專利名稱：磷酸乙醇胺n－甲基轉(zhuǎn)移酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。進(jìn)一步來說，本發(fā)明涉及植物表達(dá)載體λ455和正/反義植物表達(dá)文庫的構(gòu)建；涉及利用該技術(shù)體系克隆磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(phosphoethano λamine N-methyltransferaseAtPEAMT)基因；涉及利用該基因提高植物抗鹽能力和創(chuàng)造人工雄性不育農(nóng)作物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過該模式植物的突變表型以及同源基因的相關(guān)功能研究ΠEAMT基因及在植物耐鹽堿和植物雄性不育上的作用。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是將本發(fā)明的ΠEAMT基因轉(zhuǎn)化植物(特別是具有重要生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的農(nóng)作物)，培育出耐鹽堿植物和創(chuàng)造新的雄性不育親本，拓展雜種優(yōu)勢的利用。
為達(dá)到上述目的，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下一、構(gòu)建模式植物擬南芥χΔNA表達(dá)文庫如圖一所示利用質(zhì)粒 置換λΓEM-12的中間填充片段，得到λ455。λλ455質(zhì)粒中含有XoλE1復(fù)制起始原點(diǎn)，編碼βετα-λαχταμασε(BΛA)基因，籍此能夠在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中復(fù)制和篩選。通過T-ΔNA，該載體能夠?qū)⑼庠处A片段整合插入到植物基因組中；兩個(gè)串聯(lián)的35∑啟動子和NO∑終止子可使外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)；篩選標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NΠT II)可甄別轉(zhuǎn)基因植株的真?zhèn)巍＆?55中含有兩個(gè)λοξ重復(fù)序列，能夠在χρε蛋白的催化下進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組。在侵入 菌株τρπX9830(λKX)(能夠產(chǎn)生χρε蛋白)后，λ455能夠環(huán)化生成可直接進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。通過這個(gè)重組系統(tǒng)，得到λ455的χΔNA表達(dá)文庫轉(zhuǎn)化擬南芥。
二、產(chǎn)生正/反義表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物及τ365的表型構(gòu)建擬南芥 野生型χΔNA的λ455表達(dá)文庫，大約得到～2×106個(gè)重組體，經(jīng)感染E.χολ τρπX9830(λKX)后，收集χΔNA質(zhì)粒文庫并轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌Γ 3101(πMΠ90PK)。根癌農(nóng)桿菌在固體培養(yǎng)基上生長3天，然后在液體培養(yǎng)基上28°X培養(yǎng)2小時(shí)，通過真空抽濾方法(6)轉(zhuǎn)化擬南芥 野生型植株。通過連續(xù)兩代50μγ/Λ卡那霉素篩選，播種T2代種子觀察表型。T3代種子分析并保留表型穩(wěn)定遺傳的株系。其中含有本發(fā)明涉及的突變體，命名為T365。其表型見附圖2。
τ365突變體的遺傳分析通過對117個(gè)T2代植株的ΠXP檢測，同時(shí)進(jìn)行∑ουτηερνβλοτ鑒定，分離比例為88∶29符合預(yù)期的單位點(diǎn)插入比例(χ2＝0.0028；Π＞0.90)，分別播種觀察含有T-ΔNA插入的野生表型τ365以及不含有T-ΔNA插入的野生表型τ365，含有T-ΔNA插入的突變體發(fā)生分離且分離比類似T1代轉(zhuǎn)基因植株，沒有T-ΔNA插入的野生表型植株后代均為野生型。上述結(jié)果表明τ365的突變表型是由于χΔNA的插入突變造成的。
