專利名稱：差異表達(dá)篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過差異表達(dá)篩選基因的方法。
背景技術(shù)：
基因?qū)ふ?gene discovery)領(lǐng)域的一個(gè)中心目標(biāo)是了解和闡明特定病狀與限定和/或引起該病狀的基因表達(dá)模式之間的關(guān)系。這樣，有可能鑒定出對(duì)疾病診斷或治療具有潛在的巨大醫(yī)學(xué)價(jià)值的基因。這些基因的產(chǎn)物可以直接用作治療劑，基因本身可以用于基因治療，或者可以發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)和作用以治療疾病的小分子效應(yīng)物。研究集中在患病和健康組織之間表達(dá)模式的差異上，以闡明疾病的生理學(xué)機(jī)制。鑒定出的表達(dá)模式差異提供了一般認(rèn)定的逆轉(zhuǎn)疾病表型的治療切入點(diǎn)。這些差異還提供了診斷標(biāo)記，并確定進(jìn)一步研究的蛋白質(zhì)為影響所述疾病的因素。
基因表達(dá)的差異篩選是本領(lǐng)域一項(xiàng)眾所周知的技術(shù)，經(jīng)常與扣除cDNA克隆法一起成功用于鑒定參與一系列細(xì)胞活動(dòng)的基因。一般來說，或者使用測(cè)定mRNA表達(dá)水平的核酸型方法進(jìn)行差異篩選，或者使用諸如雙向凝膠電泳的技術(shù)分離細(xì)胞含有的總蛋的蛋白質(zhì)組方法進(jìn)行差異篩選。
迄今為止已知的差異表達(dá)篩選方法(甚至那些基于DNA芯片技術(shù)的方法)的一個(gè)問題是目的基因產(chǎn)物的絕對(duì)水平和/或兩種特定狀態(tài)(例如，存在和不存在生長因子，或者在兩種不同的細(xì)胞類型中)之間的基因產(chǎn)物表達(dá)差異可能相當(dāng)?shù)汀Ｒ虼?，盡管迄今為止使用標(biāo)準(zhǔn)差異表達(dá)篩選技術(shù)已經(jīng)鑒定出一些非常重要的基因，但許多在細(xì)胞活動(dòng)中可能起重要作用的基因仍然難以鑒別，因?yàn)槠浔磉_(dá)水平低，或者因?yàn)榭捎^察到的其表達(dá)水平變化可能相當(dāng)小。
常規(guī)差異篩選方法存在的另一個(gè)問題是這些方法不能讓人們剖析正在研究的遺傳或生化途徑。鑒定出的基因表達(dá)的任何變化都是整體性的，而不是明確針對(duì)研究途徑的特定方面。因此，本領(lǐng)域需要一種易于在分子水平剖析生物途徑的方法。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種基于差異表達(dá)的改進(jìn)型篩選方法。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種用于鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的遺傳因子的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括對(duì)比在以下細(xì)胞中的基因表達(dá)(a)第一種目的細(xì)胞；和(b)第二種目的細(xì)胞，該細(xì)胞由于引入異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子；鑒定差異表達(dá)的遺傳因子。
術(shù)語“遺傳因子”是指包括基因、基因產(chǎn)物(如RNA分子和多肽)、順式作用調(diào)節(jié)元件(如啟動(dòng)子元件和增強(qiáng)子元件)。該方法可鑒別所評(píng)價(jià)的這些分子類型中任一種的表達(dá)模式差異，并按照所研究的細(xì)胞活動(dòng)置于生物演化關(guān)系(biological context)中。該方法還允許可鑒別研究的組成型遺傳因子差異，以便例如鑒定對(duì)特定生物活動(dòng)的生物反應(yīng)有影響的突變和多態(tài)性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種目的細(xì)胞還包括相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子。然而，在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，所述第一種目的細(xì)胞具有正常生理水平的生物分子。所述生物分子可能已在功能上表征，或者未充分表征。
通常，第二種目的細(xì)胞中的生物分子水平升高或降低。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物分子和由所述異源核酸編碼的多肽為同一分子。所述多肽可能已在功能上表征，或者未充分表征。
所述核酸最好控制多肽表達(dá)。所述異源核酸編碼的多肽最好參與細(xì)胞活動(dòng)。所述“參與細(xì)胞活動(dòng)”是指發(fā)現(xiàn)所述基因在細(xì)胞的遺傳或代謝途徑中具有與眾不同的作用。所述多肽可能涉及產(chǎn)生或維持特定疾病表型或生理?xiàng)l件的敏感性。專業(yè)技術(shù)讀者顯而易見的是，任何途徑中的任意點(diǎn)都可能是獨(dú)一無二的點(diǎn)，細(xì)胞在該點(diǎn)偏離正常生理反應(yīng)而產(chǎn)生疾病表型。表現(xiàn)為疾病的作用經(jīng)常是由突變事件造成，其中在相關(guān)生理途徑起作用的蛋白的基因編碼序列發(fā)生突變。
核酸最好使用病毒載體傳遞至細(xì)胞。在此情況下，異源核酸應(yīng)當(dāng)與病毒載體同線。專業(yè)技術(shù)讀者顯而易見的是，不同的病毒載體適于不同的細(xì)胞類型。按照本發(fā)明使用的病毒載體最好得自逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒如馬傳染性貧血病病毒(EIAV)或1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和痘病毒如昆蟲痘病毒。
用于本發(fā)明目的的病毒載體優(yōu)選特征為有效轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞的能力以及使基因表達(dá)中任何微擾最小化的能力，所述干擾可能緣自使用的病毒載體本身，但與引入的異源目的核酸不是特異性相關(guān)(“表型沉默”)。病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，該領(lǐng)域在迅速發(fā)展，用于各種細(xì)胞類型的優(yōu)選載體隨著領(lǐng)域的發(fā)展在變化。例如，在撰寫本發(fā)明時(shí)，優(yōu)選的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)載體是腺病毒載體，因?yàn)樵撦d體可能使轉(zhuǎn)導(dǎo)水平最高。該載體不能以表型沉默轉(zhuǎn)導(dǎo)，但有可能使用合適的控制因素將載體對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)的影響排除在外。另一方面，能夠表型沉默轉(zhuǎn)導(dǎo)的得自慢病毒EIAV的載體在海馬神經(jīng)元中產(chǎn)生最有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此成為選擇用于該用途的載體。載體的表型沉默經(jīng)常是需要的，但必須與轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相平衡。本文包括的實(shí)施例中描述的載體開發(fā)以所述細(xì)胞類型中的這兩個(gè)特征最優(yōu)化為目標(biāo)。對(duì)載體技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明與載體類型無關(guān)，但通過優(yōu)化選擇每種細(xì)胞類型的載體，可以增進(jìn)本發(fā)明的實(shí)施。
一般而言，可以使用蛋白質(zhì)組技術(shù)或使用基于核酸的基因組或cDNA技術(shù)測(cè)定第一種和第二種細(xì)胞中的基因表達(dá)。
在本發(fā)明第一方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供一種用于鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的遺傳因子的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括對(duì)比在以下細(xì)胞中的基因表達(dá)(a)第一種目的細(xì)胞；和(b)與所述第一種細(xì)胞不同的第二種目的細(xì)胞，該細(xì)胞由于引入異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子；并鑒定差異表達(dá)的遺傳因子。
所述核酸最好控制多肽(例如上述參與細(xì)胞活動(dòng)的多肽)的表達(dá)。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于鑒定其表達(dá)受信號(hào)調(diào)控的遺傳因子的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括在兩種不同信號(hào)水平下對(duì)比(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中所述信號(hào)處于第一種水平；和(b)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子，該生物分子的活性對(duì)信號(hào)起反應(yīng)，其中所述信號(hào)處于第二種水平；并鑒定差異表達(dá)的遺傳因子。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面，使用已知或猜測(cè)參與細(xì)胞活動(dòng)的多肽鑒定該活動(dòng)的其它組分，方法是改變細(xì)胞中所述多肽的水平，以改善所鑒定其它組分水平的信噪比，使它們更易于通過差異表達(dá)技術(shù)進(jìn)行鑒定。
因此，本發(fā)明還提供一種用于鑒定其表達(dá)在細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)生改變的遺傳因子的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括對(duì)比(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；和(b)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞經(jīng)修飾含有水平改變的影響細(xì)胞活動(dòng)的多肽；并鑒定差異表達(dá)的遺傳因子。
所述多肽的水平改變優(yōu)選是由于將控制所述多肽在細(xì)胞中表達(dá)的異源核酸引入細(xì)胞中造成。更優(yōu)選所述異源核酸與病毒載體共線。
在本發(fā)明第三方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過生物信號(hào)調(diào)節(jié)遺傳因子的表達(dá)，所述方法包括對(duì)比兩種不同信號(hào)水平的兩種細(xì)胞類型中的基因表達(dá)的步驟。
因此，本發(fā)明在此方面提供一種用于鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的遺傳因子的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括對(duì)比(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；和(b)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的影響細(xì)胞活動(dòng)的生物分子；并鑒定差異表達(dá)的遺傳因子，其中在至少兩種與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的不同環(huán)境條件下對(duì)比所述第一種和/或第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)。優(yōu)選在至少兩種與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的不同環(huán)境條件下同時(shí)對(duì)比所述第一種和第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞接觸的環(huán)境條件可以是不同水平的生物信號(hào)?？梢栽谝韵颅h(huán)境條件下對(duì)比兩種細(xì)胞類型中的基因表達(dá)沒有信號(hào)、存在第一種水平的信號(hào)和/或存在第二種水平的信號(hào)(例如，在含氧量正常[20％氧]和低氧[＜1％氧]之間的不同百分比的大氣氧含量)。使用至少兩種水平的生物信號(hào)允許對(duì)比環(huán)境條件改變以及異源核酸對(duì)這些細(xì)胞類型的作用，并鑒定其表達(dá)在生物信號(hào)水平和測(cè)試的環(huán)境條件之間以相同方式或以不同方式作用的遺傳因子。當(dāng)然，不同類型的環(huán)境變化、細(xì)胞類型和異源核酸可以以相同的方式應(yīng)用兩種以上水平的生物信號(hào)。
因此，本發(fā)明此方面的一個(gè)實(shí)施方案提供一種用于鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的遺傳因子的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括對(duì)比
(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(b)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞接觸與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的生物信號(hào)，其中所述生物信號(hào)為第一種水平；(c)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞接觸與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的生物信號(hào)，其中所述生物信號(hào)為第二種水平；(d)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子的活性對(duì)所述生物信號(hào)起反應(yīng)，其中所述信號(hào)為沒有、第一種水平或第二種水平；并鑒定差異表達(dá)的遺傳因子。
在本發(fā)明此方面的一個(gè)替代的實(shí)施方案中，細(xì)胞接觸的環(huán)境條件可以為不同類型的環(huán)境變化(例如細(xì)胞接觸的不同生長因子的水平變化)。使用兩種環(huán)境變化允許對(duì)比每種環(huán)境變化和異源核酸對(duì)每種細(xì)胞類型的作用，并鑒定其表達(dá)在這些測(cè)試的環(huán)境變化之間以相同方式或不同方式作用的遺傳因子。每種細(xì)胞類型和每種異源核酸可以以相同的方式應(yīng)用兩種以上的環(huán)境變化。
因此，本發(fā)明在此方面提供一種用于鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的遺傳因子的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括對(duì)比；(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(b)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞接觸第一種類型的環(huán)境變化；(c)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞接觸第二種類型的環(huán)境變化；(d)第二種目的細(xì)胞在接觸或不接觸第一種和/或第二種類型環(huán)境變化的條件下的基因表達(dá)，所述第二種細(xì)胞由于引入控制多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子的活性對(duì)b)和c)項(xiàng)提及的一種或兩種環(huán)境變化起反應(yīng)；并鑒定差異表達(dá)的遺傳因子。
在本發(fā)明以上的實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞類型還可以含有由于引入控制多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子的活性對(duì)環(huán)境條件差異起反應(yīng)。
第一種細(xì)胞中的生物分子可以與第二種細(xì)胞中水平改變的生物分子相同。在該實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞和第二種細(xì)胞中的生物分子水平應(yīng)當(dāng)不同。
因此，本發(fā)明在此方面提供一種用于鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的遺傳因子的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括對(duì)比(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(b)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞接觸與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的生物信號(hào)；(c)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞由于引入控制多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子，其活性對(duì)所述生物信號(hào)起反應(yīng)，其中所述水平改變的生物分子為第一種水平，而其中所述生物信號(hào)或者存在或者不存在；(d)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(e)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞接觸與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的生物信號(hào)；(f)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞由于引入控制多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子，其中所述水平改變的生物分子為第二種水平，而其中所述生物信號(hào)或者存在或者不存在；并鑒定差異表達(dá)的遺傳因子。
使用兩種表達(dá)水平的異源核酸允許對(duì)比每種水平和生物信號(hào)對(duì)每種細(xì)胞類型的作用，并鑒定其表達(dá)在這些測(cè)試的水平和生物信號(hào)之間以相同方式或不同方式作用的遺傳因子。每種細(xì)胞類型和每種生物信號(hào)可以以相同的方式應(yīng)用兩種以上表達(dá)水平的異源核酸。
另一方面，第一種細(xì)胞中的生物分子可以與第二種細(xì)胞中水平改變的生物分子不同。在該實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞和第二種細(xì)胞中的生物分子水平可以相同，或者可以不同。
因此，本發(fā)明在此方面提供一種用于鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的遺傳因子的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括對(duì)比；(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(b)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞接觸與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的生物信號(hào)；(c)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制第一種多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的第一種生物分子，其活性對(duì)所述生物信號(hào)起反應(yīng)，其中所述生物信號(hào)或者存在或者不存在；(d)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(e)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞接觸與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的生物信號(hào)；(f)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制第二種多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的第二種生物分子，其中所述生物信號(hào)或者存在或者不存在；并鑒定差異表達(dá)的遺傳因子。
