專利名稱：一種植物維管束特異表達(dá)的Angrpl基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體的說，涉及一種新發(fā)現(xiàn)的DNA序列，它可以作為啟動(dòng)子調(diào)控目的基因特異表達(dá)于植物的維管束組織，包含該DNA序列與GUS報(bào)告基因的融合基因，攜帶該融合基因的植物表達(dá)載體pG6-121和pG6-Hpt，以及由此得到的組織特異性表達(dá)GUS基因的轉(zhuǎn)基因植物。
植物細(xì)胞壁蛋白由多種酶類和結(jié)構(gòu)蛋白組成。植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白在決定細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)、提供細(xì)胞壁伸縮性、滿足不同發(fā)育階段的細(xì)胞生長以及抗感染和損傷的防御作用方面有著重要意義，主要可分為Extensin，PRP，AGP，GRP四類1。
Extensins又稱HPRPs(Hydroxyproline-Rich Proteins)是一類富含羥脯氨酸的堿性糖蛋白，具有Ser-(Hyp)4五肽重復(fù)序列，其中的羥脯氨酸和絲氨酸通常被糖基化。PRPs(Proline-Rich Proteins)富含脯氨酸，具有Pro-Pro-Val-X-Y的重復(fù)序列，其脯氨酸殘基大約有50％被糖基化。AGP(Arabinogalactan Proteins)是一類可溶性的高度糖基化的蛋白質(zhì)，它的糖含量比Extensins更高(高達(dá)90％)，分子量變化較大，其糖基為D-半乳糖和L-阿拉伯糖。
GRPs(Glycine-Rich Proteins)是一類不含糖的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白，其甘氨酸含量可高達(dá)70％，前體蛋白N-端有信號(hào)肽序列使其定位在細(xì)胞壁上，成熟蛋白具有(Gly-X)n的重復(fù)單位，其中X多數(shù)仍為Gly，少數(shù)為Ala或Ser。這種重復(fù)序列構(gòu)成了規(guī)則的反向平行β-片層二級(jí)結(jié)構(gòu)，提供了維管發(fā)育時(shí)所需要的張力和彈力。GRPs也是一種植物防衛(wèi)蛋白，其酪氨酸殘基可引發(fā)分子的聚合反應(yīng)及糖分子的交聯(lián)，合成木質(zhì)素；它與另外兩種細(xì)胞壁蛋白(Extensins，PRPs)分別定位于植物器官的不同組織區(qū)域，形成立體的防御體系。當(dāng)植物組織受到損傷時(shí)，GRP還可能參與修復(fù)過程。
植物細(xì)胞壁GRP基因代表了一類小的多基因家族，其表達(dá)受到不同發(fā)育階段和多種外界壓力的誘導(dǎo)。機(jī)械損傷、真菌感染、病毒侵染、乙烯、脫落酸、生長素、水楊酸、升汞、水淹、干化、熱、冷等環(huán)境因素都可不同程度地影響GRP基因的表達(dá)。近年來，關(guān)于菜豆grp1.8基因、矮牽牛ptGRP1基因、擬南芥GRPs基因及水稻Osgrp1基因的表達(dá)定位及表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)一步表明，GRP基因的表達(dá)具有明顯的器官、組織和細(xì)胞特異性。菜豆和大豆中，GRP主要在即將木質(zhì)化和已經(jīng)木質(zhì)化的細(xì)胞和組織中表達(dá)2；水稻Osgrp1的基因表達(dá)則集中于幼莖，特別是正在發(fā)育的微管束和表皮部位3。對(duì)GRP基因表達(dá)調(diào)控元件的研究證明，決定微管束特異表達(dá)的順式調(diào)控元件位于該基因上游的啟動(dòng)子區(qū)域。例如，Keller等通過對(duì)菜豆grp1.8啟動(dòng)子的5′系列缺失分析，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)對(duì)莖維管組織特異和一個(gè)對(duì)根維管組織特異的正調(diào)控順式因子以及一個(gè)控制維管組織表達(dá)活性的負(fù)調(diào)控順式因子45。
如上所述，GRP基因?yàn)檠芯恐参锘虮磉_(dá)的組織特異性、發(fā)育階段特異性和響應(yīng)環(huán)境壓力的防御反應(yīng)提供了一個(gè)良好模式。植物組織特異性表達(dá)的研究，近年來成為植物分子生物學(xué)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域，特別是在植物基因工程的實(shí)用化階段中，為使目的基因在特定的組織部位和特定的發(fā)育階段優(yōu)先表達(dá)，更使之成為各國競相研究的熱點(diǎn)，但對(duì)控制植物維管束組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子的研究為數(shù)不多，與啟動(dòng)子中的順式調(diào)控元件相作用的反式轉(zhuǎn)錄因子的研究尚處于起步階段。迄今尚未見對(duì)水稻GRP基因啟動(dòng)子詳盡分析的報(bào)道。