專利名稱：人SP－A1在pichia pastoris中的表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種DNA的重組技術，特別是涉及人肺表面活性物質相關蛋白人SP-A1在Pichia pastoris中的表達。
肺表面活性物質(pulmonary surfactant，PS)是肺II型細胞合成、分泌的一種脂蛋白復合物，其主要功能是降低肺泡表面張力，保持肺泡擴張，防止肺萎陷，維持正常呼吸生理活動，該復合物由磷脂和蛋白質組成，其中90％為磷脂，以二棕櫚酰卵磷脂(DPPC)和磷脂酰甘油(PG)為主，8～10％為肺表面活性物質相關蛋白(surfactant-associated protein，SP)，分為SP-A、SP-B、SP-C和SP-D等，以SP-A含量最為豐富，約占總蛋白量的50％。SP-A是一種多功能糖蛋白，在調節(jié)肺表面活性物質的代謝、SP基因表達、肺內免疫及炎癥反應方面具有十分重要的作用。
SP-A是一種親水糖蛋白，單體分子量大約為32Ku，可因其糖基化數(shù)目不同，波動在28～36Ku之間，等電點pH4～5。單體SP-A分為4個不連續(xù)的區(qū)域短的氨基端球狀結構區(qū)、富含羥基脯氨酸的膠原樣區(qū)(CLR)、與磷脂結合的疏水區(qū)和羧基凝集素糖識別區(qū)(CRD)。人類SP-A基因位于第10號染色體長臂中部，SP-A基因全長約5kb，含有7個外顯子，其中4個外顯子的部分或全部為編碼序列。SP-A基因包含著一個基因家族—SP-AI、II和偽基因，與兩個功能基因相對應的cDNA為6A和1A，兩者在核酸水平有94％的同源性，在氨基酸水平有96％的同源性，非常相似。每一個功能基因都編碼一種SP-A蛋白前體，分子量約為200～250Ku，需經一系列翻譯后修飾得到唾液酸糖蛋白。成熟的人SP-A肽鏈有2型(SP-AI、SP-AII)，兩者同源性達96％，僅有6個氨基酸殘基不同。SP-AI與SP-AII以2∶1的比例纏繞成一個亞基，6個三螺旋結構亞基又通過共價鍵和非共價鍵連接在一起，形成一個分子量約為700Ku的具有生物活性的大分子。在肺泡內表面，SP-A多以18聚體的形式存在，呈一束花狀，主莖由膠原樣區(qū)構成，花葉則是植物凝集素樣區(qū)。
臨床所使用的SP-A均為動物肺組織或人羊水提取物，由于提取工藝的不完善，水溶性SP-A大量丟失，制約了PS的功能及SP-A的應用。另一方面，由于蛋白質的免疫原性，SP-A藥品不能象PS磷脂組分一樣由動物肺組織提取，由人肺組織和羊水提取也在數(shù)量和倫理上明顯受限。
迄今為止，所有在原核細胞表達系統(tǒng)表達活性SP-A的努力均告失敗，在哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達非人SP-A的研究雖有成功的報導，但尚無人SP-A的基因工程產品報道。
本發(fā)明的目的是利用真核表達系統(tǒng)Pichia pastoris生產大量、高活性的人SP-A1。
本發(fā)明中的人SP-A1基因是根據(jù)論文“肺表面活性物質結合蛋白AcDNA克隆及序列分析”中所記載的內容克隆得到的，該文獻源自《中華兒科》雜志2000，38(3)，P153。
本發(fā)明中的表達載體為pPIC9K，也可以是相應酵母胞內及分泌表達載體。
本發(fā)明中的宿主細胞為Pichia pastoris。
本發(fā)明首先將人SP-A1基因克隆至表達載體中，通過電擊轉化技術轉入P.pastoris，并從轉化菌株中篩選出多拷貝轉化子，用高表達的甲醇氧化酶1基因(AOX1)啟動子、可利用甲醇作為唯一碳源誘導對重組P.pastoris進行表達。其具體步驟為1.人SP-A1基因克隆。
2.通過轉化、質粒抽提、酶切等方法篩選重組的陽性克隆，并進行序列分析。
3.表達載體的構建及序列測定，以保證翻譯讀框的正確。
4.基因整合的鑒定。
5.表達產物的鑒定。
6.表達產物的活性測定。
由于本發(fā)明采用甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)，因此，具有如下優(yōu)點(1)應用AOX啟動子，轉錄效率高，易于誘發(fā)調控；(2)表達質粒易于整合到基因組，不易丟失，適于高密度發(fā)酵，產量高；(3)表達產物分揀進入過氧化物酶體等有利于純化；(4)能進行翻譯時/后的修飾。
通過對表達產物的鑒定可知，人SP-A1在P.Pastoris中成功地獲得表達，而且表達的目的蛋白質能對巨噬細胞殺傷病原體發(fā)揮調理作用。
