減少的順磁性磁珠標(biāo)記，并用逐漸增強(qiáng)的力場(chǎng)強(qiáng)度根據(jù)標(biāo)記程度進(jìn)行定量分離。所述電磁分離器10通過(guò)自動(dòng)進(jìn)行級(jí)份收集而提高了產(chǎn)物回收率，并可實(shí)現(xiàn)微分分離，而此前只可能進(jìn)行二元分離。該分離器可用于各種水性懸浮液，并可靈活適用于商業(yè)性用途和空間實(shí)驗(yàn)室。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)根據(jù)細(xì)胞表面抗原含量來(lái)分離大量免疫細(xì)胞、血細(xì)胞及其他分化細(xì)胞。而且，它還能夠根據(jù)磁化率和/或磁泳遷移率對(duì)樣品中的各組分進(jìn)行更高水平或純度的細(xì)分。而且，可以通過(guò)改變場(chǎng)強(qiáng)均勻俘獲磁化的細(xì)胞或其他底物。
磁泳作用力定義為其中的B是俘獲磁體的力場(chǎng)強(qiáng)度，Vm是顆粒在力場(chǎng)中的速度。該速度是力場(chǎng)和顆粒及溶劑特性的函數(shù)所以，MAGSEP裝置中的各級(jí)分別選擇磁泳遷移率不同的顆粒。各級(jí)內(nèi)的顆粒則具有不同的遷移率分布。低力場(chǎng)強(qiáng)度將選擇遷移率高的顆粒，較高的力場(chǎng)強(qiáng)度則選擇遷移率較低的顆粒。所以，各級(jí)根據(jù)俘獲磁體的力場(chǎng)強(qiáng)度和顆粒停留時(shí)間具有各自的磁泳遷移率截留值。
方程(2)中，a是顆粒半徑，Δx是顆粒與介質(zhì)的磁化率差異，η是粘度，μ0是自由空間的磁導(dǎo)率。
運(yùn)用力場(chǎng)的細(xì)胞分離方法多被用作二元分離方法，分離
圖1所示基于特異性表面配體而結(jié)合和沒(méi)有結(jié)合磁性微球體的細(xì)胞。如圖所示，抗原結(jié)合于細(xì)胞受體位點(diǎn)，生物素與抗體結(jié)合。磁珠與親和素結(jié)合，后者則與生物素結(jié)合。由于表面具有抗體結(jié)合性受體的生物細(xì)胞可通過(guò)配體(例如與生物素反應(yīng)的親和素)與磁性顆粒結(jié)合，所以可將配體與抗體化學(xué)結(jié)合。
圖2顯示的是一種多級(jí)電磁分離器與一假象磁性層析柱比較。如前所述，MAGSEP裝置采用步進(jìn)轉(zhuǎn)動(dòng)分布和容器系統(tǒng)，可選擇、分離并儲(chǔ)存不同磁泳遷移率的顆粒。各級(jí)中的顆粒將具有不同的遷移率分布。低場(chǎng)強(qiáng)將選擇遷移率高的顆粒，高場(chǎng)強(qiáng)則選擇遷移率小的顆粒。所以，各級(jí)根據(jù)俘獲磁體的力場(chǎng)強(qiáng)度和顆粒停留時(shí)間具有各自的磁泳遷移率截留值。圖2顯示，移動(dòng)快的細(xì)胞其磁泳遷移率較大。于是，細(xì)胞根據(jù)其表面上的配體得以分離。
將磁力吸引作為一種速率過(guò)程與逆流分離相結(jié)合，細(xì)胞的磁力分離就可以成為根據(jù)每個(gè)細(xì)胞所結(jié)合配體的數(shù)量進(jìn)行分離的定量技術(shù)。若根據(jù)每種細(xì)胞所結(jié)合的配體量，該方法是定性的，若根據(jù)同種細(xì)胞不同個(gè)體上配體結(jié)合量的或多或少，則是定量的。
圖3顯示一種單級(jí)分離過(guò)程，其中，與磁珠結(jié)合的細(xì)胞順著場(chǎng)強(qiáng)梯度被引向磁極。圖中顯示了一個(gè)磁源，它可以是永磁體或電磁體，位于容器或小室的上方，在其中產(chǎn)生一個(gè)力場(chǎng)梯度，磁力牽引順磁性顆粒根據(jù)各自的磁泳遷移率而移動(dòng)。本發(fā)明的電磁分離裝置10可以進(jìn)行非常清楚的分離，其中，顆粒疏松地排列成層，磁性最強(qiáng)的顆粒位于小室的頂部，磁化率略低的懸浮于中部，沒(méi)有或幾乎沒(méi)有磁化的則懸浮于小室的底部。