三、基因克隆(附圖3)根據(jù)35∑啟動子和NO∑終止子的序列設(shè)計(jì)引物，ΠXP反應(yīng)可以擴(kuò)增出插入到植物基因組中的χΔNA片段(附圖3A)，或者利用質(zhì)粒拯救的策略克隆T-ΔNA插入涉及的基因組序列。利用ΠXP擴(kuò)增得到的χΔNA片段作探針，篩擬南芥的χΔNA文庫，得到21個(gè)克隆，其中最長的克隆為1.457κβ含有22 A堿基的ΠολψA片段。5-PAXE和序列分析證明篩到全長χΔNA片段(圖4)。比較χΔNA和基因組ΔNA的序列，發(fā)現(xiàn)τ365基因含有12個(gè)外顯子，編碼492個(gè)氨基酸，分子量為56.1KΔ。BΛA∑T分析擬南芥基因組中含有3個(gè)拷貝。同源序列分析表明τ365與菠菜中編碼∑-αδενοσψλ-Λ-μετη ον νε-πηοσπηοετηανολαμ νεN-μετηψλτρανσφερασε(ΠEAMT)蛋白具有86％的氨基酸同源性，證明τ365基因在擬南芥中編碼磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶。Nορτηερν Bλοτ分析τ365突變體表型的產(chǎn)生是由于轉(zhuǎn)入植物中的χΔNA片段與內(nèi)源同源基因共抑制的結(jié)果。
功能研究表明τ365突變體在鹽脅迫條件下出現(xiàn)葉片漂白甚至死亡的現(xiàn)象。(圖5)不同溫度連續(xù)光照條件處理，τ365突變體表現(xiàn)溫敏不育的表型。在20.條件下為可育，在26.條件下表現(xiàn)為雄性不育(圖6)證明該基因與溫敏雄性不育現(xiàn)象有關(guān)。構(gòu)建含有突變體插入χΔNA片段的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生表型擬南芥得到雄性不育表型植株，證明τ365基因能夠通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到雄性不育轉(zhuǎn)基因植物。
我國目前存在人均耕地面積不斷減少，土地鹽堿化程度和面積不斷增加的問題，同時(shí)大面積的沿海灘涂和鹽堿化土壤閑置無用，耐鹽堿種質(zhì)的創(chuàng)造和品種的選育將有巨大的開發(fā)潛力。
隨著雜種優(yōu)勢的不斷利用，迫切需要解決雜種一代制種過程中人工去雄造成的成本高、效率低的問題。雜交水稻的成功關(guān)鍵在于光、溫敏雄性不育系的篩選成功?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展使得應(yīng)用τ365基因可導(dǎo)致植物溫敏雄性不育的功能在人工創(chuàng)造雄性不育轉(zhuǎn)基因植物成為可能。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。


附圖1.植物表達(dá)載體λ455以及植物表達(dá)文庫構(gòu)建附圖2.T365基因突變體表型，其中(A)和(B)分別表示生長35的野生型對照和τ365突變體植株，τ365突變體表現(xiàn)葉色淡綠(B)；(X)和(Δ)分別表示生長40天野生型對照和τ365突變體的蓮蓙葉，其中τ365植株表現(xiàn)早衰的現(xiàn)象(Δ)；(E)和(φ)表明野生型和τ365突變體植株開花結(jié)實(shí)的時(shí)期，其中τ365突變體果莢(φ)沒有種子；(Γ)和(H)分別是野生型和突變體的花器官的放大圖，(H)表明τ365植株雄性不育。
附圖3.基因克隆策略(A)通過35∑和NO∑設(shè)計(jì)引物通過ΠXP即可擴(kuò)增出插入的χΔNA片段。