水稻GRP基因啟動(dòng)子包含了控制基因表達(dá)特異性的順式元件，對(duì)其進(jìn)行深入研究將有助于闡明基因表達(dá)的分子機(jī)制，并可為植物基因工程提供有用的調(diào)控元件，有著重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明的目的在于提供一種新的水稻GRP基因(Angrp1)的啟動(dòng)子序列，該序列中包含一個(gè)負(fù)調(diào)控區(qū)域和一個(gè)正調(diào)控區(qū)域，該序列中包含一個(gè)1021bp的基本啟動(dòng)子區(qū)域，能在轉(zhuǎn)基因植物中，具體的是在轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因水稻中指導(dǎo)GUS報(bào)告基因在維管組織特異表達(dá)。具有刺吸式口器的農(nóng)業(yè)害蟲(如蚜蟲、葉禪、稻飛虱等)都是從維管組織中吸食植物的汁液，嚴(yán)重危害作物的生長、發(fā)育和成熟，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。通過Angrp1基因啟動(dòng)子使抗蟲基因在作物的維管組織特異表達(dá)將能有針對(duì)性地、高效地防治此類害蟲，還可降低對(duì)害蟲的選擇壓，減輕植物表達(dá)抗蟲基因的代謝負(fù)擔(dān)。植物病毒在形成系統(tǒng)感染時(shí)，必須通過維管組織遠(yuǎn)程傳播，用Angrp1基因啟動(dòng)子使抗病毒基因在作物的維管組織特異表達(dá)將能有效地控制病毒病的發(fā)生和危害。
本發(fā)明基于從水稻黃矮病毒(RYSV)感染的矮腳南特(An)水稻cDNA文庫中用差示篩選法得到了Angrp1基因的cDNA克隆，并證明該基因是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的水稻細(xì)胞壁GRP基因6。從核苷酸序列推測(cè)，基因產(chǎn)物N端是23個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽序列，成熟蛋白含有66％的甘氨酸，具有(Gly-X)n的重復(fù)序列，屬于典型的植物細(xì)胞壁GRP。由cDNA序列為探針的Northern雜交分析表明，Angrp1基因在An水稻中的表達(dá)具有明顯的器官特異性和發(fā)育階段特異性，機(jī)械損傷和RYSV侵染也可明顯增強(qiáng)該基因的表達(dá)。這為進(jìn)一步的啟動(dòng)子功能片段分析提供了基礎(chǔ)。
本發(fā)明從An水稻基因組中克隆了Angrp1基因及其5′上游序列，并將其定位于水稻的第10號(hào)染色體上。在測(cè)定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過煙草瞬間表達(dá)體系分析了Angrp1基因5′上游序列的系列缺失片段驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的啟動(dòng)子活性，得到了一個(gè)正調(diào)控區(qū)域和一個(gè)負(fù)調(diào)控區(qū)域，并確定了1021bp的片段為其基本啟動(dòng)子區(qū)域。隨后本發(fā)明在轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因水稻中通過GUS組織化學(xué)染色證實(shí)，該基本啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)報(bào)告基因在維管組織特異表達(dá)。實(shí)施本發(fā)明的具體步驟如下以An水稻GRP的cDNA為探針，篩選An水稻的λ基因組文庫，得到一個(gè)含GRP基因(命名為Angrp1)的噬菌體克隆。將相關(guān)區(qū)域(一個(gè)3 kb的SalI酶切片段)克隆在pBlueScriptII SK(-)質(zhì)粒載體上(命名為pBS5111)，并對(duì)其進(jìn)行亞克隆和序列測(cè)定(

圖1)，結(jié)果分析見圖2。
將-568～+1的啟動(dòng)子片段制成探針，用窄葉青8和京系17的雜交DH群體進(jìn)行RFLP作圖，將Angrp1基因定位于水稻的第10號(hào)染色體上(圖3)。
對(duì)經(jīng)過損傷誘導(dǎo)的仔苗期An水稻總RNA作引物延伸實(shí)驗(yàn)，并對(duì)仔苗期莖葉部RNA做5′RACE實(shí)驗(yàn)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，該基因只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為A(圖4)，距推測(cè)的TATA box 25bp(圖2)。
將從pBS5111上擴(kuò)增出Angrp1基因啟動(dòng)子片段分別用不同限制酶消化或者用不同引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一系列5′缺失的啟動(dòng)子片段。將他們分別克隆到pBI221中，以取代原來的35S啟動(dòng)子，構(gòu)建成9個(gè)Angrp1基因5′系列缺失啟動(dòng)子與GUS基因的轉(zhuǎn)錄融合克隆(pG1-GUS～pG9-GUS，圖2)。