例如，所有與磁化珠結(jié)合的待分離物(例如細(xì)胞或蛋白質(zhì))可以從均勻的懸浮液中被引向多級(jí)分離器的一個(gè)半室，而非磁性待分離物則仍然均衡地分配于上室和下室之間。讓非磁性顆粒靜置沉降一段時(shí)間。移動(dòng)上室至新鮮溶液上方，使之與分離后的細(xì)胞充分混合。在低重力條件下，可以不用沉降獲得以上結(jié)果，而采用稀釋法除去室中的非磁性顆粒。
優(yōu)選實(shí)施方式通過(guò)在同一平板組件中使用多個(gè)樣品室來(lái)實(shí)現(xiàn)多級(jí)分離。在分離過(guò)程中，平動(dòng)電磁體和吸持電磁體的場(chǎng)強(qiáng)是可變的。
圖4是本發(fā)明多級(jí)電磁分離器10的透視圖。MAGSEP單元10的上平板26與下平板24以協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)動(dòng)方式接合，下平板24由多個(gè)支撐腿22支承，上平板26中至少有1個(gè)(最好多個(gè))上收集室27，它們與下平板24和其中的下樣品室38液體相通，室38內(nèi)由脂、蠟或其他潤(rùn)滑劑和/或密封劑形成一密封層。該圖還顯示了一個(gè)平動(dòng)電磁體40，平動(dòng)系統(tǒng)42，吸持磁體44(在本實(shí)施例中，它是一塊永磁體)帶冷卻風(fēng)扇的吸持電磁體46，平板轉(zhuǎn)動(dòng)系統(tǒng)48，和平板定位微鈕50。
圖5所示是一個(gè)商品化的裝置，其中，上平板26由聚碳酸酯等聚合物制成，安裝在軸承33上，由夾緊螺栓29緊固。支撐腿22換成了側(cè)板23，形成一個(gè)底座。下平板24是不銹鋼制成的。吸持磁體步進(jìn)馬達(dá)帶動(dòng)平板26轉(zhuǎn)動(dòng)。吸持電磁體46懸于管27上方。電磁體35位于底座內(nèi)。底座安裝在機(jī)箱37上，機(jī)箱上有電源開(kāi)關(guān)39，110VAC插座41，流通口43，指示燈45和冷卻風(fēng)扇47。
更具體地說(shuō)，該實(shí)驗(yàn)室裝置包括一臺(tái)計(jì)算機(jī)和軟件，由電子組件箱和處理單元構(gòu)成。電子組件有數(shù)個(gè)接口，包括110VAC電源、電源開(kāi)關(guān)，RS 232接口和狀態(tài)指示燈。該處理單元接受來(lái)自110AC連接件的電源。電源由電源開(kāi)關(guān)開(kāi)啟?？刂扑鎏幚韱卧腜C通過(guò)RS232信號(hào)連接件工作。電源、平動(dòng)電磁體、吸持磁體和平板轉(zhuǎn)動(dòng)的狀態(tài)通過(guò)個(gè)人計(jì)算機(jī)以圖形用戶(hù)界面顯示。
單個(gè)處理單元由上平板和下平板，平板轉(zhuǎn)動(dòng)系統(tǒng)，電磁體，電磁體平動(dòng)系統(tǒng)和吸持磁體組件構(gòu)成。各板通過(guò)一個(gè)錐形滾柱軸承栓接在一起，使得各板能夠相對(duì)轉(zhuǎn)動(dòng)。板之間貼合界面形成一個(gè)密封層將液體隔開(kāi)。在處理過(guò)程中，下室可以與多達(dá)15個(gè)上室對(duì)齊。兩相步進(jìn)馬達(dá)通過(guò)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)系統(tǒng)使上平板轉(zhuǎn)動(dòng)，所述轉(zhuǎn)動(dòng)系統(tǒng)與位于上平板下表面的內(nèi)部齒輪嚙合。平動(dòng)電磁體安裝于平動(dòng)系統(tǒng)上，使得電磁體可沿下室垂直平動(dòng)。向電磁體傳遞定量電流，形成與下室相交的力場(chǎng)。平動(dòng)電磁體的場(chǎng)強(qiáng)可以設(shè)定為0至1400高斯(在磁極表面測(cè)得)或其他選定范圍。電磁體平動(dòng)系統(tǒng)帶動(dòng)電磁體沿下室上下移動(dòng)。平動(dòng)速度可以設(shè)定為5μm/s至2000μm/s或其他選定范圍。吸持磁體組件由安裝在連接步進(jìn)馬達(dá)的機(jī)械臂上的永磁體構(gòu)成。步進(jìn)馬達(dá)帶動(dòng)裝有吸持磁體的機(jī)械臂轉(zhuǎn)動(dòng)，使得吸持磁體位于接受處理的小室的上方。
