專利名稱：用于治療感染的減毒微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可以用于疫苗組合物的防治微生物或病毒感染的減毒微生物。
背景技術(shù)：
十分肯定的是減毒活微生物是非常有效的疫苗；這樣的疫苗通常比那些非復(fù)制型免疫原引起更強(qiáng)并且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)的免疫反應(yīng)。對(duì)這一點(diǎn)的一種解釋是活的減毒株在宿主中引起局限感染并且模擬天然感染的早期階段。另外，不象滅活制劑，活疫苗能夠誘導(dǎo)可能同其在抗原呈遞細(xì)胞，例如巨嗜細(xì)胞中的復(fù)制能力有關(guān)的有效的細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)。
將沙門氏菌(Salmonella)減毒活疫苗用作預(yù)防動(dòng)物和人的沙門氏菌病的安全而有效的疫苗已經(jīng)有了很長(zhǎng)的歷史。的確，由瑞士血清疫苗研究所生產(chǎn)制造的口服減毒活傷寒疫苗，Ty21a(Vivotif)，已經(jīng)被證明是一種用于預(yù)防傷寒的非常成功的疫苗，并且已經(jīng)在包括美國(guó)和歐洲的許多國(guó)家得到許可。
但是，用化學(xué)誘變技術(shù)獲得的這一菌株的減毒和菌株的減毒基礎(chǔ)并不完全清楚。因此，該疫苗在使用劑量(通常是4)和每次給藥量所需的活生物數(shù)量方面并不理想。
現(xiàn)代分子生物技術(shù)結(jié)合對(duì)沙門氏菌致病原因的知識(shí)的增長(zhǎng)導(dǎo)致鑒定出了對(duì)于這種生物在體內(nèi)生長(zhǎng)和存活所必需的數(shù)種基因。這就提供了新的用于減毒的靶基因，引出了未來的疫苗菌株可以通過在選擇已知的影響毒力的基因中引入確定的非回復(fù)突變而被“合理地”減毒的概念，這有利于改進(jìn)疫苗的開發(fā)，尤其是在免疫原性以及應(yīng)當(dāng)使用的劑量大小方面。
雖然現(xiàn)在已知許多沙門氏菌減毒株，但只有很少可以有資格作為潛在的人用候選疫苗。這可能部分是由于需要平衡疫苗免疫原性和沙門氏菌微生物變成復(fù)活的可能性。
我們清楚選擇合適的減毒目標(biāo)以得到合適的候選疫苗是不簡(jiǎn)單的而且不容易被預(yù)測(cè)。許多因素都可能影響減毒株作為合適的疫苗的合適性，并且進(jìn)行了許多研究以鑒定出合適的茵株。例如，許多被檢測(cè)的作為候選疫苗的減毒株導(dǎo)致病人的膿腫或vaccinemia。
因此需要開發(fā)出一種免疫原性程度高并且減少了微生物菌株恢復(fù)成為活性形式的可能性的疫苗。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)將一些減毒突變組合物引入到沙門氏菌微生物中能夠產(chǎn)生出一種免疫原性程度高并且恢復(fù)成為活性形式的危險(xiǎn)性低的疫苗。所得到的疫苗菌株顯示出了好的副作用方面。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，是具有破壞位于Spi2致病島中的基因表達(dá)的一個(gè)減毒突變的，以及破壞cipP，ompR，sifA，sseC或ssaB中的任何一個(gè)基因的表達(dá)的另一個(gè)突變的沙門氏菌屬微生物。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，是具有一個(gè)破壞aro基因表達(dá)的減毒突變，以及另一個(gè)破壞cIpP或sifA任何一個(gè)基因的表達(dá)的突變的沙門氏菌微生物沙門氏茵微生物可以用于生產(chǎn)治療細(xì)菌或病毒感染的靜脈用或口服藥物，例如用于治療傷寒。
發(fā)明描述本發(fā)明的微生物和疫苗組合物可以通過現(xiàn)有技術(shù)來制備。
普通技術(shù)人員不需要過度的試驗(yàn)就可以選擇出特定的沙門氏菌微生物以及合適的突變。一種優(yōu)選的微生物是鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)。
第一套突變株包括第一個(gè)位于沙門氏菌致病島2(Spi2)區(qū)域中的基因的突變；該區(qū)域在WO-A-9617951中公開。
Spi2是位于沙門氏菌染色體上的兩個(gè)典型致病島中的一個(gè)。Spi2含有數(shù)個(gè)基因，這些基因編碼參與將Spi2編碼的毒力相關(guān)蛋白(被稱作效應(yīng)器蛋白)運(yùn)輸?shù)缴抽T氏菌外并且可能是直接進(jìn)入到象巨噬細(xì)胞一樣的目標(biāo)宿主細(xì)胞中的III型分泌系統(tǒng)。Spi2的一部分(裝置基因)編碼III型系統(tǒng)的分泌裝置。Spi2對(duì)于沙門氏菌對(duì)小鼠的致病性和毒力是完全必需的，這一點(diǎn)現(xiàn)在已被世界的不同組織的觀察所證實(shí)。經(jīng)口服，靜脈和腹膜內(nèi)給藥途徑的攻擊小鼠的鼠傷寒沙門氏菌Spi2突變體是高度減毒的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Spi2區(qū)的基因是裝置基因。位于Spi2內(nèi)的裝置基因現(xiàn)在已經(jīng)被較好地鑒定；例如見Hensel等，分子微生物學(xué)，(1997)；24(1)155-167。適用于本發(fā)明的基因包括ssaV，ssaJ，ssaK，ssaL，ssaM，ssaO，ssaP，ssaQ，ssaR，ssaS，ssaT，ssaU和ssaH基因。
