專利名稱：通過提高細(xì)胞nadph生產(chǎn)l－氨基酸的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域概括的說，本發(fā)明涉及L-氨基酸的生產(chǎn)方法和磷酸葡糖異構(gòu)酶(phosphoglucoisomerase)的編碼基因。
背景資料工業(yè)上使用細(xì)菌細(xì)胞通過發(fā)酵方法來生產(chǎn)氨基酸(S.Ishino等人，普通和應(yīng)用微生物學(xué)雜志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37157-165，1991；S.Kinoshita、K.Nakayama、和S.Nagasaki，普通和應(yīng)用微生物學(xué)雜志(J.Gen.Appl.Microbiol.)4128-129，1958)。雖然許多研究報告和評論已經(jīng)開始關(guān)注發(fā)酵方法和氨基酸的積累機(jī)制，但是需要開發(fā)更多的方法來提高微生物的氨基酸產(chǎn)量(S.Ishino等人，普通和應(yīng)用微生物學(xué)雜志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37157-165，1991；K.Aida等人編，《氨基酸生產(chǎn)中的生物技術(shù)》(Biotechnology ofAmino Acid Production)，Kodansha(東京)/Elsevier(紐約)，1986；和A.Marx等人，代謝工程(Metabolic Engineering)135-48，1999)。
在通過代謝工程來引導(dǎo)葡萄糖衍生碳向芳香族氨基酸結(jié)構(gòu)的流動中已經(jīng)取得了一些成功(N.Flores等人，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnol.)14620-623，1996)。但是，還沒有在生產(chǎn)者菌株中成功應(yīng)用的記錄(A.Berry，TIBTECH 14250-256，1996)。
代謝工程涉及對發(fā)酵過程中流經(jīng)各種代謝途徑的起始材料(諸如碳水化合物和有機(jī)酸)的碳流的操作。例如，已經(jīng)使用13C-NMR進(jìn)行了關(guān)于谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中心代謝的研究(S.Ishino等人，普通和應(yīng)用微生物學(xué)雜志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37157-165，1991；和A.Marx等人，生物技術(shù)和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)49111-129，1996)。另外，使用13C-NMR，Walker等人(T.Walker等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2571189-1195，1982)通過嗜氨微桿菌(Microbacteriumammoniaphilum)分析了谷氨酸發(fā)酵，Inbar等人通過黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)(L.Inbar等人，歐洲生化雜志(Eur.J.Biochem.)149601-607，1985)研究了賴氨酸發(fā)酵。
本發(fā)明通過代謝工程解決了提高發(fā)酵過程中氨基酸產(chǎn)量的問題。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了L-氨基酸的生產(chǎn)方法，包括培養(yǎng)與未改變細(xì)菌細(xì)胞相比NADPH量增加的經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞，因而來自所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞的L-氨基酸產(chǎn)量高于來自未改變細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)量。
本發(fā)明提供了用于生成具有突變型磷酸葡糖異構(gòu)酶(pgi)基因的細(xì)菌細(xì)胞的方法，包括(a)將pgi基因的內(nèi)部區(qū)域亞克隆到自殺載體中，并(b)通過同源重組將所述自殺載體插入細(xì)菌基因組，由此生成具有突變型pgi基因的細(xì)菌細(xì)胞。本發(fā)明還提供了按照該方法生成的經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了可用于該方法的載體。
本發(fā)明還提供了包含谷氨酸棒桿菌磷酸葡糖異構(gòu)酶多肽的編碼多核苷酸的分離核酸分子，該多肽具有


圖1(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列或由存在于細(xì)菌宿主(NRRL保藏物編號B-30174，1999年8月17日)中的DNA克隆編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明分離核酸分子的重組載體、包含該重組載體的宿主細(xì)胞、生成這種載體和宿主細(xì)胞的方法、以及通過重組技術(shù)將它們用于生產(chǎn)Pgi多肽或肽的方法。
本發(fā)明還提供了具有由本文所述多核苷酸編碼的氨基酸序列的分離Pgi肽。
根據(jù)下文的描述將明確本發(fā)明的其它優(yōu)勢。
圖的簡述
圖1A-1C顯示了pgi的核苷酸序列(SEQ ID NO1)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。Pgi肽的推導(dǎo)分子量為大約59kDa。
發(fā)明詳述本文已經(jīng)確定，增加細(xì)菌細(xì)胞中的NADPH量可提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，特別是在NADPH作為限制性因素的合成過程中。將分解代謝反應(yīng)的化學(xué)能攜帶至生物合成需能反應(yīng)(諸如氨基酸合成)的一種方法是以氫原子或電子的形式。作為有效的還原劑，氫原子必須具有可觀的自由能。這種高能氫原子是通過脫氫酶由細(xì)胞燃料獲得的，所述脫氫酶催化氫原子脫離燃料分子并轉(zhuǎn)移至特定輔酶，特別是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化形式(NADP+)。該輔酶的還原或攜氫形式，稱為NADPH，是來自分解代謝的高能電子流向需電子生物合成反應(yīng)的載體。
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括培養(yǎng)與未改變細(xì)菌細(xì)胞相比NADPH量增加的經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞，因而所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞的L-氨基酸產(chǎn)量高于來自未改變細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)量。優(yōu)選的氨基酸是L-賴氨酸、L-蘇氨酸、和L-異亮氨酸。當(dāng)用于本文時，經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞定義為與未改變細(xì)菌細(xì)胞相比其NADPH量增加的細(xì)菌細(xì)胞。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，“經(jīng)改變”細(xì)菌細(xì)胞是“突變”的細(xì)菌細(xì)胞。“突變”是遺傳物質(zhì)中可傳遞至子細(xì)胞的任何可檢測改變。突變可以是影響一個或多個脫氧核糖核苷酸的化學(xué)或物理構(gòu)造、可突變性、復(fù)制、表型功能、或者重組的可檢測非天然改變的任一種或其聯(lián)合；可對核苷酸進(jìn)行添加、刪除、替代、倒置、或轉(zhuǎn)座至新的位置(伴隨或不伴隨倒置)。突變可自發(fā)發(fā)生，或者可通過應(yīng)用誘變劑或重組DNA技術(shù)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)。通過突變可生成核酸分子的突變變異?？捎赏蛔兒怂岱肿由赏蛔兌嚯?。
另外，經(jīng)改變或突變細(xì)菌細(xì)胞可以是遺傳“突變”的，因而與遺傳“朱突變”細(xì)胞相比NADPH的量增加了。
經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞中NADPH量的增加導(dǎo)致氨基酸產(chǎn)量增加。優(yōu)選的是，與未改變細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)量相比，經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞的氨基酸產(chǎn)量提高了大約1％以上，優(yōu)選大約1％-大約100％，優(yōu)選大約20％-大約80％，更優(yōu)選大約5％-大約60％，甚至更優(yōu)選大約10％-大約80％。當(dāng)用于本文時，“產(chǎn)量”定義為生成的氨基酸克數(shù)，乘以100，并除以消耗的葡萄糖克數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明，在含有碳源和氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞。碳源可以是例如阿拉伯糖、纖維二糖、果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、山梨糖、蔗糖、海藻糖、丙酮酸、或琥珀酸。優(yōu)選的是，碳源的最初濃度是0.1-10％，優(yōu)選0.5-6.0％，以重量計(jì)算。可在開始培養(yǎng)前向培養(yǎng)基中加入所有碳源，或者在培養(yǎng)過程中逐步或連續(xù)加入碳源。
