專利名稱：一種細(xì)菌、真菌及大腸菌群計(jì)數(shù)卡及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)裝置及其制備方法。
在食品、飲料、礦泉水、飲用純水、化妝品、藥品和飼料的檢驗(yàn)中，細(xì)菌總數(shù)、真菌總數(shù)及大腸菌群數(shù)量是十分重要的限量檢測(cè)指標(biāo)，較之化學(xué)物質(zhì)，微生物比較活躍，更具有不可控制性和預(yù)見性，因而一直引起人們的高度關(guān)注，近年來研究開發(fā)此類快速檢測(cè)產(chǎn)品則更是一個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域中的熱門課題。
八十年代初，美國(guó)3M公司首先從事這方面的研究，生產(chǎn)出Petrifilm系列細(xì)菌、真菌計(jì)數(shù)板和大腸菌群計(jì)數(shù)膠片，使用時(shí)只需將樣品或其稀釋液直接涂布在膜上，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)帶有顏色的菌落即可，操作非常方便。1997年Kinght MT等報(bào)告，美國(guó)3M公司的酵母菌和霉菌計(jì)數(shù)板與傳統(tǒng)方法無顯著差異。在3M公司之后，日本Y密列泊公司，美國(guó)Drew化學(xué)公司和芬蘭Orion Diagnostica廠等也相繼推出各種干片產(chǎn)品。
目前國(guó)內(nèi)已形成專利或產(chǎn)品的微生物檢測(cè)干片產(chǎn)品有系列水中細(xì)菌檢驗(yàn)卡、菌落總數(shù)檢測(cè)膠膜、大腸菌群快速檢驗(yàn)紙片及霉菌檢驗(yàn)紙片等，極大地促進(jìn)了國(guó)內(nèi)微生物檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，并在實(shí)際中得到一定程度的應(yīng)用，而且餐具大腸菌群紙片法還列入了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。
在上述微生物檢驗(yàn)制品中，菌落總數(shù)檢測(cè)膠膜雖然檢測(cè)范圍寬，但不少菌在其上擴(kuò)散性強(qiáng)，不能很好地形成菌落，因此會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果的可靠性；細(xì)菌、霉菌和大腸菌群檢驗(yàn)紙片大都是采用濾紙作為載體，由于細(xì)菌及霉菌孢子和酵母細(xì)胞均較小，因此容易導(dǎo)致它們可在濾紙不同深度生長(zhǎng)，而無法計(jì)數(shù)；另外，一些具鞭毛或運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)的細(xì)菌，可沿著濾紙纖維的孔隙擴(kuò)散開來，使菌落模糊不清，有時(shí)甚至擴(kuò)散至整塊紙片而無法計(jì)數(shù)；而由微孔濾膜和營(yíng)養(yǎng)襯墊粘聯(lián)而成的細(xì)菌檢驗(yàn)卡，由于檢驗(yàn)卡的上下層需用化學(xué)粘結(jié)劑粘聯(lián)，制備較為繁瑣。上述的各類制品在使用時(shí)都需要無菌培養(yǎng)皿來配合，使用不方便，不利于進(jìn)行快速檢驗(yàn)。
本發(fā)明的目的在于克服目前微生物干片檢測(cè)產(chǎn)品中的明顯不足，能提供直接檢測(cè)液體或半固體樣品中細(xì)菌總數(shù)、真菌總數(shù)及大腸菌群數(shù)量，且準(zhǔn)確性與傳統(tǒng)方法無顯著差異的新型細(xì)菌、真菌及大腸菌群計(jì)數(shù)卡，用于對(duì)食品、飲料、礦泉水、飲用純水、自來水及藥品中的細(xì)菌總數(shù)、真菌總數(shù)及大腸菌群數(shù)量的快速測(cè)定，并大大提高檢測(cè)靈敏度。