用煙草BY-2懸浮細(xì)胞建立原生質(zhì)體瞬間表達(dá)系統(tǒng)，用含35S啟動(dòng)子-熒光素酶(LUC)基因的參照質(zhì)粒pFFO分別和各測(cè)試質(zhì)粒(pGn-GUS或陽性對(duì)照pBI221)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，測(cè)定并校正裂解液的GUS活性(圖5)，結(jié)果表明G2-G5區(qū)(-2283～-1404)存在正調(diào)控序列，在G5～G6區(qū)(-1404～-1020)存在負(fù)調(diào)控序列。
將G6-GUS融合基因克隆到植物表達(dá)載體pBI121上，使得Angrp1基本啟動(dòng)子G6取代pBI121中的35S啟動(dòng)子，得到煙草轉(zhuǎn)化載體pG6-121(圖6)。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草K326，取PCR陽性轉(zhuǎn)基因植株的葉脈和莖進(jìn)行GUS染色分析。葉脈橫切片顯示染色部位主要在韌皮部(內(nèi)韌和外韌，圖7A)，莖的縱切片顯示染色部位主要是在內(nèi)韌皮部(圖7B)。
將G6-GUS融合基因克隆到改造后的水稻穩(wěn)定轉(zhuǎn)化載體p35S-Hpt-Nos上，構(gòu)建成帶潮霉素抗性基因的水稻轉(zhuǎn)化載體pG6-Hpt(圖8)，用基因槍法轉(zhuǎn)化中花一號(hào)水稻。對(duì)PCR檢測(cè)為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻植株的葉片進(jìn)行GUS組織染色(圖9A)，并作橫切面觀察(圖9B)。結(jié)果表明，染色部位主要在水稻葉片的維管束中。
以上結(jié)果表明，水稻Angrp1基因基本啟動(dòng)子G6(1021bp)在雙子葉植物煙草中和單子葉植物水稻中具有相類似的維管束組織表達(dá)特異性。
本發(fā)明申請(qǐng)人已于2001年5月將水稻Angrp1基因基本啟動(dòng)子G6融合報(bào)告基因GUS的質(zhì)粒pG6-Gus的大腸桿菌XL1Blue轉(zhuǎn)化子保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。保藏登記號(hào)為CGMCC No.××××。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述圖1.Angrp1基因的克隆、亞克隆和序列測(cè)定 Angrp1基因編碼區(qū)上游序列和3′非編碼區(qū)
Angrp1基因編碼區(qū) 篩選文庫所用的探針序列→用通用引物對(duì)亞克隆測(cè)序 用特異引物對(duì)亞克隆測(cè)序BBcl I，CCla I，HHind III，KKpn I，SSal I，SpSpe I，XXba I圖2.Angrp1基因的全序列以基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(見圖4)為+1對(duì)核苷酸進(jìn)行編號(hào)。在5′上游區(qū)，熱激蛋白因子結(jié)合序列(HS)用雙下劃線標(biāo)出；用于制備5′系列缺失啟動(dòng)子片段(G1-G9)的內(nèi)切酶(Sal I，Hind III，Spe I，Kpn I，Xba I)識(shí)別序列或PCR引物(F2，F(xiàn)3，F(xiàn)4)分別用下劃線或箭頭線標(biāo)出，基本啟動(dòng)子G6的序列用底紋標(biāo)出，推測(cè)的TATA box和CAAT box用框表示。
在基因編碼區(qū)，推測(cè)的氨基酸序列在密碼子下方列出，用于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)測(cè)定的引物F5和P2用箭頭線表示。圖3.Angrp1基因在水稻染色體上的定位左邊括號(hào)中為重組值(％)，左邊的數(shù)字為遺傳圖距(cM)，右邊為RFLP標(biāo)記，箭頭所示為Angrp1基因的位置。圖4.Angrp1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定(A)對(duì)損傷的仔苗期水稻RNA所作的引物F5延伸產(chǎn)物(W)的凝膠電泳圖。左邊(CTAG)為用同一引物對(duì)Angrp1基因所作的測(cè)序反應(yīng)，用以確定引物延伸產(chǎn)物的終止點(diǎn)。(B)引物F5和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)在Angrp1基因中的位置。圖5.Angrp1基因5′系列缺失啟動(dòng)子在煙草瞬間表達(dá)系統(tǒng)中的相對(duì)活性(A)5′系列缺失啟動(dòng)子與GUS轉(zhuǎn)錄融合克隆的構(gòu)建(B)煙草原生質(zhì)體瞬間表達(dá)系統(tǒng)中的GUS相對(duì)活性(％)F2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，GUS2PCR引物.