本文所用培養(yǎng)基可以是固體的或液體的，合成的(即人造的)或天然的，而且含有培養(yǎng)本發(fā)明經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞所需的足夠營養(yǎng)。所用培養(yǎng)基優(yōu)選液體培養(yǎng)基，更優(yōu)選合成的液體培養(yǎng)基。
本發(fā)明上述和下述實(shí)施方案中使用的天然或合成培養(yǎng)基還含有適用于培養(yǎng)經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞的氮源、合適的無機(jī)鹽、以及(根據(jù)需要)多種痕量養(yǎng)分和生長因子等，還可含有至少一種輔助碳源。這些額外成份的各自用量優(yōu)選選擇成可使氨基酸產(chǎn)量最大化。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本領(lǐng)域知道的多種方法和技術(shù)可憑經(jīng)驗(yàn)確定這些用量。
合適輔助碳源的例示性范例包括但不限于其它碳水化合物，諸如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉或淀粉水解物、纖維素水解物、和糖蜜；有機(jī)酸，諸如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、蘋果酸、檸檬酸、和延胡索酸；以及醇類，諸如甘油、肌醇、甘露醇、和山梨醇。
合適氮源的例示性范例包括但不限于氨，包括氨氣和氨水；無機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽，諸如氯化銨、硝酸銨、磷酸銨、硫酸銨、和乙酸銨；尿素；硝酸或亞硝酸鹽；以及其它含氮物質(zhì)，包括氨基酸的純制劑或粗制劑、肉羹、蛋白胨、魚粉、魚水解物、玉米漿、酪蛋白水解物、豆餅水解物、酵母提取物、干酵母、乙醇-酵母蒸餾物、大豆粉、棉籽粉、等等。
合適無機(jī)鹽的例示性范例包括但不限于鉀、鈣、鈉、鎂、錳、鐵、鈷、鋅、銅、鉬、鎢、和其它痕量元素的鹽，以及磷酸。
合適痕量養(yǎng)分、生長因子、等等的例示性范例包括但不限于輔酶A、泛酸、吡哆素-HCl、生物素、硫胺素、核黃素、黃素單核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、DL-6，8-硫辛酸、葉酸、維生素B12、其它維生素、堿基(諸如腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、和胞嘧啶)、L-氨基酸、硫代硫酸鈉、p-或γ-氨基苯甲酸、煙酰胺、次氮基乙酸(酯)、等等，其或是純或部分純的化學(xué)化合物，或是存在于天然原料中。可使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道的任何深層發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行本發(fā)明微生物菌株的培養(yǎng)，諸如氣升式、傳統(tǒng)的噴氣攪拌設(shè)計(jì)、或搖動培養(yǎng)。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可憑經(jīng)驗(yàn)確定所用培養(yǎng)條件，包括溫度、pH、通氣速率、攪拌速率、培養(yǎng)持續(xù)時間、等等，使氨基酸產(chǎn)量最大化。具體培養(yǎng)條件的選擇取決于諸如培養(yǎng)基組成和類型、培養(yǎng)技術(shù)、和相似考慮等因素。
培養(yǎng)足夠時間后，參照知道的任何方法，包括離子交換層析、凝膠過濾、溶劑萃取、親和層析、或其組合，可分離在細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中積累的一種或多種氨基酸?？墒褂眠m合于所采用培養(yǎng)條件的任何方法。
優(yōu)選的細(xì)菌細(xì)胞是棒桿菌屬物種和大腸桿菌。在細(xì)菌細(xì)胞中優(yōu)選的是谷氨酸棒桿菌細(xì)胞。當(dāng)用于本文時，黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)和乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)與谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamincum)是同義的。
一般而言，在本發(fā)明中，微生物中NADPH的增加是通過改變該生物體中糖酵解和戊糖磷酸途徑之間的碳流分布來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)用于本文時，“碳流”指相對于競爭途徑而進(jìn)行特定代謝途徑的葡萄糖分子的數(shù)目。
優(yōu)選的是，通過增加流經(jīng)戊糖磷酸途徑氧化支路的碳流來增加NADPH的可利用性。理論上說，當(dāng)葡萄糖專一進(jìn)行戊糖磷酸途徑的代謝時，每個葡萄糖產(chǎn)生12個NADPH；而在TCA循環(huán)(三羧酸，也稱為檸檬酸循環(huán))的代謝中，每個葡萄糖只產(chǎn)生2個NADPH(S.Ishino等人，普通和應(yīng)用微生物學(xué)雜志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37157-165，1991)。本發(fā)明提供了通過培養(yǎng)流經(jīng)戊糖磷酸途徑的碳流增加的經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞來生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
在活的生物體中代謝的大多數(shù)葡萄糖進(jìn)行糖酵解，產(chǎn)生丙酮酸。戊糖磷酸途徑，也稱為己糖單磷酸支路，是葡萄糖分解代謝的另一途徑。戊糖磷酸途徑產(chǎn)生NADPH，而且在賴氨酸發(fā)酵條件下更活潑(S.Ishino等人，普通和應(yīng)用微生物學(xué)雜志(J.Gen.Appl.Microbiol.)37157-165，1991)。
在本發(fā)明中，經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞可以是流經(jīng)戊糖磷酸途徑氧化支路的碳流增加的細(xì)胞。具體而言，在本發(fā)明中，經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞可以是戊糖磷酸途徑中所涉及的一種或多種酶的量增加的細(xì)胞。這種戊糖磷酸酶選自葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、核酮糖-5-磷酸-3-差向異構(gòu)酶、核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、和6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括培養(yǎng)相對于未改變細(xì)菌細(xì)胞其蘋果酸酶量增加的經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞。蘋果酸酶催化蘋果酸與NADP+反應(yīng)生成丙酮酸、二氧化碳、NADPH、和H+。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括培養(yǎng)相對于未改變細(xì)菌細(xì)胞其異檸檬酸脫氫酶量增加的經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞。異檸檬酸脫氫酶催化異檸檬酸與NADP+反應(yīng)生成α-酮戊二酸、二氧化碳、NADPH、和H+。
糖酵解和戊糖磷酸途徑二者都競爭葡萄糖。在本發(fā)明中，經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞可以是流經(jīng)糖酵解的碳流減小或阻斷從而導(dǎo)致流經(jīng)戊糖磷酸途徑氧化支路的碳流增加的細(xì)胞。當(dāng)用于本文時，經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞可以是通過糖酵解中涉及的一種或多種酶的量減少來實(shí)現(xiàn)流經(jīng)糖酵解的碳流減小的細(xì)胞。優(yōu)選的酶是6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、果糖二磷酸醛縮酶、D-甘油醛磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、endolase、或丙酮酸激酶。優(yōu)選的酶是6-磷酸葡萄糠異構(gòu)酶。