Spi2區(qū)中的突變不一定在一個(gè)基因內(nèi)以破壞其功能。例如，位于上游調(diào)節(jié)區(qū)的突變也能夠破壞基因的表達(dá)從而導(dǎo)致減毒?；蜷g隔區(qū)的突變也足以破壞該基因的功能。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Spi2基因是ssaV并且進(jìn)一步的突變破壞cipP，ompR，sifA或sseC中的任何一個(gè)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變破壞ssaT而另一個(gè)突變破壞ssaB。
Gifford等在微生物遺傳學(xué)，1993；139913-920中描述了clpP基因，所編碼的蛋白是一種應(yīng)激蛋白酶。
OmpR基因在Chatfield等，傳染與免疫性，1991；59(1)449-452中作了描述。所編碼的蛋白是具有全局調(diào)節(jié)功能的雙成份系統(tǒng)(OmpR-EnvZ)的一個(gè)成份，并且也是Spi2中的雙成份系統(tǒng)ssrA-ssrB的調(diào)節(jié)物(Lee等，細(xì)菌學(xué)雜志，2000；182(3)771-781)Medina等在傳染與免疫性，1999；67(3)1093-1099中描述了sseC基因。所編碼的產(chǎn)物的功能是未知的。
Hensel在分子微生物學(xué)，2000；36(5)1015-1023中描述了ssaB基因。所編碼的產(chǎn)物是一種已知的Spi2的底物蛋白，并且同巨噬細(xì)胞正常的內(nèi)體運(yùn)輸相互配合。
第二套獨(dú)立的突變體包括一個(gè)破壞aro基因的第一個(gè)突變。由于aro基因?qū)τ诖嬖谟谏抽T氏菌中而不存在于哺乳動(dòng)物中的生物合成途徑是必需的，所以這一突變被稱作“營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變”。所以，突變體不能依賴于在受治病人中發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物來避免突變的影響。用于營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變的合適的基因包括aroA，aroC，aroD和aroE。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，aroC被破壞。
第二個(gè)突變破壞clpP或sifA基因中的任何一個(gè)。上面描述了ClpP。Stein等在分子微生物學(xué)，1996；20(1)151-164以及Beuzon等在歐洲分子生物學(xué)雜志，2000；19(13)3235-3249中描述了sifA基因。SifA基因的產(chǎn)物參與上皮細(xì)胞中含有糖蛋白的溶酶體結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。
可以用任何已知的技術(shù)將這種突變引入到微生物中。優(yōu)選地，突變是缺失突變，基因的破壞是核酸被切除引起的。另外，可以通過插入核酸或者點(diǎn)突變來引入突變。將突變引入到特定區(qū)域的方法對(duì)于技術(shù)人員來說是顯而易見的。
例如，可以通過首先用PCR和高保真度聚合酶擴(kuò)增靶基因以及側(cè)翼DNA造成基因缺失。然后可以將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到合適的克隆載體中。當(dāng)用在反相PCR中時(shí)，可以設(shè)計(jì)PCR引物來刪除基因以產(chǎn)生初始構(gòu)建體。PCR引物應(yīng)當(dāng)含有Xbal位點(diǎn)以引入新的限制性位點(diǎn)并且因此提供了基因缺失的標(biāo)記。然后將缺失構(gòu)建體轉(zhuǎn)入到自殺載體中再轉(zhuǎn)入到沙門氏菌染色體中。構(gòu)建體可以通過電穿孔或整合作用進(jìn)入到所需菌株中，并且重組體含有整合到在同源位點(diǎn)(部分二倍體)的染色體的質(zhì)粒，用質(zhì)粒上攜帶的抗生素抗性標(biāo)記篩選。自殺載體應(yīng)當(dāng)含有編碼果聚糖蔗糖酶的sacB基因，當(dāng)有蔗糖存在時(shí)這對(duì)許多革蘭氏陰性細(xì)菌是有毒性的。對(duì)蔗糖的選擇性因此可以用來分離出導(dǎo)致質(zhì)粒從染色體上丟失的第二個(gè)重組事件發(fā)生的茵落，這第二個(gè)重組事件會(huì)導(dǎo)致兩種結(jié)果，野生型等位基因的再生或者缺失突變體的產(chǎn)生。然后可以通過菌落-PCR鑒定含有缺失突變的菌落并且通過DNA印跡分析來鑒定缺失。