使用兩種類型的異源核酸允許對(duì)比每種異源核酸類型和生物信號(hào)對(duì)每種細(xì)胞類型的作用，并鑒定其表達(dá)在這些異源核酸類型和生物信號(hào)之間以相同方式或不同方式作用的遺傳因子。所測(cè)試的每種細(xì)胞類型和每種生物信號(hào)可以以相同的方式應(yīng)用兩種以上類型的的異源核酸。本發(fā)明的該方面能夠?qū)ふ以谔囟ōh(huán)境變化下受不同生物分子差異調(diào)節(jié)的基因。這提高了組織和細(xì)胞特異性治療調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)的可能性。
在以上所有的實(shí)施方案中，對(duì)比其基因表達(dá)的第一種和第二種細(xì)胞可以為不同的細(xì)胞類型(例如，健康細(xì)胞和患病細(xì)胞)。使用兩種或多種細(xì)胞類型允許對(duì)比不同生物信號(hào)和異源核酸對(duì)這些細(xì)胞類型的作用，并鑒定其表達(dá)在這些測(cè)試的細(xì)胞類型和生物信號(hào)之間以相同方式或不同方式作用的遺傳因子?？梢砸韵嗤绞皆u(píng)價(jià)兩種以上的細(xì)胞類型。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽影響疾病過程。因此，第一種細(xì)胞可以得自正常患者，而第二種細(xì)胞得自患病患者，反之亦可。或者，第一種細(xì)胞得自患病患者，而第二種細(xì)胞得自同一患病患者或患同樣疾病的患者。
因此，本發(fā)明再一個(gè)方面提供一種用于鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的基因或基因產(chǎn)物的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括(i)對(duì)比以下細(xì)胞中的基因表達(dá)(a)第一種目的細(xì)胞；和(b)第二種目的細(xì)胞；(ii)對(duì)比以下細(xì)胞中的基因表達(dá)(a)第一種目的細(xì)胞；和(b)第三種目的細(xì)胞，該細(xì)胞由于引入控制侯選基因或基因產(chǎn)物擴(kuò)增或表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的侯選基因或基因產(chǎn)物；和(iii)選擇那些導(dǎo)致第三種目的細(xì)胞中的第二種基因或基因產(chǎn)物的水平、拷貝數(shù)或表達(dá)相對(duì)于第一種目的細(xì)胞發(fā)生改變的侯選基因或基因產(chǎn)物，所述第二種目的細(xì)胞中的第二種基因或基因產(chǎn)物相對(duì)于第一種目的細(xì)胞也具有改變的水平、拷貝數(shù)或表達(dá)。
所述侯選基因產(chǎn)物優(yōu)選為多肽或RNA分子。
在本發(fā)明以上方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供一種用于鑒定參與疾病過程的基因產(chǎn)物的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括(i)對(duì)比以下細(xì)胞中的基因表達(dá)(a)得自正?；颊叩牡谝环N目的細(xì)胞；和(b)得自患病患者的第二種目的細(xì)胞；(ii)對(duì)比以下細(xì)胞中的基因表達(dá)
(a)第一種目的細(xì)胞；和(b)得自正常患者的第三種目的細(xì)胞，該細(xì)胞由于引入控制侯選基因或基因產(chǎn)物擴(kuò)增或表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的侯選基因或基因產(chǎn)物；和(iii)選擇那些導(dǎo)致第三種目的細(xì)胞中的第二種基因或基因產(chǎn)物的水平、拷貝數(shù)或表達(dá)相對(duì)于第一種目的細(xì)胞發(fā)生改變的侯選基因或基因產(chǎn)物，所述第二種目的細(xì)胞中的第二種基因或基因產(chǎn)物相對(duì)于第一種目的細(xì)胞也具有改變的水平、拷貝數(shù)或表達(dá)。
在本發(fā)明此方面的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物的表達(dá)優(yōu)選受到信號(hào)(例如和疾病過程相關(guān)的生物或其他環(huán)境信號(hào))調(diào)節(jié)，該方法包括對(duì)比兩種不同信號(hào)水平下所述細(xì)胞類型中基因表達(dá)的步驟。
在上述的本發(fā)明實(shí)施方案中，通過使用核酸技術(shù)鑒定那些其水平在不同目的細(xì)胞類型改變的mRNA轉(zhuǎn)錄物，進(jìn)行基因表達(dá)對(duì)比。
在上述的本發(fā)明實(shí)施方案中，通過使用蛋白分析技術(shù)鑒定那些其水平在不同目的細(xì)胞類型之間改變的多肽，進(jìn)行基因表達(dá)對(duì)比。
按照本發(fā)明的再另一方面，提供一種增加差異表達(dá)篩選方法敏感性的方法，其中對(duì)比第一種和第二種目的細(xì)胞在兩種不同水平信號(hào)作用下的基因表達(dá)，該方法包括將異源核酸引入第一種細(xì)胞或第二種細(xì)胞中，以增加調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)信號(hào)反應(yīng)的生物分子的水平。發(fā)明詳述盡管本文提及的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，但特別可參閱Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)，第4版，John Wiley &Sons，Inc。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科技術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。A.差異表達(dá)篩選技術(shù)基因編碼基因產(chǎn)物，主要為多肽，但也有RNA，這些產(chǎn)物參與的細(xì)胞活動(dòng)不計(jì)其數(shù)。差異表達(dá)篩選技術(shù)是基于這樣一種構(gòu)思通過對(duì)比兩組環(huán)境下的表達(dá)，可以鑒定出在這兩種條件下其表達(dá)發(fā)生改變的基因，反過來其功能又與這些條件之間的差異有關(guān)。例如，可通過對(duì)比接觸有絲分裂原如血小板衍生生長因子(PDGF)的細(xì)胞中的基因表達(dá)和未接觸PDGF的細(xì)胞中的基因表達(dá)，鑒定涉及PDGF反應(yīng)途徑的基因。
因此，本文使用的術(shù)語“差異表達(dá)篩選”是指對(duì)比不同條件下兩種細(xì)胞之間的基因表達(dá)或相同或不同條件下兩種不同細(xì)胞之間的基因表達(dá)，目的是鑒定其表達(dá)水平在兩種細(xì)胞之間不同的基因或基因產(chǎn)物。
可使用各種技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)差異。第一種主要類型的技術(shù)是基于核酸檢測(cè)，本文稱為“基因組或cDNA技術(shù)”。Kozian和Kirschbaum(1999)中提供了有用的綜述。第二種主要類型的技術(shù)是基于細(xì)胞蛋白含量的檢測(cè)，本文稱為“蛋白質(zhì)組技術(shù)”?；蚪M或cDNA技術(shù)本領(lǐng)域一個(gè)眾所周知的方法是扣除cDNA雜交。該技術(shù)包括將一種細(xì)胞(例如對(duì)照細(xì)胞)的mRNA群與由另一種細(xì)胞(例如接觸PDGF的細(xì)胞)的mRNA制備的cDNA群雜交。該步驟將把eDNA制備物中兩種細(xì)胞共有的序列全部去除。由其表達(dá)在接觸PDGF的細(xì)胞中上調(diào)的mRNA產(chǎn)生的cDNA將沒有對(duì)應(yīng)的對(duì)照mRNA與其雜交，可以分離。通常，還將所述cDNA與同一細(xì)胞的mRNA雜交，以證實(shí)它們代表編碼序列。此方法詳述于WO90/11361，其中使用得自用化學(xué)物質(zhì)N-(氨基羰基)-2-氯苯磺酰胺處理的植物根部細(xì)胞的mRNA產(chǎn)生cDNA文庫，然后將該文庫與未處理根細(xì)胞的mRNA雜交。該方法鑒定出大量其表達(dá)受所述化學(xué)物質(zhì)上調(diào)的基因。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)已經(jīng)導(dǎo)致了許多其它方法的發(fā)展。首先由Liang和Pardee(1992)描述了RT-PCR差異展示。該技術(shù)包括使用寡脫氧胸苷酸引物和隨機(jī)寡核苷酸10聚物對(duì)不同細(xì)胞群的反轉(zhuǎn)錄RNA進(jìn)行PCR。經(jīng)常使用放射性標(biāo)記核苷酸進(jìn)行PCR，以使產(chǎn)物在凝膠電泳和放射自顯影后可以顯色。Wilkinson等(1995)使用PCR差異展示鑒定出5種在草莓成熟過程中被上調(diào)的mRNA。Zhang等(1998)提供了差異展示RT-PCR(也叫做mRNA差異展示)的綜述，最近的使用“長距離”PCR的改進(jìn)描述于Zhao等(1999)。
另一種技術(shù)稱作cDNA文庫篩選。Maser和Calvet(1995)提供了該技術(shù)以及以上提及的其它兩種差異表達(dá)篩選技術(shù)的綜述。
差異展示競(jìng)爭(zhēng)性PCR是一種相當(dāng)新的技術(shù)，已經(jīng)成功用于研究在僅有少數(shù)基因改變表達(dá)水平的條件(例如MCF17細(xì)胞接觸雌二醇)下和更復(fù)雜條件(例如人NTERA2細(xì)胞的神經(jīng)元差異)下的基因表達(dá)總體變化(Jorgensen等，1999)。
其它適于分析特定細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)的技術(shù)包括基因表達(dá)連續(xù)分析(SAGE；Velculescu等，Science(1995)270；484-487)，經(jīng)抗生物素介導(dǎo)和限制介導(dǎo)的富集選擇性擴(kuò)增(SABRE)(Lavery等，(1997)，PNAS USA 946831-6836頁)、差異展示(例如指標(biāo)化差異展示反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(DDRT-PCR；Mahadeva等(1998)J.Mol.Biol.284，1391-1398))、代表性差異分析(RDA)(Hubank(1999)Methodsin Enzymology 303325-349；參見Kozian和Kirschbaum(1999)的綜述和其中的參考文獻(xiàn))、差異篩選cDNA文庫(參見Sagerstrom等(1997)Annu.Rev.Biochem.，66751-783；“Advanced Molecular Biology”，R.M.Twyman(1998)Bios Scientific Publisher，Oxford；“Nucleic AcidHybridization”，M.L.M.Anderson(1999)Bios Scientific Publisher，Oxford)、RNA印跡、RNA酶保護(hù)測(cè)定、S1核酸酶保護(hù)測(cè)定、RT-PCR、實(shí)時(shí)RT-PCR(Taq-man)、EST測(cè)序、整體平行特征測(cè)序(MPSS)和雜交測(cè)序(SBH)(參閱Drmanac R.等(1999)，Methods in Enzymology 303165-178)。這些技術(shù)中的大部分綜述于“Comparative gene-expressionanalysis”Trends Biotechnol.1999年2月；17(2)73-8。
可以許多方式對(duì)其表達(dá)在兩種細(xì)胞群中不同的基因產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)際鑒定。扣除方法固有鑒定其表達(dá)不同的基因產(chǎn)物，因?yàn)槠浔磉_(dá)相同的基因產(chǎn)物已由樣品中去除。其它方法包括僅對(duì)比一種細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物和另一種細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物，并任選借助于計(jì)算機(jī)程序觀察任何差異(用基于PCR的技術(shù)，每個(gè)樣品中的產(chǎn)物數(shù)量可限制在合理的大小)。例如使用基于PCR的技術(shù)，顯色對(duì)比不同泳道上出現(xiàn)的條帶，可鑒定只有一個(gè)泳道才有的條帶。這些條帶可由凝膠中切除，隨后進(jìn)行分析。
DNA芯片技術(shù)的出現(xiàn)使得可以通過使用微陣列方便地進(jìn)行對(duì)比(參閱Kozian和Kirschbaum，1999的綜述和參考文獻(xiàn))。通常使用固定在基體(例如尼龍濾膜、玻璃片或硅片)上的cDNA(包括EST)、PCR產(chǎn)物、克隆的DNA和合成寡核苷酸制備陣列。為測(cè)定基因表達(dá)差異，將標(biāo)記的cDNA或PCR產(chǎn)物與陣列雜交并對(duì)比雜交圖譜。使用熒光標(biāo)記探針可以同時(shí)分析一個(gè)芯片上的兩種不同細(xì)胞群的mRNA，以不同的波長檢測(cè)結(jié)果?；谖㈥嚵械牟町惐磉_(dá)篩選技術(shù)描述于US-A-5,800,992。蛋白質(zhì)組技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)大規(guī)模研究蛋白的特性，以在蛋白水平上獲得對(duì)疾病過程、細(xì)胞活動(dòng)及其聯(lián)系的整體、綜合看法。關(guān)于蛋白質(zhì)組中使用技術(shù)的綜述描述于Blackstock和Weir(1999)-另見其中提供的參考文獻(xiàn)。本發(fā)明方法主要涉及表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)，表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)使用分辨蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)和成像分析研究細(xì)胞中蛋白表達(dá)的整體變化。鑒于核酸分析突出信息，蛋白質(zhì)組學(xué)更多地涉及產(chǎn)物。兩種方法有時(shí)是互補(bǔ)的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)組技術(shù)可用于檢測(cè)由于蛋白穩(wěn)定性改變所引起的多肽水平(不是mRNA水平)變化。
蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域使用的一種廣為人知的獨(dú)特技術(shù)是使用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè)細(xì)胞的多肽含量，并對(duì)比其與另一種細(xì)胞的多肽含量。電泳的結(jié)果通常為用染料(如銀染或考馬斯亮藍(lán))顯色的凝膠，或者由凝膠產(chǎn)生的放射自顯影，所有斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)于各種蛋白的印跡。還可以使用熒光染料。
因此，目標(biāo)是鑒定在兩種凝膠/放射自顯影之間有差異的斑點(diǎn)，即其中一種沒有、強(qiáng)度減弱或強(qiáng)度增強(qiáng)。因此，在蛋白質(zhì)組學(xué)中，對(duì)比基因表達(dá)僅包括對(duì)比一種細(xì)胞和另一種細(xì)胞的蛋白譜。可利用商業(yè)軟件包進(jìn)行自動(dòng)斑點(diǎn)檢測(cè)。
可將目的斑點(diǎn)由凝膠中切除，并使用諸如基體加速激光解吸電離飛行時(shí)間(matrix-assisted-laser-desorption-ionisation-time-of-flight)(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析法和電噴射質(zhì)譜分析法的技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)(參閱“Proteomics to study genes and genomes”Akhilesh Pandey andMatthias Mann，(2000)，Nature 405837-846)。
可能需要進(jìn)行一些預(yù)分離檢測(cè)，例如離心或自由流動(dòng)電泳，以改善對(duì)低豐度蛋白的鑒定。還開發(fā)了對(duì)堿性蛋白、膜蛋白和其它低溶解性蛋白的特殊方法(Rabilloud等，1997)。
另外，蛋白和抗體陣列領(lǐng)域的新進(jìn)展現(xiàn)在可以同時(shí)檢測(cè)大量的蛋白質(zhì)。例如，在濾膜上的低密度蛋白陣列如通用蛋白陣列系統(tǒng)(Ge H，(2000)Nucleic Acids Res.28(2)，e3)使得可以用標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)和掃描電荷耦合裝置(CCD)檢測(cè)儀使陣列抗原成像。還開發(fā)了免疫傳感器陣列，能夠同時(shí)檢測(cè)臨床分析物?，F(xiàn)在，有可能使用蛋白陣列剖析體液蛋白表達(dá)，例如健康或患病個(gè)體的血清以及藥物治療前和治療后的患者的體液蛋白表達(dá)。
抗體陣列也促進(jìn)了推定影響疾病或特定生理狀態(tài)的眾多蛋白的大范圍平行分析。近來已經(jīng)報(bào)道了許多制備抗體陣列的方法(參閱Cahill，Trends in Biotechnology，2000 747-51)。
以上論述描述了技術(shù)人員可利用的在先技術(shù)方法，以在一般意義上對(duì)兩種或多種細(xì)胞群進(jìn)行差異表達(dá)篩選。還描述了為檢測(cè)總體基因表達(dá)變化而引入異源基因(Busch and Bishop，J Immunol，19991622555-2561；Robinson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997 947170-7175)。然而，本發(fā)明與這些先有技術(shù)方法的區(qū)別之處在于本發(fā)明需要進(jìn)一步的步驟，即由實(shí)驗(yàn)者改變細(xì)胞中特定內(nèi)源生物分子的水平，使得對(duì)細(xì)胞微擾(如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件)起反應(yīng)并受到生物分子影響的基因產(chǎn)物水平變得更容易檢測(cè)。換句話說，目的是放大和/或增加通常獲得的差異反應(yīng)的信噪比，使其細(xì)胞水平低和/或其表達(dá)通常僅小量改變的基因產(chǎn)物的檢測(cè)可能性增加。
舉例來說，轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α對(duì)胞內(nèi)氧水平起反應(yīng)。降低氧水平增加HIF-1α活性，并導(dǎo)致受控于低氧反應(yīng)因子(HRE)的基因轉(zhuǎn)錄增加。如果例如通過用控制HIF-1α表達(dá)的病毒載體感染細(xì)胞人為將細(xì)胞中的HIF-1α水平增加，那么預(yù)期HIF-1α介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)增加。因此，其表達(dá)對(duì)低氧敏感并由HIF-1α誘導(dǎo)介導(dǎo)的基因表達(dá)改變，應(yīng)當(dāng)大于表達(dá)生理水平HIF-1α的正常細(xì)胞。B.生物分子生物分子可以為由于細(xì)胞合成代謝或分解代謝過程或以任何方式由胞外環(huán)境攝取而在細(xì)胞中可見的任何化合物。術(shù)語“生物分子”是指在生物學(xué)意義上具有活性的分子。生物分子最好在細(xì)胞中合成(即是細(xì)胞內(nèi)源性的)或在多細(xì)胞生物情況下在生物體的任何細(xì)胞中合成。
因此生物分子的實(shí)例包括蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、類固醇、輔因子、擬態(tài)物、輔基(如血紅素)、無機(jī)分子、離子(如Ca2+)、肌醇磷脂、激素、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、炎性因子、毒素、代謝物、藥物因子、漿質(zhì)攜帶的營養(yǎng)物(包括葡萄糖、氨基酸、輔因子、無機(jī)鹽、蛋白和脂質(zhì))、外源或病理胞外組分、胞內(nèi)或胞外病原體(包括細(xì)菌、病毒、真菌或支原體)。適當(dāng)時(shí)還可以包括以上物質(zhì)的前體、單體、寡聚和多聚形式以及分解產(chǎn)物。
多肽生物分子的實(shí)例包括酶、轉(zhuǎn)錄因子、激素、細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分和受體(包括膜結(jié)合受體)。