降低經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞中糖酵解酶量的優(yōu)選方法是突變該酶的編碼基因。當(dāng)用于本文時，優(yōu)選阻斷(無)或削弱(降低)6-磷酸葡糖異構(gòu)酶編碼基因(“pgi”)的表達(dá)。
阻斷(無)或削弱(降低)涉及糖酵解之酶的編碼基因的表達(dá)的優(yōu)選方法是使用自殺載體(也稱為整合型載體)。當(dāng)用于本文時，自殺載體定義為在特定生物體中不進(jìn)行自主復(fù)制，在導(dǎo)入細(xì)胞后重組進(jìn)入該生物體染色體同源區(qū)從而引起同源基因插入失活的載體。基因的插入失活是通過破壞該基因讀碼框來實(shí)現(xiàn)的。只有在以該基因的內(nèi)部片段作為同源區(qū)時才發(fā)生基因的插入失活。
使用眾所周知的技術(shù)，諸如轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位、綴合(conjugation)、電穿孔、電轉(zhuǎn)化、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、由DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、由陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、或其它方法，可將重組構(gòu)建物導(dǎo)入本發(fā)明細(xì)菌細(xì)胞。這些方法描述于許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊，諸如Davis等人，《分子生物學(xué)基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology)，1986。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞是如下生成的(a)將pgi基因的內(nèi)部區(qū)域亞克隆到自殺載體中；并(b)通過同源重組將所述自殺載體插入細(xì)菌基因組。內(nèi)部區(qū)域可以定義為討論中的開放讀碼框(ORF)第一個密碼子與最后一個密碼子之間但不包括這兩個密碼子的毗連DNA序列。優(yōu)選可促進(jìn)基因組整合且導(dǎo)致由討論中的ORF表達(dá)非功能多肽的內(nèi)部區(qū)域。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，自殺載體可以是可誘導(dǎo)的、突變體特異的、和/或條件特異的。在這些載體中，特別優(yōu)選通過易操作的環(huán)境因素(諸如溫度和營養(yǎng)添加劑)可誘導(dǎo)的自殺載體。其它合適的環(huán)境因素對于熟練技術(shù)人員是顯而易見的。
可以用任選包含至少一種標(biāo)記基因的自殺載體轉(zhuǎn)化本發(fā)明的經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞。這種標(biāo)記包括阿米卡星(amikacin)、奧格門汀(augmentin)(阿莫西林(amoxicillin)+棒酸)、氨芐青霉素、塞發(fā)查令(cefazolin)、頭孢噻吩(cefoxitin)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢噻夫(ceftiofur)、頭孢金素(cephalothin)、氯霉素、恩氟沙星(enrofloxacin)、紅霉素、氟苯尼考(florfenicol)、慶大霉素、亞胺培南、卡那霉素、沙氟沙星(sarafloxicin)、四環(huán)素、替卡西林(ticarcillin)、鏈霉素、壯觀霉素、潮霉素、三甲氧芐二氨嘧啶(trimethoprim)、或替米考星(tilmicosin)抗性基因。優(yōu)選的標(biāo)記包括氯霉素和/或卡那霉素抗性基因。其它合適標(biāo)記對于熟練技術(shù)人員是顯而易見的。
使用自殺載體的例示性范例如下通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增基因內(nèi)部區(qū)域，將由擴(kuò)增產(chǎn)生的片段亞克隆到包含抗生素抗性標(biāo)記基因的自殺載體中，并將自殺載體轉(zhuǎn)化到最初的生物體中?？股乜剐钥寺〉闹匦芦@得暗示同源基因的插入失活。所用自殺載體可包括在靶生物體中不能自主復(fù)制的任何質(zhì)粒。當(dāng)靶生物體不是大腸桿菌時，優(yōu)選基于Col E1的復(fù)制子。在基于Col E1的復(fù)制子中，優(yōu)選pBGS131(美國典型培養(yǎng)物收藏中心ATCC，Manassas，VA，保藏物編號37443)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了生產(chǎn)具有突變型pgi基因的細(xì)菌細(xì)胞的方法。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有突變型pgi基因的細(xì)菌細(xì)胞的方法，包括(a)將pgi基因的內(nèi)部區(qū)域亞克隆到自殺載體中；并(b)通過同源重組將所述自殺載體插入細(xì)菌基因組，由此生成具有突變型pgi基因的細(xì)菌細(xì)胞。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了按照上述方法生成的細(xì)菌細(xì)胞。
生成經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞的例示性范例如下使用合適引物對通過PCR擴(kuò)增谷氨酸棒桿菌中編碼6-磷酸葡糖異構(gòu)酶(一種糖酵解酶)的pgi基因的一個區(qū)域。PCR引物對優(yōu)選SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示引物，它們包含限制酶HindIII的識別序列。在用HindIII進(jìn)行限制性消化后，將PCR產(chǎn)物亞克隆到自殺載體pBGS131中。將產(chǎn)生的亞克隆命名為pDPTpgi2。然后將亞克隆pDPTpgi2轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒桿菌中，并在適當(dāng)培養(yǎng)基上選擇卡那霉素抗性菌落?？敲顾乜剐跃涞姆蛛x暗示發(fā)生了整合事件。整合主要是通過同源重組發(fā)生的，導(dǎo)致pgi基因的破壞。
用于生成經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞的另一種優(yōu)選方法是通過改變所述基因前面的啟動子來阻斷或削弱適當(dāng)基因的表達(dá)。優(yōu)選使用來自任何來源的不同啟動子，或者改變天然啟動子的核苷酸序列。在改變天然啟動子核苷酸序列的方法中，優(yōu)選PCR誘變。在已知細(xì)菌啟動子中，適用于本發(fā)明這種用途的包括大腸桿菌的lacI和IacZ啟動子、T3和T7啟動子、gpt啟動子、λPR和PL啟動子、trp啟動子、tac啟動子、或者本發(fā)明細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)源啟動子。同樣優(yōu)選上調(diào)戊糖磷酸途徑所涉及的酶的編碼基因。這可以通過改變控制該基因的啟動子，使用比天然啟動子更強(qiáng)的啟動子來進(jìn)行。上調(diào)戊糖磷酸途徑中的基因的另一種優(yōu)選方法是通過使用基因組整合型或自主復(fù)制型質(zhì)粒來增加討論中的基因的拷貝數(shù)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了通過培養(yǎng)經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞來生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是具有突變型pgi基因的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞。
用于生成經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞的另一種優(yōu)選方法包括突變涉及糖酵解的酶的編碼基因從而阻斷或削弱糖酵解酶編碼基因的表達(dá)。