如圖6所示，一種優(yōu)選的平動(dòng)電磁體40有一個(gè)C-1018不銹鋼鐵芯42，繞以818匝26號(hào)銅線(xiàn)，形成一個(gè)在兩端之間具有空氣隙44的碟形。它接收來(lái)自電子組件的0至2.16Amps的電流。力場(chǎng)強(qiáng)度可設(shè)定為0-1500高斯(在磁極表面測(cè)得)。電磁體平動(dòng)系統(tǒng)使電磁體沿下室28上下移動(dòng)。平動(dòng)速度可設(shè)定為120-250μm/s。
如圖4所示，吸持磁體組件44由固定在連接步進(jìn)馬達(dá)31的機(jī)械臂19上的永磁體構(gòu)成。步進(jìn)馬達(dá)帶動(dòng)裝有吸持磁體44的機(jī)械臂19轉(zhuǎn)動(dòng)，使得吸持磁體44位于接受處理的上室27上方。
使用方法MAGSEP 10的作用是分離懸浮于液體中的可磁化物質(zhì)。如圖4所示的一種應(yīng)用方式可描述如下讓上平板26和下平板24處于進(jìn)樣位置(步進(jìn)半步)，將液體樣品加入上室27和下室28。上室27轉(zhuǎn)動(dòng)到下室28正上方的位置，兩管對(duì)齊。平動(dòng)電磁體40通電到設(shè)定的電流值，從下室28的底部平動(dòng)到平板24與26的界面。平動(dòng)電磁體40斷電，吸持電磁體46通電到設(shè)定值，特定遷移率范圍內(nèi)的顆粒于是被引入上收集室27的頂部。最后，吸持電磁體46斷電，僅由吸持永磁體44將收集到的樣品顆粒保持在管27的頂部，同時(shí)，上平板26轉(zhuǎn)動(dòng)，從而俘獲樣品中的集得顆粒。可以對(duì)多達(dá)15個(gè)俘獲室27重復(fù)以上過(guò)程或加以改變后重復(fù)。
圖7是平板組件的剖視圖，其中，下平板24和上平板26的協(xié)動(dòng)接合，樣品室28與上方的收集室27與機(jī)械臂19上的吸持磁體孔44對(duì)齊。
圖8更具體地顯示了上平板26內(nèi)的進(jìn)樣口，該進(jìn)樣口與上收集室27液體相通。分離前后都由平板組件承載樣品。一種優(yōu)選的平板組件由聚碳酸酯上平板，不銹鋼下平板和一個(gè)聚碳酸酯樣品室28構(gòu)成。上平板與下平板用中心的一個(gè)夾緊螺栓接合，所述夾緊螺栓即上平板相對(duì)于下平板轉(zhuǎn)動(dòng)的旋轉(zhuǎn)軸。上平板至少有一個(gè)(最好多個(gè))被稱(chēng)為收集室27的小室，如圖所示是15個(gè)。樣品室28固定于下平板24的開(kāi)孔內(nèi)。這使得收集室27可以在樣品室28上方轉(zhuǎn)動(dòng)，從而允許樣品室28內(nèi)的顆粒轉(zhuǎn)移到收集室27內(nèi)。然后，收集室27可以從樣品室上方轉(zhuǎn)開(kāi)，從而俘走收集室內(nèi)的顆粒。夾緊螺栓的壓力使得上平板與下平板壓合密封。
圖9-14顯示了用本發(fā)明進(jìn)行的顆粒分級(jí)分離過(guò)程。
如圖9所示，顯示了俘獲室28，樣品室38，吸持電磁體46，吸持永磁體44和平動(dòng)電磁體40的位置。
圖10顯示向樣品室28內(nèi)加入細(xì)胞等選擇性結(jié)合了磁性顆粒的物質(zhì)。如
圖11所示，上平板26相對(duì)于下平板24和樣品室28轉(zhuǎn)動(dòng)到一個(gè)整步位置，最終使得樣品室與收集室對(duì)齊。如
圖12所示，平動(dòng)電磁體40通電，并向兩板的界面移動(dòng)，該圖顯示樣品室28內(nèi)顆粒排列的啟動(dòng)階段。必需指出的是，進(jìn)樣順序可以是提升電磁體40，上平板26進(jìn)半步，然后帶動(dòng)帶有磁體的上收集室27到位，或者帶動(dòng)所述管的上室27和磁體40到位，然后抬升樣品室28。