最好已知所述生物分子涉及令人感興趣的細(xì)胞活動(dòng)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物分子對(duì)細(xì)胞環(huán)境條件(本文也稱作信號(hào))變化起反應(yīng)。這種環(huán)境條件或信號(hào)的實(shí)例包括細(xì)胞微環(huán)境的改變、接觸激素、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、炎性因子、毒素、代謝物、pH、藥物因子、低氧、缺氧、局部缺血、任何漿質(zhì)攜帶營養(yǎng)物(包括葡萄糖、氨基酸、輔因子、無機(jī)鹽、蛋白和脂質(zhì))的不平衡、滲透壓、溫度(低溫或高溫)、機(jī)械應(yīng)力、輻射(電離或非電離輻射)、細(xì)胞-胞外基體的相互作用、細(xì)胞-細(xì)胞的相互作用、外源或病理性胞外組分的累積、胞內(nèi)和胞外病原體(包括細(xì)菌、病毒、真菌或支原體)以及遺傳微擾(均為后生或由突變或多態(tài)性介導(dǎo))。由以上的羅列可清楚看出，信號(hào)可以是外部施加的信號(hào)如環(huán)境信號(hào)，例如氧化還原壓力、胞外配體與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，該結(jié)合導(dǎo)致由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)。另一方面，所述信號(hào)可以為內(nèi)部施加的信號(hào)，例如由于細(xì)胞代謝水平下降而使激酶活性增加。
可以直接或間接地改變生物分子水平。直接改變可通過例如在培養(yǎng)基中溫育細(xì)胞使細(xì)胞吸收分子實(shí)現(xiàn)，所述培養(yǎng)基含有的分子水平與生理水平不同例如高于生理水平。其它方法包括載體介導(dǎo)的傳遞和微注射。在核酸和多肽的情況下，可通過將控制核酸或多肽表達(dá)的異源核酸引入到細(xì)胞中而使細(xì)胞中的生物分子水平升高。
本文的術(shù)語“異源核酸”是指其天然不存在的核酸，即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其含有除了其引入形式之外其它形式不存在的核酸。例如，所述核酸可以為染色體外核酸，例如在以下物質(zhì)上編碼的核酸細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、病毒(包括例如桿狀病毒和SV40病毒(猿猴病毒)、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒)或其組合，如得自質(zhì)粒和噬菌體遺傳因子的物質(zhì)，包括粘粒和噬菌粒。所述核酸可以通過例如使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括小鼠或貓白血病病毒或慢病毒人免疫缺陷病毒和馬傳染性貧血病病毒)摻入到染色體中。還可以使用人、細(xì)菌和酵母人工染色體(分別為HAC、BAC和YAC)傳遞比其它載體可包含或表達(dá)的DNA片段大的DNA片段。還可以通過例如病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或同源重組(參見例如國際專利申請(qǐng)WO99/29837號(hào))或用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物胚胎或干細(xì)胞的微注射技術(shù)將所述核酸整合入基因組中。盡管如此，部分或全部異源核酸分子仍可以與對(duì)應(yīng)的基因組序列相同，因?yàn)橐腩~外拷貝基因?qū)τ谠黾釉摶虻谋磉_(dá)水平是一個(gè)便利的方法。
改變生物分子水平的間接方法為數(shù)眾多，包括使用以上描述的方法增加抑制或刺激性分子的水平。抑制性分子包括針對(duì)編碼生物分子的mRNA的反義核酸、核酶或EGS(外部向?qū)蛄?、針對(duì)生物分子的轉(zhuǎn)顯性失活突變體、轉(zhuǎn)錄因子、酶抑制劑和胞內(nèi)抗體如scFv。刺激性分子的實(shí)例包括酶激活劑和轉(zhuǎn)錄激活劑。因此，可以以多種方式處理細(xì)胞，使得生物分子的水平最終發(fā)生改變?？赏ㄟ^表達(dá)反義RNA降低表達(dá)。
按照本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)使生物分子的水平相對(duì)于生理水平發(fā)生改變。因此它們可以增強(qiáng)或者減弱。術(shù)語“相對(duì)于生理水平”是指在轉(zhuǎn)變這些水平之前，相對(duì)于在正常生理?xiàng)l件下通常存在于細(xì)胞類型中的生物分子的濃度或活性。因此，本發(fā)明通過慎重的方法，將生物分子的活性改變至在正常生理?xiàng)l件范圍下細(xì)胞中可見的水平之上或之下。“生理?xiàng)l件”包括通常體內(nèi)存在的條件和一般體外使用的細(xì)胞培養(yǎng)條件。
作為實(shí)施例，所述活性或濃度可以比例如引入異源核酸之前于細(xì)胞中存在的正常生理活性或濃度增加或降低2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
本發(fā)明還允許鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的遺傳因子。如上所述，術(shù)語“遺傳因子”是指包括基因、基因產(chǎn)物(如RNA分子和多肽)和順式作用調(diào)節(jié)元件(如啟動(dòng)子元件和增強(qiáng)子元件)。相比于常規(guī)的差異篩選技術(shù)，本發(fā)明顯著易化了對(duì)參與細(xì)胞活動(dòng)的基因和基因產(chǎn)物的鑒定，因?yàn)槭褂盟龇椒@著提高了信號(hào)水平和/或信噪比。
特別值得注意的是，本發(fā)明能夠鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的基因和基因產(chǎn)物并因此進(jìn)一步研究這些基因和基因產(chǎn)物的作用。例如，如果已知一種特定的多肽在細(xì)胞活動(dòng)中起作用，那么這就為開發(fā)修飾或調(diào)節(jié)多肽并由此影響細(xì)胞活動(dòng)本身的藥物鋪平了道路。這種信息顯然與疾病的分析、診斷和治療、鑒定侯選切入點(diǎn)具有極大關(guān)聯(lián)，并為開發(fā)能夠預(yù)防或糾正任何細(xì)胞活動(dòng)中任何導(dǎo)致不需要效應(yīng)(例如疾病)的生理不平衡的藥物鋪平道路。
除了鑒定基因和基因產(chǎn)物之外，本發(fā)明還允許鑒定其它與影響特定細(xì)胞活動(dòng)的基因相關(guān)的元件。這些元件的實(shí)例包括調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)中表達(dá)的基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子元件和增強(qiáng)子元件。鑒定這些元件對(duì)于研究細(xì)胞活動(dòng)具有極大價(jià)值，并且例如為開發(fā)對(duì)特定細(xì)胞活動(dòng)中產(chǎn)生的生物信號(hào)起反應(yīng)的合成調(diào)節(jié)元件鋪平了道路。
本發(fā)明在此方面包括鑒定基因及其調(diào)節(jié)元件中的突變和多態(tài)性，這些突變和多態(tài)性影響所述基因?qū)λ芯康募?xì)胞活動(dòng)的反應(yīng)。這類信息對(duì)于評(píng)價(jià)和剖析在不同生物條件下于不同個(gè)體之間發(fā)現(xiàn)的表達(dá)模式差異具有極大價(jià)值。
本發(fā)明的差異表達(dá)篩選方法還允許根據(jù)需要通過改變所研究途徑的特定方面，在分子水平剖析生物途徑。這樣，本發(fā)明方法比本領(lǐng)域已知的常規(guī)差異表達(dá)篩選方法有優(yōu)勢(shì)。這些先有技術(shù)方法對(duì)比不同生物條件下細(xì)胞群之間的基因表達(dá)模式，并因此獲得對(duì)兩種細(xì)胞群基因表達(dá)模式的總體判斷，即使使用的異源核酸與具體的生物途徑和反應(yīng)無關(guān)。相反，本發(fā)明方法通過將異源核酸引入一個(gè)細(xì)胞群，改變影響所研究途徑的特定生物分子的水平，可以仔細(xì)分析生物途徑的精確分子組分。
本發(fā)明在此方面可以用對(duì)低氧起生物反應(yīng)的特別實(shí)施例闡述，盡管專業(yè)技術(shù)讀者理解類似的細(xì)胞活動(dòng)同樣可用此方法研究。對(duì)低氧的生物應(yīng)答是復(fù)雜的，具有大量的參與分子組分。兩種重要的組分為蛋白HIF1α和EASP1。通過將編碼HIF1α的異源核酸引入一個(gè)細(xì)胞群，可以評(píng)價(jià)由HIF1α自身產(chǎn)生的基因表達(dá)模式差異。使用編碼EPAS1的異源核酸進(jìn)行一個(gè)相似實(shí)驗(yàn)，可以在此特別方面剖析對(duì)低氧的分子應(yīng)答。通過鑒定受一個(gè)途徑(HIF1α)調(diào)節(jié)而不受另一個(gè)途徑(EASP1)調(diào)節(jié)的分子組分，可以使用例如對(duì)HIF1α途徑組分特異性的因子選擇性調(diào)節(jié)該細(xì)胞活動(dòng)。本發(fā)明對(duì)低氧反應(yīng)的應(yīng)用能夠發(fā)現(xiàn)受HIF1α和EASP1差異性調(diào)節(jié)的新基因，并因此提升了組織和細(xì)胞特異性治療調(diào)節(jié)對(duì)低氧的細(xì)胞應(yīng)答的可能性。
HIF1α激動(dòng)劑或拮抗劑潛在地具有分別上調(diào)或下調(diào)低氧反應(yīng)(諸如血管生成和紅細(xì)胞生成)的應(yīng)用。例如，已知腎臟促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生受HIF1α調(diào)節(jié)(Bunn等(1998)EPO研究氧依賴性調(diào)節(jié)的模型系統(tǒng)，J Exp Biol 2011197-1201)，因此HIF1α拮抗劑可通過下調(diào)EPO而引起貧血。本發(fā)明鑒定受HIF1α和EASP1差異性調(diào)節(jié)的基因和清楚識(shí)別這兩種密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的不同作用的應(yīng)用使得可以開發(fā)EPAS1激動(dòng)劑或拮抗劑或者特異性差異調(diào)節(jié)基因的活性調(diào)節(jié)劑，以克服HIF1α調(diào)節(jié)的任何潛在臨床副作用，并因此能夠鑒定和開發(fā)用于診斷和治療低氧相關(guān)疾病的診斷和治療產(chǎn)品。
而在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過引入異源核酸(通常為控制多肽表達(dá)的核酸)改變生物分子水平，所述異源核酸應(yīng)當(dāng)包含有效連接至控制序列的編碼序列，該控制序列能夠保證宿主細(xì)胞表達(dá)所述編碼序列，即載體是表達(dá)載體。術(shù)語“有效連接”是指所述組分處于允許其以其預(yù)定方式起作用的關(guān)系?！坝行нB接”至編碼序列的調(diào)節(jié)序列可以這樣的方式與編碼序列連接在與控制序列匹配的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列表達(dá)。
例如可以通過加入另外的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件修飾控制序列，以使控制序列控制的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的反應(yīng)更強(qiáng)。
適于有效連接至本發(fā)明蛋白編碼序列的控制序列包括啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)。可以選擇那些與其中的表達(dá)載體設(shè)計(jì)使用的宿主細(xì)胞相容的控制序列。術(shù)語“啟動(dòng)子”是本領(lǐng)域眾所周知的，包括在大小和復(fù)雜性方面由最小啟動(dòng)子至包括上游元件和增強(qiáng)子的啟動(dòng)子的核酸區(qū)段。
啟動(dòng)子通常從在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子中選擇，盡管在合適的時(shí)候可以使用在原核細(xì)胞和其它真核細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子。因此，啟動(dòng)子通常得自病毒或真核生物基因的啟動(dòng)子序列。例如，可以是得自其中發(fā)生表達(dá)的細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子。真核生物啟動(dòng)子可以是以遍在方式(例如α-肌動(dòng)蛋白、β-肌動(dòng)蛋白、微管蛋白啟動(dòng)子)或以組織特異性方式(例如丙酮酸激酶基因啟動(dòng)子)起作用的啟動(dòng)子?？梢允褂锰囟?xì)胞特有的組織特異性啟動(dòng)子。還可以是對(duì)特定刺激物起反應(yīng)的啟動(dòng)子，例如結(jié)合甾類激素受體的啟動(dòng)子。還可以使用病毒啟動(dòng)子，例如莫洛尼鼠類白血病病毒長末端重復(fù)序列(MMLV LTR)啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動(dòng)子或人巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動(dòng)子。
誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可能有優(yōu)勢(shì)，可在細(xì)胞生存期間調(diào)節(jié)異源核酸表達(dá)水平?？烧T導(dǎo)是指使用所述啟動(dòng)子獲得的表達(dá)水平可以調(diào)節(jié)。
另外，這些啟動(dòng)子中的任何一個(gè)都可以通過加入另外的調(diào)節(jié)序列(例如增強(qiáng)子序列)進(jìn)行修飾。還可以使用包含得自上述兩種或多種不同啟動(dòng)子的序列元件的嵌合啟動(dòng)子。
合適載體的實(shí)例包括質(zhì)粒、人工染色體和病毒載體。病毒載體包括腺病毒載體、單純皰疹病毒載體和反轉(zhuǎn)錄病毒載體?？梢允褂酶鞣N本領(lǐng)域已知技術(shù)，如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、電穿孔、重組病毒載體(如反轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒和腺病毒)感染、直接注射核酸和biolistic轉(zhuǎn)化，將載體/多核苷酸引入到合適的宿主細(xì)胞中。特別優(yōu)選使用重組病毒載體介導(dǎo)技術(shù)。病毒載體按照本發(fā)明將異源核酸引入到細(xì)胞中使用的病毒載體可得自任何合適病毒。已經(jīng)鑒定了無數(shù)不同的病毒，存在的亞類包括反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒(為反轉(zhuǎn)錄病毒的亞類)、腺病毒和單純皰疹病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒實(shí)例包括鼠類白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒、人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)、馬傳染性貧血病病毒(EIAV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、Jembrana病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、長臂猿白血病病毒(GALV)、脾病灶形成病毒(SFFV)、小鼠乳瘤病毒(MMTV)、Rous肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠類白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠類骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠類肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠類白血病病毒(A-MLV)、禽類髓細(xì)胞組織增生病毒-29(MC29)和禽類成紅細(xì)胞增多病毒(AEV)。反轉(zhuǎn)錄病毒的詳細(xì)清單可見Coffin等，1997，“Retroviruses”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，主編JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，758-763頁。
可在本領(lǐng)域獲得許多反轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)。作為實(shí)施例，有關(guān)HIV、EIAV和Mo-MLV的細(xì)節(jié)可見NCBI Genbank(基因組登錄號(hào)分別為AF033819、U01866和AF033811)。
反轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒亞型甚至可再分為“靈長類”和“非靈長類”病毒。靈長類慢病毒的實(shí)例包括獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的致病因子人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長類慢病毒類包括原型“慢病毒”維斯那/梅迪病毒(VMV)以及相關(guān)性山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病病毒(EIAV)和最新描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和Jembrana病毒。
反轉(zhuǎn)錄病毒基因組基本結(jié)構(gòu)是5′LTR和3′LTR，位于它們之間或之中的是能夠包裝基因組的包裝信號(hào)(psi)、引物結(jié)合位點(diǎn)、能夠整合入宿主細(xì)胞基因組的整合位點(diǎn)以及編碼包裝組分(為病毒顆粒組裝所需要的多肽)的gag、pol和env基因。更復(fù)雜的反轉(zhuǎn)錄病毒具有其它特征，例如HIV中的rev和RRE序列，它們能夠?qū)⒄显《镜腞NA轉(zhuǎn)錄物由細(xì)胞核有效輸送至感染靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。HIV-1基因組具有的其它特征為編碼輔助蛋白的tat、vif、vpu、vpr和nef，輔助蛋白是病毒感染性必須的或調(diào)節(jié)病毒的感染性。慢病毒基因組具有的另一個(gè)特征是促進(jìn)非分裂細(xì)胞感染的中心多嘌呤段/中心終止序列(cPPT/CTS)。
在原病毒中，這些基因和其它元件位于稱作長末端重復(fù)序列(LTR)的區(qū)域兩端的側(cè)翼。LTR負(fù)責(zé)原病毒整合和轉(zhuǎn)錄。因此，它們含有增強(qiáng)子一啟動(dòng)子序列，并可以控制病毒基因表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄病毒RNA依靠位于病毒基因組5′末端附近的psi序列包衣殼。
LTR本身是相同的序列，可以分為三種元件，叫做U3、R和U5。U3得自RNA 3′末端獨(dú)有的序列。R得自RNA兩個(gè)末端重復(fù)的序列，而U5得自RNA 5′末端獨(dú)有的序列。三種元件的大小在不同的反轉(zhuǎn)錄病毒中可顯著不同。病毒RNA兩端的R區(qū)為重復(fù)序列，而U5和U3分別代表RNA基因組5′末端和3′末端獨(dú)有的序列。
對(duì)于一個(gè)用于本發(fā)明篩選方法的典型反轉(zhuǎn)錄病毒載體，至少可以去除病毒復(fù)制必須的一個(gè)或多個(gè)gag、pol和env蛋白編碼區(qū)中的一部分。這產(chǎn)生了復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體。其它修飾，如去除U3區(qū)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件或缺失輔助蛋白基因，也可以使載體復(fù)制缺陷。去除的部分甚至可以由目的核苷酸序列(NOI)代替，如編碼上述生物分子的核苷酸序列，以產(chǎn)生能夠?qū)⑵浠蚪M整合入宿主基因組的載體，但其中修飾的病毒基因組由于缺少結(jié)構(gòu)蛋白而不能自身繁殖。
在整合入宿主基因組時(shí)，NOI或者由于載體LTR轉(zhuǎn)錄或者由于位于合適位置(例如LTR之間的合適位置和相對(duì)于NOI的合適位置)的啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄而發(fā)生表達(dá)。應(yīng)當(dāng)注意的是，還可以用不同的啟動(dòng)子替代LTR中存在的病毒啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子序列通常在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性。控制一個(gè)或多個(gè)第一核苷酸序列表達(dá)的啟動(dòng)子序列可以是例如組成型或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以是例如病毒啟動(dòng)子，如天然病毒啟動(dòng)子或CMV啟動(dòng)子，或者可以是哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。特別優(yōu)選使用在特定細(xì)胞類型或組織類型中具有優(yōu)選活性或可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用組織特異性調(diào)節(jié)序列。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子系統(tǒng)的實(shí)例是四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)(Clontech，Palo Alto，CA)。