AAsp 718，BBamH I，HHind III，PPst I，SSal I，SpSpe I，
XXba I圖6.煙草穩(wěn)定表達(dá)載體pG6-121圖7.Angrp1基因啟動(dòng)子在煙草中的維管束特異表達(dá)(A)轉(zhuǎn)基因煙草葉柄的橫切面，(B)轉(zhuǎn)基因煙草莖的縱切面ip內(nèi)韌皮部，op外韌皮部，p髓部，x木質(zhì)部圖8.水稻穩(wěn)定表達(dá)載體pG6-Hpt圖9.Angrp1基因啟動(dòng)子在水稻中的維管束特異表達(dá)(A)轉(zhuǎn)基因水稻的葉片，(B)轉(zhuǎn)基因水稻葉片的橫切面，lv葉脈實(shí)施例1Angrp1基因的克隆、定位和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)確定1.Angrp1基因的克隆首先提取An水稻的基因組DNA將適量水稻葉片經(jīng)研磨(在液氮中)后轉(zhuǎn)入50ml離心管，加入15ml在65℃預(yù)熱的提取液(500mM NaCl，1.25％SDS，100mM Tris，pH8.0，5mM EDTA)，混勻后65℃保溫30分鐘；加入5ml 5M KAc，置于冰上20分鐘；加入等體積的氯仿并顛倒幾次混勻，4℃ 12,000rpm離心15分鐘；上清液轉(zhuǎn)移到新管，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻；將絮狀DNA移到新管中，用70％乙醇洗一次后晾干，用適量ddH2O溶解。
將An水稻的基因組DNA用Sau3A部分酶解，用試劑盒(Stratagene公司，Cat#400766)從瓊脂糖電泳膠中分離9-23kb的片段，在底物只加G和A的反應(yīng)液中用Klenow部分補(bǔ)齊后與λFixII/Xho I部分補(bǔ)齊載體(Stratagene公司試劑盒，Cat#248211)連接，按照試劑盒說明書操作，經(jīng)體外包裝得到一個(gè)滴度為3.5×105的基因組文庫。將矮腳南特水稻GRP的cDNA片段(圖1)用PCR摻入法制成探針，通過原位雜交篩選該基因組文庫，得到一個(gè)含GRP基因(命名為Angrp1)的噬菌體克隆λ5-1。
將λ5-1的一個(gè)3 kb的SalI酶切片段克隆在pBlueScriptII SK(-)質(zhì)粒載體上(命名為pBS5111)并按照?qǐng)D1所示對(duì)其進(jìn)行亞克隆和序列測(cè)定。序列測(cè)定的區(qū)域共3138bp，包括了2401bp的Angrp1基因上游序列、41bp的5′非編碼區(qū)、552bp的編碼區(qū)和138bp的3′非編碼區(qū)，連同Angrp1 cDNA中包含的3′非編碼區(qū)末端序列111bp，已知Angrp1基因序列共3249bp(圖2)。2.Angrp1基因在水稻染色體中的定位以Angrp1 cDNA片段(圖2)為探針對(duì)An水稻DNA Hind III酶解樣品作Southern雜交分析，證明該基因在基因組中是單拷貝的。進(jìn)一步將-568～+1啟動(dòng)子片段制成探針，分別與窄葉青8和京系17的基因組DNA的不同酶切樣品(BamH I，Bgl I，Dra I，EcoR I，Hind III，Sca I和Xba I)進(jìn)行雜交，結(jié)果表明用Hind III酶切時(shí)，它們之間具有多態(tài)性。因此將窄葉青8和京系17的DH群體(127個(gè))的基因組DNA用Hind I II酶切后用上述探針作Southern雜交，進(jìn)行基因定位。數(shù)據(jù)處理是利用Mapmaker軟件在MacintoshII計(jì)算機(jī)上進(jìn)行，先用Two point和Group命令進(jìn)行兩點(diǎn)分析得到Angrp1基因所在的連鎖群，然后用Compare命令做多點(diǎn)分析，最后用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換成圖距單位(cM)。結(jié)果將Angrp1基因定位于水稻的第10號(hào)染色體上(圖3)。3.Angrp1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定將引物F5(圖2，5′-CTAAGGAGGACAAGGATGGC-3′)的5′末端用T4-Kinase標(biāo)記32P后對(duì)經(jīng)過損傷誘導(dǎo)的仔苗期矮腳南特水稻總RNA作引物延伸實(shí)驗(yàn)將總RNA經(jīng)85℃變性5分鐘后取8.5μl(約40μg)加入到含32P-F5的延伸反應(yīng)混合物中，42℃退火30分鐘；然后加入dNTP混合物(每種10mM)1μl和AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μl，42℃延伸60分鐘；加入3MNaOH 2μl，42℃保溫20分鐘以降解RNA，用0.18M HCl 34μl中和并依次用苯酚和氯仿抽提，上清液用乙醇沉淀后重懸于8μl測(cè)序反應(yīng)終止液中；取2.5μl與同一引物F5對(duì)pBS5111的測(cè)序反應(yīng)一起電泳。結(jié)果表明，該基因只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為A，兩側(cè)為C(圖4)，距推測(cè)的TATA box 25bp(圖2)，符合真核生物基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的規(guī)律。