除了這兩種突變，沙門氏菌屬微生物也可以含有異種抗原。這種減毒微生物因此可以作為施用抗其它細(xì)菌或病毒感染抗原的傳送工具。適用于這種方法的抗原對(duì)于技術(shù)人員來說是清楚的并且抗原包括致病大腸桿菌(E.Coli)抗原，即產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)甲型，乙型和丙型肝炎病毒抗原萊姆氏病(Lime disease)抗原霍亂弧菌(Vibrio cholera)抗原螺桿菌屬(Helicobacter)抗原單純皰疹病毒(Herpes Simplex virus)抗原人類乳頭狀瘤病毒(Human papilloma virus)抗原這種系統(tǒng)也有可能提供用于治療病人，例如被肝炎病毒感染的病人的治療蛋白，肽或核酸。細(xì)胞因子是可以由突變微生物提供的治療蛋白的合適的例子。用疫苗組合物提供異種抗原或治療蛋白的方法對(duì)技術(shù)人員來說是顯而易見的。
用本發(fā)明的微生物制備的疫苗可用于治療病人和治療獸感染。
雙重突變提供了使微生物減毒的有效方法從而提供了一種安全的候選疫苗。
這種疫苗組合物甚至為無免疫應(yīng)答患者提供了有效的保護(hù)，并且重要的是降低了發(fā)生脾膿腫的危險(xiǎn)。使用以單一突變?yōu)榛A(chǔ)的疫苗已經(jīng)被證實(shí)會(huì)導(dǎo)致脾膿腫，因此本發(fā)明的組合物可以為患者帶來巨大的好處。
為了配制疫苗組合物，突變體微生物可同任何合適的藥學(xué)上可接受的助劑，稀釋劑或賦性劑一起出現(xiàn)在組合物中。合適的配方對(duì)于普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。根據(jù)任何適合的給藥方法可以開發(fā)出各種配方。優(yōu)選的給藥方式是通過口服或靜脈途徑并且疫苗是減毒活沙門氏菌屬微生物。技術(shù)人員可以確定配方中所需和最佳的微生物數(shù)量。但是，一般來說，一個(gè)患者大約施用107-1010CFUs的微生物。優(yōu)選的是每單位劑量大約108-109CFUs。
權(quán)利要求
1.一種沙門氏菌屬(Salmonella)微生物，該微生物含有破壞位于Spi2致病島內(nèi)的基因表達(dá)的一個(gè)減毒突變，和另外一個(gè)破壞clpP，ompR，sifA，sseC和ssaB中任何一個(gè)基因表達(dá)的突變。
2.一種沙門氏茵屬微生物，該微生物含有破壞aro基因表達(dá)的一個(gè)減毒突變，和另外一個(gè)破壞clpP和sifA中任何一個(gè)基因表達(dá)的突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的微生物，其中aro基因是aroC。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的微生物，其中Spi2基因是ssaV，并且另一個(gè)突變破壞clpP，ompR，sifA或sseC。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的微生物，其中Spi2基因是ssaT，并且另一個(gè)突變破壞ssaB。
6.根據(jù)以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求的微生物，其進(jìn)一步含有一個(gè)異種抗原或者一種治療蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的微生物，其中的抗原是甲型，乙型或丙型肝炎病毒抗原。
8.根據(jù)以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求的微生物，其中的微生物是傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)Ty2。
9.根據(jù)以上任何一項(xiàng)權(quán)利要求的微生物，用于治療作用。
10.含有根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一微生物，一種助劑和一種生理上可接受的稀釋劑的疫苗組合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，每單位劑量含有107-1010CFUs的微生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，每單位劑量含有108-109CFUs的微生物。
13.權(quán)力要求1到8中任意一項(xiàng)所述的微生物在制備用于治療全身細(xì)菌感染的藥物中的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中的感染是傷寒。
全文摘要
雙重突變體沙門氏菌屬微生物在保持該微生物能夠有效引起免疫反應(yīng)的同時(shí)幫助防止微生物的復(fù)活。不同特定突變體的結(jié)合是有益的。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1411468SQ0081744
公開日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2000年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月23日
發(fā)明者G·都甘, D·W·赫爾頓, J·D·桑坦格羅, J·E·舍艾, F·R·布倫南 申請(qǐng)人:微科學(xué)有限公司