用于制備突變基因的合適方法的例示性范例包括但不限于PCR誘變、體外化學(xué)誘變、寡核苷酸誘變、紫外線或X射線照射誘變、或者用化學(xué)誘變劑(諸如亞硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)、甲磺酸甲酯、氮芥、等等)處理；基因整合技術(shù)，諸如由插入元件或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)或者由轉(zhuǎn)化的線性或環(huán)狀DNA分子的同源重組介導(dǎo)的整合；以及由噬菌體(諸如P1)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且描述于例如J.H.Miller，《分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)》(Experiments in MolecularBiology)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1972；J.H.Miller，《細(xì)菌遺傳學(xué)短期課程》(A Short Course in Baterial Genetics)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1992；M.Singer和P.Berg，《基因和基因組》(Gene&Genomes)，大學(xué)科學(xué)課本，Mill Valley，加利福尼亞，1991；J.Sambrook、E.F.Fritsch、和T.Maniatis，《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989；P.B.Kaufman等人，《生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的分子和細(xì)胞方法手冊》(Handbook of Molecularand Cellular Methods in Biology and Medicine)，CRC出版社，BocaRaton，佛羅里達(dá)，1995；B.R.Glick和J.E.Thompson編，《植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)中的方法》(Methods in Plant Molecular Biologyand Biotechnology)，CRC出版社，Boca Raton，佛羅里達(dá)，1993；和P.F.Smith-Keary，《大腸桿菌的分子遺傳學(xué)》(Molecular Geneticsof Escherichia coli)，Guilford出版社，紐約，NY，1989。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了具有突變型pgi基因的分離或純化細(xì)菌細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了包含編碼Pgi多肽的多核苷酸的分離核酸分子，所述Pgi多肽具有
圖1(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列。通過對1999年8月17日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心(NRRL，北方大學(xué)街1815號，Peoria，伊利諾斯，61604，美國)、指定編號B-30174的DNA克隆的測序可以獲得
圖1(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列。保藏克隆在p41-13(C01)質(zhì)粒中。
本發(fā)明還提供了選自下組的分離核酸分子(a)編碼包含SEQ ID NO2中大約第1位-大約第540位氨基酸的多肽的多核苷酸；(b)編碼包含由NRRL保藏物編號B-30174所含DNA克隆編碼之氨基酸序列之一的多肽的多核苷酸；(c)(a)或(b)的互補(bǔ)物；(d)通過改變(a)的多核苷酸而生成的多核苷酸變體，其中(1)所述改變包括核苷酸插入、刪除、或替代，或其任意組合；且(2)改變的數(shù)目等于或小于(a)的核苷酸總數(shù)的5％；(e)通過改變(b)的多核苷酸而生成的多核苷酸變體，其中(1)所述改變包括核苷酸插入、刪除、或替代，或其任意組合；且(2)改變的數(shù)目等于或小于(b)的核苷酸總數(shù)的5％；(f)通過改變(c)的多核苷酸而生成的多核苷酸變體，其中(1)所述改變包括核苷酸插入、刪除、或替代，或其任意組合；且(2)改變的數(shù)目等于或小于(c)的核苷酸總數(shù)的5％。
本發(fā)明還提供了上述核酸分子，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO1中的完整核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了上述核酸分子，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO1中編碼具有SEQ ID NO2中完整氨基酸序列的Pgi多肽的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了上述核酸分子，其中所述多核苷酸具有編碼由NRRL保藏物編號B-30174所含DNA克隆編碼的Pgi多肽的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了包含在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與具有與上述核酸分子(a)、(b)、或(c)中核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸發(fā)生雜交的多核苷酸的分離核酸分子，其中發(fā)生雜交的所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與具有只由A殘基或只由T殘基構(gòu)成的核苷酸序列的多核苷酸不發(fā)生雜交。
本發(fā)明還提供了用于生成重組載體的方法，包括將上述分離核酸分子插入載體。
本發(fā)明還提供了包含上述核酸分子的載體。本發(fā)明還提供了用于生成重組宿主細(xì)胞的方法，包括將上述載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了包含上述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)Pgi多肽的方法，包括在所述多肽得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述重組宿主細(xì)胞并回收所述多肽。
本發(fā)明還提供了選自下組的分離多肽(a)包含SEQ ID NO2中大約第1位-大約第540位氨基酸的多肽；(b)包含由NRRL保藏物編號B-30174所含DNA克隆編碼的氨基酸序列的多肽；
(c)通過改變(a)的氨基酸序列而生成的多肽變體，其中(1)所述改變包括插入、刪除、或替代，或其任意組合；且(2)改變的數(shù)目等于或小于(a)的氨基酸總數(shù)的5％；(d)通過改變(b)的多核苷酸序列而生成的多肽變體，其中(1)所述改變包括插入、刪除、或替代，或其任意組合；且(2)改變的數(shù)目等于或小于(b)的氨基酸總數(shù)的5％。
核酸分子除非另有說明，由本文DNA分子測序獲得的所有核苷酸序列是使用自動化DNA測序儀(諸如Applied Biosystems公司的373型)測定的，而且由本文測定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列是通過翻譯如上測定的DNA序列來預(yù)測的。因此，正如本領(lǐng)域關(guān)于通過這種自動化方法測定的任何DNA序列所知，本文測定的任何核苷酸序列可能有一些誤差。自動測序獲得的核苷酸序列與所測DNA分子的真實(shí)核苷酸序列通常至少大約90％，更通常至少大約95％-至少大約99.9％相同。正如本領(lǐng)域知道的，所測定的核苷酸序列中與真實(shí)序列相比的一個插入或刪除將在該核苷酸序列的翻譯中引起讀碼框移位，使得由測定的核苷酸序列編碼的預(yù)測氨基酸序列與由所測DNA分子真正編碼的氨基酸序列自這個插入或刪除位點(diǎn)開始完全不同。
使用本文提供的信息，諸如
圖1所示核苷酸序列，可通過標(biāo)準(zhǔn)克隆和篩選流程獲得編碼Pgi多肽的本發(fā)明核酸分子。
因此，本發(fā)明提供了編碼Pgi多肽的核苷酸序列，該多肽具有由確定為NRRL保藏物編號B-30174的宿主所含克隆編碼且如
圖1(SEQ ID NO1和2)所示的氨基酸序列。
正如普通技術(shù)人員將領(lǐng)會的，由于測序誤差的可能性，由保藏克隆編碼的預(yù)測Pgi多肽包含大約540個氨基酸，但可能是500-580范圍內(nèi)的任一值。
正如指出的，本發(fā)明核酸分子可以是RNA形式，諸如mRNA，或是DNA形式，包括例如通過克隆或合成生成的cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈，也稱為有義鏈；或是非編碼鏈，也稱為反義鏈。
“分離”核酸分子指脫離其天然環(huán)境的核酸分子，DNA或RNA。例如，對于本發(fā)明，認(rèn)為包含于載體中的重組DNA分子是分離的。分離DNA分子的其它范例包括維持于異源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子或溶液中的(部分或基本)純化DNA分子。分離RNA分子包括本發(fā)明DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄本。本發(fā)明分離核酸分子還包括合成法生成的這種分子。
本發(fā)明分離核酸分子包括包含
圖1(SEQ ID NO1)所示開放讀碼框(ORF)的DNA分子；包含
圖1(SEQ ID NO2)所示Pgi蛋白質(zhì)的編碼序列的DNA分子；和包含與上述序列基本不同、但由于遺傳密碼子簡并性仍編碼Pgi蛋白質(zhì)的序列的DNA分子。當(dāng)然，遺傳密碼子在本領(lǐng)域是眾所周知的。因此，生成這種簡并變體對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是常規(guī)的。
另外，本發(fā)明提供了具有與SEQ ID NO1廣泛部分有關(guān)的核苷酸序列的核酸分子。
在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼Pgi多肽的分離核酸分子，該多肽具有由1999年8月17日以NRRL保藏物編號B-30174保藏的核酸分子編碼的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了具有