因此，通常通過以下方法將NOI轉(zhuǎn)移入目的位點(diǎn)將NOI整合入重組病毒載體；將修飾的病毒載體包裝為病毒體顆粒；并允許目的位點(diǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)-例如靶細(xì)胞或靶細(xì)胞群。
因此，用于本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒載體的最小基因組包括(5′)R-U5-包裝信號(hào)(psi)和一種或多種第一核苷酸序列-U3-R(3′)。然而，用于產(chǎn)生宿主細(xì)胞/包裝細(xì)胞載體基因組的質(zhì)粒載體還包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制序列，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制序列有效連接至控制基因組在宿主細(xì)胞/包裝細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的載體基因組。這些調(diào)節(jié)序列可以為與轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄病毒序列相關(guān)的天然序列，即5′U3區(qū)，或者它們可以為異源啟動(dòng)子，例如另一種病毒啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子。制備反轉(zhuǎn)錄病毒載體可通過使用生產(chǎn)細(xì)胞系、包裝細(xì)胞系或者瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的合適細(xì)胞系生產(chǎn)復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
生產(chǎn)細(xì)胞系是表達(dá)能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體顆粒裝配所需的所有組分的細(xì)胞系。即它們表達(dá)形成載體顆粒所需的gag/pol和包膜蛋白，并產(chǎn)生包裝入載體顆粒的載體基因組轉(zhuǎn)錄物。通常，生產(chǎn)細(xì)胞與包裝細(xì)胞的不同之處僅在于它們還可以穩(wěn)定表達(dá)載體RNA這一事實(shí)。通過能夠控制載體RNA表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，或者整合入宿主細(xì)胞核DNA后通過能夠控制載體RNA合成的載體基因組轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以將載體RNA引入包裝細(xì)胞中制備生產(chǎn)細(xì)胞。還可以通過控制載體RNA轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橐贿^性生產(chǎn)細(xì)胞。還可以由僅包含形成可轉(zhuǎn)導(dǎo)載體顆粒必須的三種組分中的兩種的細(xì)胞系制備生產(chǎn)細(xì)胞。例如，在MLV載體領(lǐng)域，TelCEB細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)MLV gag/pol和MLV載體基因組MFGnlsLacZ。通過引入控制包膜基因表達(dá)的質(zhì)?？梢詫elCEB細(xì)胞系轉(zhuǎn)變?yōu)樯a(chǎn)細(xì)胞系。在這方面，應(yīng)當(dāng)注意的是盡管gag/pol基因得自同一病毒，但env可以得自相同病毒，也可得自不同病毒。當(dāng)由于利用不同病毒的包膜功能而形成感染性顆粒時(shí)，據(jù)認(rèn)為載體顆粒已經(jīng)假型化。例如，在慢病毒載體領(lǐng)域，通常制備由棒狀病毒、水泡性口炎病毒G蛋白假型化的載體。
還可以通過用表達(dá)轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒形成所需組分的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染合適細(xì)胞系瞬時(shí)制備載體顆粒。例如，可通過用控制gag/pol、載體基因組和包膜表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人細(xì)胞系HEK 293T生產(chǎn)MLV、EIAV或HIV載體顆粒(Soneoka等，1995)。例如為增加滴度，還可以共轉(zhuǎn)染另一種質(zhì)粒。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法正開發(fā)載體時(shí)可有利地用于檢測(cè)載體產(chǎn)生水平。在這一點(diǎn)上，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染避免了產(chǎn)生穩(wěn)定載體生產(chǎn)細(xì)胞系所需的時(shí)間長的缺點(diǎn)，還可以在載體或反轉(zhuǎn)錄包裝組分對(duì)細(xì)胞有毒時(shí)使用。通常用于產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體的組分包括編碼gag/pol蛋白的質(zhì)粒、編碼env蛋白的質(zhì)粒和包含NOI的質(zhì)粒。載體產(chǎn)生包括將這些組分中的一種或多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入含其它需要組分的細(xì)胞中。如果載體編碼毒性基因或干擾宿主細(xì)胞復(fù)制的基因(例如細(xì)胞周期抑制劑或誘導(dǎo)凋亡的基因)，則可能難以產(chǎn)生穩(wěn)定的載體生產(chǎn)細(xì)胞系，但瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可用于在細(xì)胞死亡前產(chǎn)生載體。此外，用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的細(xì)胞系產(chǎn)生的載體滴度水平與由穩(wěn)定載體生產(chǎn)細(xì)胞系獲得的水平相當(dāng)。
現(xiàn)在，排列單獨(dú)編碼的顆粒形成組分編碼基因已成為反轉(zhuǎn)錄病毒載體領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)操作。例如，F(xiàn)LYA13 MLV包裝細(xì)胞系具有表達(dá)MLV gag/pol和env的單獨(dú)轉(zhuǎn)錄單元。該策略降低了可復(fù)制病毒的生產(chǎn)可能性，因?yàn)橐吧筒《旧a(chǎn)需要三個(gè)重組事件。因?yàn)橥葱苑浅Ｓ幸嬗谥亟M，所以降低或消除載體和輔助病毒基因組之間的同源性還可以用于減少可復(fù)制輔助病毒產(chǎn)生的問題。
生產(chǎn)細(xì)胞/包裝細(xì)胞可以是任何合適的細(xì)胞類型。最通常使用的是哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞，但其它細(xì)胞如昆蟲細(xì)胞并沒有被排除在外。顯然，生產(chǎn)細(xì)胞必須能夠有效翻譯env和gag、pol mRNA。許多合適的生產(chǎn)包裝細(xì)胞系是本領(lǐng)域已知的。技術(shù)人員還能夠通過例如將編碼包裝組分的核苷酸構(gòu)建物穩(wěn)定引入細(xì)胞系中來制備合適的包裝細(xì)胞系。
非常理想的是，在實(shí)驗(yàn)和實(shí)際應(yīng)用時(shí)都使用高滴度病毒制備物。一種增加病毒的技術(shù)是濃縮病毒母液。通過離心可以很便利地達(dá)到此目的，但也可以使用其它方法如柱層析。
基于慢病毒的載體系統(tǒng)特別適用于本發(fā)明。這是因?yàn)樗鼈兡軌蚋腥痉至鸭?xì)胞或非分裂細(xì)胞?？蓪?shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移的非分裂細(xì)胞實(shí)例包括神經(jīng)元和造血干細(xì)胞。另外，可以構(gòu)造慢病毒載體，以便它們?cè)诎屑?xì)胞中僅表達(dá)NOI。實(shí)際上它們是表型沉默。因此，引入轉(zhuǎn)基因的過程對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生的微擾最小。已經(jīng)開發(fā)了基于HIV-1、EIAV和FIV的載體系統(tǒng)，并已經(jīng)開發(fā)至據(jù)說最小的程度。HIV-1和EIAV的最小載體系統(tǒng)描述于WO 98/17815和WO 99/32646以及Kim等(1998)J.Virol，72，811-816和Mitrophanous等(1996)Gene Therapy，6，1808-1818。在這些最小系統(tǒng)中，載體組分被工程為在靶細(xì)胞中僅表達(dá)NOI，而且生產(chǎn)使用細(xì)胞的病毒蛋白表達(dá)降低至最小。對(duì)于HIV-1和EIAV兩個(gè)系統(tǒng)來說，為形成感染性顆粒必須表達(dá)的慢病毒基因僅僅是gag/pol和rev。與Rev反應(yīng)元件(RRE)組合起作用的Rev必須達(dá)到形成高水平顆粒所需的Gag/Pol水平。一種甚至更進(jìn)一步降低慢病毒蛋白要求的途徑是密碼子優(yōu)化gag/pol。這使得Rev/RRE成為表達(dá)無關(guān)型。慢病毒gag/pol的密碼子優(yōu)化過程描述于WO 99/41397、Kotsopoulou等，(2000)J.Virol.74，4839-4852。EIAV gag/pol的密碼子優(yōu)化過程描述于英國專利申請(qǐng)0009760.0。
本文通過解釋給出了有關(guān)密碼子優(yōu)化過程的更多信息。不同物種細(xì)胞的具體密碼子使用不同。這種密碼子偏倚反映出細(xì)胞類型中特定tRNA相對(duì)豐度的偏差。通過改變序列中的密碼子使得它們與對(duì)應(yīng)的tRNA的相對(duì)豐度匹配，有可能增加表達(dá)?；谕瑯永碛?，通過故意選擇已知對(duì)應(yīng)的tRNA在特定細(xì)胞類型中罕有的密碼子，有可能降低表達(dá)。因此，可獲得另外的翻譯控制度。
許多病毒，包括HIV和其它慢病毒，使用大量罕有密碼子，通過將這些密碼子改變?yōu)椴溉閯?dòng)物通常使用的相應(yīng)密碼子，可以增加包裝組分在哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞中的表達(dá)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及各種其它生物的密碼子使用表是本領(lǐng)域已知的。
密碼子優(yōu)化具有許多其它優(yōu)勢(shì)。利用其序列中的改變，生產(chǎn)細(xì)胞/包裝細(xì)胞中編碼病毒顆粒組裝所需的病毒顆粒包裝組分的核苷酸序列具有由其中除去的RNA不穩(wěn)定序列(INS)。與此同時(shí)，仍保留包裝組分編碼序列，使得由所述序列編碼的病毒組分保持相同，或至少保持足夠相似，以確保包裝組分的功能未失效。密碼子優(yōu)化還解決了Rev/RRE的輸出需要，使得優(yōu)化序列與Rev無關(guān)。密碼子優(yōu)化還降低了載體系統(tǒng)中不同構(gòu)建物之間(例如gag-pol重疊區(qū)和env可讀框之間)的同源重組。因此，密碼子優(yōu)化的總體作用是顯著增加病毒滴度和改善安全性。
在一個(gè)方案中，僅有與INS相關(guān)的密碼子進(jìn)行密碼子優(yōu)化。然而，在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，序列整體進(jìn)行密碼子優(yōu)化，除了包含移碼部位的序列。gag-pol基因包含兩個(gè)分別編碼gag和pol蛋白的重疊讀框。兩種蛋白的表達(dá)依賴于翻譯過程中的移碼。這種移碼是由于翻譯過程中核糖體“滑動(dòng)”造成。這種滑動(dòng)據(jù)認(rèn)為至少部分是由于核糖體失速(stalling)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)引起。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)存在于gag/pol基因的移碼部位下游。對(duì)于HIV，重疊區(qū)由gag起始處下游的核苷酸1222(其中核苷酸1為gag ATG的A)延伸至gag末端(核苷酸1503)。因此，跨越移碼部位和兩個(gè)讀框重疊區(qū)的281bp片段最好不進(jìn)行密碼子優(yōu)化。保留此片段能夠更有效地表達(dá)gag-pol蛋白。對(duì)于EIAV，重疊區(qū)的起始處已經(jīng)到了核苷酸1262(其中核苷酸1為gag ATG的A)。重疊區(qū)的末端在核苷酸1461。為了確保保留下移碼部位和gag-pol重疊區(qū)，保留野生型序列的核苷酸1156至1465。
可以對(duì)最優(yōu)密碼子使用進(jìn)行衍化，例如為了提供便利的限制位點(diǎn)，可以將保守氨基酸變化引入到gag-pol蛋白中。
在一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，密碼子優(yōu)化基于高度表達(dá)的哺乳動(dòng)物基因?？梢愿淖兊谌齻€(gè)堿基，有時(shí)可以改變第二和第三個(gè)堿基。
由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，專業(yè)技術(shù)人員可以獲得眾多gag/pol序列。還存在許多據(jù)描述可用作產(chǎn)生密碼子優(yōu)化的gag/pol序列起點(diǎn)的反轉(zhuǎn)錄病毒變異體。慢病毒基因組可變性相當(dāng)大。例如存在許多仍有功能的HIV-1準(zhǔn)物種。對(duì)EIAV也有同樣的情況。這些變異體可用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的特定部分。HIV-1變異體的實(shí)例可見于http//hiv-web.lanl.gov。EIAV克隆的詳述可見于NCBI數(shù)據(jù)庫http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
任何反轉(zhuǎn)錄病毒均可以使用密碼子優(yōu)化gag/pol序列的策略。這應(yīng)適用于所有的慢病毒，包括EIAV、FIV、BIV、CAEV、Maedi/Visna、SIV、HIV-1和HIV-2。另外，此方法還可用于增加HTLV-1、HTLV-2、HFV、HSRV以及人內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(HERV)、MLV和其它反轉(zhuǎn)錄病毒基因的表達(dá)。
可以幾種方式增強(qiáng)慢病毒載體的性能。最值得注意的是，對(duì)病毒基因組的修飾改善了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和NOI表達(dá)水平。這兩種類型的修飾可改善慢病毒載體用于本文所述用途的適用性。可通過加入稱作中心多嘌呤段/中心終止序列(cPPT/CTS)的元件改善轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。該元件約200個(gè)核苷酸，天然地位于病毒基因組中心附近，并顯示改善HIV-1型載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)(Follenzi等，(2000)Nat Genet.2000年6月；25(2)217-22；Sirven等，Blood，2000年12月15日；96(13)4103-10)。可利用旱獺肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(WHPRE)改善NOI表達(dá)。該元件為600bp，通過涉及增強(qiáng)聚腺苷酸化的機(jī)制增加mRNA半壽期來增強(qiáng)蛋白表達(dá)。其有益作用已在許多載體中得到證實(shí)，包括HIV-1型載體(Zuffeerey，J Virol.(1999)4月；73(4)2886-92；Ramezani等，Mol Ther.2000年11；2(5)458-69)。使用該元件的這種方法和其它方法描述于WO 99/14310號(hào)。
還可以使用得自痘病毒的載體(包括得自牛痘病毒、禽類痘病毒和昆蟲痘病毒的載體)在廣泛的靶細(xì)胞類型中表達(dá)NOI。其應(yīng)用綜述于B Moss.1996(痘病毒科病毒及其復(fù)制，載于Virology，BN Fields等主編，83章，2637-2671頁，Lippincott-Raven Publishers；PA USA)。得自α-病毒和痘病毒的載體的應(yīng)用綜述于MW Carroll等，2001(哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)和免疫接種；載于Genetically Engineered Viruses，107-158頁，C Ring & E Blair主編，BIOS Scientific Publishers Ltd OxfordUK)。還可以將腺伴隨病毒載體用作基因轉(zhuǎn)移載體，其應(yīng)用綜述于以下的出版物“用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療的腺伴隨病毒載體”(Bueler，H AUTHOR AFFILIATIONInstitut fur Molekularbiologie，UniversitatZurich，Switzerland，來源Biol Chem 1999年6月；380(6)613-22)。C.目的細(xì)胞目的細(xì)胞可以為任何細(xì)胞，例如原核細(xì)胞、真菌細(xì)胞(例如酵母)、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞(例如昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人細(xì)胞)。在多細(xì)胞生物細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞可以為靈長類細(xì)胞或無限增殖細(xì)胞系，可以包含組織樣品，或者它們可以為活體生物的組成部分。盡管細(xì)胞經(jīng)常是指單個(gè)細(xì)胞，但一般意義上的細(xì)胞為細(xì)胞群組成部分。
在本發(fā)明方法中，需要對(duì)比至少兩種不同細(xì)胞之間的基因表達(dá)。通常兩種或多種細(xì)胞中的第一種細(xì)胞叫做參比細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于對(duì)比的細(xì)胞基本上在所有方面都相同。例如，它們可以都是相同細(xì)胞系的細(xì)胞，或者可以得自一個(gè)生物體的同一組織。然后，可以操作其中一種或兩種細(xì)胞，使它們包含如B節(jié)所述的相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞未改變，而第二種細(xì)胞改變。特別優(yōu)選這種情況，因?yàn)檫@應(yīng)當(dāng)改善信噪比。但在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩種細(xì)胞都改變。
盡管如此，用作研究起點(diǎn)的細(xì)胞也不一定要大致相同。例如，在本發(fā)明的一個(gè)方面，可以使用患病生物(例如哺乳動(dòng)物患者)的細(xì)胞研究參與疾病過程的基因。這可以與正常生物細(xì)胞或得自相同或不同患病個(gè)體的類似細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比。在使用正常生物細(xì)胞或患病生物細(xì)胞時(shí)，正常細(xì)胞一般相當(dāng)于第一種目的細(xì)胞，而患病細(xì)胞相當(dāng)于第二種目的細(xì)胞。因此，至少如以上B節(jié)所述，患病細(xì)胞發(fā)生改變，使得這些細(xì)胞包含水平改變的生物分子。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，一種細(xì)胞是含突變基因的細(xì)胞，而另一種細(xì)胞含野生型形式的同一基因。
本發(fā)明包含的另一種可能性是細(xì)胞得自不同組織或得自發(fā)育或分化的不同階段。D.應(yīng)用本發(fā)明提供許多利用差異表達(dá)篩選技術(shù)鑒定基因的改進(jìn)方法。
在第一方面，提供一種鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的基因的方法。大體上是操作一種細(xì)胞類型，使得細(xì)胞中參與細(xì)胞活動(dòng)的生物分子水平發(fā)生改變。通常，這可以通過將控制多肽表達(dá)的異源核酸引至所述細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)。所述多肽可以和生物分子相同，或者可以如上所述調(diào)節(jié)生物分子的水平。