(B)鄰近T-ΔNA插入位點(diǎn)的基因組ΔNA可以通過質(zhì)粒拯救方法分離。B，BαμHI；X，XλαI；H，H νδIII；P，EχοPI；∑，∑αχI；Ξ，ΞηολI.附圖4.T365基因序列及編碼氨基酸序列附圖5. NαXλ脅迫條件下χολ-0野生型(A)和T365基因突變體(B)表型附圖6.不同溫度條件下χολ-0野生型(A)和T365基因突變體(B)表型附圖7.同源比較擬南芥T365和菠菜ΠEAMT蛋白質(zhì)用QuickPrep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)提取擬南芥Columbia野生型的地上部分，經(jīng)TimeSaver cDNA Synthesis Kit(Pharmacia)合成cDNA。用Wizard Lamda Preps DNA Purification System(Promega)制備λ455 DNA。50μΛ酶切體系，30單位的EχοPI，完全酶切4μγλ455ΔNA，經(jīng)HKπηοσπηατασε(Eπ χεντρε Tεχηνολογ εσ)30°X水浴1小時(shí)脫磷處理，加入5μΛοφ3M NαAχ和110μΛ-20°X預(yù)冷乙醇，20°X保溫 ，16,900γ離心 ，加入1μΛ70％ 乙醇清洗沉淀，吹干后懸浮在8μΛ TE緩沖液中。2μγ經(jīng)EχοPI酶切，磷酸化處理的λ455ΔNA載體與15μΛχΔNA在25μΛ連接體系中過夜連接，經(jīng)oneReady-To-Go Lamda Packaging Reaction System(Pharmacia)包裝。
2、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥λπηαγε感受態(tài)細(xì)胞(參照方法制備)，與1μΛ新制備的 菌株τρπX9830(λKX)(10)在1μΛ ΛB培養(yǎng)基(含10μM MγXλ2)37°X共培養(yǎng)30分鐘后，取150μΛ涂板(50μγμΛ-1 和50μγμΛ-1κανκμψχ ν)，37°X培養(yǎng)過夜，懸浮于250μΛΛB(含 和 )培養(yǎng)基中，37°X搖床振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，用πολψετηψλενε γλψχολ提取純化質(zhì)粒ΔNA(9)。電激轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株Γ 3101(πMΠ90PK)，用真空抽濾方法轉(zhuǎn)化擬南芥Xολ-0野生型。植株轉(zhuǎn)化前培養(yǎng)在1/3的B5培養(yǎng)基、23°X、連續(xù)光照條件下。轉(zhuǎn)化植株(T0)自花授粉后收到T1種子，采用50μγμΛ-1 在1/2M∑培養(yǎng)基上篩選?？?的植株轉(zhuǎn)移到土壤中單株收種得到T2代種子。
3、遺傳分析與分子生物學(xué)鑒定利用 35S-F2(5’ACCACGTCTTCAAAGCAAGTG3’)和 NOS-R2(5’TATGATAATCATCGCAAGACCG3’)片段作引物，提取突變體DNA進(jìn)行PCR檢測。反應(yīng)條件如下94°X變性3分鐘，45個(gè)循環(huán)(94°X1分鐘，58°X退火1分鐘，72°X延伸1分鐘)最后72°X延伸10分鐘。同收ΔNA片段作探針，southern blot鑒定。T365 cDNA的5’端使用5’-RACE Kit(BoehringerMannheim)鑒定。采用的3個(gè)引物SP1(5’GTTTGTGAGCACTGGTGGAC3’)、SP25’TGGCCAAAGACACGCTCATAG3’)、P3(5’GACATAAGCTCCAATGCACTTG3’)?？寺CR產(chǎn)物于pBluescriptII SK(+)(Stratagene)載體，用37 3A DNA測序儀和ΔψEναμ χΔ ρεχτδΓTΠ∑εθυενχ νγK τ(Aμερσηαμ)測序。為驗(yàn)證τ365是否與突變表型共分離，利用T-ΔNA載體引物35∑-Ф2和T365χΔNA片段特殊引物T365-R(5’GATGAGAA-CTTTACCTCCCG3’)PCR擴(kuò)增突變體基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體再轉(zhuǎn)化擬南芥Xολ-0野生表型植株，在T1、T2代得到τ365的表型證明突變表型與τ365基因有關(guān)。提取植物基因組ΔNA與PNA，常規(guī)σουτηερν和Nορτηερν βλοτ鑒定突變基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的情況。
4、播種Xολ-0和τ365突變體，在連續(xù)光照((80το 120μE μ-2σεχ-1)，20°X、23°X、26°X條件下分別培養(yǎng)，觀察雄性不育表型。結(jié)果表明20°X條件下突變體可育，26°X條件下突變體完全不育，該基因受溫度誘導(dǎo)。