圖1(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列或上述保藏克隆所含pgi基因組核苷酸序列的分離核酸分子，或者具有與上述序列之一互補(bǔ)的序列的核酸分子。這種分離分子，特別是DNA分子，可作為探針通過與染色體的原位雜交用于基因作圖。
本發(fā)明還致力于本文所述分離核酸分子的片段。具有保藏克隆的核苷酸序列或
圖1(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列的分離核酸分子的片段指長度為至少大約15個核苷酸(nt)、更優(yōu)選至少大約20nt、仍更優(yōu)選至少大約30nt、甚至更優(yōu)選至少大約40nt，可作為本文所述診斷性探針和引物的片段。當(dāng)然，長度為50、75、100、125、150、175、200、225、250、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550nt的較大片段也可用于本發(fā)明，對應(yīng)于保藏克隆或
圖1(SEQ IDNO1)所示的大部分(如果不是所有)核苷酸序列的片段同樣也可用于本發(fā)明。例如，長度為至少20nt的片段指包含來自保藏克隆核苷酸序列或
圖1(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列的20個或更多毗連堿基的片段。
在另一個方面，本發(fā)明提供了包含在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與本發(fā)明上述核酸分子(例如NRRL保藏物B-30174所含保藏克隆)中的多核苷酸部分發(fā)生雜交的多核苷酸的分離核酸分子?！皣?yán)謹(jǐn)雜交條件”指在含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5x Denhardt氏液、10％硫酸葡聚糖、和20g/mL變性剪切鮭魚精DNA的溶液中于42℃保溫過夜，隨后于大約65℃用0.1x SSC清洗膜。
與多核苷酸“部分”可發(fā)生雜交的多核苷酸指與參考多核苷酸的至少大約15個核苷酸(nt)、更優(yōu)選至少大約20nt、仍更優(yōu)選至少大約30nt、甚至更優(yōu)選大約30-70nt可發(fā)生雜交的多核苷酸(DNA或RNA)。它們可作為上文所述診斷性探針和引物使用，下文將更詳細(xì)的討論。
例如，“長度為至少20nt”的多核苷酸部分指來自參考多核苷酸(如保藏克隆或
圖1(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列)的核苷酸序列的20個或更多毗連核苷酸。當(dāng)然，與本發(fā)明核酸的部分進(jìn)行雜交的本發(fā)明多核苷酸將不包含只與polyA序列(諸如
圖1(SEQ ID NO1)所示pgi cDNA的3’端polyA序列)或一段T(或U)殘基互補(bǔ)序列發(fā)生雜交的多核苷酸，因?yàn)檫@種多核苷酸將與包含polyA序列或其互補(bǔ)序列的任何核酸分子(如實(shí)際應(yīng)用中的任何雙鏈cDNA克隆)發(fā)生雜交。
正如指出的，編碼Pgi多肽的本發(fā)明核酸分子可包含但不限于那些自身編碼多肽氨基酸序列的核酸分子；多肽和額外序列的編碼序列，諸如那些氨基酸前導(dǎo)序列或分泌序列的編碼序列，諸如前-、原-、或前原-蛋白質(zhì)序列；含或不含上述額外編碼序列，同時具有額外非編碼序列的多肽編碼序列，所述非編碼序列包括但不限于5’和3’非編碼序列，諸如轉(zhuǎn)錄但不翻譯、在轉(zhuǎn)錄和mRNA加工(例如核糖體結(jié)合和mRNA穩(wěn)定性)中起作用的序列；編碼額外氨基酸的額外編碼序列，諸如那些提供額外功能的氨基酸。因此，多肽編碼序列可融合標(biāo)記序列，諸如可便于純化融合多肽的肽的編碼序列。在本發(fā)明這個方面的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記氨基酸序列是6個組氨酸的肽，諸如在pQE載體(Qiagen公司)等中提供的標(biāo)簽，它們中的許多是商品化的。His6為融合蛋白的純化提供了便利(例如Gentz等人，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86821-824，1989)?！癏A”標(biāo)簽是另一種可用于純化的肽，對應(yīng)于由流感血凝素蛋白質(zhì)衍生的表位(Wilson等人，細(xì)胞(Cell)37767，1984)。正如下文討論的，其它這種融合蛋白包括N端或C端融合了Fc的Pgi。
上述探針、引物、和/或核酸片段可用于監(jiān)控發(fā)酵過程中pgi基因的表達(dá)。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明核酸分子的變體，它們編碼Pgi蛋白質(zhì)的片段、類似物、或衍生物。變體可以是天然發(fā)生的，諸如天然等位基因變體。“等位基因變體”指占據(jù)生物體染色體中指定基因座的基因的幾種可變形式之一(《基因》(Gene)，第2版，B.Lewin編，JohnWiley&Sons，紐約，1985)?？墒褂帽绢I(lǐng)域知道的誘變技術(shù)生成非天然發(fā)生的變體。
這樣的變體包括那些通過可能涉及一個或多個核苷酸的核苷酸替代、刪除、或添加而生成的變體?？筛淖冏凅w的編碼區(qū)、非編碼區(qū)、或二者兼之。編碼區(qū)的改變可產(chǎn)生保守性或非保守性氨基酸替代、刪除、或添加。在這些改變中尤其優(yōu)選沉默替代、添加、和刪除，它們不改變Pgi蛋白質(zhì)或其片段的特性和活性。在這方面同樣尤其優(yōu)選保守性替代。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括包含具有與下述核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的核苷酸序列的多核苷酸的分離核酸分子(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽的編碼核苷酸序列；(b)具有由NRRL保藏物編號B-30147所含克隆編碼的完整氨基酸序列的全長Pgi多肽的編碼核苷酸序列；或(c)與(a)或(b)中任何核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
例如，具有與編碼Pgi多肽的參考核苷酸序列至少95％“相同”的核苷酸序列的多核苷酸指除了在編碼Pgi多肽的參考核苷酸序列的每100個核苷酸中所述多核苷酸序列可包含多達(dá)5個點(diǎn)突變之外，該多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同。換言之，為了獲得具有與參考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，可刪除參考序列中多達(dá)5％的核苷酸，用其它核苷酸替代參考序列中多達(dá)5％的核苷酸，或者在參考序列中插入占其核苷酸總數(shù)多達(dá)5％的核苷酸。參考序列的這些突變可發(fā)生于參考核苷酸序列的5’或3’末端的位置，或者兩末端之間的任何位置，它們以單個或者以毗鄰的一組或幾組散布于參考序列的核苷酸間。
實(shí)際的情況是，使用已知的電腦程序，諸如Bestfit程序(威斯康星序列分析軟件包，用于Unix的第8版，遺傳學(xué)電腦小組，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)，可常規(guī)測定任何特定核酸分子是否與例如
圖1所示核苷酸序列或保藏克隆的核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同。Bestfit使用Smith和Waterman(應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(Advances in AppliedMathematics)2482～489，1981)的局部同源性算法來尋找兩種序列間的最佳同源區(qū)段。在使用Bestfit或任何其它序列比對程序來測定特定序列是否與本發(fā)明參考序列例如95％相同時，參數(shù)當(dāng)然應(yīng)設(shè)成在參考核苷酸序列全長基礎(chǔ)上計(jì)算同一性百分率，且允許參考序列中存在占核苷酸總數(shù)的多達(dá)5％的同源性缺口。
本發(fā)明致力于與
圖1(SEQ ID NO1)所示核酸序列或保藏克隆的核酸序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的核酸分子，而不管它們是否編碼具有Pgi活性的多肽。這是因?yàn)?，即使特定核酸分子不編碼具有Pgi活性的多肽，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員仍然知道如何使用該核酸分子，例如作為雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。不編碼具有Pgi活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的應(yīng)用包括但不限于在基因組文庫中分離pgi基因或其等位基因變體，以及用于檢測pgimRNA表達(dá)的Northern印跡分析。
然而，優(yōu)選具有與
圖1(SEQ ID NO1)所示核酸序列或保藏克隆的核酸序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同，并且事實(shí)上確實(shí)編碼具有Pgi蛋白質(zhì)活性之多肽的序列的核酸分子。“具有Pgi活性的多肽”指通過特定生物學(xué)測定法測量，展示與本發(fā)明Pgi蛋白質(zhì)的活性相似(但不必要相同)的活性的多肽。