一般來說，僅調(diào)節(jié)兩種相同細(xì)胞中的一種細(xì)胞的生物分子水平然后檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄不是本發(fā)明方法的目的，因?yàn)槭菣z測(cè)細(xì)胞中生物分子對(duì)基因表達(dá)的作用，而不是改變生物分子水平以增強(qiáng)或降低對(duì)目的事件的反應(yīng)。
但是，在生物分子為細(xì)胞天然產(chǎn)生的基因產(chǎn)物(如多肽)時(shí)，通過引入異源核酸改變基因產(chǎn)物水平可同時(shí)用于微擾細(xì)胞活動(dòng)和增強(qiáng)對(duì)這種微擾的反應(yīng)，所以易于使用差異表達(dá)技術(shù)鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的基因產(chǎn)物。作為實(shí)施例，HIF-1α過表達(dá)增強(qiáng)了低氧反應(yīng)下游的元件，因?yàn)槠湓鰪?qiáng)了HIF-1α介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用。
盡管如此，在本發(fā)明的較廣泛方面，存在兩種最大的可能性。第一種可能性是兩種細(xì)胞類型不同，并具有固有的差異基因表達(dá)模式。在此情況下，生物分子水平改變可用于增強(qiáng)這些差異。所述兩種細(xì)胞例如可得自不同組織，或者可得自不同的發(fā)育或分化階段。所述兩種細(xì)胞還可以因?yàn)橐环N細(xì)胞得自患病組織而另一種細(xì)胞得自正常組織而不同。在以上C節(jié)中給出了設(shè)想的其它配置。
第二種可能性是兩種細(xì)胞類型相同，但一種細(xì)胞以某種方式受刺激，而另一種細(xì)胞沒有(或一種細(xì)胞的受刺激程度高于另一種)。例如，一種細(xì)胞可以在生長因子存在下溫育，而另一種沒有。因此，在此實(shí)例中，生長因子不是生物分子，而是用來微擾細(xì)胞中基因表達(dá)的刺激物或信號(hào)，其作用可通過所述生物分子增強(qiáng)，而其又被由異源核酸表達(dá)的多肽改變水平。
因此，本發(fā)明在此方面提供以下方法通過使兩種不同的細(xì)胞群經(jīng)受不同水平的信號(hào)或環(huán)境條件，鑒定其表達(dá)受信號(hào)或環(huán)境變化調(diào)節(jié)的基因，通過操作任一種或兩種細(xì)胞群，以改變其活性對(duì)信號(hào)或環(huán)境條件起反應(yīng)的生物分子的水平，并鑒定其表達(dá)不同的基因產(chǎn)物。術(shù)語“其活性對(duì)信號(hào)或環(huán)境條件起反應(yīng)”包括任何其在細(xì)胞中的濃度根據(jù)信號(hào)或環(huán)境條件而變化的生物分子，以及其特性(如酶活性或?qū)α硪环N細(xì)胞組分的親和性)根據(jù)信號(hào)或環(huán)境條件而變化的生物分子。
因此，回到以上生長因子的實(shí)例，可以改變接觸生長因子的細(xì)胞，以表達(dá)增加水平的轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子參與涉及該特定生長因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)。因此，轉(zhuǎn)錄因子之后的生長因子的作用增強(qiáng)(或者負(fù)面意義或者正面意義)，所以易于鑒定其表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子并最終受生長因子調(diào)節(jié)的差異表達(dá)基因。
如上所述，信號(hào)或環(huán)境條件或者為物理信號(hào)，例如氧化還原條件的變化、CO2水平、光、滲透壓、溫度[低溫或高溫]、機(jī)械壓力、輻射[電離或非電離]、暴露于低氧、缺氧、局部缺血，或者為化學(xué)信號(hào)，例如細(xì)胞微環(huán)境變化，接觸結(jié)合細(xì)胞表面受體并觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的配體，包括激素、正常附著于其他細(xì)胞的細(xì)胞表面分子、擴(kuò)散或轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的酶反應(yīng)底物、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、炎性因子、毒素、代謝物、pH、藥物因子、漿質(zhì)攜帶營養(yǎng)物的不平衡、細(xì)胞-胞外基體的相互作用、細(xì)胞-細(xì)胞的相互作用、外源或病理性胞外組分的累積、胞內(nèi)或胞外病原體(包括細(xì)菌、病毒、真菌和支原體)以及遺傳微擾。
第一種細(xì)胞可以以第一種水平經(jīng)受信號(hào)，而第二種細(xì)胞以第二種水平接觸信號(hào)。在一個(gè)實(shí)例中，第一種水平可僅缺乏信號(hào)，而第二種水平可存在所述信號(hào)，或相反。信號(hào)水平可以調(diào)節(jié)，以便提供可分辨差異的基因表達(dá)。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，第一種和第二種細(xì)胞都可以于第一種和第二種兩種信號(hào)水平進(jìn)行對(duì)比。在第二種細(xì)胞中存在異源核酸將放大由信號(hào)改變引起的基因表達(dá)差異。
兩種信號(hào)水平最好都為生理相關(guān)水平。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，可以使用已經(jīng)獲得的有關(guān)參與疾病或其它生物過程的基因的知識(shí)，得到有關(guān)其表達(dá)在疾病或其它生物過程中改變的其它基因的進(jìn)一步信息。為此，修飾一種細(xì)胞，以便改變已知參與疾病或其它生物過程的基因產(chǎn)物水平，這種改變或者通過例如引入編碼基因產(chǎn)物的異源核酸直接進(jìn)行，或者如B節(jié)所述間接進(jìn)行。然后檢測(cè)兩種細(xì)胞中的基因表達(dá)，對(duì)比結(jié)果以鑒定其表達(dá)改變的基因產(chǎn)物。
在本發(fā)明的這一方面，兩種細(xì)胞可以相同，只是已知參與疾病或其它目的生物過程的基因產(chǎn)物水平有變化。因此，兩種細(xì)胞可以都是和本身表現(xiàn)疾病或其它過程的細(xì)胞類型相同的正常細(xì)胞，或者它們可以都是患病細(xì)胞?；蛘撸环N細(xì)胞可以是正常細(xì)胞，而另一種細(xì)胞是患病細(xì)胞。如果僅有一種細(xì)胞被修飾，那么最好是患病細(xì)胞被修飾。
在本發(fā)明的再一方面，差異表達(dá)篩選方法以兩步法用于鑒定參與疾病或其它進(jìn)程的基因。首先，對(duì)比第一種目的細(xì)胞(例如正常患者細(xì)胞)和第二種目的細(xì)胞(例如患病患者的相應(yīng)細(xì)胞)之間的基因表達(dá)。如上所述，第一種細(xì)胞和第二種細(xì)胞在某些方面是不同的，使得它們作用出不同的表達(dá)模式。這可能是因?yàn)榧?xì)胞得自不同組織，或者是因?yàn)樗鼈兊米圆煌膫€(gè)體(例如得自正?；颊吆突疾』颊?。所述細(xì)胞可能來源相似，但在某些方面進(jìn)行了不同的處理。
然后鑒定其表達(dá)在第一種細(xì)胞和第二種細(xì)胞之間不同的基因產(chǎn)物。其次，在此篩選方法中使用基本與第一種細(xì)胞相同的第三種目的細(xì)胞，其中將侯選基因引入到第三種細(xì)胞使基因水平改變(通常上升)。對(duì)比該細(xì)胞的基因表達(dá)和第一種細(xì)胞的基因表達(dá)，鑒定在第一種細(xì)胞和含有水平改變的侯選基因的第三種細(xì)胞之間表達(dá)不同的基因產(chǎn)物。如果其表達(dá)在第二種細(xì)胞中改變的基因產(chǎn)物在第三種細(xì)胞中還具有改變的基因表達(dá)，那么選擇該侯選基因繼續(xù)研究。
最好在兩種或多種基因產(chǎn)物之間存在相關(guān)性，優(yōu)選至少4種或5種基因產(chǎn)物，以使假陽性最小化。
現(xiàn)在，引用僅僅是說明性和非限制性的實(shí)施例描述本發(fā)明。在以下的實(shí)施例中，將以上描述的本發(fā)明方法稱為“Smartomics”，。
附圖簡(jiǎn)述

圖1進(jìn)行RNA印跡，以證實(shí)使用腺病毒基因轉(zhuǎn)移的HIF-1α和EPAS1在轉(zhuǎn)導(dǎo)巨噬細(xì)胞中過表達(dá)。如下所述進(jìn)行RNA上樣1、2道用腺病毒AdApt ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的巨噬細(xì)胞。3、4道用腺病毒AdApt HIF-1α-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的巨噬細(xì)胞。4、5道用腺病毒AdAptEPAS1-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的巨噬細(xì)胞。在泳道1、3、5中，以正常含氧量(20％O2)保持巨噬細(xì)胞。在泳道2、4、6中，以低含氧量(0.1％O2)保持巨噬細(xì)胞。RNA大小梯度的條帶位置以千堿基(kb)標(biāo)在每個(gè)印跡的右側(cè)。雜交探針與基因HIF-1α(A)、EPAS1(B)和28s核糖體RNA(C)互補(bǔ)。
圖2使用Research Genetics GeneFilters分析兩種典型RNA樣品的散點(diǎn)圖。正常含氧量(Y軸)和低含氧量(X軸)中的非轉(zhuǎn)導(dǎo)巨噬細(xì)胞RNA與兩個(gè)Research Genetics GeneFilters GF200陣列雜交。分析以對(duì)陣列上每個(gè)基因的歸一化密度表示，每個(gè)基因具有兩個(gè)對(duì)應(yīng)于正常氧含量和低氧含量信號(hào)的兩個(gè)值。將這些值作圖為散點(diǎn)圖，每個(gè)點(diǎn)代表陣列上的一個(gè)基因。RNA樣品之間以相似水平表達(dá)的基因位于x＝y(tǒng)線上。在此圖中清楚顯示了檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍。
圖3用Smartomics分析乳酸脫氫酶A的表達(dá)。在A圖中，顯示了對(duì)應(yīng)于乳酸脫氫酶A(LDH-A)基因的點(diǎn)的微型圖象。對(duì)照水平設(shè)定在使該基因顯色最佳但在整個(gè)圖中為恒定設(shè)置的水平。6個(gè)圖象的每個(gè)條圖都對(duì)應(yīng)于RNA樣品范圍內(nèi)的離散陣列位置或?qū)嶒?yàn)。位于各個(gè)點(diǎn)圖像下面的數(shù)字為該點(diǎn)對(duì)參比條件(gfp；20％O2)的歸一化密度比。陣列位置Research Genetics定義的點(diǎn)標(biāo)識(shí)?？寺MAGE鑒定。直方圖(B圖)顯示所示數(shù)值的平均值，誤差范圍為標(biāo)準(zhǔn)差。gfp用AdApt ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
圖4用Smartomics分析甘油醛3-磷酸脫氫酶的表達(dá)。在A圖中，顯示了對(duì)應(yīng)于甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因的點(diǎn)的微型圖象。對(duì)照水平設(shè)定在使該基因顯色最佳但在整個(gè)圖中為恒定設(shè)置的水平。6個(gè)圖象的每個(gè)條圖都對(duì)應(yīng)于RNA樣品范圍內(nèi)的離散陣列位置或?qū)嶒?yàn)。位于各個(gè)點(diǎn)圖像下面的數(shù)字為該點(diǎn)對(duì)參比條件(gfp；20％O2)的歸一化密度比。陣列位置Research Genetics定義的點(diǎn)標(biāo)識(shí)?？寺MAGE鑒定。直方圖(B圖)顯示所示數(shù)值的平均值，誤差范圍為標(biāo)準(zhǔn)差。gfp用AdApt ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
圖5用Smartomics分析血小板衍生生長因子β的表達(dá)。在A圖中，顯示了對(duì)應(yīng)于血小板衍生生長因子β(PDGFβ)基因的點(diǎn)的微型圖象。對(duì)照水平設(shè)定在使該基因顯色最佳但在整個(gè)圖中為恒定設(shè)置的水平。6個(gè)圖象的每個(gè)條帶都對(duì)應(yīng)于RNA樣品范圍內(nèi)的離散陣列位置或?qū)嶒?yàn)。位于各個(gè)點(diǎn)圖像下面的數(shù)字為該點(diǎn)對(duì)參比條件(gfp；20％O2)的歸一化密度比。陣列位置Research Genetics定義的點(diǎn)標(biāo)識(shí)?？寺MAGE鑒定。對(duì)于該基因，對(duì)應(yīng)于同一基因存在不同的IMAGE克隆。直方圖(B圖)顯示所示數(shù)值的平均值，誤差范圍為標(biāo)準(zhǔn)差。gfp用AdApt ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
圖6用Smartomics分析單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)。在A圖中，顯示了對(duì)應(yīng)于單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)基因的點(diǎn)的微型圖象。對(duì)照水平設(shè)定在使該基因顯色最佳但在整個(gè)圖中為恒定設(shè)置的水平。6個(gè)圖象的每個(gè)條帶都對(duì)應(yīng)于RNA樣品范圍內(nèi)的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)。位于各個(gè)點(diǎn)圖像下面的數(shù)字為該點(diǎn)對(duì)參比條件(gfp；20％O2)的歸一化密度比。陣列位置Research Genetics定義的點(diǎn)標(biāo)識(shí)。克隆IMAGE鑒定。直方圖(B圖)顯示所示數(shù)值的平均值，誤差范圍為標(biāo)準(zhǔn)差。gfp用AdApt ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
圖7使用Smartomics發(fā)現(xiàn)新基因(Hs.16335)。在A圖中，顯示了對(duì)應(yīng)于UniGene簇Hs.16335 EST的點(diǎn)的微型圖象。對(duì)照水平設(shè)定在使該基因顯色最佳但在整個(gè)圖中為恒定設(shè)置的水平。對(duì)于該基因，對(duì)照水平為最大。6個(gè)圖象的每個(gè)條帶都對(duì)應(yīng)于RNA樣品范圍內(nèi)的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)。位于各個(gè)點(diǎn)圖像下面的數(shù)字為該點(diǎn)對(duì)參比條件(gfp；20％O2)的歸一化密度比率。陣列位置Research Genetics定義的點(diǎn)標(biāo)識(shí)。克隆IMAGE鑒定。直方圖(B圖)顯示所示數(shù)值的平均值，誤差范圍為標(biāo)準(zhǔn)差。gfp用AdApt ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。Hif-1α用AdApt Hif-1α-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。Epas1用AdApt Epas1-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
圖8用有效RNA印跡(Virtual Northern blot)雜交來證實(shí)Smartomics發(fā)現(xiàn)的Hs.16335。A)雜交探針＝Hs.16335。B)雜交探針＝β肌動(dòng)蛋白。1-6泳道為圖3-7中使用的得自腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的RNA樣品。泳道7-10為有(泳道9、10)或沒有(泳道7、8)預(yù)先激活的非轉(zhuǎn)導(dǎo)巨噬細(xì)胞。直方圖顯示得自磷成像儀的、與位于其上的RNA印跡相關(guān)的相對(duì)mRNA表達(dá)水平。數(shù)字為相對(duì)于gfp(20％O2)的相對(duì)表達(dá)比。
圖9pONY8Z的質(zhì)粒圖譜。
圖10pONY8.1SM的質(zhì)粒圖譜。
圖11pSMART CMV-HIF的質(zhì)粒圖譜。
圖12pSMART CMV-空白型質(zhì)粒圖譜。
實(shí)施例實(shí)施例1Smartomics用于在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)基因巨噬細(xì)胞與各種疾病狀態(tài)有關(guān)，包括癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化和炎性疾病(如關(guān)節(jié)炎)。在許多這樣的病癥中，巨噬細(xì)胞分泌惡化疾病狀態(tài)的因子。這些因子包括血管發(fā)生因子、趨化因子和炎性細(xì)胞因子。這些因子中有一些是已知的，但可能存在目前未知的其它因素，而它們可能是治療的重要靶點(diǎn)。在許多病癥中，巨噬細(xì)胞存在于低氧區(qū)域，就是這種生理狀態(tài)起啟動(dòng)眾多基因的信號(hào)作用。已知這種背景，那么就有理由提出，在心血官疾病、癌癥和炎性疾病領(lǐng)域可以于低氧環(huán)境下誘導(dǎo)藥物開發(fā)的重要靶。
代表本領(lǐng)域當(dāng)前水平的一個(gè)簡(jiǎn)單方法是采用單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞群，將它們分為兩組，一組置于正常氧濃度下，另一組置于低氧條件下。然后可以將兩組的RNA或蛋白分子用于合適的差異分析。目標(biāo)是鑒定在低氧條件下存在但在保持在正常氧濃度下的細(xì)胞中不存在的蛋白或cDNA分子。
如果本發(fā)明用于鑒定巨噬細(xì)胞中的低氧誘導(dǎo)基因和蛋白，應(yīng)當(dāng)試圖擴(kuò)大低氧和正常氧之間的差異，以便增加信噪比。這可以通過以下方法實(shí)現(xiàn)將Hif1α基因傳遞至其中Hif1α基因過表達(dá)配置的巨噬細(xì)胞中，增強(qiáng)對(duì)低氧信號(hào)的反應(yīng)。Hif1α是對(duì)低氧反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程的一部分。低氧誘導(dǎo)途徑中的Hif1α和其它蛋白與稱為低氧反應(yīng)元件(HRE)的增強(qiáng)子元件相互作用，以開啟低氧誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄。各種形式的HRE存在于許多已知在低氧條件下被開啟的基因的上游位置。Hif1α過表達(dá)導(dǎo)致許多低氧誘導(dǎo)基因大量過表達(dá)，并因此在差異篩選中增加了低氧特異性cDNA或蛋白的水平。這又增加了檢測(cè)那些可能為藥物開發(fā)靶的分子種類的可能性。因此，在此情況下，按照本發(fā)明使用的方法將對(duì)比在正常氧條件下未過表達(dá)Hif1α的巨噬細(xì)胞和在低氧條件下過表達(dá)Hif1α的巨噬細(xì)胞。
Hif1α的傳遞和表達(dá)可通過多種方式實(shí)現(xiàn)。
在此，我們描述組成表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子HIF1α的腺病毒載體的構(gòu)建。使用以下的PCR引物由Jurkat mRNA分離HIF1αcDNA，所述引物在5′突出端分別具有NheI和HpaI限制位點(diǎn)正向引物5′-CG -GACCGATTCACCATGGAG-3′反向引物5′-CG -GCTCAGTTAACTTGATCC-3′用NheI和HpaI限制酶消化PCR產(chǎn)物，并插入含人CMV啟動(dòng)子和SV40聚腺苷酸序列的Introgene AdAptTM轉(zhuǎn)移載體的NheI-HpaI位點(diǎn)。該載體可以用PmlI線性化，然后和腺病毒血清型5基因組的右臂共轉(zhuǎn)染入E1表達(dá)細(xì)胞系PerC6(還可以用911或293細(xì)胞)。
使用PerC6無RCA系統(tǒng)產(chǎn)生AdCMVHIF1α腺病毒描述于www.introgene.com(Introgen，Leiden，the Netherlands)。用腺病毒有效轉(zhuǎn)導(dǎo)初級(jí)人巨噬細(xì)胞的方法描述于Griffiths等，2000。
以如下所述的多種可能方式比較轉(zhuǎn)導(dǎo)和未轉(zhuǎn)導(dǎo)巨噬細(xì)胞群的基因表達(dá)，以獲得在Hif1α控制下表達(dá)的基因讀數(shù)。另外，對(duì)比在低于0.5％氧濃度下溫育的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。