5、播種Xολ-0和τ365突變體于同一個(gè)營養(yǎng)缽中，噴施50μM、100μM、200μM、400μM、500μM濃度的NαXΛ，觀察表型并照相。試驗(yàn)結(jié)果顯示低濃度(50μM)NαXΛ即可誘導(dǎo)明顯的表型差異，突變體葉片漂白死亡。該基因在表達(dá)受到抑制時(shí)，突變體明顯不耐鹽堿。該基因與鹽逆境有關(guān)。
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權(quán)利要求
1.一種編碼磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因τ365。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的τ365基因，其核苷酸序列所示ACTCTTTTCGCTCTCAGATCTGAAACCTTATCTGAATTACATTTCCCCGATTCGACGTTG 60TGCGAATTGATGCAGCAGAGAGGACGATCCGTCAACCGCAGATCACGAAGCTTCTCTAGA 120TCCAGACTCGCCGTCGAAGGCCACTGAATTACTCTCTCCCCTCTCTTGGCAGATCTTCTT 180CTTCGTTTTTTCCCGACAAACGACATTTCCGAAATGGCTGCATCGTACGAAGAAGAGCGT 240GATATTCAGAAGAATTACTGGATAGAGCATTCCGCTGATCTGACTGTTGAAGCTATGATG 300CTTGACTCGAGAGCTTCTGATCTCGACAAGGAAGAACGTCCTGAGGTACTCTCTTTGCTC 360CCTCCATATGAAGGCAAATCAGTGTTGGAACTTGGAGCTGGTATTGGTCGTTTCACTGGT 420GAATTAGCTCAAAAGGCTGGTGAACTCATTGCTCTTGACTTCATTGATAACGTTATCAAG 480AAGAATGAAAGTATCAATGGGCATTACAAGAATGTCAAGTTTATGTGTGCTGATGTTACA 540TCCCCTGACCTCAAGATCACTGATGGATCTCTTGACTTGATTTTCTCCAACTGGCTGCTC 600ATGTATCTTTCTGACAAAGAGGTGGAGCTTTTGGCAGAAAGGATGGTCGGTTGGATCAAG 660GTTGGAGGATACATTTTCTTCCGTGAATCTTGCTTCCACCAATCAGGGGACAGTAAGCGG 720AAATCCAACCCCACTCACTACCGTGAACCCCGTTTCTATTCCAAGGTCTTTCAAGAGTGT 780CAGACTCGGGATGCTGCTGGAAATTCATTTGAGCTCTCTATGATCGGATGCAAGTGCATT 840GGAGCTTATGTCAAGAACAAGAAGAATCAGAATCAGATTTGTTGGATATGGCAGAAGGTC 900AGCTCAGAAAATGACAGAGGCTTCCAACGTTTCTTGGACAATGTCCAATACAAATCCAGT 960GGAATCCTACGCTATGAGCGTGTCTTTGGCCAAGGGTTTGTGAGCACTGGTGGACTTGAG 1020ACAACCAAAGAATTTGTGGAGAAAATGAATCTGAAACCAGGACAGAAAGTCTTAGATGTT 1080GGGTGTGGCATTGGTGGAGGTGACTTCTACATGGCTGAGAAGTTTGATGTTCACGTTGTT 1140GGTATCGATCTTTCTGTCAACATGATCTCTTTCGCATTGGAACGTGCTATTGGACTCAGC 1200TGCTCGGTTGAGTTTGAGGTTGCTGATTGCACCACAAAACACTACCCAGATAATTCGTTT 1260GATGTCATTTACAGCCGTGACACTATTCTGCACATCCAAGACAAACCAGCCTTGTTTAGG 1320ACTTTCTTCAAATGGCTTAAACCGGGAGGTAAAGTTCTCATCAGCGACTACTGTAGAAGC 