當(dāng)然，由于遺傳密碼的簡并性，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將立即認(rèn)識到，具有與保藏克隆的核酸序列或
圖1(SEQ ID NO1)所示核酸序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列的許多核酸分子將編碼“具有Pgi蛋白質(zhì)活性”的多肽。事實(shí)上，熟練技術(shù)人員甚至在沒有進(jìn)行上述比較測定時也清楚的知道，這些核苷酸序列的簡并變體都編碼相同多肽。本領(lǐng)域還認(rèn)識到，對于不是簡并變體的那些核酸分子，其中有相當(dāng)數(shù)目也將編碼具有Pgi蛋白質(zhì)活性的多肽。這是因?yàn)?，熟練技術(shù)人員完全知道不大可能或不可能顯著影響蛋白質(zhì)功能的氨基酸替代(如用一種脂肪族氨基酸替代另一種脂肪族氨基酸)。
例如，J.U.Bowie等人(蛋白質(zhì)序列信息的解碼氨基酸替代的耐受性”，科學(xué)(Science)2471306-1310，1990)提供了關(guān)于如何產(chǎn)生表型沉默的氨基酸替代的指導(dǎo)，其中指出蛋白質(zhì)出人意料的耐受氨基酸替代。載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明分離DNA分子的載體、經(jīng)遺傳工程改造包含重組載體的宿主細(xì)胞、和Pgi多肽或其片段的重組技術(shù)生產(chǎn)。
可將多核苷酸連接含可選擇標(biāo)記的載體從而得以在宿主中擴(kuò)增。若載體是病毒，則可使用適當(dāng)包裝細(xì)胞系進(jìn)行體外包裝，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞中。
DNA插入片段應(yīng)當(dāng)可操作連接適當(dāng)啟動子，諸如噬菌體λPL啟動子、大腸桿菌lac、trp、和tac啟動子，這是其中的一些。熟練技術(shù)人員將知道其它的合適啟動子。表達(dá)構(gòu)建物還包含起始和終止轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)，以及在轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由構(gòu)建物表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分優(yōu)選在待翻譯多肽的起點(diǎn)包含起始密碼子，而在終點(diǎn)的適當(dāng)位置包含終止密碼子(UAA、UGA、或UAG)。
如上所述，表達(dá)載體優(yōu)選包含至少一種可選擇標(biāo)記。這樣的標(biāo)記包括但不限于用于培養(yǎng)大腸桿菌和其它細(xì)菌的卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、或氨芐青霉素抗性基因。適當(dāng)宿主的代表性范例包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌、鏈霉菌、和鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，諸如酵母細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，諸如果蠅S2細(xì)胞和Spodoptera Sf9細(xì)胞。適用于上述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和條件在本領(lǐng)域是知道的。
在已知細(xì)菌啟動子中，適用于生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的包括大腸桿菌lacI和lacZ啟動子、T3和T7啟動子、gpt啟動子、λPR和PL啟動子、以及trp啟動子。
因此，本發(fā)明還致力于可用于生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。
在載體中，優(yōu)選用于細(xì)菌的包括pQE70、pQE60、和pQE-9(Qiagen)；pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、和pNH46A(Stratagene)；以及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、和pRIT5(Pharmacia)。其它合適載體對熟練技術(shù)人員是顯而易見的。
可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、由DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、由陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、或其它方法將構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細(xì)胞。這些方法描述于許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊，諸如Davis等人，《分子生物學(xué)基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology)，1986。
可以經(jīng)修飾形式(諸如融合蛋白)表達(dá)多肽，該多肽可不僅包含分泌信號，還包含額外的異源功能區(qū)。例如，可在多肽N端添加額外氨基酸(特別是帶電荷氨基酸)區(qū)域以改進(jìn)在宿主細(xì)胞中、在純化過程中、或在隨后的處理和儲存過程中的穩(wěn)定性和持久性。同樣，可向多肽中添加肽模塊以便于純化?？稍诙嚯牡淖罱K制劑前除去這些區(qū)域。向多肽中添加肽模塊以造成分泌或排泄、改進(jìn)穩(wěn)定性、或便于純化等等，在本領(lǐng)域是熟悉的常規(guī)技術(shù)。
可通過眾所周知的方法由重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收并純化Pgi蛋白質(zhì)，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、和凝集素層析。更優(yōu)選的是，采用高效液相層析(“HPLC”)進(jìn)行純化。本發(fā)明多肽包括自然純化產(chǎn)物、化學(xué)合成流程的產(chǎn)物、和通過重組技術(shù)由原核或真核宿主(包括但不限于例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲、和哺乳動物細(xì)胞)生成的產(chǎn)物。根據(jù)在重組生產(chǎn)流程中采用的宿主，本發(fā)明多肽可以是糖基化的，或是未糖基化的。另外，本發(fā)明多肽還可包含經(jīng)修飾起始甲硫氨酸殘基，在有些情況中這是宿主介導(dǎo)過程的結(jié)果。Pgi多肽及片段本發(fā)明還提供了具有由保藏克隆編碼的氨基酸序列或
圖1(SEQ IDNO2)所示氨基酸序列的分離Pgi多肽，或者包含上述多肽一部分的肽或多肽。
在本領(lǐng)域可以理解，可以改變Pgi多肽的一些氨基酸序列而不顯著影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能。若在序列中嘗試了這樣的差異，則應(yīng)當(dāng)記住蛋白質(zhì)上存在決定活性的關(guān)鍵區(qū)域。
因此，本發(fā)明還包括顯示基本Pgi多肽活性或包含Pgi蛋白質(zhì)區(qū)域(諸如下述蛋白質(zhì)部分)的Pgi多肽變異。這些突變體包括刪除、插入、倒置、重復(fù)、和類型替代。如上所述，可以在J.U.Bowie等人，“蛋白質(zhì)序列信息的解碼氨基酸替代的耐受性”，科學(xué)(Science)2471306-1310，1990中找到關(guān)于哪些氨基酸變化有可能是表型沉默的指導(dǎo)。
因此，
圖1(SEQ ID NO2)所示Pgi多肽或由保藏克隆編碼的Pgi多肽的片段、衍生物、或類似物，可以是(1)用保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)替代一個或多個氨基酸殘基的類型，其中替代氨基酸殘基可以是或者不是由遺傳密碼子編碼的，或者(2)一個或多個氨基酸殘基包含取代基團(tuán)的類型，或者(3)多肽融合了另一種化合物，諸如增加多肽半壽期的化合物(例如聚乙二醇)的類型，或者(4)成熟多肽融合了額外氨基酸，諸如IgG Fc融合區(qū)肽、前導(dǎo)序列或分泌序列、用于多肽純化的序列的類型、或者前蛋白質(zhì)序列。根據(jù)本文的教學(xué)，認(rèn)為這樣的片段、衍生物、和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。
如上所述，變化優(yōu)選較小本質(zhì)，諸如不顯著影響蛋白質(zhì)折疊或活性的保守氨基酸替代(見表1)。表1.保守氨基酸替代芳香族 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸疏水亮氨酸異亮氨酸纈氨酸極性谷氨酰胺天冬酰胺堿性精氨酸賴氨酸組氨酸酸性天冬氨酸谷氨酸小型丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸甘氨酸當(dāng)然，熟練技術(shù)人員將根據(jù)許多因素(包括上文所述)來決定氨基酸替代的數(shù)目。一般而言，任何給定Pgi多肽的氨基酸替代的數(shù)目不會超過50、40、30、20、10、5、或3個。