下面將結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖1是pPIC9K/SP-A1和pPIC9K的限制性酶切圖。
圖2是pPIC9K/SP-A1和pPIC9K的PCR。
圖3是克隆至T載體用T7和SP6引物測序圖。
圖4是SP-A1在Saccharomyces cerevisiae S-78及Pichia pastoris GS115中的表達12％SDS-PAGE。
圖5是SP-A1經HPLC純化的目的峰。
圖6是SP-A1的Western雜交檢測。
圖7是SP-A調理肺巨噬細胞對大腸桿菌J5的殺傷率。
實施例本實施例中所涉及的質粒pPIC9K、酵母菌株Pichia postoris GS115、KM71、SMD1168、GS115 Albumin、GS115 β-Gal均購自Invitrogen公司。
本實施例中所涉及的用于擴增目的基因SP-A和鑒定轉化子的PCR引物由上海生工生物有限公司合成。
本實施例中所涉及的主要酶類及試劑包括DNA限制內切酶、T4DNA連接酶、Taq酶購自大連寶生物工程有限公司和華美生物有限公司，酵母裂解酶、G418、玻璃珠購自Sigma公司。
本實施例的操作步驟如下1.培養(yǎng)基YPD、MGY、MGYH、RD、RDH、RDB、RDHB、MD、MDH、MM、MMH、BMG、BMM、BMGY、BMMY所需試劑均為市售，其濃度按說明配制。
2.SP-A1基因表達載體的構建 設計擴增引物(+)5’-GATACGTAATGTGGCTGTGCCCTCTG-3’(-)5’-GCGGAATTCGAACTCACAGATGGTCAG-3’用重組質粒pUC19/SP-A1作為模板擴增人SP-A1基因，PCR產物用SnaB I和EcoR I酶切后純化目的片段與相同酶切的pPIC9K連接，構建pPIC9K/SP-A1。
3.E.coli JM109感受態(tài)的制作及轉化在平板挑取E.coli JM109或TOP10F’單菌落于2ml的LB中，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)10～12小時，取0.5ml種子液接種于50ml的LB中，37℃，250rpm培養(yǎng)至A600為0.6，約需1.5～2.0h；置培養(yǎng)物于冰上10min，移入50ml離心管中，4℃，4000rpm離心5min；棄上清，加入15ml濃度為0.1mol/L的預冷(4℃)CaCl2懸浮細胞，冰浴30min；4000rpm，4℃離心10min回收細胞，棄上清，加入2ml預冷CaCl2懸浮細胞，冰浴備用；取100μl感受態(tài)細胞，加入10μl連接液，混勻，冰浴30min；42℃熱休克90秒，迅速放回冰中2min，加入500μl LB培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)1h；取150μl培養(yǎng)液涂布于含氨芐青霉素50～100μg/ml的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)12小時。篩選目的重組子，其中含重組質粒pPIC9K/SP-A1。
4.重組質粒的鑒定在含氨芐青霉素100μg/ml的LB平板挑取單菌落置于含氨芐青霉素50-100μg/ml的LB中，振蕩培養(yǎng)10～12小時；按常規(guī)堿裂解方法或純化試劑盒提取質粒；用限制性內切酶SnaB I和EcoR I進行酶切鑒定；酶切正確的質粒用α因子引物(+)5’TACTATTGCCAGCATTGCTGC3’(-)5’CAAATGGCATTCTGACATCC3’擴增，進行序列分析，確保讀框及序列正確。
5.質粒的準備將正確構建的重組質粒pPIC9K/SP-A1及親本質粒pPIC9K在大腸桿菌JM109或TOP10F’中擴增，用質粒抽提試劑盒提取所需的質粒，然后用Sal I進行限制性酶切，使之完全線性化，0.8％瓊脂糖電泳后用膠回收試劑盒回收線性化質粒溶于1×TE中。