本發(fā)明中所提供的細(xì)菌、真菌及大腸菌群計(jì)數(shù)卡，由計(jì)數(shù)卡盒和放置于該計(jì)數(shù)卡盒底部的計(jì)數(shù)內(nèi)卡兩部分組成，所說的計(jì)數(shù)卡盒的底部平整，底部形狀與計(jì)數(shù)內(nèi)卡相配，所說的計(jì)數(shù)內(nèi)卡由下框架、上框架和夾在上、下框架之間的計(jì)數(shù)片構(gòu)成，所說的下框架的內(nèi)壁沿底部周邊具有一階梯式的突緣，所說的計(jì)數(shù)片架于所說的下框架的階梯突緣之上，沿該階梯突緣的內(nèi)邊緣下凹成淺平底皿狀，以使放置其中的待測(cè)液體樣品不外流為度，上框架將計(jì)數(shù)片的邊緣夾壓固定于下框架的突緣上，所說的計(jì)數(shù)片由上、下兩層材料構(gòu)成，其下層材料為濾紙，濾紙上吸附有滅菌后的液體培養(yǎng)基，上層材料為微孔濾膜。
所說的計(jì)數(shù)片上可印制計(jì)數(shù)格，以便于對(duì)生長(zhǎng)的菌落計(jì)數(shù)。
所說的計(jì)數(shù)片的上層材料可采用孔徑為0.2～1.0um的微孔濾膜。
所說的計(jì)數(shù)卡的下框架的高度一般為3～8mm，該下框架的階梯突緣高度為1～5mm。
所說的計(jì)數(shù)卡盒以及計(jì)數(shù)卡的上框架和下框架可由透明塑料制成。
所說的計(jì)數(shù)卡盒可根據(jù)需要設(shè)計(jì)成各種形狀，最好為圓形或方形。
上述所提及的被吸附于計(jì)數(shù)片的濾紙上的液體培養(yǎng)基，既可采用一般的液體培養(yǎng)基，也可采用具有抵抗防腐劑、消毒劑或臭氧干擾性能的液體培養(yǎng)基，例如由廣東省微生物研究所屬下廣東環(huán)凱微生物科技公司生產(chǎn)并已公開銷售的具有抵抗防腐劑、消毒劑或臭氧干擾性能的抗干擾液體培養(yǎng)基制品，如表1所列的十二個(gè)配方，這些液體培養(yǎng)基分別具有抵抗防腐劑、消毒劑或臭氧干擾的性能，在檢測(cè)含有抗防腐劑、消毒劑或臭氧等干擾物質(zhì)的樣品時(shí)，與普通計(jì)數(shù)卡相比，可大大提高檢測(cè)的靈敏度。表1為以廣東環(huán)凱微生物科技公司生產(chǎn)的十二個(gè)不同配方液體培養(yǎng)基和用量及所制成的計(jì)數(shù)卡表1 各種計(jì)數(shù)卡的培養(yǎng)基及用量
下面為本發(fā)明的細(xì)菌、真菌和大腸菌群計(jì)數(shù)卡的具體制備工藝步驟(1)、按設(shè)計(jì)尺寸制備計(jì)數(shù)卡盒以及計(jì)數(shù)內(nèi)卡的上框架和下框架，將構(gòu)成記數(shù)片的微孔濾膜和濾紙裁切成與下框架相配的尺寸；(2)、滅菌處理a、用鈷-60或環(huán)氧乙烷將計(jì)數(shù)卡盒以及計(jì)數(shù)內(nèi)卡的上框架和下框架進(jìn)行滅菌處理；b、用鈷-60或高溫蒸汽對(duì)濾紙片和微孔濾膜進(jìn)行滅菌處理；c、用高溫蒸汽或膜過濾對(duì)液體培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌；(3)、按滅菌濾紙所能吸附液體量的1-5倍量，把滅菌的濾紙加入到滅菌后的培養(yǎng)基中進(jìn)行吸附，或把滅菌后的培養(yǎng)基加入到滅菌的濾紙中；(4)、取出已充分吸附培養(yǎng)基的濾紙，置于下框架的階梯突緣上，再在濾紙上貼附上滅菌的微孔濾膜形成計(jì)數(shù)片，然后壓裝上框架把計(jì)數(shù)片固定在下框架的階梯突緣上，再將計(jì)數(shù)片沿所說的下框架的階梯突緣的內(nèi)邊緣下壓成淺平底皿狀，即成計(jì)數(shù)內(nèi)卡；