按Gibico-BRL公司5′-RACE試劑盒(Cat# 18382-010)說明書的方法，用引物P2(圖2，5′-ACGGATCCATAACCTAGGAGGGT-3′)對(duì)仔苗期莖葉部RNA所做的5′RACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果(未列出)與上述結(jié)果完全一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了Angrp1基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。實(shí)施例2Angrp1基因5′系列缺失啟動(dòng)子在煙草原生質(zhì)體中的活性1. 5′系列缺失啟動(dòng)子融合GUS質(zhì)粒的構(gòu)建首先用引物T3(圖1，5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′)和F2(圖2，5′-CTGGGATCCGTGGTTGGAGTGAAGGGGAG-3′)從pBS5111上擴(kuò)增出Angrp1基因2.4kb的啟動(dòng)子片段，然后分別用不同限制酶消化或者用不同引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)，得到一系列5′缺失的啟動(dòng)子片段。將他們分別克隆到pBI221中，以取代原來的35S啟動(dòng)子，構(gòu)建成9個(gè)Angrp1基因5′系列缺失啟動(dòng)子與GUS基因的轉(zhuǎn)錄融合克隆(pG1-GUS～pG9-GUS)，其啟動(dòng)子片段的5′起點(diǎn)分別為G1-2401，G2-2283，G3-2035，G4-1793，G5-1404，G6-1021，G7-941，G8-568，G9-182(圖2，圖5A)。2.原生質(zhì)體的制備將煙草BY-2懸浮細(xì)胞繼代3-5天后，離心收集細(xì)胞(4℃，100×g離心3分鐘，以下同)，用0.4M的甘露醇洗一遍；重懸于含1％纖維素酶和0.1％果膠酶的0.4M甘露醇中，30℃水浴1小時(shí)，其間每隔15分鐘輕搖一次并觀察細(xì)胞酶解情況；酶解液依次用100μm和60μm的篩網(wǎng)過濾，離心收集細(xì)胞；用W5溶液(154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，5mM蔗糖，pH5.9)洗三次，重懸于2-5ml W5中，4℃靜置2-6小時(shí)。3.PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)染離心收集細(xì)胞，重懸于MaMg溶液(0.4M甘露醇，15mM MgCl2，pH5.6)，調(diào)整原生質(zhì)體濃度至2×106個(gè)/ml；加0.3ml于已分裝有DNA(含35S啟動(dòng)子-LUC基因的參照質(zhì)粒pFFO和各測(cè)試質(zhì)粒即pGn-GUS或陽性對(duì)照pBI221)的離心管中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管以混勻；5分鐘后緩緩加入0.3ml PEG溶液(40％PEG4000，0.4mM甘露醇，0.1mM Ca(NO3)2，pH7.9)，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管以混勻，靜置15分鐘；逐滴加入W5溶液，5分鐘后離心收集細(xì)胞，重懸于5ml液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24小時(shí)；用PBS緩沖液(0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4，pH7.4)洗一次，離心收集細(xì)胞，重懸于0.3ml Promega細(xì)胞裂解液(Cat.# E1531)；于4℃，12,000rpm離心15分鐘，上清液用于LUC和GUS的活性測(cè)定。4.GUS活性的測(cè)定和校正首先測(cè)定GUS活性在0.5ml含1mM MUG的細(xì)胞裂解液(PromegaCat#E1531)中，加入20μl-50μl細(xì)胞提取液，37℃水浴30-60分鐘后，取100μl加到900μl 0.2M Na2CO3中，在Hoefer DyNA QuantTM儀器上測(cè)定GUS活性(以50nM的4-MU為標(biāo)準(zhǔn))。然后用Promega公司的熒光素酶分析試劑盒(Cat.#1500)測(cè)定LUC活性取5μl細(xì)胞提取液與50μl LUC反應(yīng)底物迅速混勻，立即置入液閃計(jì)數(shù)器(參數(shù)設(shè)為Tritium，windows0005-1024，30秒)記錄CPM及CLM％(化學(xué)發(fā)光百分?jǐn)?shù))。