本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種擬南芥UDP‐葡萄糖4‐異構(gòu)酶基因At‐UGE2及其過表達(dá)突變株35S::UGE2和缺失突變株uge2在調(diào)節(jié)植物產(chǎn)量相關(guān)性狀及抗逆性狀方面的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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在植物生長發(fā)育過程中，經(jīng)常會(huì)遭受諸如：低溫、高溫、干旱、鹽堿等逆境環(huán)境因素的影響，這些因素往往會(huì)對(duì)植物的生長過程構(gòu)成嚴(yán)重的非生物脅迫。由于植物自身的移動(dòng)受限制，它們只能通過適應(yīng)環(huán)境改變來維持生存，因此在漫長的適應(yīng)進(jìn)化過程中，植物不斷形成了一套抵御逆境脅迫的生理機(jī)制。研究植物在逆境下的生理變化規(guī)律和分子機(jī)理，有利于深入解析植物的抗逆機(jī)制，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)指導(dǎo)中培育具有優(yōu)良性狀的抗逆品種，從而提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。

植物在逆境脅迫下易發(fā)生細(xì)胞失水，植物可通過快速調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)可溶性糖、脯氨酸等滲透物質(zhì)的含量來應(yīng)對(duì)。糖類是植物細(xì)胞中重要的有機(jī)化合物，它與植物的生長發(fā)育和抵御逆境脅迫息息相關(guān)。核苷糖是植物體內(nèi)一類重要的單糖物質(zhì)，可由核苷二磷酸或核苷一磷酸與不同單糖異構(gòu)體的羥基連接形成。核苷糖可由核苷糖互變轉(zhuǎn)化酶催化反應(yīng)，改變糖基團(tuán)從而生成不同的糖類及其他代謝中間產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控核苷糖生物合成、轉(zhuǎn)化過程的這類酶是也植物響應(yīng)逆境脅迫的重要功能基因，其中，UDP‐D‐葡萄糖4‐異構(gòu)酶(亦稱UDP‐半乳糖4‐異構(gòu)酶，UGE；EC 5.1.3.2)是目前研究比較清楚的一類核苷糖互變轉(zhuǎn)化酶，它催化了UDP‐D‐葡萄糖(UDP‐glucose，UDP‐glc)與UDP‐D‐半乳糖(UDP‐galactose，UDP‐gal)之間的互變反應(yīng)。該反應(yīng)過程具體為：(1)UGE催化UDP‐D‐葡萄糖C4位上羥基的氫轉(zhuǎn)移到NAD⁺上，形成中間產(chǎn)物4‐呋喃糖和NADH；(2)NADH煙酰胺環(huán)上的H再轉(zhuǎn)移到糖C4位的對(duì)應(yīng)面上，形成UDP‐D‐半乳糖。UDP‐D‐半乳糖是半乳糖參與生物合成過程的活性形式，它是植物合成細(xì)胞壁多糖的重要物質(zhì)，在植物細(xì)胞壁果膠、半纖維素、纖維素以及胞質(zhì)的多糖中都含有大量半乳糖殘基；UDP‐D‐半乳糖還與多種植物糖蛋白的核心寡糖連接，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程；它還是貯存代謝物棉子糖和水蘇糖的合成底物；此外，它還參與了單半乳糖二酰甘油脂(monogalactosyl diacylglycerol,MGDG)和雙半乳糖二酰甘油脂(digalactosyl diacylglycerol,DGDG)的合成，這兩類半乳 糖脂占植物葉綠體膜脂組成的75％左右，對(duì)于葉綠體功能的穩(wěn)定至關(guān)重要。因此，UGE作為UDP‐D‐半乳糖合成途徑中的關(guān)鍵酶，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)UDP‐D‐半乳糖與UDP‐D‐葡萄糖的動(dòng)態(tài)平衡起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。研究表明，UGE基因的功能缺陷會(huì)引起酵母菌和植物發(fā)生嚴(yán)重的半乳糖不耐受，產(chǎn)生半乳糖毒性；在人類中，UGE基因的功能缺陷會(huì)導(dǎo)致血糖中的半乳糖含量升高造成半乳糖血癥。目前，已從細(xì)菌、釀酒酵母、人類、水稻、大麥、馬鈴薯、瓜豆、白菜以及模式植物擬南芥中克隆到UGE基因，UGE基因的氨基酸編碼序列在各種物種中都高度保守，同源性約為50％。在擬南芥基因組中共發(fā)現(xiàn)5個(gè)UGE編碼基因，但它們介導(dǎo)的催化反應(yīng)傾向不同，UGE1和UGE3傾向于催化糖類降解過程中釋放的UDP‐D‐半乳糖生成UDP‐D‐葡萄糖，為新的生物合成反應(yīng)提供原料，而UGE2、4、5傾向于催化UDP‐D‐葡萄糖向UDP‐D‐半乳糖轉(zhuǎn)化，為細(xì)胞壁多糖和葉綠體膜半乳糖脂的合成提供底物。此外，這5個(gè)UGE基因在擬南芥組織器官中的表達(dá)模式也不同，UGE1主要在種子和根下胚軸中表達(dá)，UGE3在種子、花序及花中表達(dá)，UGE2和UGE5在衰老的葉片中表達(dá)，UGE4在根尖伸長區(qū)表達(dá)。在擬南芥中這五個(gè)UGE基因經(jīng)常是協(xié)同發(fā)揮作用的，例如UGE2和UGE4在植物營養(yǎng)生長階段共同作用于細(xì)胞壁多糖的生物合成，UGE2和UGE3在植物生殖生長階段共同促進(jìn)花粉的發(fā)育，而UGE1和UGE5在非生物脅迫下可非特異性地促進(jìn)UGE酶活進(jìn)而維持脅迫下植物的生長。UGE1基因在擬南芥中目前研究的最為系統(tǒng)清楚，與野生型植株相比UGE1基因缺失或過表達(dá)分別造成了UGE總酶活性降低10％或提升250％；在含有1％半乳糖的培養(yǎng)基上生長時(shí)，野生型擬南芥生長受到抑制，UGE1缺失突變株的抑制程度更強(qiáng)，UGE1過表達(dá)突變株則生長正常；在含有半乳糖的培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間，野生型植株的UDP‐半乳糖含量升高，UDP‐葡萄糖含量下降，而在UGE1過表達(dá)突變體中UDP‐半乳糖和UDP‐葡萄糖的含量沒有變化。造成以上的差異的原因可能是由于野生型和UGE1缺失突變株中UGE酶活達(dá)到上限，不能及時(shí)清理細(xì)胞內(nèi)積累的UDP‐半乳糖，造成細(xì)胞毒性，進(jìn)而抑制植株生長，而過表達(dá)UGE1突變株中UGE表達(dá)量及酶活較高，能更大限度地耐受半乳糖毒性，使植株得以正常生長。其它相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，UGE基因不僅參與調(diào)控植物生長發(fā)育的某些過程，還部分地參與了植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)。例如，在已報(bào)道的擬南芥響應(yīng)逆境脅迫的基因芯片數(shù)據(jù)中，低溫、干旱、高鹽等都可誘導(dǎo)UGE基因的表達(dá)升高；水稻UGE1基因的表達(dá)量受干旱、高鹽及紫外線脅迫誘導(dǎo)，并在缺氮條件下負(fù)責(zé)糖類的分配；將水稻的UGE1基因轉(zhuǎn)入擬南芥中表達(dá)，雖未改變擬南芥的形態(tài)特征，但卻改變了其中棉子糖含量和對(duì)非生物脅迫的抗性。因此，UGE基因不僅為植物生長代謝提供了原料核苷糖，還參與了植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)，系統(tǒng)深入的研究其功能具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥UDP‐葡萄糖4‐異構(gòu)酶基因At‐UGE2及其過表達(dá)突變株35S::UGE2和缺失突變株uge2在調(diào)控植物產(chǎn)量相關(guān)性狀及抗逆性狀中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：