(5)、把計(jì)數(shù)內(nèi)卡置35-100℃的烘箱內(nèi)干燥0.5-3.0小時(shí)；(6)、把干燥的計(jì)數(shù)內(nèi)卡置于計(jì)數(shù)卡盒的底部，蓋上塑料盒蓋，即得本發(fā)明產(chǎn)品。
本發(fā)明較好地解決了國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有細(xì)菌、真菌及大腸菌群檢驗(yàn)干片產(chǎn)品存在的主要問題，計(jì)數(shù)卡均采用底部四周有一定凹度的塑盒一體化裝置，不必與無菌培養(yǎng)皿配合，可方便加樣并進(jìn)行快速檢測(cè)，使細(xì)菌和大腸菌群減少菌落擴(kuò)散程度，并使真菌生長(zhǎng)良好，便于計(jì)數(shù)。此外，可制成抗防腐劑型、抗消毒劑型及抗臭氧型計(jì)數(shù)卡以分別消除防腐劑山梨酸及山梨酸鉀、苯甲酸及苯甲酸鈉，消毒劑二氧化氯、過氧乙酸、次氯酸鈉及過氧化氫和臭氧及余氯的干擾(表2)，在檢測(cè)含有干擾物質(zhì)的樣品時(shí)，與普通計(jì)數(shù)卡相比，可大大提高檢測(cè)的靈敏度。
表2 抗干擾計(jì)數(shù)卡可以消除的干擾物質(zhì)及其濃度


圖1為本發(fā)明一實(shí)施例的正視圖；圖2為
圖1的側(cè)視圖；圖3為
圖1的A-A向剖視圖；圖4為
圖1中的計(jì)數(shù)內(nèi)卡的正視圖；圖5為圖4的B-B向剖視圖。
以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步的詳細(xì)說明實(shí)施例一本細(xì)菌、真菌及大腸菌群抗干擾計(jì)數(shù)卡由計(jì)數(shù)卡盒1和放置于該計(jì)數(shù)卡盒底部的計(jì)數(shù)內(nèi)卡2兩部分組成，計(jì)數(shù)卡盒1由盒體11和盒蓋12構(gòu)成，一個(gè)計(jì)數(shù)卡盒1內(nèi)裝兩個(gè)相同的方形計(jì)數(shù)內(nèi)卡2，計(jì)數(shù)內(nèi)卡2包括一方形的下框架22和一方形的上框架23，形成淺平底皿狀的計(jì)數(shù)片21夾在上、下框架之間，上框(23將計(jì)數(shù)片21的邊緣夾壓固定于下框架22的階梯突緣上，計(jì)數(shù)片21由上、下兩層材料構(gòu)成，其下層材料為濾紙，濾紙上吸附有滅菌后的液體培養(yǎng)基，上層材料為孔徑微孔濾膜，其上印制有計(jì)數(shù)方格。
本計(jì)數(shù)卡的制備方法如下1、選用聚苯乙烯作為計(jì)數(shù)卡盒1和計(jì)數(shù)卡2上、下框架材料，計(jì)數(shù)卡盒的尺寸大小為88×44×15 mm，該計(jì)數(shù)卡盒的壁厚為2mm，分成左右兩隔，計(jì)數(shù)內(nèi)卡的下框架22和上框架23的尺寸大小分別為40×40×5mm與35×35×2mm，下框架的階梯突緣高度為2mm，上框架可套夾于下框架的內(nèi)框壁中，據(jù)此設(shè)計(jì)模具制作塑料計(jì)數(shù)卡盒和計(jì)數(shù)內(nèi)卡塑料框架；2、把按計(jì)數(shù)內(nèi)卡下框架大小裁好的濾紙片及微孔濾膜與塑料計(jì)數(shù)卡盒和塑料框架采用鈷-60進(jìn)行殺菌。
3、把不含氯化三苯甲基四氮唑(TTC)的各類液體培養(yǎng)基置于121℃，0.1MPa下滅菌15-20分鐘；TTC溶液則采用0.2μm微孔濾膜過濾滅菌，待培養(yǎng)基冷卻后，使用前加入其中即可。