最后用FFO的LUC活性來校正各次測(cè)定的GUS活性，以得到各測(cè)試質(zhì)粒較為準(zhǔn)確的相對(duì)GUS活性，公式為GUSn＝GUS1×LUCn/LUC1。5.結(jié)果分析瞬間表達(dá)分析的結(jié)果表明(圖5)，Angrp1的9個(gè)5′系列缺失啟動(dòng)子在雙子葉植物煙草的原生質(zhì)體細(xì)胞中都有轉(zhuǎn)錄活性。其中，啟動(dòng)子片段G2的活性最高，約為35S啟動(dòng)子活性的兩倍。從G2到G5活性逐漸降低，但G6的活性高于G5，從G6到G9活性又不斷下降。這說明在G2-G5區(qū)(-2283～-1404)存在正調(diào)控序列，-1874～-1796區(qū)域的熱激蛋白因子結(jié)合區(qū)可能于正調(diào)控有關(guān)；在G5～G6區(qū)(-1404～-1020)存在負(fù)調(diào)控序列，-1321～-1109區(qū)域的三個(gè)反向重復(fù)序列可能與該區(qū)的負(fù)調(diào)控功能有關(guān)。我們選定G6(1021bp)啟動(dòng)子片段為Angrp1基本啟動(dòng)子，并作為主要研究對(duì)象做轉(zhuǎn)基因植物的分析。
G6啟動(dòng)子片段的序列如下-1021 ACTAGTATAT ATATTATTCC CTCCGTTTCA TAATGTAAGA CTTTCTAGCA TTGCTCATAT-961 TTATATAGAT GTTAATGAAT CTAGATGCAT ATATATGTCT AGATTTATTA ATATCTGTAT-901 GAATATGGGT AATATGCTAA AAAGACTTGC ATTATGAAAC GGAGGAAGTA TGTCGCCAGG-841 CTCACTTAAC ATGTTGGTCT AGATCGGTTT AAAATGCTGC ATTTAAGTCG GAATCAGATC-781 ATGTATACAT GTAACACAAT ACTGGTAAGC AGTAAGAAAT GCCCGATCTA GGGATGAAAA-721 AGAATAACTG AGATAATAAC TTACCATGCA ATTTTATTAT TGCACAAATT TAATTAACTG-661 TTTAGTTTGA TACTTGGCCT CATATATAGT ACGTAGTAAT TAATTAAACC ATCGATCTCA-601 CTAGGCTCCA ACTAGAAATC AGATCCACGT CTACTAGTAC AGATATGTGA TGAGCAGATA
-541 TAAGTGCATC TGCCACACAT CACTGAACCA GCACATGGAT CACATTAAGC ACGTCAATGT-481 ATGCTAATTA ATTGATTAAC TATACCATGC CTAATTGCTT AATTAGCAGC CAACGGTATT-421 CGATTGATCC CATTCGCCAA AACCGGCCGG AGTCGCTCTC ATGAAAACAG CCTCAGATGA-361 CCTTGAAGTA TGGACAGAAT ACAATAGCAA ACCGATCGAA TAATTCTATC TCTGCTTACA-301 TAAAAGCAAA AGCAAAAGTA AACACACACA CACACAAAGC AAAAACAATA AATCAGTATT-241 CTAAAAATAA ATCAGTAACA TCACCACACC GCTCTCCAAG TGTCAAAAAG AATTAAAGGA-181 CAACAGCTAC TGGCACTCTC CATGAACTCT CCTGGTCATC ATTTCACACC CATATACTGT-121 GTCCAAAGTC CAAAAGCTCT AACGTCTCTA GTTTTGGACC ATGCAGACTG ATGAACATCT-61 GATGAGATAG CCATACACGA GATGCACCCT ATAAATACCC CAGCTCCCCT TCACTCCAAC-1CAC實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因煙草中Angrp1啟動(dòng)子的維管束特異表達(dá)將植物表達(dá)載體pBI121用HindIII和EcoRI雙酶切，回收載體大片段；將pG6-GUS 也用HindIII和EcoRI雙酶切，回收G6-GUS片段，與載體片段連接得到pG6-121。其中，Angrp1基本啟動(dòng)子G6取代了pBI121中的35S啟動(dòng)子(圖6)。
將質(zhì)粒pG6-121電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草K326將無菌苗葉片切除邊緣和中脈后切成小塊，放入用倍的MS培養(yǎng)基稀釋20-40倍的農(nóng)桿菌過夜培養(yǎng)液中，約5分鐘后取出并用濾紙除去多余菌液，平鋪在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)兩天后轉(zhuǎn)于分化培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)3周左右再生芽長大，及時(shí)切出并轉(zhuǎn)于生根培養(yǎng)基上，大量根長出后可移栽于溫室。