擬南芥At‐UGE2基因在調(diào)控植物營養(yǎng)生長和生殖生長階段中的應(yīng)用。

擬南芥At‐UGE2基因在培育延緩激素脫落酸或乙烯和黑暗誘導(dǎo)的離體葉片衰老中的應(yīng)用。

擬南芥At‐UGE2基因在培育具有高、低溫脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

擬南芥At‐UGE2基因的過表達(dá)突變株35S::UGE2在培育具有增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

如所述的擬南芥At‐UGE2基因的過表達(dá)突變株35S::UGE2在培育具有增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其中所述的增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀是指葉面積大、葉片數(shù)多、開花時(shí)間提前、單株莢果數(shù)多、種子體積增大、種子產(chǎn)量提高。

擬南芥At‐UGE2基因的過表達(dá)突變株35S::UGE2在培育延緩激素脫落酸或乙烯和黑暗誘導(dǎo)的離體葉片衰老的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

擬南芥At‐UGE2基因的過表達(dá)突變株35S::UGE2在培育具有高、低溫脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

擬南芥At‐UGE2基因的缺失突變株uge2在培育降低植物產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

如所述的擬南芥At‐UGE2基因的缺失突變株uge2在培育降低植物產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其中所述的降低植物產(chǎn)量相關(guān)性狀是指葉面積小、葉片數(shù)少、開花時(shí)間延遲、單株莢果數(shù)減少、種子體積減小、種子產(chǎn)量降低。

擬南芥At‐UGE2基因的缺失突變株uge2在培育具有加速激素脫落酸或乙烯和黑暗誘導(dǎo)的離體葉片衰老的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

擬南芥At‐UGE2基因的缺失突變株uge2在培育對(duì)高、低溫脅迫抗性降低的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

根據(jù)所述的應(yīng)用，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物是將擬南芥的At‐UGE2基因以及來源于其 他植物的同源基因，完整克隆或其中部分片斷化連接到具有使表達(dá)量升高的不同種類的表達(dá)載體上，通過對(duì)不同表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化獲得At‐UGE2基因表達(dá)量升高的轉(zhuǎn)基因植物。