4、在無菌條件下，按滅菌濾紙所能吸附液體量的3倍吸取上述滅菌后的液體培養(yǎng)基，然后把滅菌濾紙置于其中，吸附10分鐘后，置于已打開的計(jì)數(shù)內(nèi)卡塑料框下框上后，在濾紙上面放置濾膜，并合上上框。
5、置計(jì)數(shù)片于70℃的烘箱內(nèi)干燥2.0小時(shí)后，取出干燥的計(jì)數(shù)片置于滅菌塑料盒的底部，合上塑料蓋。
6、將包裝好的計(jì)數(shù)卡套上熱收縮膜后進(jìn)行熱收縮，然后裝入外包裝紙盒。
采用上述計(jì)數(shù)卡進(jìn)行細(xì)菌、真菌及大腸菌群的計(jì)數(shù)方法如下1、把固體樣品加入滅菌生理鹽水中溶解或制成半固體樣品，液體樣品可直接進(jìn)行檢測(cè)，無需對(duì)樣品進(jìn)行處理。
2、在超凈工作臺(tái)上打開實(shí)施例一生產(chǎn)的計(jì)數(shù)卡后，吸取1mL樣品，加入到計(jì)數(shù)卡膜的中央，然后合上塑料盒蓋，5分鐘后待膜上的液體全部被下層的濾紙吸干，倒置計(jì)數(shù)卡。
3、把細(xì)菌及大腸菌群計(jì)數(shù)卡置35-37℃培養(yǎng)24-36小時(shí)，真菌計(jì)數(shù)卡置30-32℃培養(yǎng)36-48小時(shí)后，觀察計(jì)數(shù)。
4、在細(xì)菌及大腸菌群計(jì)數(shù)卡上顯紅色并有明顯突起的數(shù)量分別為細(xì)菌及大腸菌群數(shù)。真菌計(jì)數(shù)卡上有霉點(diǎn)或絲狀的數(shù)量則為霉菌數(shù)，有類似細(xì)菌的突起菌落數(shù)則為酵母菌數(shù)。
5、計(jì)數(shù)卡適合的計(jì)數(shù)菌數(shù)小于200cfu/mL，如超過則需采用無菌生理鹽水稀釋后再計(jì)數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌、真菌及大腸菌群計(jì)數(shù)卡，其特征在于由計(jì)數(shù)卡盒(1)和放置于該計(jì)數(shù)卡盒底部的計(jì)數(shù)內(nèi)卡(2)兩部分組成，所說的計(jì)數(shù)卡盒(1)的底部平整，底部形狀與計(jì)數(shù)卡(2)相配，所說的計(jì)數(shù)內(nèi)卡(2)由下框架(22)、上框架(23)和夾在上、下框架之間的計(jì)數(shù)片(21)構(gòu)成，所說的下框架(22)的內(nèi)壁沿底部周邊具有一階梯式的突緣，所說的計(jì)數(shù)片(21)架于所說的下框架(22)的階梯突緣之上，沿該階梯突緣的內(nèi)邊緣下凹成淺平底皿狀，上框架(23)將計(jì)數(shù)片(21)的邊緣夾壓固定于下框架(22)的突緣上，所說的計(jì)數(shù)片(21)由上、下兩層材料構(gòu)成，其下層材料為濾紙，濾紙上吸附有滅菌后的液體培養(yǎng)基，上層材料為微孔濾膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的計(jì)數(shù)卡，其特征在于所說的計(jì)數(shù)片(21)上印有計(jì)數(shù)格。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的計(jì)數(shù)卡，其特征在于所說的計(jì)數(shù)片(21)的上層材料微孔濾膜的孔徑為0.2～1.0um。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的計(jì)數(shù)卡，其特征在于所說的計(jì)數(shù)內(nèi)卡(2)的下框架(22)的高度為3～8mm，該下框架的階梯突緣高度為1～5mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的計(jì)數(shù)卡，其特征在于所說的計(jì)數(shù)卡盒(1)以及計(jì)數(shù)內(nèi)卡(2)的上框架(23)和下框架(22)由透明塑料制成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的計(jì)數(shù)卡，其特征在于所說的計(jì)數(shù)卡盒(1)為圓形或方形。