制備總RNA樣品進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。這些樣品或者放射標(biāo)記，或者熒光標(biāo)記，并與固相支持物上的cDNA陣列雜交。低氧和/或各種HIF蛋白表達(dá)上調(diào)的基因定量地產(chǎn)生更強(qiáng)的雜交信號(hào)。陣列方案可以包括尼龍或玻璃支持物的任一種，這綜述于Bowtell，1999。涉及玻璃支持物方案的方法學(xué)細(xì)節(jié)詳述于Eisen和Brown，1999。在此，使用熒光標(biāo)記探針，并使用激光共聚焦掃描儀檢測(cè)雜交。對(duì)于尼龍支持物方法，包括點(diǎn)印跡和雜交的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法，詳述于Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook，J等，Cold SpringHarbor Laboratory Press。在此，放射標(biāo)對(duì)比的RNA樣品，并使用磷成像儀檢測(cè)雜交。
陣列可購自Research Genetics，Huntsville，AL，或使用扣除克隆產(chǎn)生的cDNA克隆自己制作(PCR選擇法，由Clontech，Palo Alto，CA擁有)。制作包括應(yīng)用點(diǎn)陣機(jī)器人(MicroGrid，BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)。實(shí)施例2使用Smartomics鑒定巨噬細(xì)胞中的低氧調(diào)節(jié)基因本發(fā)明用于鑒定巨噬細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)的基因和蛋白。
Smartomics用于改善發(fā)現(xiàn)初級(jí)人巨噬細(xì)胞中受低氧作用激活或抑制的基因。如實(shí)施例1所述，Smartomics涉及通過實(shí)驗(yàn)性引入低氧反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物即低氧誘導(dǎo)型因子1α(HIF-1α)，增強(qiáng)對(duì)低氧的天然反應(yīng)?；蛘邌为?dú)實(shí)現(xiàn)HIF-1α過表達(dá)，或者與細(xì)胞暴露于低氧組合實(shí)現(xiàn)HIF-1α過表達(dá)。這使得可以檢測(cè)用其他方法還不能檢測(cè)到的在單獨(dú)低氧作用下產(chǎn)生的基因表達(dá)改變。
盡管HIF-1α介導(dǎo)低氧反應(yīng)廣為人知，但還已知或猜測(cè)其它轉(zhuǎn)錄因子參與其中。這些因子包括叫做內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白1(EPAS1)或HIF-2α的蛋白，HIF-2α與HIF-1α具有48％序列同一性(“內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白1(EPAS1)，一種在內(nèi)皮細(xì)胞中選擇性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子”，Tian H，McKnight SL，Russell DW.Genes Dev.1997年1月；11(1)72-82)。有證據(jù)提示，EPAS1對(duì)介導(dǎo)某些細(xì)胞類型的低氧反應(yīng)特別重要，在人巨噬細(xì)胞中可清楚檢測(cè)出EPAS1，表明其在該細(xì)胞類型中起作用(“巨噬細(xì)胞—基因治療病理性低氧的新系統(tǒng)”，Gene Ther.2000年2月；7(3)255-62，Griffiths L，Binley K，Iqball S，Kan O，Maxwell P，Ratcliffe P，Lewis C，Harris A，Kingsman S，Naylor S.)。按照該文獻(xiàn)，本實(shí)施例還利用EPAS1過表達(dá)作為獨(dú)立于HIF-1α過表達(dá)的改善低氧反應(yīng)型基因?qū)ふ业姆椒ā＿€闡述了本發(fā)明的實(shí)施方案，其中可以鑒定對(duì)HIF-1α和EPAS1(或其它低氧反應(yīng)介導(dǎo)物)反應(yīng)的差異，目的是鑒定更適于特異性和有效治療疾病的治療靶分子。
如實(shí)施例1所述，可利用重組腺病毒將外源基因序列(即HIF-1α或EPAS1)引入初級(jí)巨噬細(xì)胞。如實(shí)施例1所述，可利用商用系統(tǒng)生產(chǎn)包含腺病毒轉(zhuǎn)移載體AdApt、腺病毒基因組質(zhì)粒AdEasy和包裝細(xì)胞系Per-c6(Introgen，Leiden，The Netherlands)的腺病毒顆粒。按照標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)商說明書操作。
已經(jīng)制備了AdApt轉(zhuǎn)移載體的三種衍生物，叫做AdApt ires-GFP、AdApt HIF-1α-ires-GFP和AdApt EPAS1-ires-GFP。在這些載體中，為便利起見，修飾AdApt，使由強(qiáng)巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子表達(dá)的插入基因(即HIF-1α或EPAS1)借助于內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ires)連接至綠色熒光蛋白(gfp)標(biāo)記物。因此，出現(xiàn)綠色熒光成為病毒在轉(zhuǎn)導(dǎo)的哺乳動(dòng)物中表達(dá)HIF-1α或EPAS1的便利指示劑。
使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法構(gòu)建AdApt衍生物，所述方法包括反轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)、通過限制酶消化在質(zhì)粒之間轉(zhuǎn)移DNA片段、瓊脂糖凝膠DNA片段分離、“末端修復(fù)”具有突出端的雙鏈DNA片段以產(chǎn)生平端，以及DNA連接。由DNA測(cè)序確認(rèn)亞克隆步驟。這些技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，但特別可參考Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Short Protocols inMolecular Biology(1999)，第4版，John Wiley & Sons，Inc。
簡(jiǎn)而言之，通過將腦心肌炎病毒(EMCV)ires和綠色熒光蛋白基因(GFP)緊接著CMV啟動(dòng)子下游并與其同一方向先后插入到AdApt的末端修復(fù)的HpaI限制位點(diǎn)中，制備AdApt ires-GFP。EMCV ires和gfp序列都廣泛使用，并可由常用的質(zhì)粒獲得。SEQ ID NO1列出了插入到AdApt質(zhì)粒的連接的ires-GFP的確切核苷酸序列。
通過將人HIF-1α蛋白編碼序列插入到AdApt ires-GFP的CMV啟動(dòng)子和ires-GFP元件之間，由AdApt ires-GFP獲得質(zhì)粒AdAptHIF-1α-ires-GFP。為此，通過RT-PCR由人mRNA克隆人HIF-1αcDNA，通過與公開的HIF-1αcDNA核苷酸序列(Genbank登錄號(hào)U22431)對(duì)比驗(yàn)證所述序列。HIF-1α序列以末端修復(fù)的片段連接入AdApt ires-GFP的末端修復(fù)的AgeI限制位點(diǎn)[還可以是緊接著CMV啟動(dòng)子下游的親代載體AdApt的AgeI限制位點(diǎn)]。SEQ ID NO2顯示了含插入到AdApt ires-GFP中的編碼HIF-1α的確切DNA序列。
通過將人EPAS 1蛋白編碼序列插入到AdApt ires-GFP的CMV啟動(dòng)子和ires-GFP元件之間，由AdApt ires-GFP獲得質(zhì)粒AdAptEPAS1-ires-GFP。為此，通過反轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)由人mRNA克隆人EPAS1 cDNA，通過與公開的EPAS1 cDNA核苷酸序列(Genbank登錄號(hào)U81984)對(duì)比驗(yàn)證所述序列。EPAS1序列以末端修復(fù)的片段連接入AdApt ires-GFP的末端修復(fù)的AgeI限制位點(diǎn)[還可以是緊接著CMV啟動(dòng)子下游的親代載體AdApt的AgeI限制位點(diǎn)]。SEQ ID NO3顯示了含插入到AdApt ires-GFP中的編碼EPAS1的確切DNA序列。
在生產(chǎn)腺病毒顆粒之前，驗(yàn)證腺病毒轉(zhuǎn)移載體AdApt HIF-1α-ires-GFP和AdApt EPAS1-ires-GFP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中控制CMV啟動(dòng)子表達(dá)具功能活性的HIF-1α或EPAS1蛋白的能力。這可如文獻(xiàn)所述通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)導(dǎo)基因測(cè)定實(shí)現(xiàn)(Boast K，Binley K，IqballS，Price T，Spearman H，Kingsman S，Kingsman A，Naylor S.Hum GeneTher.1999年9月1日；10(13)2197-208，“用于治療局部缺血疾病的生理調(diào)節(jié)載體的特征”)。
使用前述的Introgene腺病毒系統(tǒng)，生產(chǎn)每個(gè)載體AdApt ires-GFP、AdApt HIF-1α-ires-GFP和AdApt EPAS1-ires-GFP的銫帶純腺病毒顆粒。按照Introgene的說明書，通過分光光度測(cè)定法定量腺病毒制備物，獲得每ml的病毒顆粒(VP)值。
為分離人巨噬細(xì)胞，由健康獻(xiàn)血人的外周血獲得單核細(xì)胞。將得自Bristol輸血中心(Bristol，UK)的100ml袋裝血沉棕黃層與等體積的RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma)混合?；旌衔镌?0ml離心管中的10mlficol-paque(Pharmacia)頂部分層，以800xg離心25分鐘。取出交界層，用MACS緩沖液(磷酸緩沖鹽水pH7.2，0.5％牛血清白蛋白，2mmEDTA)清洗，并以80μl/10n7細(xì)胞重懸浮。向其中加入20μl CD14微珠(Miltenyi Biotec)，將離心管于4℃溫育15分鐘。此后，用MACS緩沖液以400×g進(jìn)行1次清洗，將細(xì)胞重懸浮于3ml MACS緩沖液中，用位于midi-MACS磁體(Miltenyi Biotec)上的LS+MACS分離柱(Miltenyi Biotec)分離。用3×3ml MACS緩沖液清洗該柱。將該柱由磁體上取下，用注射器以5ml MACS緩沖液洗脫。用補(bǔ)加2％人AB血清(Sigma)的培養(yǎng)基(AIM V(Sigma))清洗細(xì)胞，以2×10n5細(xì)胞/ml重懸浮于同一培養(yǎng)液中，并置于特氟隆包被的大培養(yǎng)袋(Sud-LaborbedarfGmbH，82131 Gauting，Germany)中，轉(zhuǎn)移至組織培養(yǎng)箱(37℃，5％CO2)培養(yǎng)7-10天。在此過程中，單核細(xì)胞自然地分化為巨噬細(xì)胞。通過使用相差顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行確認(rèn)。通過于4℃放置30分鐘并排空內(nèi)容物取出細(xì)胞。
用補(bǔ)加4％胎牛血清(Sigma)的DMEM(Gibco，Paisley，UK)清洗并重懸浮巨噬細(xì)胞。將4×106細(xì)胞置于各個(gè)10cm的Prineria(Falcon)組織培養(yǎng)皿中，每板的總體積為8ml，6×109腺病毒顆粒/ml。培養(yǎng)16小時(shí)后(在此過程中，巨噬細(xì)胞附著于板上并受到腺病毒顆粒感染)，去除培養(yǎng)基并代之以補(bǔ)加2％人AB血清的AIM V培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)前再培養(yǎng)24小時(shí)，以使轉(zhuǎn)導(dǎo)的腺病毒進(jìn)行基因表達(dá)。
使用綠色熒光作為基因轉(zhuǎn)移標(biāo)記測(cè)定以上腺病毒顆粒的劑量，為大部分(超過80％)巨噬細(xì)胞群實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的最小量。這可使用含LacZ報(bào)告基因的單獨(dú)腺病毒構(gòu)建物證實(shí)。通過選擇最小劑量的病毒，使可能存在的病毒轉(zhuǎn)移的非特異性作用最小化。
對(duì)于低氧實(shí)驗(yàn)，將相同的培養(yǎng)皿分處于兩個(gè)單獨(dú)的培養(yǎng)箱中一個(gè)為37℃、5％CO2、95％空氣(＝正常氧含量)，而另一個(gè)為37℃、5％CO2、94.9％氮?dú)狻?.1％氧氣(＝低氧含量)。在這些條件下培養(yǎng)8小時(shí)后，由培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，置于冷凍平臺(tái)上，用冷PBS清洗，使用RNazol B(Tel-Test，Inc；Biogenesis Ltd分銷)按照生產(chǎn)商的說明提取總RNA。
設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)是為了獲得6個(gè)細(xì)胞群(簡(jiǎn)稱“細(xì)胞類型”)，它們的差異僅在于用如下所示的腺病毒和/或低氧處理“細(xì)胞類型”腺病毒表達(dá)基因氧條件1 AdApt ires-GFP無 常 (20％氧氣)2 AdApt ires-GFP無 低氧(0.1％氧氣)3 AdApt HIF-1α-ires-GFPHIF-1α 正常(20％氧氣)4 AdApt HIF-1α-ires-GFPHIF-1α 低氧(0.1％氧氣)5 AdApt EPAS1-ires-GFP EPAS1正常(20％氧氣)6 AdApt EPAS1-ires-GFP EPAS1低氧(0.1％氧氣)可通過比較這些“細(xì)胞類型”之間的基因表達(dá)模式進(jìn)行基因?qū)ふ摇０凑瘴墨I(xiàn)使用的常規(guī)方法，應(yīng)當(dāng)比較細(xì)胞類型1和細(xì)胞類型2。通過實(shí)施本發(fā)明(Smartomics)，注意到其它幾種可能性。首先，可對(duì)比細(xì)胞類型3或5和細(xì)胞類型1。此時(shí)，對(duì)參與低氧反應(yīng)的關(guān)鍵分子過表達(dá)的刺激可能超出天然的低氧反應(yīng)，如細(xì)胞類型2所見。其次，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可對(duì)比細(xì)胞類型4或6和細(xì)胞類型1。在此情況下，通過過表達(dá)參與低氧反應(yīng)的關(guān)鍵分子，使對(duì)低氧的天然反應(yīng)增強(qiáng)或加強(qiáng)。應(yīng)當(dāng)注意的是，以上闡述的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用對(duì)照腺病毒代替未處理的細(xì)胞。這樣做應(yīng)當(dāng)使病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的任何非特異性作用在整個(gè)分析過程中都同等發(fā)生，并將消失。
盡管由轉(zhuǎn)導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的綠色熒光蛋白指示有效的腺病毒基因轉(zhuǎn)移，但使用RNA印跡證實(shí)了HIF-1α和EPAS1的過表達(dá)。通過RNA印跡(圖1)分析如上所述由細(xì)胞類型1-6中提取的RNA樣品。將RNA樣品(每泳道8μg總RNA樣品)在甲醛變性的1％瓊脂糖凝膠上電泳，然后轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Hybond-N，Amersham，UK)，并先后和核苷酸序列與HIF-1α(圖1a)、EPAS1(圖1b)或28S核糖體RNA(圖1c)互補(bǔ)的33p-標(biāo)記的DNA探針雜交。用于RNA印跡、嚴(yán)格條件下的探針雜交以及去除雜交探針的方法學(xué)是本領(lǐng)域眾所周知的。
在圖1a中，可以看到所有的泳道都含有對(duì)應(yīng)于內(nèi)源HIF-1αmRNA的約4kb模糊條帶。在含有AdApt HIF-1α-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞RNA的泳道3，4中，觀察到相似大小的較強(qiáng)條帶，表明HIF-1α成功過表達(dá)。
在圖1b中，可以看到所有的泳道都含有對(duì)應(yīng)于內(nèi)源EPAS1mRNA的非常模糊的約5kb條帶。在含有AdApt EPAS1-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞RNA的泳道5，6中，觀察到約4kb的較強(qiáng)條帶，表明EPAS1成功過表達(dá)。內(nèi)源和過表達(dá)EPAS1大小的不同是由于內(nèi)源基因存在長非翻譯區(qū)，該區(qū)并不重要。
在圖1c中，可以看到所有的泳道都檢測(cè)出28S核糖體RNA，表明凝膠上的RNA上樣量相同。
通過圖1a和1b的磷成像定量分析，顯然HIF-1α和EPAS1的過表達(dá)水平超出內(nèi)源水平約80倍。低氧沒有再增強(qiáng)由腺病毒控制的這些基因的mRNA過表達(dá)。例如，在圖1a中，泳道4的條帶強(qiáng)度沒有超過泳道3。但是在蛋白和功能水平上，低氧加強(qiáng)了這些mRNA編碼蛋白的作用(Semenza GL.Annu.Rev.Cell Dev Biol.1999；15551-78，“低氧誘導(dǎo)因子1調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物O2穩(wěn)態(tài)”)。
使用Research Genetics Human GeneFilters Release 1(GF200)(Research Genetics，Huntsville，AL)獲得分離自6種“細(xì)胞類型”的RNA樣品的總體mRNA表達(dá)模式。該方法使用預(yù)先制備的與包含一系列特征水平的5,300種基因互補(bǔ)的DNA陣列，包括僅與未注解EST或未知功能cDNA序列匹配的序列。
所述陣列為尼龍組成，用得自特異性IMAGE聯(lián)合cDNA克隆的DNA點(diǎn)陣(http//image.llnl.gov/image/)。所述陣列與已經(jīng)用同位素33p放射性標(biāo)記的RNA樣品雜交，以檢測(cè)RNA樣品中各個(gè)基因的豐度。標(biāo)記多個(gè)RNA樣品，平行與單獨(dú)拷貝的所述陣列雜交，比較RNA樣品之間的點(diǎn)雜交信號(hào)。
基于陣列的mRNA表達(dá)分析的關(guān)鍵問題是敏感性和可靠性。目前可利用其它兩種方法玻璃微陣列和DNA芯片，它們都使用熒光標(biāo)記的RNA(Bowtell DD.Nat Genet.1999年1月；21(增刊1)25-32，“可通過微陣列獲得表達(dá)數(shù)據(jù)的選項(xiàng)—由開始到結(jié)束”)。盡管這些方法經(jīng)常被認(rèn)為比尼龍型方法敏感性增加，但這種觀點(diǎn)缺乏權(quán)威性的證據(jù)。相反，細(xì)心比較三種方法顯示，對(duì)于相似量的未擴(kuò)增RNA，尼龍型放射性方法較好(Bretucci F，Bemard K，Loriod B，Chang YC，Granjeaud S，Birnbaum D，Nguyen C，Peck K，Jordan BR，Hum MolGenet.1999年9月；8(9)1715-22，“基于DNA陣列的表達(dá)檢測(cè)的敏感性問題和尼龍微陣列對(duì)小樣品的性能”)。微陣列和DNA芯片法需要更大量的RNA，而RNA經(jīng)常難以由初級(jí)細(xì)胞獲得，或者易于產(chǎn)生錯(cuò)誤的復(fù)雜擴(kuò)增方法。
為證明用于所述Smartomics實(shí)施例的基于陣列的基因表達(dá)方法的敏感性，在我們的實(shí)驗(yàn)室中用Research Genetics GeneFilters分析兩種代表性RNA樣品的散點(diǎn)圖，顯示約4對(duì)數(shù)的檢測(cè)范圍(圖2)。相比之下，可以論證地指出最復(fù)雜的基于陣列的方法DNA芯片具有3對(duì)數(shù)的檢測(cè)范圍(Affymetrix)。
因此，有理由假定，本文實(shí)施例闡述的由Smartomics提供的與敏感性問題有關(guān)的改進(jìn)，能夠容易地通過使用替代的基于陣列的方法獲得。在任何情況下，任何潛在有利的陣列方法都可通過使用本文描述的Smartomics發(fā)明進(jìn)一步改善。本發(fā)明的一個(gè)重要的用途是高通量方法，例如可使用陣列鑒定通常僅可用很敏感的低通量方法(例如RT-PCR或RNA印跡)檢測(cè)的表達(dá)改變。
放射性標(biāo)記如上所述由6種“細(xì)胞類型”中提取的RNA，將其與單獨(dú)拷貝的Research Genetics Human GeneFilters GF200雜交(實(shí)驗(yàn)1)。按照生產(chǎn)商提供的方法進(jìn)行操作(http//www.resgen.com/products/GF200 ptotocol.php3)。使用MolecularDynamics Storm磷成像儀獲得雜交陣列的圖象。然后按照前述方法由陣列上剝離RNA。