根據(jù)所述的應(yīng)用，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物是將擬南芥中的At‐UGE2基因以及來源于其他植物的同源基因，利用植物基因敲除技術(shù)同源重組、隨機(jī)插入突變、RNA干擾、CRISPR/Cas9，獲得的At‐UGE2基因表達(dá)完全缺失或部分缺失的轉(zhuǎn)基因植物。

上述應(yīng)用中，所述的轉(zhuǎn)基因植物包括兩類，一是將擬南芥的At‐UGE2基因以及來源于其他植物的同源基因，完整克隆或其中部分片斷化連接到具有使其表達(dá)量升高的不同種類的表達(dá)載體上，通過對(duì)不同表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化獲得At‐UGE2基因表達(dá)量升高的轉(zhuǎn)基因植物；二是將擬南芥中的At‐UGE2基因以及來源于其他植物的同源基因，利用同源重組、隨機(jī)插入突變、RNA干擾、CRISPR/Cas9等植物基因敲除技術(shù)，獲得的At‐UGE2基因表達(dá)完全缺失或部分缺失的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明的技術(shù)方案是基于以下原理得出的：At‐UGE2基因在植物生長發(fā)育過程中有重要作用，過表達(dá)突變株35S::UGE2在擬南芥營養(yǎng)生長和生殖生長階段都表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的優(yōu)勢(shì)，與野生型相比其葉面積較大、葉片數(shù)多、開花時(shí)間提前、單株莢果數(shù)多、種子體積增大、種子產(chǎn)量提高等優(yōu)勢(shì)，缺失突變株uge2則相反，各項(xiàng)產(chǎn)量性狀都比野生型弱；At‐UGE2基因參與了脫落酸、乙烯和黑暗誘導(dǎo)的植物離體葉片衰老過程，過表達(dá)突變株35S::UGE2對(duì)于這三種因素誘導(dǎo)的離體葉片衰老有延緩效果，葉綠素降解較慢，而缺失突變株uge2的離體葉片衰老加速，葉綠素降解較快；At‐UGE2基因還參與了植物對(duì)溫度脅迫的響應(yīng)，過表達(dá)突變株35S::UGE2對(duì)高溫脅迫和低溫脅迫的抗性較強(qiáng)，細(xì)胞膜離子滲漏較弱，而缺失突變株uge2對(duì)高、低溫脅迫都較敏感，抗性較弱。

本發(fā)明所述的擬南芥At‐UGE2基因在GeneBank中的編號(hào)是AT4G23920，編碼區(qū)序列全長1053bp，編碼350個(gè)氨基酸，主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，催化UDP‐D‐半乳糖與UDP‐D‐葡萄糖的轉(zhuǎn)換，為細(xì)胞壁多糖的合成提供原料。

本發(fā)明所述的At‐UGE2基因的過表達(dá)突變株35S::UGE2，由下述方法構(gòu)建而得：用正常條件(22℃)土培生長四周的擬南芥葉片提取總RNA，以oligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版克隆At‐UGE2基因的編碼區(qū)，然后將測(cè)序后確認(rèn)序列完全正確的基因片段構(gòu)建到連有CaMv 35S組成型表達(dá)啟動(dòng)子的過表達(dá)載體pBI121上，利用液氮凍融法將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，進(jìn)而以農(nóng)桿菌侵染花序的方法進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化。通過表達(dá)載體上 攜帶的卡那霉素抗性及PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因雙重手段驗(yàn)證，最終獲得35S::UGE2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。

本發(fā)明所述的At‐UGE2缺失突變株uge2，是從擬南芥生物資源中心ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)購買的兩個(gè)T‐DNA插入純合子突變株，種子編號(hào)分別為CS25040和CS859980，突變體株的產(chǎn)生是由于載體pROK2上一段T‐DNA的插入。CS25040的插入位點(diǎn)在At‐UGE2基因的第五和第六外顯子間，CS859980插入位點(diǎn)在At‐UGE2基因的第三和第四外顯子間，T‐DNA的插入導(dǎo)致了At‐UGE2基因表達(dá)量缺失。

在本發(fā)明中，擬南芥UGE基因家族成員At‐UGE2基因的功能與植物生長發(fā)育過程、激素和黑暗誘導(dǎo)離體葉片衰老及溫度脅迫響應(yīng)有關(guān)，組成型高表達(dá)At‐UGE2可增強(qiáng)植物產(chǎn)量相關(guān)性狀、延緩激素和黑暗誘導(dǎo)的衰老，增強(qiáng)高、低溫脅迫抗性。因此研究該基因的功能不僅對(duì)探索植物生長發(fā)育規(guī)律及闡明植物抗逆機(jī)制有重要的理論意義，操作At‐UGE2基因的表達(dá)水平對(duì)培育優(yōu)良性狀的農(nóng)作物及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的運(yùn)用也有現(xiàn)實(shí)價(jià)值。