可通過本領(lǐng)域知道的方法來鑒定本發(fā)明Pgi蛋白質(zhì)中的功能必需氨基酸，諸如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學(xué)(Science)2441081-1085，1989)。后一種方法是在分子中的每一個殘基處引入一個丙氨酸突變。然后對產(chǎn)生的突變分子測試磷酸葡糖異構(gòu)酶活性。
優(yōu)選以分離形式提供本發(fā)明多肽，且優(yōu)選基本純化的?！胺蛛x多肽”指脫離其天然環(huán)境的多肽。因此，對于本發(fā)明，認(rèn)為由重組宿主細(xì)胞生成和/或包含的多肽是分離的。已經(jīng)由重組宿主細(xì)胞部分或基本純化的多肽同樣是 “分離多肽”。例如，可通過Smith和Johnson(基因(Gene)6731-40，1988)描述的一步法基本純化重組生產(chǎn)形式的Pgi多肽。
本發(fā)明多肽包括由保藏DNA編碼的Pgi多肽，與由保藏克隆編碼的多肽或
圖1(SEQ ID NO2)所示多肽至少95％、仍更優(yōu)選至少96％、97％、98％、或99％相同的多肽，還包括這些多肽具有至少30個氨基酸，更優(yōu)選至少50個氨基酸的片段。
具有與Pgi多肽參考氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽指除了在Pgi多肽參考序列的每100個氨基酸中所述多肽序列可包含多達(dá)5個氨基酸的改變之外，該多肽的氨基酸序列與參考序列相同。換言之，為了獲得具有與參考氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，可刪除參考序列中多達(dá)5％的氨基酸殘基，用其它氨基酸替代參考序列中多達(dá)5％的氨基酸殘基，或者在參考序列中插入占其氨基酸總數(shù)多達(dá)5％的氨基酸。參考序列的這些改變可發(fā)生于參考氨基酸序列的氨基或羧基末端的位置，或者兩末端之間的任何位置，它們以單個或者以毗鄰的一組或幾組散布于參考序列的氨基酸間。
實(shí)際的情況是，使用已知的電腦程序，諸如Bestfit程序(威斯康星序列分析軟件包，用于Unix的第8版，遺傳學(xué)電腦小組，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)，可常規(guī)測定任何特定多肽是否與例如
圖1(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列或由保藏克隆編碼的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同。在使用Bestfit或任何其它序列比對程序來測定特定序列是否與本發(fā)明參考序列例如95％相同時，參數(shù)當(dāng)然應(yīng)設(shè)成在參考氨基酸序列全長基礎(chǔ)上計(jì)算同一性百分率，且允許參考序列中存在占氨基酸總數(shù)的多達(dá)5％的同源性缺口。
使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的方法，本發(fā)明多肽可在SDS-PAGE或分子篩凝膠過濾柱上作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。N端和C端刪除突變體在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在
圖1(SEQ ID NO2)所示或保藏克隆所含DNA編碼的Pgi多肽的氨基酸序列氨基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。具體而言，在一個實(shí)施方案中，Pgi多肽的N端刪除可用一般通式m-540描述，其中m是由2至539的任一整數(shù)，對應(yīng)于在SEQID NO2中確定的氨基酸殘基位置，優(yōu)選對應(yīng)于在本文說明的N端刪除中確定的一個N端氨基酸殘基。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個實(shí)施方案致力于本發(fā)明Pgi多肽的C端缺失體，由一般通式1-n描述，其中n是由2至539的任一整數(shù)，對應(yīng)于在SEQ ID NO2中確定的氨基酸殘基位置，優(yōu)選對應(yīng)于在本文說明的C端刪除中確定的一個殘基。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個實(shí)施方案致力于包含由一般通式m-n描述的氨基酸殘基或由其構(gòu)成的多肽片段，其中m和n分別對應(yīng)于上文為這些符號說明的任一氨基酸殘基。本發(fā)明還涵蓋編碼這些多肽的多核苷酸。
實(shí)施例下列實(shí)施例只是例示性的，而非限制由所附權(quán)利要求確定的本發(fā)明范圍。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將領(lǐng)會，可在本發(fā)明方法中進(jìn)行多種修飾和變化而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明意欲覆蓋本發(fā)明的這些修改和變化，只要它們屬于所附權(quán)利要求及其等同的范圍之內(nèi)。實(shí)施例1-分離并純化DNA由NRRL B-11474細(xì)胞的培養(yǎng)物分離DNA。由CM(表B)培養(yǎng)基收獲NRRL B-11474細(xì)胞，并懸浮于10ml TE(10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8)。每毫升懸浮液加入40μg RNA酶和10mg溶菌酶，并將懸浮液于37℃保溫30分鐘。加入十二烷基硫酸鈉(SDS)至1.0％和蛋白酶K至0.1mg/L，并通過于37℃保溫10分鐘來裂解細(xì)胞。通過TE飽和酚(pH7)抽提3次及隨后的乙醇沉淀來純化核酸。用80％乙醇清洗核酸沉淀物2次，并重新溶解于TE(pH8)。通過分光光度法(260nm)測定DNA濃度。通過分光光度法(A260/A280和A260/A230比率)和瓊脂糖凝膠電泳(0.8％1xTAE瓊脂糖)測定DNA制劑的純度。
正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知道的，分別使用pGEM3和Lorist6生成質(zhì)粒和粘粒文庫，以進(jìn)行基因組DNA測序。通過與結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(Swiss Prot瑞士蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號P77895，Swiss Prot ID G6PI_MYCTU)的同源性來鑒定谷氨酸棒桿菌pgi基因。實(shí)施例2-通過破壞pgi來增加NADPH的可利用性通過破壞編碼6-磷酸葡糖異構(gòu)酶的pgi基因來獲得流經(jīng)戊糖磷酸途徑氧化支路的碳流的增加。由上述基因組DNA序列設(shè)計(jì)了兩種PCR引物來擴(kuò)增谷氨酸棒桿菌pgi基因的680bp內(nèi)部區(qū)域。這兩種引物是pgif*(SEQ ID NO3)5′gctgatgtccacgaagctttgggac 3′pgir*(SEQ ID NO4)3′gctgagaaccttggaataaggtagg 3′引物對pgif*和pgir*包含限制酶HindIII的識別序列。對于pgir*，需要在谷氨酸棒桿菌核苷酸序列中進(jìn)行3處改變以摻入HindIII識別序列。這兩個HindIII限制性位點(diǎn)有助于亞克隆。
采用如下PCR擴(kuò)增條件。每個PCR反應(yīng)的終體積是100μl。使用兩種引物各100ng，以及50ng高分子量谷氨酸棒桿菌ATCC 21799基因組DNA和2.5U Taq DNA聚合酶。以制造商(Stratagene)推薦的濃度加入反應(yīng)緩沖液，并加入dNTP至終濃度200μM。循環(huán)參數(shù)如下94℃1min；94℃30sec、60℃30sec、和72℃1min，30個循環(huán)；72℃7min；隨后凍存。
在用HindIII進(jìn)行限制性消化后，PCR產(chǎn)物的大小降至大約660bp。然后將該片段亞克隆到自殺載體pBGS131中。將產(chǎn)生的亞克隆命名為pDPTpgi2。
在電轉(zhuǎn)化感受態(tài)谷氨酸棒桿菌(NRRL B-11474)后，在含卡那霉素(終濃度10μg/ml)的CM(表B)瓊脂平板上選擇整合體。通過酶測定法確認(rèn)了突變株中不存在磷酸葡糖異構(gòu)酶活性，表明這些菌株中的pgi基因已遭到破壞。
搖瓶實(shí)驗(yàn)表明與谷氨酸棒桿菌(NRRL B-11474)相比谷氨酸棒桿菌(NRRL B-11474)pgi突變體的賴氨酸效價和產(chǎn)量獲得了提高(表A)。表AFM3培養(yǎng)基(表C)上的賴氨酸生產(chǎn)菌株 生長 效價 產(chǎn)量NRRL B11474 4625 42NRRL B1474pgi2A 4031 52生長＝于660nm的光密度效價＝賴氨酸克數(shù)/培養(yǎng)基升數(shù)產(chǎn)量＝(賴氨酸克數(shù)/葡萄糖消耗克數(shù))×100表BCM培養(yǎng)基體積1000ml ％瓊脂0蔗糖 50gKH2PO40.5gK2HPO41.5g尿素 3gMgSO4·7H2O 0.5g聚蛋白胨 20g牛肉浸膏 5g生物素12.5ml(60mg/L)硫胺素25ml(120mg/L)煙酰胺25ml(5g/L)L-甲硫氨酸0.5gL-蘇氨酸 0.25gL-丙氨酸 0.5g定容加入蒸餾水至1000mlpH大約7.1表CFM3培養(yǎng)基(每升)(NH4)2SO450gKH2PO41gMgSO4·7H2O0.4gMnSO4H2O 0.01gFeSO4·7H2O0.01g生物素 0.03mg玉米漿 4％干固體終濃度葡萄糖 6％終濃度CaCO350g實(shí)施例3-破壞編碼6-磷酸果糖激酶的基因(pfkA)以與實(shí)施例2中關(guān)于pgi基因所述相似的方法，破壞了編碼6-磷酸果糖激酶的基因(pfkA)。通過突變體提取物的酶測定法確認(rèn)了對pfkA基因的破壞并顯示缺乏6-磷酸果糖激酶活性。出乎意料的是，谷氨酸棒桿菌(NRRL B-11474)pfkA突變體不能利用葡萄糖。