6.酵母菌株的轉化分別挑取P.pastoris GS115、SMD1168和KM71單菌落，接種于5ml的YPD置于50ml三角瓶中，30℃培養(yǎng)10小時，取50～100μl接種于50mlYPD中，振蕩培養(yǎng)16小時至A600＝1.3～1.5；4℃離心1500g×5min，沉淀用50ml預冷的滅菌ddH2O重懸；同前離心，沉淀用25ml預冷的滅菌ddH2O重懸；同前離心，沉淀用5ml預冷的1M山梨醇重懸；同前離心，沉淀用1.5ml預冷的1M山梨醇重懸備用；將酵母感受態(tài)細胞分裝為80μl/份；5～20μg的線性化DNA加入感受態(tài)酵母菌株中，轉移至0.2cm的電極杯，置冰上5分鐘；用Bio-Rad GenePulser進行電擊轉化，其參數(shù)為1500V、25μF、400Ω，立即加入預冷的1M山梨醇1ml，200～600μl/份涂MD和RDB選擇平板，置28℃培養(yǎng)48h至轉化子出現(xiàn)。
7.多拷貝整合事件的篩選(1)采用無菌操作技術在96孔培養(yǎng)板的每孔加入200μl YPD，每孔接種一個轉化子，并使菌體懸浮于YPD培養(yǎng)基中，置于30℃培養(yǎng)2天；(2)分別取種子液10μl接種于另一96孔培養(yǎng)板各含有200μl YPD相應的培養(yǎng)孔，30℃培養(yǎng)1天；(3)重復步驟(2)一次；(4)取10μl接種于含G418終濃度分別為0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0mg/ml的YPD或MD固體培養(yǎng)板，待液體完全吸附后，置30℃培養(yǎng)，于接種后2，3，4，5天觀察生長菌落，抗性越高，整合的拷貝數(shù)越多。
8.篩選GS115His+Mut+/His+Muts表型用Sal I線性化質粒轉化GS115或SMD1168菌株，產生的重組菌株可以存在兩種表型His+Mut+/His+Muts表型，用GS115 Albumin和GS115β-Gal分別作為His+Muts、His+Mut+的對照，而KM71僅有His+Muts表型。
(1)挑取在MD或RDB平板上的單菌落分別依次接種在MM和MD平板上，以GS115/β-Gal和GS115/Albumin作為對照。30℃培養(yǎng)36～48小時。
(2)根據(jù)菌落在MM和MD生長的速度不同判斷其表型，MM和MD平板生長良好為His+Mut+表型，MD平板生長良好而MM平板生長緩慢或不生長為His+Muts表型。
9.酵母總DNA的提取將培養(yǎng)16小時的培養(yǎng)液(重組菌和親本GS115、KM71、SMD1168)1.5ml移至Eppendorf管，離心30秒，棄上清；沉淀中加入45μl裂解酶緩沖液重懸，加入5μl酵母裂解酶，振蕩后于37℃孵化1h，不時進行振蕩；加入10μl蛋白酶K，振蕩數(shù)秒，55℃孵化15min，不時振蕩；加入5μl RNase A，常溫下放置15min；加入500μl抽提液，振蕩，常溫下放置10min，不時振蕩；離心，12000～16000r/min×2min，沉淀細胞脆片，將上清移入GFX柱中，5000g×1min倒掉收集管中液體，重新將吸附柱放至收集管中，加入500μl抽提液，8000r/min×1min倒掉收集管中液體，加入500μl洗滌溶液，12000～16000r/min×3min；移去收集管，將吸附柱放至無菌Eppendorf管中，加入200μl的洗脫緩沖液或滅菌ddH2O，室溫放置1min；8000r/min×1min，收集純化的DNA，0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
10.酵母整合的PCR分析設計如下反應體系10×PCR buffer 5μlGenomic DNA(～1μg)5μl100mM dNTP(25mM each) 1μl5’AOX1 Primer(0.1μg/μl) μl3’AOX1 Primer(0.1μg/μl) μlTaq Polymerase(5U/μl) 0.25μlddH2O加至總體積為50μl重組質粒作為陽性對照，相應的空質粒作為另一個對照，其熱循環(huán)參數(shù)如表1所示。
表1 熱循環(huán)參數(shù)步驟溫度時間循環(huán)數(shù)Hot Start 94℃2min 1Denaturation 94℃1minAnnealing 55℃1min25Extension 72℃1minFinal Extension72℃7min 1取10μl樣品進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳。