為確保重復(fù)性，用相同的RNA樣品重復(fù)該步驟(實(shí)驗(yàn)2)。然后使用Research Genetics Pathways 3.0軟件按照Pathways 3.0說明書的講解輸入和分析全部數(shù)據(jù)集。該分析的關(guān)鍵方面概述如下程序結(jié)構(gòu)(project tree)設(shè)置使用“條件對(duì)”模式同時(shí)分析多個(gè)實(shí)驗(yàn)?！皸l件”是指與得自相同“細(xì)胞類型”的相似RNA樣品雜交的幾個(gè)陣列。條件 “細(xì)胞類型” 腺病毒 氧實(shí)驗(yàn)號(hào)1 1 AdApt ires-GFP 正常 11 1 AdApt ires-GFP 正常 22 2 AdApt ires-GFP 低氧 12 2 AdApt ires-GFP 低氧 23 3 AdApt HIF-1 α-ires-GFP 正常 13 3 AdApt HIF-1α-ires-GFP 正常 24 4 AdApt HIF-1α-ires-GFP 低氧 14 4 AdApt HIF-1α-ires-GFP 低氧 25 5 AdApt EPAS1-ires-GFP 正常 15 5 AdApt EPAS1-ires-GFP 正常 26 6 AdApt EPAS1-ires-GFP 低氧 16 6 AdApt EPAS 1-ires-GFP低氧 2歸一化設(shè)置按照Pathways 3.0說明書的解釋選擇“所有數(shù)據(jù)點(diǎn)”選項(xiàng)和默認(rèn)設(shè)置的Y.Chen算法。作為兩個(gè)單獨(dú)的歸一化組處理兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，以校正相同實(shí)驗(yàn)的不同陣列的雜交信號(hào)之間的總體差異。對(duì)比分析在條件2和條件1、條件3和條件1、條件4和條件1、條件5和條件1、條件6和條件1之間進(jìn)行成對(duì)比較。
換句話說，使用條件1(即細(xì)胞類型1)作為參比條件進(jìn)行成對(duì)對(duì)比。這相當(dāng)于用對(duì)照腺病毒AdApt ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，并置于正常氧濃度(正常氧含量)下。以此方式對(duì)Research Genetics GF200陣列上存在的所有基因進(jìn)行對(duì)比。通過對(duì)比條件，該分析判斷實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2二者的數(shù)據(jù)。過濾設(shè)定然后對(duì)以上列明的5個(gè)成對(duì)比較中的至少一個(gè)進(jìn)行過濾，選擇表達(dá)比率高于2.0的基因。使用最小0.2最大1000的Intensity II濾器自動(dòng)去除全部6種條件中信號(hào)強(qiáng)度低的基因。使用Students t-檢驗(yàn)濾器(90％可信度)自動(dòng)去除在實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2中不以可重復(fù)方式反應(yīng)的基因。
結(jié)果以各個(gè)基因的表達(dá)模式輸出，顯示歸一化信號(hào)強(qiáng)度和表達(dá)比率。Pethways 3.0分析的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于顯示各個(gè)點(diǎn)的高倍放大的微型圖象。這使得可以目測(cè)鑒定所檢測(cè)部位精確覆蓋了含雜交陣列點(diǎn)的區(qū)域，并且該點(diǎn)是真實(shí)的而不是背景假象。
即使取樣部位明顯為真實(shí)的陣列點(diǎn)，有時(shí)也會(huì)觀察到定量數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)的微型圖象之間的微小差異。例如，肉眼可能觀察到兩個(gè)點(diǎn)之間有小差異，而定量分析可能提示有較大差異。應(yīng)當(dāng)注意的是，微型圖象沒有歸一化來補(bǔ)償總體差異，并受限于圖象質(zhì)量。灰度圖象固有地受限于其定量描述密度差異的能力。由Strom磷成像儀產(chǎn)生的數(shù)碼圖象單個(gè)像素包含的線性動(dòng)態(tài)范圍為100,000，而打印的圖象僅可以256色灰度繪圖。三種代表性的已知低氧調(diào)節(jié)基因的結(jié)果就發(fā)現(xiàn)的真實(shí)低氧調(diào)節(jié)基因來說，證實(shí)HIF-1α或EPAS1過表達(dá)連同低氧接觸一起優(yōu)于使用非轉(zhuǎn)導(dǎo)低氧細(xì)胞，顯示了本領(lǐng)域已知受低氧調(diào)節(jié)的基因的結(jié)果。
選擇了三種在Research Genetics GF200陣列上以雙點(diǎn)呈現(xiàn)的基因。因此，由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)是重復(fù)的，所有可以對(duì)這些基因進(jìn)行總共4次重復(fù)對(duì)比。
本領(lǐng)域已知乳酸脫氫酶A(LDH-A)基因由低氧激活(Webster KA.Mol Cell Biochem.1987年9月；77(1)19-28，“在骨骼肌細(xì)胞中通過氧利用度調(diào)節(jié)糖酵解酶RNA轉(zhuǎn)錄速率”)。在圖3中，可以看出在單獨(dú)的低氧(gfp 0.1％O2)作用下，mRNA表達(dá)相比于正常氧含量(gfP20％O2)平均增加2.24倍。
通過過表達(dá)HIF-1α，LDH-A表達(dá)平均增加3.39倍，比天然反應(yīng)明顯改善(圖3；HIF-1α20％O2)。通過使用Smartomics法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，同時(shí)在低氧下過表達(dá)HIF-1α，LDH-A的平均反應(yīng)進(jìn)一步提高至4.50倍(圖3；HIF-1α0.1％O2)。
在先有技術(shù)中已經(jīng)確立HIF-1α負(fù)責(zé)介導(dǎo)LDH-A的低氧誘導(dǎo)激活(Iyer NV，Kotch LE，Agani F，Leung SW，Laughner E，Wenger RH，Gassmann M，Gearhart JD，Lawler AM，Yu A Y Semanza GL，Genes Dev.1998年1月15日；12(2)149-62，“由低氧誘導(dǎo)因子1α進(jìn)行O2穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞和發(fā)育控制”)。但是從沒有設(shè)想或證明同時(shí)有或沒有低氧時(shí)使用病毒基因轉(zhuǎn)移技術(shù)以穩(wěn)定方式過表達(dá)HIF-1α引起基因表達(dá)的次級(jí)變化，該變化明顯大于天然低氧反應(yīng)。LDH-A對(duì)低氧的反應(yīng)還可由EPAS1過表達(dá)改善(圖3；EPAS1)，盡管沒有HIF-1α過表達(dá)顯著。
同LDH-A一樣，本領(lǐng)域已知甘油醛3-磷酸脫氫酶(GADPH)基因由低氧激活(Webster KA.Mol Cell Biochem.1987年9月；77(1)19-28，“在骨骼肌細(xì)胞中通過氧利用度調(diào)節(jié)糖酵解酶RNA轉(zhuǎn)錄速率”)。在圖4中，可以看出在單獨(dú)低氧(gfp 0.1％O2)作用下，mRNA表達(dá)相比于正常氧含量平均增加1.52倍。
通過過表達(dá)HIF-1α，GAPDH表達(dá)平均增加3.33倍，比天然反應(yīng)明顯改善(圖4；HIF-1α20％O2)。通過使用Smartomics法的完整實(shí)施方案，同時(shí)在低氧下過表達(dá)HIF-1α，GAPDH的平均反應(yīng)進(jìn)一步提高至4.57倍(圖4；HIF-1α0.1％O2)。
在已公開的文獻(xiàn)中，已經(jīng)確立HIF-1α負(fù)責(zé)介導(dǎo)GAPDH的低氧誘導(dǎo)激活(Iyer NV，Kotch LE，Agani F，Leung SW，Laughner E，WengerRH，Gassmann M，Gearhart JD，Lawler AM，Yu A Y Semanza GL，GenesDev.1998年1月15日；12(2)149-62，“由低氧誘導(dǎo)因子1α進(jìn)行O2穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞和發(fā)育控制”)。但本領(lǐng)域從沒有設(shè)想或證明同時(shí)有或沒有低氧時(shí)使用病毒基因轉(zhuǎn)移技術(shù)以穩(wěn)定方式過表達(dá)HIF-1α引起基因表達(dá)的次級(jí)變化，該變化明顯大于天然低氧反應(yīng)。
對(duì)于GAPDH，可以看出EPAS1過表達(dá)(圖4；EPAS1 20％O2和0.1％O2)的作用明顯小于HIF-1α過表達(dá)的作用。證實(shí)Smartomics法的一個(gè)鑒定對(duì)EPAS1或HIF-1α過表達(dá)選擇性或優(yōu)選反應(yīng)的基因的單獨(dú)實(shí)施方案。
本領(lǐng)域還已知血小板衍生生長因子β(PDGFβ)由低氧激活(Kourembanas S，Hannan RL，F(xiàn)aller DV.J Clin Invest，1990年8月；86(2)670-4，“氧含量調(diào)節(jié)人內(nèi)皮細(xì)胞血小板衍生生長因子-B鏈基因表達(dá)”)。在圖5中，可以看出在單獨(dú)低氧作用(gfp 0.1％O2)下，mRNA表達(dá)比正常氧含量平均增加2.14倍。
通過過表達(dá)EPAS1，PDGFβ表達(dá)平均增加9.28倍(圖5；EPAS120％O2)，比天然反應(yīng)有極大改善。在此情況下，低氧和EPAS1過表達(dá)組合沒有超過單獨(dú)的EPAS1過表達(dá)的反應(yīng)，表明劑量-反應(yīng)飽和作用(圖5；EPAS1 0.1％O2)。
由圖5可明顯看出，在PDGFβ對(duì)EPAS1和HIF-1α的反應(yīng)中存在顯著的特異性，對(duì)GAPDH觀察到相反的方式。單獨(dú)的HIF-1α過表達(dá)對(duì)PDGFβ沒有明顯作用，而EPAS1過表達(dá)產(chǎn)生很大的作用。這解釋了Smartomics法的一個(gè)單獨(dú)實(shí)施方案，通過該實(shí)施方案鑒定對(duì)以相同方式起作用的不同基因過表達(dá)選擇性或優(yōu)選反應(yīng)的基因。
本領(lǐng)域已知單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)編碼基因通過降低mRNA表達(dá)以反向方式對(duì)低氧起反應(yīng)(Negus RP，Turner L，Burke F，Balkwill FR，J Leukoc Biol.，1998年1月；63(6)758-65，“低氧下調(diào)MCP-1表達(dá)與腫瘤中巨噬細(xì)胞分布有關(guān)”)。在圖6中，可以看出在單獨(dú)低氧作用(gfp 0.1％O2)下，mRNA表達(dá)比正常氧含量平均變化0.47倍(即降低2.46倍)。
通過過表達(dá)HIF-1α，MCP-1表達(dá)平均變化0.243倍(即降低4.11倍)，比天然反應(yīng)明顯改善(圖6；HIF-1α20％O2)。通過使用Smartomics法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，同時(shí)在低氧下過表達(dá)HIF-1α，MCP-1的平均反應(yīng)變化進(jìn)一步改善至0.112倍(即降低8.93倍)(圖6；HIF-1α0.1％O2)。通過過表達(dá)EPAS1甚至更顯著地改善了低氧誘導(dǎo)抑制的MCP-1表達(dá)(圖6；EPAS1 20％O2和0.1％O2)。這證明使用Smartomics改善了對(duì)受疾病信號(hào)抑制的基因的尋找。
以MCP-1作為例證，HIF-1α或EPAS1過表達(dá)加強(qiáng)低氧誘導(dǎo)基因抑制，這一發(fā)現(xiàn)在本領(lǐng)域完全沒有先例。HIF-1α和EPAS1蛋白的結(jié)構(gòu)都含有反式激活結(jié)構(gòu)域而沒有已知的轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域(Pugh CW，O′Rourke JF，Nagao M，Gleadle JM，Ratcliffe PJ，J Biol Chem.，1997年4月25日；272(17)11205-14，“低氧誘導(dǎo)因子-1的活化；鑒定α亞單位中的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域”)。
以上闡述的結(jié)果涉及陣列基因表達(dá)分析，其中，在陣列上總共約5300個(gè)基因中鑒定出超過50個(gè)基因受低氧調(diào)節(jié)。通過關(guān)注本領(lǐng)域已知受低氧調(diào)節(jié)的基因并顯示Smartomics法如何可以明顯增強(qiáng)反應(yīng)，提出一個(gè)觀點(diǎn)Smartomics提供了一個(gè)用于鑒定真實(shí)的新低氧調(diào)節(jié)基因的改進(jìn)方法。在本研究中，如下所示，也可以直接顯示使用Smartomics法發(fā)現(xiàn)新基因。因?yàn)樵摲治霭顺Ｒ?guī)分析得到的表達(dá)改變(即沒有病毒過表達(dá)時(shí)對(duì)比低氧/正常氧含量)，清楚顯示了Smartomics發(fā)明的優(yōu)勢(shì)。
表1列出了在此分析中鑒定的未注解基因或EST，這些基因或EST在病毒控制的過表達(dá)作用下激活，但還沒有被先有技術(shù)中進(jìn)行的低氧/正常氧含量對(duì)比鑒定出。表1的最后5列顯示了相比于正常氧含量下Adapt-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的表達(dá)比率。這5列的第一列為沒有Smartomics的反應(yīng)，在此處顯示的所有情況下，水平都在顯著性以下。其它4列提供了使用本發(fā)明獲得的結(jié)果，由此可看出顯著的應(yīng)答。特別是，在該表的最后幾行，鑒定出顯示對(duì)EPAS1過表達(dá)反應(yīng)大的新基因。
表1Smartomics鑒定的新基因
列1是2001年2月16日UniGene數(shù)據(jù)庫使用的基因名稱。核苷酸和蛋白登錄號(hào)得自Genbank數(shù)據(jù)庫。最后5列顯示以對(duì)正常氧含量下Adapt ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的比率表示的表達(dá)水平。gfp H低氧下AdApt ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的表達(dá)。Hif N正常氧含量下AdAptHif-1α-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的表達(dá)。Hif H低氧下AdApt Hif-1α-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的表達(dá)。EPAS N正常氧含量下AdApt Epas1-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的表達(dá)。EPAS H低氧下AdApt Epas1-ires-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的表達(dá)。
圖7顯示這些基因中一種對(duì)應(yīng)于EST(GenBank登錄號(hào)N64734；IMAGE克隆293336)的基因的表達(dá)模式。在UniGene EST數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)中，該EST目前僅與兩個(gè)其它EST(登錄號(hào)為AI051607(IMAGE 1674154)和T87161(IMAGE 293336))成簇。UniGene簇號(hào)為Hs.16335，在該數(shù)據(jù)庫中完全沒有注解。序列分析顯示該稀有序列是不完整的，缺少關(guān)于蛋白編碼序列的信息。在人類基因組計(jì)劃基因注解的Ensembl數(shù)據(jù)庫(http//www.ensembl.org/)中，預(yù)測(cè)或證實(shí)cDNA序列的blast檢索沒有鑒定出該EST。因此，由公用信息顯然可知，對(duì)應(yīng)于EST IMAGE293336的基因確實(shí)是新的未注解基因。
在圖7中，以最大對(duì)比度顯示微型陣列點(diǎn)圖象，使背景信號(hào)明顯?？梢钥吹?，在單獨(dú)低氧作用下(gfp 0.1％O2)，mRNA表達(dá)水平相比于正常氧含量平均增加1.4倍。但是，這是不顯著的，因?yàn)槠涞米愿鱾€(gè)實(shí)驗(yàn)的巨大比率差異(2.41和0.46)。根據(jù)gfp 20％O2和gfp 0.1％O2的微型圖象，顯然在這些條件下的基因表達(dá)低于陣列型方法檢測(cè)閾。但是，在使用Smartomics發(fā)明并使用病毒基因轉(zhuǎn)移方法過表達(dá)EPAS1時(shí)，觀察到清晰的可檢測(cè)應(yīng)答，誘導(dǎo)比率超過8倍(圖7；EPAS1 20％O2或0.1％O2)。圖7的表達(dá)模式還解釋了Smartomics的一個(gè)用于鑒定選擇性應(yīng)答于HIF-1α或EPAS1的基因的單獨(dú)實(shí)施方案。
為證實(shí)圖7提供的結(jié)果，使用更敏感的方法研究對(duì)應(yīng)于IMAGE克隆293336基因的表達(dá)，即有效RNA印跡。應(yīng)當(dāng)指出的是，該方法已經(jīng)不適于最初發(fā)現(xiàn)得低氧誘導(dǎo)的IMAGE克隆293336，因?yàn)橛行NA印跡和類似的方法不能同時(shí)篩選大量的基因。該技術(shù)類似于常規(guī)的RNA印跡，只是對(duì)應(yīng)于表達(dá)基因mRNA群的雙鏈cDNA用電泳分離，并印跡在尼龍膜上。這依賴于產(chǎn)生全長cDNA分子的cDNA合成方法，該方法可由商業(yè)渠道購買(SMART PCR eDNA SynthesisKit；Clontech Laboratories Inc，Palo Alto，CA，USA)。
按照SMART PCR cDNA Synthesis Kit說明書的描述實(shí)施有效RNA印跡方法。簡(jiǎn)單地說，由6個(gè)用于陣列雜交的RNA樣品合成600ng cDNA。還加工了另外4個(gè)RNA樣品，它們得自在正常氧含量和低氧(6小時(shí)，0.1％O2)下培養(yǎng)的非轉(zhuǎn)導(dǎo)巨噬細(xì)胞，它們都用或不用100ng/ml脂多糖(大腸桿菌026B6 Sigma，UK)和1000u/ml人γ干擾素(Sigma，UK)預(yù)處理16小時(shí)。該組合因素引起巨噬細(xì)胞激活，這是巨噬細(xì)胞生理和病理作用的關(guān)鍵過程。所有的10個(gè)cDNA樣品都在瓊脂糖凝膠上分離，并按照Hybond N+說明將其堿轉(zhuǎn)移至Hybond N+膜(AmershamPharmacia，UK)上。按照本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)RNA印跡雜交與33P標(biāo)記的克隆cDNA探針嚴(yán)格雜交。使用市售試劑盒(Prime-a-Gene，Promega，UK)放射標(biāo)記cDNA探針。首先讓有效RNA印跡與UniGene簇Hs.16335的IMAGE克隆1674154的cDNA插入片段雜交(圖8a)。然后通過高溫/低鹽清洗剝離印跡，并用人β-肌動(dòng)蛋白基因的蛋白編碼區(qū)再探測(cè)(圖8b)。
由圖8a可見，檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于Hs.16335的mRNA為約4.5kb的雙聯(lián)條帶。該基因受腺病毒控制的EPAS1過表達(dá)強(qiáng)烈誘導(dǎo)(泳道5，6)，與圖7的陣列數(shù)據(jù)一致。在該非陣列分析中的高誘導(dǎo)比率緣于有效RNA技術(shù)敏感性增加。與陣列數(shù)據(jù)不同，Hs.16335的表達(dá)在所有RNA樣品的檢測(cè)范圍內(nèi)。重要之處在于，可見單獨(dú)的低氧產(chǎn)生約60倍的誘導(dǎo)比率(圖8a；泳道2，8)。因此，Hs.16335被鑒定為真實(shí)的低氧調(diào)節(jié)基因，盡管其在未用本發(fā)明(Smartomics)的陣列篩選檢測(cè)水平之下。
圖8a的檢測(cè)結(jié)果還解釋了Smartomics法的一個(gè)用于鑒定對(duì)EPAS1或HIF-1α過表達(dá)選擇性或優(yōu)選反應(yīng)的基因的單獨(dú)實(shí)施方案。HIF-1α過表達(dá)產(chǎn)生18.9倍的誘導(dǎo)比率(泳道3)，而EPAS1過表達(dá)產(chǎn)生141倍的大得多的誘導(dǎo)比率(泳道5)。
在圖8a的泳道9中，顯示LPS和THFα激活巨噬細(xì)胞使對(duì)應(yīng)于Hs.16335的基因表達(dá)增加10.8倍。因此，該新基因可能與巨噬細(xì)胞的炎性功能相關(guān)。