*****本文明白的、完整的收入文中提及的所有專利和發(fā)表物作為參考。
在為了澄清和理解目的而詳細(xì)描述了上述發(fā)明之后，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員在閱讀本說明書之后將領(lǐng)會，可以在形式和細(xì)節(jié)上進(jìn)行多種變化而不脫離本發(fā)明和所附權(quán)利要求的真實(shí)范圍。
序列表<110>O′Donohue，Michael R.
Hanke，Paul D.<120>用于生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130>1533.101PC02<140><141><150>US 60/150,017<151>1999-08-20<150>US 60/145,217<151>1999-07-23<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1623<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(1)..(1620)<400>1atg gcg gac att tcg acc acc cag gct tgg caa gac ctg acc gat cat48Met Ala Asp Ile Ser Thr Thr Gln Ala Trp Gln Asp Leu Thr Asp His1 5 10 15tac tca aac ttc cag gca acc act ctg cgt gaa ctt ttc aag gaa gaa96Tyr Ser Asn Phe Gln Ala Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu20 25 30aac cgc gcc gag aag tac acc ttc tcc gcg gct ggc ctc cac gtc gac144Asn Arg Ala Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp35 40 45ctg tcg aag aat ctg ctt gac gac gcc acc ctc acc aag ctc ctt gca192Leu Ser Lys Asn Leu Leu Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala50 55 60ctg acc gaa gaa tct ggc ctt cgc gaa cgc att gac gcg atg ttt gcc240Leu Thr Glu Glu Ser Gly Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala65 70 75 80ggt gaa cac ctc aac aac acc gaa gac cgc gct gtc ctc cac acc 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權(quán)利要求
1.L-氨基酸的生產(chǎn)方法，包括培養(yǎng)與未改變的細(xì)菌細(xì)胞相比其NADPH量有所增加的經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞的L-氨基酸產(chǎn)量高于來自未改變細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞中流經(jīng)戊糖磷酸途徑氧化支路的碳流增加了。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞中選自下組的一種或多種酶的量增加了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、內(nèi)酯酶、和6-磷酸葡糖酸脫氫酶。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞中流經(jīng)糖酵解途徑的碳流減小了。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞中6-磷酸葡糖異構(gòu)酶酶促活性降低了。
6.權(quán)利要求1的方法，其中來自所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞的所述L-氨基酸產(chǎn)量比所述未改變細(xì)菌細(xì)胞高大約1％-大約100％。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞具有突變型pgi基因。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞是如下生成的(a)亞克隆pgi基因的內(nèi)部區(qū)域；并(b)通過同源重組將由步驟(a)產(chǎn)生的載體插入細(xì)菌基因組。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞中蘋果酸酶的量增加了。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞中異檸檬酸脫氫酶的量增加了。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞是谷氨酸棒桿菌細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述谷氨酸棒桿菌細(xì)胞具有突變型pgi基因。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述L-氨基酸包括L-賴氨酸。
14.包含pDPTpgi2的載體。
15.生產(chǎn)具有突變型pgi基因的細(xì)菌細(xì)胞的方法，包括(a)將pgi基因的內(nèi)部區(qū)域亞克隆到自殺載體中；并(b)將由步驟(a)產(chǎn)生的載體插入細(xì)菌基因組，由此生成具有突變型pgi基因的細(xì)菌細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述自殺載體選自包括pBGS131和含可選擇標(biāo)記的基于Col E1的復(fù)制子。
17.按照權(quán)利要求15的方法生成的經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞。
18.L-氨基酸的生產(chǎn)方法，包括培養(yǎng)與未改變細(xì)菌細(xì)胞相比其6-磷酸葡糖異構(gòu)酶酶促活性有所降低的經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞，其中來自所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞的L-氨基酸產(chǎn)量高于來自未改變細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)量。
19.權(quán)利要求18的方法，其中來自所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞的所述L-氨基酸產(chǎn)量比所述未改變細(xì)菌細(xì)胞高大約1％-100％。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞具有突變型pgi基因。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞是如下生成的(a)亞克隆pgi基因的內(nèi)部區(qū)域；并(b)通過同源重組將由步驟(a)產(chǎn)生的載體插入細(xì)菌基因組。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞是谷氨酸棒桿菌細(xì)胞。
23.權(quán)利要求18的方法，其中所述L-氨基酸包括L-賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明總的涉及用于生產(chǎn)L－氨基酸的方法,包括培養(yǎng)與未改變細(xì)菌細(xì)胞相比其NADPH量增加的經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞,因而來自所述經(jīng)改變細(xì)菌細(xì)胞的L－氨基酸產(chǎn)量高于來自未改變細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)量。本發(fā)明還涉及編碼磷酸葡糖異構(gòu)酶的基因。
文檔編號C12N15/61GK1372597SQ00810748
公開日2002年10月2日 申請日期2000年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月23日
發(fā)明者M·R·奧唐諾休, P·D·漢克 申請人:阿徹-丹尼爾斯-米德蘭公司