11.重組P.pastoris的表達挑取His+Mut+單菌落，置于盛有25ml的BMG的250ml搖瓶中，28℃、250r/min培養(yǎng)至A600＝2～6(約16～18h)，常溫下1500～3000g×5min離心沉淀菌體，去上清，用BMMY重懸菌體至A600＝1.0(約200ml)，置于1000ml的搖瓶中96h，分別于0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取樣1ml，離心取上清儲存-80℃待進一步電泳分析。每24h加100％甲醇至培養(yǎng)基中使終濃度為0.5％，維持誘導表達。
12.SDS-PAGE分析取各個時間點的樣品融化并置于冰上，旋轉蒸發(fā)或超濾濃縮樣品至原體積的1/5～1/10，等體積加入電泳上樣緩沖液，煮沸10min，上樣進行12％SDS-PAGE電泳。余樣品置于-20℃?zhèn)溆?，上清置?80℃留待進一步分析。
13.SP-A1在P.pastoris中的表達及產物純化上述表達獲得的上清經旋轉蒸發(fā)(冷凍干燥SentryTMVirTis公司)濃縮至1/5～1/10，以固體Tris調pH至6.5離心除去沉淀的雜蛋白后，經Sephadex G-25層析柱分批脫鹽，收集蛋白洗脫液(約25ml)，經Sepharose 4B和Sephadex G-75層析。
14.高效液相色譜(HPLC)純化產物經C-8柱純化，用乙晴和水洗脫，于20min處得到蛋白峰。
15.Western雜交接常規(guī)方法處理蛋白質樣品并進行SDS-PAGE；電泳完成后，拆卸凝膠夾層，去除積層膠。以適量的轉移緩沖液室溫平衡凝膠30min.；準備硝酸纖維素膜(NC膜)，按凝膠大小但比凝膠大約1mm，成45°角慢慢將凝膠放入蒸餾水中，水將會滲入膜中并濕潤整個表面。然后在轉移緩沖液中平衡10～15min；在塑料轉移盒的底邊，依次將下面物品組裝轉印夾層海綿、數(shù)張剪切得如凝膠大小的濾紙，并預先以轉移緩沖液濕潤凝膠、NC膜、數(shù)張已濕潤的濾紙、海綿，組裝過程注意排除所有氣泡；往轉移槽中加入轉移緩沖液，按正確的極性方向將轉移盒放進電轉儀中，連接電源；在冷卻條件下100V電轉移30～60min，拆卸轉印裝置，取出NC膜，并在膜上剪一小角作為標記；凝膠用考馬斯亮藍染色以確定轉移效率；將膜放入可熱密封的塑料袋，加5ml封閉液，密封塑料袋，在旋轉搖床或擺動平臺中搖動30～60min；用封閉液稀釋鼠抗人SP-A(1∶3000)；傾去封阻液，加入稀釋的第一抗體，4℃過夜；帶著手套從塑料袋中取出NC膜，放在塑料盒中搖動，用20ml PBST洗滌4次，每次10～15min；用PBS稀釋HRP標記羊抗鼠IgG(1∶5000)；將NC膜放進新的塑料袋子，37℃ 1h，取出NC膜，室溫下以PBS洗膜15min去除過量的磷酸鹽和Tween20；將膜放入發(fā)色底物顯色液，條帶在10～30min內出現(xiàn)；用蒸餾水洗膜，終止反應，晾干后拍照或直接拍照。
16.SP-A1的調理作用(1)鼠巨噬細胞的分離肺巨噬細胞按文獻Journal of Infectiousdiseases 1995；172(2)P481中報道的方法由無特殊病原體的雄性大鼠中分離，重懸在A緩沖液，該緩沖液的組成為140mM NaCl、5mM KCl、2.5mMNa2PO4、10mM HEPES、2mM MgSO4、6mM葡萄糖、2mM CaCl2、0.1％明膠(wt/vol)，pH為7.4。懸液中肺巨噬細胞終濃度為107細胞/ml。
(2)SP-A的準備天然豬SP-A和重組的SP-A1(釀酒酵母P1和P.pastoris P2)溶解于5mM HEPES，pH為7.4，分成若干份保存于-70℃?zhèn)溆谩?br> (3)細菌培養(yǎng)E.coli J5分別培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，常溫下離心，3000g×2min收集細菌，用A緩沖液洗滌3次，離心，2500g×10min，A緩沖液重懸，熒光分光光度計測定使其終濃度為5×108cfu/ml。
(4)細菌殺傷實驗在有或無SP-A和/或肺巨噬細胞存在時，實驗其吞噬殺傷活性。采用細菌/巨噬細胞比為1∶1，保證細菌被有效地攝取，不同劑量SP-A加入至混合液中，終體積為200μl，輕度晃動，37℃孵化30min，加入預冷的ddH2O中止吞噬和殺傷作用，用等體積的LB稀釋后涂瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜，計數(shù)克隆。三、結果1.pPIC9K/SP-A1重組表達載體的鑒定用SnaB I和EcoR I限制性酶切分析發(fā)現(xiàn)可切出目的片段，如
圖1所示，