1380CCCAAAACTCCATCTGCTGAGTTTTCAGAGTACATCAAACAGAGAGGATATGATCTCCAT 1440GACGTTCAAGCTTATGGACAGATGCTAAAAGACGCTGGCTTCACTGATGTGATCGCAGAG 1500GACCGTACTGATCAGTTTATGCAAGTCCTGAAACGTGAATTAGACAGGGTGGAGAAAGAA 1560AAGGAAAAATTCATCTCCGACTTCTCCAAAGAGGATTACGATGACATTGTTGGAGGATGG 1620AAGTCAAAGCTGGAGAGGTGTGCATCGGATGAGCAGAAATGGGGACTTTTCATCGCCAAC 1680AAGAATTAAGCAAATCGAAATCTACTACTTCTATGTTTTCTTCTTTCTTTGTTTGTTCAA 1740TAAAAATGTCATTTCCGCTAGGTGATGATATATGCCTGTAGTGTGTTATGTGGACTTGTT 1800GAGTGGTGTTAAATCTTGTTTCCCTTATGTGATATGTAAACCGAATTATGTTTGGTCTTA 1860GTTTATACTCTTTGATTTGAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
3.由權(quán)利要求2所要求的核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列如下MAASYEEERDIQKNYWIEHSADLTVEAMMLDSRASDLDKEERPEVLSLLPPYEGKSVLELGAGIGRFTGELAQKAGELIALDFIDNVIKKNESINGHYKNVKFMCADVTSPDLKITDGSLDLIFSNWLLMYLSDKEVELLAERMVGWIKVGGYIFFRESCFHQSGDSKRKSNPTHYREPRFYSKVFQECQTRDAAGNSFELSMIGCKCIGAYVKNKKNQNQICWIWQKVSSENDRGFQRFLDNVQYKSSGILRYERVFGQGFVSTGGLETTKEFVEKMNLKPGQKVLDVGCGIGGGDFYMAEKFDVHVVGIDLSVNMISFALERAIGLSCSVEFEVADCTTKHYPDNSFDVIYSRDTILHIQDKPALFRTFFKWLKPGGKVLISDYCRSPKTPSAEFSEYIKQRGYDLHDVQAYGQMLKDAGFTDVIAEDRTDQFMQVLKRELDRVEKEKEKFISDFSKEDYDDIVGGWKSKLERCASDEQKWGLFIANKN
4.一種植物表達(dá)載體λ455。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述，編碼磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因τ365在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物表達(dá)載體λ455在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明構(gòu)建了植物表達(dá)載體λ455，并以此載體構(gòu)建了擬南芥的xΔNA表達(dá)文庫。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥(Aραβιδоπσισ)，得到了一系列突變體。其中一個(gè)突變體表現(xiàn)為早衰、葉色淡綠以及雄性不育。通過基因克隆、序列測定和轉(zhuǎn)基因分析，表明此基因是編碼磷酸乙醇胺N－甲基轉(zhuǎn)移酶пEAMT)的基因。該基因在表達(dá)水平上的抑制導(dǎo)致該突變體對高濃度鹽、高溫環(huán)境條件敏感，從而產(chǎn)生溫敏型雄性不育性。該基因在植物抗鹽、抗逆和利用雄性不育性配制雜交種子方面具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N15/82GK1394957SQ0112021
公開日2003年2月5日 申請日期2001年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月6日
發(fā)明者李家洋, 牟中林, 王曉群, 付志明, 戴亞, 包方, 韓暢, 歐陽劍, 胡玉欣, 劉新仿 申請人:中國科學(xué)院遺傳研究所