附圖說明：

圖1 At‐UGE2基因結(jié)構(gòu)及缺失突變株的T‐DNA插入位置。

圖2A‐C：At‐UGE2基因T‐DNA插入突變株的鑒定；圖2A、T‐DNA插入突變株uge2‐1(CS25040)的純合子鑒定；圖2B、T‐DNA插入突變株uge2‐2(CS859980)的純合子鑒定；圖2C、半定量RT‐PCR分析22℃正常生長和4℃處理7d的野生型與過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2葉片中At‐UGE基因轉(zhuǎn)錄水平。

圖3A‐D：At‐UGE2基因過表達(dá)突變株35S::UGE2的構(gòu)建及鑒定；圖3A、重組質(zhì)粒pBI121/UGE2的酶切鑒定；圖3B、農(nóng)桿菌中重組質(zhì)粒載體pBI121/UGE2的PCR鑒定；圖3C、第三代過表達(dá)突變株35S::UGE2的抗生素(卡那霉素)篩選；圖3D、半定量RT‐PCR分析22℃正常生長和4℃處理7d的野生型與過表達(dá)突變株35S::UGE2‐2葉片中At‐UGE基因轉(zhuǎn)錄水平。

圖4A‐C：在不同半乳糖濃度MS培養(yǎng)基上生長2周的擬南芥野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2無菌苗表型；圖4A、在不同半乳糖濃度MS培養(yǎng)基上生長2周的野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2無菌苗的表型及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm值；圖4B、在不同半乳糖濃度MS培養(yǎng)基上生長2周的野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2無菌苗的葉綠素含量；圖4C、在不同半乳糖MS培養(yǎng)基上生長2周的野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2無菌苗的類胡蘿卜素含量。

圖5A‐C：過表達(dá)突變株35S::UGE2在植物營養(yǎng)生長階段具有增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的表現(xiàn)；圖5A、22℃正常培養(yǎng)4周的擬南芥野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2土培苗表型；圖5B、剛抽薹的野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2土培苗的葉片表型；圖5C、野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2土培苗單株莢果排列表型。

圖6A‐B：野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2土培苗的干種子大小及單株種子產(chǎn)量；圖6A、收獲后干燥1個(gè)月的野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2土培苗種子表型；圖6B、收獲后干燥1個(gè)月的野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2土培苗種子單株產(chǎn)量。

圖7A‐D：外源施加激素和黑暗誘導(dǎo)野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2離體葉片衰老表型；圖7A、外源施加脫落酸誘導(dǎo)野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2離體葉片衰老表型及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm值；圖7B、外源施加脫落酸誘導(dǎo)野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2離體葉片衰老葉綠素和類胡蘿卜素含量；圖7C、外源施加乙烯誘導(dǎo)野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2離體葉片衰老表型及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm值；圖7D、黑暗誘導(dǎo)野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2離體葉片衰老表型及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm值。

圖8A‐C：野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2的高溫脅迫抗性分析；圖8A、熱馴后熱激的高溫脅迫處理(條件：先38℃熱馴2h，22℃恢復(fù)1h，之后48℃熱激3h)4周土培苗恢復(fù)3天的表型及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm值；圖8B、直接熱激的高溫脅迫處理(條件：48℃直接熱激3h)4周土培苗恢復(fù)3天的表型及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm值；圖8C、高溫脅迫處理(熱馴熱激和直接熱激)4周土培苗恢復(fù)5天的細(xì)胞膜離子滲漏分析。

圖9A‐C：野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2的低溫脅迫抗性分析；圖9A、低溫脅迫處理(條件：‐6℃凍1h和‐8℃凍1h)4周土培苗恢復(fù)3天的表型及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm值；圖9B、低溫脅迫處理(條件：‐6℃凍1h和‐8℃凍1h)4周土培苗恢復(fù)3天的葉片細(xì)胞膜離子滲漏分析；圖9C、低溫脅迫處理(條件：‐4℃、‐6℃、‐8℃、‐10℃及‐12℃凍1h)2周無菌苗恢復(fù)3天的表型及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm值。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明

實(shí)施例1：

At‐UGE2基因缺失突變株uge2‐1和uge2‐2的獲得和表達(dá)量檢測(cè)。

(一)At‐UGE2基因缺失突變株uge2‐1和uge2‐2純合子的PCR鑒定：

本發(fā)明所述的擬南芥At‐UGE2基因在GeneBank中的編號(hào)是AT4G23920，編碼區(qū)序列全長1053bp，編碼350個(gè)氨基酸，其核苷酸序列和氨基酸序列如序列表1和2(SEQ ID No 1：At‐UGE2基因編碼區(qū)核苷酸序列和SEQ ID No 2：At‐UGE2基因編碼氨基酸序列)所示，主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，催化UDP‐D‐半乳糖與UDP‐D‐葡萄糖的轉(zhuǎn)換，參與細(xì)胞壁碳水化合物的生物合成。