再生苗用用CTAB法提取小量DNA在100μl CTAB提取液(100mMTris，pH8.0，1.4M NaCl，20mM EDTA，2％CTAB)中研磨約50mg的植物組織，補(bǔ)加400μl提取液，65℃水浴30分鐘。加500μl冷氯仿抽提，離心上清液加等體積冷的異丙醇混勻，離心沉淀物重懸于50μl TE，取1μl用作PCR底物。
用引物F4(圖2，5′-TTAGTCGACAACAGCTACTGGCACTC-3′)和GUS2(位于GUS基因ATG后450-469 bp的反向引物，5′-GGGATAGTCTGCCAGTTCA-3′)進(jìn)行PCR鑒定以確定轉(zhuǎn)基因植株。
轉(zhuǎn)基因植株移栽于溫室25天后，取葉脈和莖進(jìn)行GUS染色分析分別取轉(zhuǎn)基因植物的根莖葉(莖用刀片切出橫截面或縱切面)，浸入固定液(0.3％甲醛，10mM MES，0.3 M甘露醇)，抽真空3-5分鐘后室溫固定1小時(shí)；用50mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗三次，浸入含1mM X-Gluc的上述緩沖液，抽真空3-5分鐘后37℃反應(yīng)過夜；用70％乙醇65℃脫色1小時(shí)后做成石蠟切片，顯微觀察照相。
葉脈橫切片顯示染色部位主要在韌皮部(內(nèi)韌和外韌，圖7A)，莖的縱切片顯示染色部位主要是在內(nèi)韌皮部(圖7B)。這就表明，水稻Angrp1基因的基本啟動(dòng)子G6(1021bp)在轉(zhuǎn)基因煙草中是特異性表達(dá)的，主要表達(dá)于維管組織的韌皮部部位。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因水稻中Angrp1啟動(dòng)子的維管束特異表達(dá)首先PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pBluescript SK(+)的多克隆位點(diǎn)，將其連接到水稻穩(wěn)定轉(zhuǎn)化載體p35S-Hpt-Nos上；將此重組載體用Sal I酶切，補(bǔ)齊，再用Hind III酶切，回收載體片段。將pG6-GUS用EcoR I酶切，補(bǔ)齊，再用Hind III酶切，回收G6-GUS片段，與載體片段連接，構(gòu)建成帶潮霉素抗性基因的水稻穩(wěn)定表達(dá)載體pG6-Hpt(圖8)。
從中花一號(hào)水稻的種子中分離幼胚，在NB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。將質(zhì)粒pG6-Hpt與金粉混合制成微彈懸液，用基因槍(BioRad公司)轟擊愈傷組織，經(jīng)潮霉素篩選(包括預(yù)分化篩選，分化篩選，壯苗篩選)得到轉(zhuǎn)基因苗，用CTAB法提取小量DNA，用引物F4和GUS2進(jìn)行PCR鑒定。
對(duì)PCR鑒定為陽性的水稻植株，取其葉片進(jìn)行GUS組織染色(圖9A)，并作橫切面觀察(圖9B)。結(jié)果表明，染色部位主要在水稻葉片的維管束中，說明Angrp1的1021bp啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因水稻中能夠指導(dǎo)外源基因進(jìn)行維管束特異的表達(dá)。
主要參考文獻(xiàn)1.Showalter AM.(1993).Structure and function of plant cell wall proteins.Plant Cell.59-23.2.Keller B，Sauer N，Lamb CJ.(1988).Glycine-rich cell wall proteins in beangene structure and association of the protein with the vascular system.EMBO J.73625-3633.3.Xu D，Lei M，Wu R.(1995).Expression of the rice Osgrp1 promoter-Gusreporter gene is specifically associated with cell elongation/expansion anddifferentiation.Plant Mol Biol.28455-471.4.Keller B，Baumgartner C.(1991).Vascular-specific expression of the beanGRP 1.8 gene is negatively regulated.Plant Cell.31051-1061.5.Keller B，Heierli D.(1994).Vascular expression of the grp1.8 promoter iscontrolled by three specific regulatory elements and one unspecific activatingsequence.Plant Mol Biol.26747-756.6.Fang RX，Pang Z，Gao DM，Mang KQ，Chua NH.(1991).cDNA sequenceof a virus-inducible，glycine-rich protein gene from rice.Plant Mol Biol.171255-1257.