圖1中的1為DNAMarkers，2、3為pPIC9K，4、5為pPIC9K/SP-A1。重組質粒及親本質粒經α因子引物擴增分別得到936bp和188bp的片段，如圖2所示，圖2中的1～3為pPIC9K/SP-A1，4為Markers，5～6為pPIC9K?？寺≈罷載體用T7和SP6引物測序結果，序列及讀框完全正確，如圖3所示，由此說明已成功構建pPIC9K/SP-A1表達載體。
2.酵母轉化結果用Sal I線性化質粒轉化的GS115，其表型為HIS4Mut+有167個菌落，表型為HIS4+Muts有28個菌落，二者之比約6∶1，可見所獲得的轉化子絕大部分是利用AOX1啟動子的快速生長型。轉化SMD1168獲得類似的結果。G418濃度為3.0mg/ml時宿主為GS115、SMD1168和KM71的轉化子分別有23、18、21個。
3.SP-A1在P.pastoris中的誘導表達重組菌株在甲醇濃度為0.1～1.0％(g/ml)時表達，甲醇濃度0.5％時誘導表達效果最佳，培養(yǎng)72h，蛋白質達到最大表達量，即150mg/L，不同菌株其表達量范圍為0mg/L～150mg/L。SP-A1在Saccharomyces cerevisiaeS-78及Pichia postoris GS115中的表達12％SDS-PAGE如圖4所示，其中，1為Protein Markers，2為SP-A1(S-78)，3為SP-A1(GS115)。
4.產物的純化表達產物經Sephadex G-25、Sepharose 4B和SephadexG-75得到大小約為32kD的目的蛋白質。
5.HPLC純化后得到目的峰如圖5所示。
6.用抗SP-A的抗體進行Western雜交檢測利用ELISA方法分別檢測天然SP-A及基因表達產物的免疫原性，可見兩反應曲線的特征相似，都是典型的S型曲線，表明SP-A1的抗原特性與天然SP-A的相同，圖6所示為表達在Pichia pastoris中的SP-A1的Western雜交，其中，1為pPIC9K/GS115，2為pPIC9K-SP-A1/GS115。
7.SP-A的調理作用37℃孵化30min，觀察在有或無肺巨噬細胞和SP-A存在時細菌成活率，肺巨噬細胞單獨殺傷率為5.6％±2％，當加入SP-A時殺傷效率明顯增加，而SP-A本身對細菌無影響，SP-A調理肺巨噬細胞對大腸桿菌J5的殺傷率如圖7所示。
權利要求
1.人SP-A1在Pichia pastoris中的表達，其特征是將人SP-A1基因克隆至表達載體中，通過電擊轉化技術轉入P.pastoris，并從轉化菌株中篩選出多拷貝轉化子，用高表達的甲醇氧化酶1基因(AOX1)啟動子、利用甲醇作為唯一碳源誘導對重組P.pastoris進行表達。
2.根據(jù)權利要求1所述的人SP-A1在Pichia pastoris中的表達，其特征是在所述的人SP-A1基因表達載體的構建中，所設計的擴增引物為(+)5’-GATACGTAATGTGGCTGTGCCCTCTG-3’(-)5’-GCGGAATTCGAACTCACAGATGGTCAG-3’。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的人SP-A1在Pichia pastoris中的表達，其特征是所述的電擊轉化參數(shù)為1500V、25μF、400Ω。
4.根據(jù)權利要求1所述的人SP-A1在Pichia pastoris中的表達，其特征是所述的甲醇濃度為0.1～1.0％(g/ml)。
5.根據(jù)權利要求4所述的人SP-A1在Pichia pastoris中的表達，其特征是所述的甲醇濃度最佳值為0.5％(g/ml)，培養(yǎng)時間為72h。
全文摘要
本發(fā)明公開了人SP－Al在Pichia.pastoris中的表達,該方法將人SP－Al基因克隆至表達載體中,通過電擊轉化技術轉入Pichia.pastoris,并從轉化菌株中篩選出多拷貝轉化子,用高表達的甲醇氧化酶1基因(AOXl)啟動子、利用甲醇作為唯一碳源誘導對重組P.pastoris進行表達;在所述的誘導表達中,甲醇濃度為0.1～1.0%(g/ml)。本發(fā)明能生產大量、高活性的人SP－Al,其最大表達量可達150mg/L,而且所表達的目的蛋白質能對巨噬細胞殺傷病原體發(fā)揮調理作用。
文檔編號C12N15/12GK1372001SQ01107600
公開日2002年10月2日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權日2001年2月28日
發(fā)明者封志純, 蘭和魁 申請人:珠江醫(yī)院