本發(fā)明從擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center,ABRC)購買了At‐UGE2基因的兩個(gè)T‐DNA插入突變體株(種子編號(hào)為：CS25040和CS859980)(圖1)，其側(cè)翼序列如序列表3(SEQ ID No 3：At‐UGE2基因T‐DNA插入突變株CS25040側(cè)翼序列)和序列表4(SEQ ID No 4：At‐UGE2基因T‐DNA插入突變株CS859980側(cè)翼序列)所示，通過PCR鑒定T‐DNA插入情況，所用引物如下：

CS25040FP 5’端引物：5’‐CTATCCCATTCTTAGCCCTGC‐3’

CS25040RP3’端引物：5’‐ACATCGTTCTGACTCGGAATG‐3’

LBpROK2引物：5’‐ATTTTGCCGATTTCGGAAC‐3’

CS859980FP5’端引物：5’‐TTTGGTTTAGGAAACGTGTGC‐3’

CS859980RP3’端引物：5’‐ACTAGGATGTGCACCAACAGG‐3’

LBpROK2引物：5’‐ATTTTGCCGATTTCGGAAC‐3’

結(jié)果如圖2A和圖2B所示，經(jīng)鑒定T‐DNA插入突變株CS25040和CS859980皆為純合子，并將其分別命名為uge2‐1和uge2‐2用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(二)半定量RT‐PCR分析過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2中At‐UGE2基因轉(zhuǎn)錄水平：

提取22℃正常培養(yǎng)下生長4周的擬南芥土培苗葉片總RNA，進(jìn)行半定量RT‐PCR分析，所用引物如下：

At‐UGEF：5’‐ATGGCGAAGAGTGTTTTG‐3’

At‐UGER：5’‐TTATGAAGAGGAGCCATTG‐3’

Actin2F：5’‐TGTGCCAATCTACGAGGGTTT‐3’

Actin2R：5’‐TTTCCCGCTCTGCTGTTGT‐3’

結(jié)果如圖2C所示，T‐DNA插入已導(dǎo)致突變株uge2‐1和uge2‐2中At‐UGE2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)缺失。

實(shí)施例2：

At‐UGE2基因過表達(dá)突變株35S::UGE2的構(gòu)建及鑒定：

構(gòu)建At‐UGE2過表達(dá)突變株35S::UGE2的具體方法為：用22℃正常條件土培生長四周的擬南芥葉片提取總RNA，以oligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版克隆At‐UGE2基因的編碼區(qū)，然后將測(cè)序后確認(rèn)序列完全正確的基因片段構(gòu)建到連有CaMv 35S組成型表達(dá)啟動(dòng)子的過表達(dá)載體pBI121上(圖3A)，利用液氮凍融法將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中(圖3B)，進(jìn)而以農(nóng)桿菌侵染花序的方法進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化。收獲的第一代種子以50mg/L使用終濃度的卡那霉素進(jìn)行抗性篩選并通過PCR擴(kuò)增目的片段驗(yàn)證，對(duì)篩選得到的第一代陽性植株進(jìn)行單株繁種，收獲的第二、三代種子同樣進(jìn)行抗生素篩選及PCR驗(yàn)證，最終獲得了四個(gè)具有抗性的株系，命名為#1、#2、#3、#4(圖3C)，并選取了#1、#2用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，命名為35S::UGE2‐1和35S::UGE2‐2。半定量RT‐PCR的結(jié)果也證實(shí)，在過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1和35S::UGE2‐2中(圖2C和3D)，At‐UGE2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平比野生型顯著提高了。

實(shí)施例3：

利用半乳糖毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證At‐UGE2基因缺失突變株和過表達(dá)突變株表型。

細(xì)胞內(nèi)過量的半乳糖會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生嚴(yán)重的半乳糖毒性，主要表現(xiàn)在抑制植株生長，葉綠素含量降低，出現(xiàn)黃化苗。At‐UGE2基因在擬南芥中主要催化了UDP‐葡萄向UDP‐半乳糖的轉(zhuǎn)化，在外源施加一定濃度的半乳糖后，At‐UGE2基因的功能缺陷可能會(huì)導(dǎo)致植株產(chǎn)生半乳糖毒性。因此，本發(fā)明將擬南芥野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐2和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2的種子經(jīng)表面消毒后分區(qū)點(diǎn)種于半乳糖濃度依次增加的0mM、50mM、100mM、150mM、200mM的MS培養(yǎng)基上，經(jīng)過4℃春化1天后放置于正常條件下培養(yǎng)(溫度22℃，濕度50％‐60％，光周期12h白天/12h黑暗)，2周后觀察記錄無菌苗的表型及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)值。結(jié)果如圖4所示，與野生型相比缺失突變株uge2‐1和uge2‐2隨著培養(yǎng)基中半乳糖濃度的升高，生長受到顯著抑制，葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，葉綠素和類胡蘿卜素含量降低，而野生型和過表達(dá)株突變株能耐受的半乳糖濃度更高，且過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐2在高濃度半乳糖下的生長略優(yōu)于野生型。