圖13顯示平動(dòng)電磁體的最終位置以及顆粒的俘獲，其中，平動(dòng)電磁體40停止移動(dòng)并斷電，吸持電磁體46通電，其力場(chǎng)與永磁體44的偶合。最后，如
圖14所示，上平板26轉(zhuǎn)動(dòng)從而帶走作為處理樣品的顆粒中的選定級(jí)份。
圖15是例如圖4所示平動(dòng)電磁體40的場(chǎng)強(qiáng)圖。
如
圖16所示，用俘獲或吸持電磁體46或程控電磁體牽引樣品越過(guò)板的界面進(jìn)入上室27的頂部。
用永磁體44保持俘獲的樣品停留于俘獲室27的頂部，防治它落入板的界面而夾在板24與26之間?？梢酝ㄟ^(guò)改變永磁體44的大小和材質(zhì)來(lái)改變其力場(chǎng)強(qiáng)度。
圖17顯示一個(gè)通過(guò)多級(jí)磁泳過(guò)程將磁性微粒與非磁性微粒分離的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)從含90％1-2μm磁性微球體(animosphere，Polysciences Inc.，)和10％6.0μm非磁性球體(Interfacial Dynamics，Corp.)的混合物開(kāi)始。這些顆粒可以懸浮在各種液體中；然而，通常使用的是水、聚乙二醇或乙醇。給6個(gè)室配備磁極面場(chǎng)強(qiáng)為10-375mT的磁體。以2.54cm為梯度建立場(chǎng)強(qiáng)梯度，換算成mT/m。在各室的停留時(shí)間為15分鐘，平均移動(dòng)距離為3mm。根據(jù)以上數(shù)據(jù)估算7個(gè)室各自的磁泳遷移率，得該圖所示的結(jié)果。
如圖所示，80.1％的磁性顆粒俘獲在6號(hào)室中，對(duì)應(yīng)于0.6mm/N-S的遷移率，只有2.8％的非磁性顆粒被俘獲。磁性球體的“純度”達(dá)90-99.6％。
圖18是一個(gè)平動(dòng)電磁體臺(tái)的外部平板組件的剖視圖，所示平板組件100包括平動(dòng)電磁體臺(tái)102(最好每個(gè)樣品板104有3個(gè))，它與樣品板104接合，樣品板104以可轉(zhuǎn)動(dòng)方式與多個(gè)室106液體相通，這些室形成并排列于收集板108的外緣，板108與吸持磁體(電磁體)146協(xié)作接合。
圖19是MAGSEP用于轉(zhuǎn)動(dòng)收集板的引導(dǎo)系統(tǒng)的剖視圖，其中，盤(pán)蓋110裝在平板組件100上，100與蝸輪112接合，112的斜角接觸齒輪114與軸承座116連接。所述組件可轉(zhuǎn)動(dòng)地安裝于基座組件119上，該基座有軸承座圈凸緣(relief)118，和位置探測(cè)器120，其中，基座119形成盤(pán)122，它與精密蝸桿126的軸124機(jī)械連接，蝸桿126與活動(dòng)連軸節(jié)128相連，后者由步進(jìn)馬達(dá)130驅(qū)動(dòng)。該引導(dǎo)(indexing)系統(tǒng)位于由外殼134和外殼蓋136形成的筒體或盒體132內(nèi)，它們?nèi)鐖D20所示那樣包住平板組件，圖20是一種盒式處理裝置模件設(shè)計(jì)的透視圖。
如圖21所示，MAGSEP盒可用于設(shè)計(jì)包括更多相同或不同所述盒單元的處理模件。
圖22顯示了另一種實(shí)施方式，即采用層疊式磁體系統(tǒng)，其中，一系列二極、四極或環(huán)性磁體，一般為3、4個(gè)，沿MAGSEP兩板裝置的上部柱形室層疊。它們從最底下的開(kāi)始順次通電，用以向上加速(即顆粒物理學(xué)上所用的磁感應(yīng)加速器)顆粒，直到它們達(dá)到Earnshaw定理所規(guī)定的不穩(wěn)定點(diǎn)，此時(shí)，關(guān)閉第一力場(chǎng)，啟動(dòng)第二力場(chǎng)，通過(guò)磁泳(1995年Zborowski等的美國(guó)專(zhuān)利5,053,344)繼續(xù)向上的俘獲過(guò)程，使顆粒不會(huì)粘附于器壁。