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的計(jì)數(shù)卡，其特征在于所說的計(jì)數(shù)片(21)上的濾紙所吸附的液體培養(yǎng)基為廣東環(huán)凱微生物科技公司所生產(chǎn)的抗干擾液體培養(yǎng)基制品。
8.一種權(quán)利要求1所述的細(xì)菌、真菌及大腸菌群計(jì)數(shù)卡的制備方法，其特征在于制備步驟如下(1)、按設(shè)計(jì)尺寸制備計(jì)數(shù)卡盒(1)以及計(jì)數(shù)內(nèi)卡(2)的上框架(23)和下框架(22)，將構(gòu)成計(jì)數(shù)片的微孔濾膜和濾紙裁切成與下框架相配的尺寸；(2)、滅菌處理a、用鈷-60或環(huán)氧乙烷將計(jì)數(shù)卡盒(1)以及計(jì)數(shù)內(nèi)卡(2)的上框架(23)和下框架(22)進(jìn)行滅菌處理；b、用鈷-60或高溫蒸汽對(duì)濾紙片和微孔濾膜進(jìn)行滅菌處理；c、用高溫蒸汽或膜過濾對(duì)液體培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌；(3)、按滅菌濾紙所能吸附液體量的1-5倍量，把滅菌的濾紙加入到滅菌后的培養(yǎng)基中進(jìn)行吸附，或把滅菌后的培養(yǎng)基加入到滅菌的濾紙中；(4)、取出已充分吸附培養(yǎng)基的濾紙，置于下框架(22)的階梯突緣上，再在濾紙上貼附上滅菌的微孔濾膜形成計(jì)數(shù)片(21)，然后壓裝上框架(23)把計(jì)數(shù)片固定在下框架的階梯突緣上，再將計(jì)數(shù)片(21)沿所說的下框架的階梯突緣的內(nèi)邊緣下壓成淺平底皿狀，即成計(jì)數(shù)內(nèi)卡(2)；(5)、把計(jì)數(shù)內(nèi)卡(2)置35-100℃的烘箱內(nèi)干燥0.5-3.0小時(shí)；(6)、把干燥的計(jì)數(shù)內(nèi)卡(2)置于計(jì)數(shù)卡盒的底部，蓋上塑料盒蓋，即得本發(fā)明產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種細(xì)菌、真菌及大腸菌群計(jì)數(shù)卡及其制備方法,該計(jì)數(shù)卡由計(jì)數(shù)卡盒和放置于該計(jì)數(shù)卡盒底部的計(jì)數(shù)內(nèi)卡兩部分組成,計(jì)數(shù)內(nèi)卡由下框架、上框架和夾在上、下框架之間的計(jì)數(shù)片構(gòu)成,由上層材料微孔濾膜和吸附有滅菌液體培養(yǎng)基的下層材料濾紙構(gòu)成的計(jì)數(shù)片下凹成淺平底皿狀。本計(jì)數(shù)卡可用于對(duì)食品、飲料、礦泉水、飲用純水、自來水及藥品中的細(xì)菌總數(shù)、真菌總數(shù)及大腸菌群數(shù)量的快速測(cè)定,并大大提高檢測(cè)靈敏度。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK1376800SQ0110766
公開日2002年10月30日 申請(qǐng)日期2001年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月23日
發(fā)明者吳清平, 蔡芷荷, 張菊梅, 鄒黎明 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所