實(shí)施例4：

過表達(dá)突變株35S::UGE2在植物營養(yǎng)生長和生殖生長階段具有增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀表現(xiàn)。

將擬南芥野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐2和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2的種子播種于泥炭土中，正常條件下(溫度22℃，濕度50％‐60％，光周期12h白天/12h黑暗)培養(yǎng)生長，4周時(shí)拍照記錄所有基因型植株的表型，在植株剛抽薹時(shí)統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)、蓮座葉直徑、總?cè)~面積、生物量等指標(biāo)，在第一朵花開時(shí)統(tǒng)計(jì)株高和莖分枝數(shù)，在種子成熟后期統(tǒng)計(jì)莢果數(shù)目和形態(tài)，收獲種子后統(tǒng)計(jì)單株種子產(chǎn)量和種子大小。結(jié)果如圖5A所示，相同的生長周期下(4周)，過表達(dá)突變株土培苗的長勢(shì)較好，其次為野生型，缺失突變株的苗體型最??；而在植株由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的剛抽薹時(shí)，過表達(dá)突變株的土培苗有較多的葉片數(shù)、較大的蓮座葉直徑和總?cè)~面積、生物量積累最高，其次為野生型，缺失突變株最弱(圖5B和表1)；在第一朵花開時(shí)，過表達(dá)突變株的株高最高，莖分枝數(shù)最多，其次為野生型和缺失突變株(表1)；在單株莢果數(shù)和莢果長度上，過表達(dá)突變株也比野生型和缺失突變株有略微優(yōu)勢(shì)(表1和圖5C)；統(tǒng)計(jì)單株種子產(chǎn)量，過表達(dá)突變株明顯高于野生型和缺失突變株，并且過表達(dá)突變株干種子的體積明顯增大了，看起來更飽滿(圖6A和6B)。

表1、野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐1和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2土培苗剛抽薹時(shí)的葉片數(shù)、蓮座直徑(cm)、總?cè)~面積(cm²)、生物量(g)，以及第一朵花開時(shí)的株高(cm)和莖分枝數(shù)，單株莢果數(shù)統(tǒng)計(jì)(n＝5)

實(shí)施例5：

激素(脫落酸和乙烯)和黑暗誘導(dǎo)At‐UGE2各基因型植株離體葉片的衰老。

植物激素脫落酸和乙烯參與了葉片的衰老過程，外源施加脫落酸和乙烯可以加速葉片的衰老，誘導(dǎo)衰老相關(guān)基因表達(dá)，導(dǎo)致生理失調(diào)及葉綠素降解，最終葉片發(fā)黃衰老脫落。光是調(diào)控植物衰老的重要環(huán)境因子，植株或其它離體器官在黑暗條件下不能進(jìn)行光合作用，因此黑暗會(huì)加速衰老的進(jìn)程。本發(fā)明通過外源施加激素脫落酸和乙烯、以及避光黑暗處理，誘導(dǎo)野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐2和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2離體葉片的衰老。結(jié)果如圖7所示，激素和黑暗處理能加速離體葉片的衰老發(fā)生，但在相同處理時(shí)間下，過表達(dá)突變株離體葉片的葉綠素降解程度較輕，光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm值減弱較慢，對(duì)誘導(dǎo)衰老的耐受性最強(qiáng)，其次為野生型，缺失突變株對(duì)誘導(dǎo)衰老較為敏感。

實(shí)施例6：

過表達(dá)突變株35S::UGE2對(duì)高、低溫脅迫有較強(qiáng)的抗性。

(一)At‐UGE2各基因型植株的高溫脅迫抗性分析：

將擬南芥野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐2和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2的種子播種于泥炭土中，正常條件下培養(yǎng)(溫度22℃，濕度50％‐60％，光周期12h白天/12h黑暗)4周左右進(jìn)行高溫脅迫處理，處理?xiàng)l件為：一是熱馴熱激，38℃熱馴2小時(shí)，22℃恢復(fù)培養(yǎng)1小時(shí)，然后迅速升溫至48℃熱激處理3小時(shí)；二是直 接熱激，將22℃正常培養(yǎng)的植株直接迅速升溫至48℃熱激處理3小時(shí)，最后將所有處理后的植株放置于22℃正常條件下恢復(fù)培養(yǎng)3天后觀察記錄植株表型及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)值，檢驗(yàn)高溫脅迫后植株的損傷程度。結(jié)果如圖8所示，兩種不同條件的高溫脅迫處理后，過表達(dá)突變株的抗性最好，F(xiàn)v/Fm熒光值較高，說明葉片光系統(tǒng)Ⅱ的狀態(tài)好，細(xì)胞膜離子滲漏最低，其次是野生型，缺失突變株的高溫抗性最弱。