圖2是一種層疊的、依次通電的多個(gè)四極磁體的平動(dòng)磁體組件，還包括一個(gè)樣品室，分離電磁體，收集室和吸持電磁體。
圖23是一種活動(dòng)四極磁體組件，包括一個(gè)分離電磁體，樣品室，收集室和吸持電磁體。
圖24是一種四極或六極平動(dòng)電磁體。
其他應(yīng)用本發(fā)明還可以用作“磁層析”的工具。俘獲可以是“等度”俘獲，即各級(jí)的磁場(chǎng)強(qiáng)度相等，或者是“梯度”俘獲，即磁體的場(chǎng)強(qiáng)隨級(jí)數(shù)升高而增強(qiáng)。在后一種情況的一種典型應(yīng)用中，第一級(jí)沒(méi)有磁體也沒(méi)有上室，其作用是在轉(zhuǎn)移開(kāi)始前將細(xì)胞混合物攪拌均勻。第二級(jí)沒(méi)有磁體，用于從一個(gè)小體積的上室向細(xì)胞懸浮液中加入磁性顆粒，讓它們混合并反應(yīng)。第三級(jí)的上室內(nèi)有一塊很弱的磁體，其體積與下室相近，它只吸引磁化程度最高的細(xì)胞，即磁性配體的受體最多的細(xì)胞。第四級(jí)上室內(nèi)的磁體強(qiáng)于第三級(jí)，吸引磁化程度較弱的細(xì)胞，以此類(lèi)推，倒數(shù)第二級(jí)是最強(qiáng)的磁體，在此將俘獲受體最少的細(xì)胞。最后一級(jí)也沒(méi)有磁體，其中將是轉(zhuǎn)移后最終留下的所有完全沒(méi)有磁化的細(xì)胞。在重力條件下，如果轉(zhuǎn)移時(shí)間足夠長(zhǎng)，未被俘獲的細(xì)胞將因重力沉降而進(jìn)入位置較低的室。如果沒(méi)有重力，則未被俘獲的細(xì)胞將在每次轉(zhuǎn)移時(shí)留在上室和下室中；然而，每次轉(zhuǎn)移的不斷混合可帶走各室中未被俘獲的細(xì)胞。
以上的詳細(xì)描述是為了便于清楚地理解本發(fā)明，不應(yīng)將其視為不必要的限定，因?yàn)椋鶕?jù)以上所述，符合本發(fā)明宗旨和范圍的修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
權(quán)利要求
1.一種定量分離細(xì)胞、蛋白質(zhì)或其他顆粒的新方法，它包括使用多級(jí)電磁輔助分離技術(shù)，該技術(shù)包括使用一系列二極、四極或環(huán)形磁體，它們沿MAGSEP兩板裝置上部圓柱形室堆疊，從最底層開(kāi)始依次啟動(dòng)，用于向上加速顆粒，直至它們達(dá)到Earnshaw定理所規(guī)定的不穩(wěn)定點(diǎn)，此時(shí)，關(guān)閉第一力場(chǎng)而啟動(dòng)第二力場(chǎng)，通過(guò)磁泳繼續(xù)向上的俘獲過(guò)程，顆粒不會(huì)粘附于器壁。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種定量分離細(xì)胞、蛋白質(zhì)或其他顆粒的新方法，涉及多級(jí)電磁輔助分離技術(shù)，用到一系列二極、四極或環(huán)形磁體(40，44)，沿MAGSEP(10)雙盤(pán)裝置上部圓柱形室堆疊，先啟動(dòng)第一力場(chǎng)，向上加速(即粒子物理學(xué)中所用的磁感應(yīng)加速器)粒子，直至它們達(dá)到Evamshaw定理所規(guī)定的不穩(wěn)定點(diǎn)，此時(shí)，關(guān)閉第一力場(chǎng)，啟動(dòng)第二力場(chǎng)，繼續(xù)通過(guò)磁泳向上的俘獲過(guò)程，期間，粒子不會(huì)粘附于器壁。
文檔編號(hào)C12N5/02GK1399718SQ00808434
公開(kāi)日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2000年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月9日
發(fā)明者J·維林格, P·W·托德, K·巴頓, S·鄧恩, M·S·多瑟 申請(qǐng)人:宇宙硬件最佳技術(shù)股份有限公司