權(quán)利要求
1.一種在植物維管束特異表達(dá)的Angrp1啟動(dòng)子，其核苷酸序列(1021bp)如下所示-1021ACTAGTATAT ATATTATTCC CTCCGTTTCA TAATGTAAGA CTTTCTAGCA TTGCTCATAT-961 TTATATAGAT GTTAATGAAT CTAGATGCAT ATATATGTCT AGATTTATTA ATATCTGTAT-901 GAATATGGGT AATATGCTAA AAAGACTTGC ATTATGAAAC GGAGGAAGTA TGTCGCCAGG-841 CTCACTTAAC ATGTTGGTCT AGATCGGTTT AAAATGCTGC ATTTAAGTCG GAATCAGATC-781 ATGTATACAT GTAACACAAT ACTGGTAAGC AGTAAGAAAT GCCCGATCTA GGGATGAAAA-721 AGAATAACTG AGATAATAAC TTACCATGCA ATTTTATTAT TGCACAAATT TAATTAACTG-661 TTTAGTTTGA TACTTGGCCT CATATATAGT ACGTAGTAAT TAATTAAACC ATCGATCTCA-601 CTAGGCTCCA ACTAGAAATC AGATCCACGT CTACTAGTAC AGATATGTGA TGAGCAGATA-541 TAAGTGCATC TGCCACACAT CACTGAACCA GCACATGGAT CACATTAAGC ACGTCAATGT-481 ATGCTAATTA ATTGATTAAC TATACCATGC CTAATTGCTT AATTAGCAGC CAACGGTATT-421 CGATTGATCC CATTCGCCAA AACCGGCCGG AGTCGCTCTC ATGAAAACAG CCTCAGATGA-361 CCTTGAAGTA TGGACAGAAT ACAATAGCAA ACCGATCGAA TAATTCTATC TCTGCTTACA-301 TAAAAGCAAA AGCAAAAGTA AACACACACA CACACAAAGC AAAAACAATA AATCAGTATT-241 CTAAAAATAA ATCAGTAACA TCACCACACC GCTCTCCAAG TGTCAAAAAG AATTAAAGGA-181 CAACAGCTAC TGGCACTCTC CATGAACTCT CCTGGTCATC ATTTCACACC CATATACTGT-121 GTCCAAAGTC CAAAAGCTCT AACGTCTCTA GTTTTGGACC ATGCAGACTG ATGAACATCT-61 GATGAGATAG CCATACACGA GATGCACCCT ATAAATACCC CAGCTCCCCT TCACTCCAAC-1 CAC
2.一種含有權(quán)力要求1所述的啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物表達(dá)載體，是pG6-121。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物表達(dá)載體，是pG6-Hpt。
5.一種含有權(quán)利要求1所述核苷酸序列的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化子，是質(zhì)粒pG6-GUS的大腸桿菌XL1Blue轉(zhuǎn)化子，其保藏登記號(hào)為CGMCC No.0579
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5和6任一項(xiàng)所述的Angrp1基因啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新發(fā)現(xiàn)的DNA序列,它可以作為啟動(dòng)子調(diào)控目的基因特異表達(dá)于植物的維管束組織。本發(fā)明從矮腳南特水稻基因組中克隆了Angrp1基因及其上游序列,在測(cè)定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的基礎(chǔ)上,通過煙草瞬間表達(dá)體系分析了Angrp1基因上游序列的5′系列缺失片段驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的啟動(dòng)子活性,確定了1021bp的片段為其基本啟動(dòng)子區(qū)域。隨后在轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因水稻中通過GUS組織化學(xué)染色證實(shí),該基本啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)報(bào)告基因在維管組織特異表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1388246SQ0111852
公開日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2001年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月30日
發(fā)明者方榮祥, 王建龍, 黃勛, 徐衛(wèi)輝, 劉宗旨 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所