(二)At‐UGE2各基因型植株的低溫脅迫抗性分析：

將擬南芥野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐2和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2的種子播種于泥炭土中，正常條件下培養(yǎng)(溫度22℃，濕度50％‐60％，光周期12h白天/12h黑暗)4周左右進(jìn)行低溫脅迫處理，處理?xiàng)l件為：4℃冷馴24小時(shí)，然后以2℃/小時(shí)的速率降溫到‐2℃誘導(dǎo)結(jié)冰2小時(shí)，防止產(chǎn)生過冷，之后同樣以2℃/小時(shí)的速率降溫到‐6℃處理1小時(shí)或‐8℃處理1小時(shí)。低溫處理完成后以2℃/小時(shí)的速率升溫到4℃黑暗放置過夜(12‐16小時(shí))，最終放置于22℃，光照10％左右的條件下恢復(fù)培養(yǎng)3天后觀察記錄植株表型及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)值，檢驗(yàn)低溫脅迫后植株的損傷程度。結(jié)果如圖9A和9B所示，相同的冷凍處理?xiàng)l件，過表達(dá)突變株的抗性最好，細(xì)胞膜滲漏最低，其次是野生型，缺失突變株的低溫抗性最弱，膜滲漏最強(qiáng)。

將擬南芥野生型(Col‐0)、過表達(dá)突變株35S::UGE2‐1、35S::UGE2‐2和缺失突變株uge2‐1、uge2‐2的種子經(jīng)表面消毒后分區(qū)點(diǎn)種于MS培養(yǎng)基上，經(jīng)過4℃春化1天后放置于正常條件下培養(yǎng)(溫度22℃，濕度50％‐60％，光周期12小時(shí)白天/12小時(shí)黑暗)，2周后進(jìn)行低溫脅迫處理，處理?xiàng)l件為：4℃冷馴24小時(shí)，然后以2℃/小時(shí)的速率降溫到‐2℃誘導(dǎo)結(jié)冰2小時(shí)，防止產(chǎn)生過冷，之后同樣以2℃/小時(shí)的速率降溫到指定的零下溫度處理1小時(shí)。低溫處理完成后以2℃/小時(shí)的速率升溫到4℃黑暗放置過夜(12‐16小時(shí))，最終放置于22℃，光照10％左右的條件下恢復(fù)培養(yǎng)3天后觀察記錄植株表型及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)值，檢驗(yàn)低溫脅迫后植株的損傷程度。結(jié)果如圖9C所示，冷凍處理后，過表達(dá)突變株能忍耐更低的零下低溫處理，其次為野生型，缺失突變株對(duì)低溫的抗性最弱。

擬南芥At‐UGE2基因的以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，該基因參與了植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)和脅迫應(yīng)答等過程，本發(fā)明對(duì)深入理解不同發(fā)育階段和脅迫處理后UGE酶介導(dǎo)的UDP‐葡萄糖和UDP‐半乳糖在細(xì)胞內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)換有實(shí)質(zhì)性的意義和價(jià)值；鑒于過表達(dá)突變株35S::UGE2具有增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀及抗逆性的優(yōu)勢(shì)，并且以往的大量研究證明以擬南芥為材料鑒定 的大多數(shù)功能基因都能應(yīng)用到其它植物中，因此本發(fā)明還為植物品種改良提供了一個(gè)優(yōu)質(zhì)基因，闡明了一種新的提高植物產(chǎn)量相關(guān)性狀及抗逆性的方法和機(jī)制，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和運(yùn)用前景。

最后，還需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的其中幾個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多改進(jìn)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的改進(jìn)，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110> 中國科學(xué)院昆明植物研究所

<120> 擬南芥At-UGE2基因及其過表達(dá)突變株和缺失突變株在調(diào)節(jié)植物性狀中的應(yīng)用

<160> 4

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> 擬南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 1

atggcgaaga gtgttttggt taccggcggc gctggctata tcggaagtca tactgttctt 60

caactgcttg aaggtggtta ctccgccgtc gttgttgaca attacgacaa ttcctctgct 120

gcttcgcttc agcgcgtgaa gaaactcgcc ggcgaaaacg gaaaccgcct ctccttccac 180

caggtggatc tccgagacag gcctgcgctt gagaagatat tctcagaaac aaagtttgat 240

gcagtgatac actttgctgg acttaaagca gtaggtgaga gtgtggagaa gcctttgctc 300

tattataata ataacattgt tggcactgtt actcttttgg aggttatggc tcaatacggc 360

tgcaaaaatc ttgtattttc atcatcagct actgtctatg gctggcctaa ggaggttcct 420

tgcactgagg agtcaccaat ttctgccact aacccatatg gccgtacaaa gctttttatc 480

gaagagattt gccgggatgt acatcgttct gactcggaat ggaagatcat attgcttaga 540

tacttcaacc ctgttggtgc acatcctagt ggttacattg gtgaagatcc tcttggagtt 600

cccaacaatc tcatgcctta tgtccaacaa gttgcagttg gccggagacc tcaccttact 660

gtctttggaa ccgactacaa gacaaaggat ggtacagggg ttagagatta cattcatgtc 720

atggatttag cagatggaca catagctgct ctgcgtaagc tagatgatct caaaatcagt 840

tgtgaggtat acaatcttgg aacgggtaat ggaacatcgg tcctagaaat ggtcgctgcc 900

tttgaaaaag catccggaaa gaaaatccct ttggtgatgg ctggacgacg tcctggagac 960

gctgaagttg tttacgcctc aacggaaaaa gcagagcgcg aactaaattg gaaggctaag 1020

aatgggatag aggagatgtg tagggatcta tggaattggg caagcaataa cccctacggc 1080

tacaattcct cctccaatgg ctcctcttca taa 1053

<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> 擬南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 2

Met Ala Lys Ser Val Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ser

1 5 10 15

His Thr Val Leu Gln Leu Leu Glu Gly Gly Tyr Ser Ala Val Val Val

20 25 30

Asp Asn Tyr Asp Asn Ser Ser Ala Ala Ser Leu Gln Arg Val Lys Lys

35 40 45

Leu Ala Gly Glu Asn Gly Asn Arg Leu Ser Phe His Gln Val Asp Leu

50 55 60

Arg Asp Arg Pro Ala Leu Glu Lys Ile Phe Ser Glu Thr Lys Phe Asp

65 70 75 80

Ala Val Ile His Phe Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Glu

85 90 95

Lys Pro Leu Leu Tyr Tyr Asn Asn Asn Ile Val Gly Thr Val Thr Leu

100 105 110

Leu Glu Val Met Ala Gln Tyr Gly Cys Lys Asn Leu Val Phe Ser Ser

115 120 125

Ser Ala Thr Val Tyr Gly Trp Pro Lys Glu Val Pro Cys Thr Glu Glu

130 135 140

Ser Pro Ile Ser Ala Thr Asn Pro Tyr Gly Arg Thr Lys Leu Phe Ile

145 150 155 160

Glu Glu Ile Cys Arg Asp Val His Arg Ser Asp Ser Glu Trp Lys Ile

165 170 175

Ile Leu Leu Arg Tyr Phe Asn Pro Val Gly Ala His Pro Ser Gly Tyr

180 185 190

Ile Gly Glu Asp Pro Leu Gly Val Pro Asn Asn Leu Met Pro Tyr Val

195 200 205

Gln Gln Val Ala Val Gly Arg Arg Pro His Leu Thr Val Phe Gly Thr

210 215 220

Asp Tyr Lys Thr Lys Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val

225 230 235 240

Met Asp Leu Ala Asp Gly His Ile Ala Ala Leu Arg Lys Leu Asp Asp

245 250 255

Leu Lys Ile Ser Cys Glu Val Tyr Asn Leu Gly Thr Gly Asn Gly Thr

260 265 270

Ser Val Leu Glu Met Val Ala Ala Phe Glu Lys Ala Ser Gly Lys Lys

275 280 285

Ile Pro Leu Val Met Ala Gly Arg Arg Pro Gly Asp Ala Glu Val Val

290 295 300

Tyr Ala Ser Thr Glu Lys Ala Glu Arg Glu Leu Asn Trp Lys Ala Lys

305 310 315 320

Asn Gly Ile Glu Glu Met Cys Arg Asp Leu Trp Asn Trp Ala Ser Asn

325 330 335

Asn Pro Tyr Gly Tyr Asn Ser Ser Ser Asn Gly Ser Ser Ser

340 345 350

<210> 3

<211> 365

<212> DNA

<213> 擬南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 3

agatgaataa tatctgttaa tataattcac aattcgttgt attatctccc atactccata 60

atatatcaca atttatgatt gtaatgtaaa tctgtcaaat ggtttgttgt ctataagaca 120

tcataagtca catacccctg taccatcctt tgtcttgtag tcggttccaa agacagtaag 180

gtgaggtctc cggccaactg caacttgttg gacataaggc atgagattgt tgggaactcc 240

aagaggatct tcaccaatgt aaccactatg atgtgcacca acagggttga agtatctaag 300

caatatgatc ttccattccg agtcagaacg atgtacatcc cggcaaatct cttcgataaa 360

aagct 365

<210> 4

<211> 445

<212> DNA

<213> 擬南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 4

tctgttttcc atcttgtatt ttcatcatca gctactgtct atggctggcc taaggaggtt 60

ccttgcactg aggagtcacc aatttctgcc actaacccat atggcacgta caaaggtatc 120

acctttagcc tgagtattga cccaagccca ccttgtgata gtggtgatga atgataataa 180

tcaggaaatg aatctgactg acattatttg cttgtgctgt gtaagctgca gcccgggccg 240

tccaccacgc gtgccctaag ntgagtcgta agggccttcg accacgcgtg ccctatagtg 300

agtcgtaaca cacacctgcc ccatagtgat tcgtaatgac gcttttacac cgactgccac 360

atggtccccc ccctcacata ttcttgtatc atcccctgct ctccgctcaa gcctcgccct 420

acattatttt tgggacccca gtccc 445