在圖8b中，發(fā)現(xiàn)人β-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中都大致恒定，與圖8a中由于基因表達(dá)的特異性變化而產(chǎn)生的差異一致。
可根據(jù)有效RNA印跡上cDNA的大小進(jìn)行cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)，以克隆對(duì)應(yīng)于Hs.16335的全長型基因。對(duì)該基因的測(cè)序和功能分析可能導(dǎo)致鑒定出新治療靶分子。該過程的至關(guān)重要之處是開始使用Smartomics發(fā)明。實(shí)施例3EIAV載體構(gòu)建本實(shí)施例描述了在CMV啟動(dòng)子下游具有4種獨(dú)特克隆位點(diǎn)的EIAV載體(pONY8.1SM)的產(chǎn)生。根據(jù)其包含的EIAV序列(約1.1kb)和其表達(dá)的EIAV蛋白(無)，pONY8.1SM是迄今為止最小的EIAV載體。該載體是基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例，可用于按照本發(fā)明的差異表達(dá)篩選方法。但是，可以使用其它基于任何其它慢病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺病毒、α病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒或任何合適制品的DNA的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。構(gòu)建EIAV型載體pONY8.1SM起點(diǎn)是pONY4.0Z(GB9727135.7和Mitophanous等，1999)。用ATTG替換EIAV gag區(qū)中的前兩個(gè)ATG三聯(lián)體，以消除EIAV基因組的gag表達(dá)，同時(shí)保持載體中的gag序列。發(fā)現(xiàn)gag序列對(duì)于保持產(chǎn)生高滴度載體很重要。
通過PCR進(jìn)行ATG至ATTG的變化。使用引物ATTG1和PS2對(duì)EIAV前導(dǎo)序列/gag序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其模板是質(zhì)粒pONY3.1(GB9727135.7和Mitophanous等，1999)。該P(yáng)CR片段在5′和3′末端分別包含NarI和XbaI位點(diǎn)。將該片段插入到用NarI和XbaI切割的pONY4Z中，產(chǎn)生pONY8.0Z。
ATTG1引物AGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGGCTGATCGTAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTCCTGGCCAGAACACAGGAGGACAGGTAAGATTGGGAGACCCTTTGACATTGGAGCAAGGCGCTCAAGAA下劃線＝NarI位點(diǎn)PS2引物TAGTTCTAGAGATATTCTTCAGAG下劃線＝XbaI位點(diǎn)pONY8.1SM是含內(nèi)部CMV啟動(dòng)子的EIAV載體基因組，由該啟動(dòng)子可表達(dá)任何目的基因。該載體通過缺失pONY8Z的一部分env序列制備。用SbfI切割pONY8Z(位置5885)。接著用SapI部分切割(在pONY8Z中有兩個(gè)SapI位點(diǎn)，參看圖9)。然后純化于位點(diǎn)8056切割的分子，平端并再連接，獲得pONY8.1Z。為產(chǎn)生pONY8.1SM，用SacII和SphI切割pONY8.1Z、平端并再連接。這去除了lacZ基因，并產(chǎn)生了4個(gè)用于插入任意基因或基因文庫的獨(dú)特位點(diǎn)BsmBI、SbfI、EcoRI和HindIII(圖10)。SbfI具有一個(gè)8堿基識(shí)別序列，使其用于插入未知基因。實(shí)施例4產(chǎn)生表達(dá)HIF1-α的EIAV載體本實(shí)施例描述了產(chǎn)生能夠由內(nèi)部CMV啟動(dòng)子表達(dá)HIF-1α的EIAV載體(pONY8.1SMHIF1)。人HIF-1α的登錄號(hào)為U22431。為制備pONY8.1SMHIF1，由分離自Jurkat細(xì)胞的mRNA產(chǎn)生的cDNA對(duì)HIF-1α進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其引物為下述的HIFPM1和HIFPM2。它們含有用于克隆的SbfI位點(diǎn)，并使用Kozak序列增強(qiáng)翻譯。該途徑產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物含有SbfI克隆位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于HIF-1α可讀框的側(cè)翼。用SbfI切割該產(chǎn)物，并插入到SbfI切割的pONY8.1SM中。以該途徑產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pONY8.1SMHIF1。
HIFPM1引物ATCGCCTGCAGG GAGGGCGCCGGCGGCGCGSbfI位點(diǎn)＝下劃線，Kozak序列＝粗斜體，ATG起始密碼子＝下劃線斜體HIFPM2引物ACTGCCTGCAGGTCAGTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAGSbfI位點(diǎn)＝下劃線該質(zhì)粒用于和gag-pol和env表達(dá)質(zhì)粒連接，產(chǎn)生如Mitrophanous等，1999所述的EIAV型載體顆粒。然后在基因受Hif1途徑直接或間接控制的情況下，使用這些顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)各種可能感興趣的細(xì)胞類型。
一個(gè)實(shí)例是初級(jí)人骨骼肌細(xì)胞。對(duì)比轉(zhuǎn)導(dǎo)和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞群。另外，對(duì)比低氧濃度下的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和正常氧濃度下的未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。
制備用于差異基因表達(dá)分析的RNA樣品。這些樣品或者放射標(biāo)記，或者熒光標(biāo)記，并與固相支持體上的cDNA陣列雜交。受低氧和/或各種HIF蛋白表達(dá)上調(diào)的基因產(chǎn)生數(shù)量上更強(qiáng)的雜交信號(hào)。陣列方案可包括綜述于Bowtell，1999的尼龍或玻璃支持物。涉及玻璃支持物方案的方法學(xué)細(xì)節(jié)詳述于Eisen和Brown，1999。在此使用熒光標(biāo)記探針，并使用激光共聚焦掃描儀檢測(cè)雜交。對(duì)于尼龍支持物方案，所涉及的點(diǎn)印跡和雜交的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法見MolecularCloningA Laboratory Manual，Sambrook，J等，Cold Spring HarborLaboratory Press詳述。在此，放射標(biāo)記對(duì)比的RNA樣品，并使用磷成像儀檢測(cè)雜交。
陣列可購自Research Genetics，Huntsville，AL，或者可使用通過扣除克隆產(chǎn)生的cDNA克隆自己制備(PCR選擇法，由Clontech，PaloAlto，CA擁有)。制備包括使用點(diǎn)陣機(jī)器人(MicroGrid，BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)。實(shí)施例5產(chǎn)生表達(dá)HIF1-α的密碼子優(yōu)化的EIAV載體本實(shí)施例描述了產(chǎn)生EIAV衍生載體pSMART CMV-HIF，其中HIF-1α表達(dá)由位于載體內(nèi)部的CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)(圖11)。為本專利所述的差異篩選目的，可以使用相似的載體骨架獲得其它基因的表達(dá)。
構(gòu)建pSMART CMV-HIF的起點(diǎn)是pONY4.0Z(WO 99/32646和Mitophanous等，Gene Ther.1999年11月；6(11)1808-18)。在第一步中，通過引入突變將質(zhì)粒pONY4.0Z轉(zhuǎn)變?yōu)閜ONY8.0Z(參見以上的實(shí)施例3)，所述突變1)通過在tat的外顯子2產(chǎn)生一個(gè)83nt的缺失防止TAT表達(dá)；2)通過一個(gè)51nt的缺失防止S2 ORF表達(dá)；3)通過缺失rev外顯子1中的單個(gè)堿基防止REV表達(dá)；和4)通過在gag區(qū)的第一個(gè)和第二個(gè)ATG密碼子中插入T殘基，從而將序列由ATG變?yōu)锳TTG，防止gag的N末端部分表達(dá)。相對(duì)于野生型EIAV序列(登錄號(hào)U01866)，這些缺失對(duì)應(yīng)于以下缺失1)核苷酸5234-5316，首尾均包括在內(nèi)；2)核苷酸5346-5396，首尾均包括在內(nèi)；和3)核苷酸5538。插入的T殘基(4)在核苷酸526和核苷酸543之后。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員容易實(shí)施的技術(shù)進(jìn)行這些改變。獲得的載體pONY8.0Z不表達(dá)任何EIAV輔助蛋白或任何EIAV gag蛋白。
在第二步中，用增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(eGFP)報(bào)告基因替換pONY8.0Z中存在的β-半乳糖苷酶報(bào)告基因，產(chǎn)生pONY8G。這可通過將對(duì)應(yīng)于GFP基因的SacII-KpnI片段和pONY2.13GFP的側(cè)翼序列(WO 99/32646)轉(zhuǎn)移至用相同酶切割的pONY8.0Z中進(jìn)行。
已經(jīng)表明，叫做中央多嘌呤段的序列和中央終止序列(cPPT/CTS)的存在改善了基因通過HIV-1型載體傳遞至非分裂細(xì)胞的效率(Zennou等，Cell，2000年4月14日；101(2)173-85，F(xiàn)ollenzi等，Nat Genet.2000年6月；25(2)217-22)。類似的EIAV順式作用元件位于多聚酶編碼區(qū)，并可作為功能元件如下通過使用PCR擴(kuò)增由任何含有EIAV多聚酶編碼區(qū)(例如pONY3.1，WO 99/32646)的質(zhì)粒獲得。PCR產(chǎn)物包括中央多嘌呤段和中央終止序列(CTS)。用于PCR反應(yīng)的寡核苷酸引物是EIAV cPPT POSCAGGTTAT GTCGACGCTCTCATTACTTGTAACEIAV cPPT NEGCGAATGCGT GTCGACCATGTTCACCAGGGATTTTGXbaI的識(shí)別序列以粗體顯示，并將其插入到pONY8G骨架中。在插入如上所述制備的cPPT/CTS PCR產(chǎn)物之前，修飾pONY8G，以去除已經(jīng)存在于pONY8G載體中的中央終止序列(CTS)。這可通過將含pONY8.0Z的CTS和RRE區(qū)的SalI至ScaI片段亞克隆入用SalI和EcoRV消化連接制備的pSP72中實(shí)現(xiàn)。然后通過用KpnI和PpuMI消化提取CTS區(qū)，突出端用T4 DNA聚合酶處理‘平端’，接著再連接末端。然后使用SalI和NheI提取修飾的EIAV載體片段，并連接入用同樣的酶消化連接制備的pONY8G中。此新EIAV載體叫做pONY8G del CTS。pONY8G del CTS具有兩個(gè)XbaI位點(diǎn)，位于CMV-GFP表達(dá)盒側(cè)翼，代表cPPT/CTS的PCR產(chǎn)物在用XbaI消化后可連接入部分消化后的任一個(gè)位點(diǎn)中。連接至這些位點(diǎn)產(chǎn)生具有或者正義或者反義的cPPT/CTS元件的質(zhì)粒。其中cPPT/CTS在5′或3′-位置為正義(功能活性)的克隆分別叫做pONY8G 5′POS del CTS和pONY8G 3′POS del CTS。還按照與制備pONY8G 5′POS del CTS相似的策略制備了另一個(gè)叫做pONY8Z 5′POS del CTS的載體。因此，以相同的方式去除存在于pONY8.0Z中的CTS序列，以制備pONY8Zdel CTS，并將cPPT/CTS序列引入到恰好在pONY8Z del CTS的CMV啟動(dòng)子上游的唯一XbaI位點(diǎn)中。
通過用HIF-1α的編碼區(qū)替換eGFP的編碼區(qū)，由pONY8G 5′POSdel CTS產(chǎn)生pSMART CMV-HIF載體質(zhì)粒。這可通過用SacII和NotI消化pONY8G 5′POS del CTS(SacII和NotI位點(diǎn)位于eGFP基因側(cè)翼)并連接至由質(zhì)粒AdApt HIF-1α-ires-GFP獲得的SacII-NotI片段實(shí)現(xiàn)。按以上實(shí)施例2所述構(gòu)建質(zhì)粒AdApt HIF-1α-ires-GFP。
還制備了pONY8G 5′POS del CTS的另一個(gè)衍生物，以便獲得在轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中用做‘陰性對(duì)照’的載體制備物。該載體叫做pSMARTCMV-空白型載體(圖12)，通過用BsmBI和NotI消化pONY8G 5′POSdel CTS(BsmBI和NotI位點(diǎn)位于eGFP基因側(cè)翼)然后再連接制備。根據(jù)由內(nèi)部啟動(dòng)子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的序列分析，預(yù)期該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞僅產(chǎn)生一個(gè)3氨基酸的肽。
使用磷酸鈣沉淀法，通過用載體質(zhì)粒pONY3.1(表達(dá)EIAVgag/pol蛋白)和包膜表達(dá)質(zhì)粒pRV67(編碼皰疹性口腔炎病毒蛋白G，VSV-G)中的任一種瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293-T人胚腎細(xì)胞，獲得上述的EIAV載體。
轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將293T細(xì)胞以每皿3.6×106細(xì)胞接種在裝有10ml補(bǔ)加谷氨酰胺、非必需氨基酸和10％胎牛血清的DMEM的10cm培養(yǎng)皿中。在第二天下午進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞過夜溫育，然后用補(bǔ)加丁酸鈉(5mM)的6ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。7小時(shí)后收集培養(yǎng)基，并將6ml未補(bǔ)加的新鮮培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中。通過低速離心澄清收集的培養(yǎng)基，然后通過0.4μm濾膜過濾。
然后于4℃通過過夜低速離心(6,000g，JLAl0.500轉(zhuǎn)子)濃縮載體顆粒，傾去上清液，留下管底部的沉淀。第二天早晨收獲剩余的組織培養(yǎng)液，澄清并過濾。然后將其置于先前收集的沉淀頂部，再進(jìn)行過夜離心。此后傾析上清液，排掉多余的液體。然后將沉淀重懸浮在配制緩沖液中，達(dá)到起始上清液體積的1/1000。然后以等份儲(chǔ)存于-80℃。配制緩沖液(100ml)組織培養(yǎng)級(jí)水 28.65ml19.75mM Tris/HCl緩沖液pH7.019.75ml的0.1M溶液40mg/ml乳糖26.6ml的150mg/ml溶液37.5mM NaCl24.4ml的154mM溶液1mg/ml的人血清白蛋白a500μl的20％溶液
5μl/ml的硫酸魚精蛋白b100μl的5mg/ml溶液a人血清白蛋白(20％)(Albuteinv，Alpha therapeutics UK Ltd，Thetford，Norfolk)。
b硫酸魚精蛋白5mg/ml(Prosulf，CP Pharmaceuticals，Wrexham，UK)。
SED ID NO4中提供了pSMART CMV-HIF的序列。
SED ID NO5中提供了pSMART CMV-空白型的序列。實(shí)施例6使用Smartomics鑒定海馬神經(jīng)元中的基因如以上實(shí)施例1和2所述，低氧是中風(fēng)(腦局部缺血)的重要組成部分?，F(xiàn)在利用本發(fā)明(Smartomics)改善了對(duì)初級(jí)大鼠海馬神經(jīng)元中低氧作用激活或抑制的基因的尋找。這涉及通過實(shí)驗(yàn)性引入低氧反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，即低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)，增強(qiáng)對(duì)低氧的天然反應(yīng)。HIF-1α過表達(dá)與細(xì)胞接觸低氧相組合使得可以檢測(cè)出在單獨(dú)的HIF-1α過表達(dá)或單獨(dú)的低氧作用下尚不能檢測(cè)的基因表達(dá)變化。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法由胚胎大鼠建立初級(jí)大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物(Dunnett SB，Bjorkland A(主編)1992，Neural Transplantation，APractical Approach，IRL Press)。簡(jiǎn)而言之，在妊娠第18天用0.7ml異熒烷麻醉記錄懷孕時(shí)間的Wistar大鼠，并通過頸部脫位處死。取出子宮中的幼鼠并去頭。解剖海馬并在含DNAse(0.05％)和葡萄糖(2mM)的Hanks緩沖鹽溶液(HBSS)中儲(chǔ)存在冰上，然后在胰蛋白酶(0.1％)和DNAse(0.05％)中溫育5分鐘。溫育后，通過加入大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI，0.1％)使胰蛋白酶失活，輕柔地研制溶液。通過離心(3,000rpm，5分鐘)沉淀細(xì)胞并去除胰蛋白酶。然后用含SBTI和DNAse(0.05％)的HBSS清洗細(xì)胞兩次，再沉淀，然后最終懸浮于含胎牛血清(10％)、谷氨酰胺(2mM)和慶大霉素(0.1mg/ml)的Dulbecco改良型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。將細(xì)胞(3×106細(xì)胞/皿)平板接種在包被聚-D-賴氨酸(50μg/ml)和纖連蛋白附著促進(jìn)肽(10μg/ml)的60mm皿上。將培養(yǎng)物放置在含5％CO2的37℃濕潤培養(yǎng)箱中，平板接種后12小時(shí)，用補(bǔ)加B27和谷氨酰胺(2mM)的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Brewer GJ，(1995)“無血清B27/神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基支持紋狀體、黑質(zhì)、隔膜、大腦皮質(zhì)、小腦和齒狀回的神經(jīng)元差異生長”，Journal of NeuroscienceResearch 42674-83)替換50％的平板接種培養(yǎng)基。每?jī)商煊醚a(bǔ)加的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基供給培養(yǎng)物，并在第3天體外轉(zhuǎn)導(dǎo)。
在含聚凝胺(2μg/ml)的補(bǔ)加神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以0.5體積的典型培養(yǎng)基體積進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)開始后5小時(shí)，將培養(yǎng)基體積增加2倍，12小時(shí)后更換。按照以上詳述的方法平行產(chǎn)生病毒pSMART CMV-HIF(攜帶HIF-1α基因；參見實(shí)施例5)、pSMART CMV-空白型(用作對(duì)照的空基因組；參見實(shí)施例5)和pONY8Z 5′POS del CTS(含β-半乳糖苷酶基因)。使用pONY8Z 5′POS del CTS計(jì)算D17細(xì)胞和海馬神經(jīng)元中的病毒滴度。通過對(duì)三種病毒制備物進(jìn)行定量RT-PCR(Taqman)對(duì)比RNA包裝信號(hào)，這種對(duì)比可以建立相對(duì)于pONY8Z5′POS del CTS的pSMART CMV-HIF和pSMART CMV-空白型病毒的生物滴度。所有的轉(zhuǎn)導(dǎo)都使用對(duì)兩種病毒大約相等的感染復(fù)數(shù)(MOI)進(jìn)行，用于每個(gè)實(shí)驗(yàn)的MOI至少為10。
轉(zhuǎn)導(dǎo)后36小時(shí)，將相同的培養(yǎng)皿分放入兩個(gè)單獨(dú)的培養(yǎng)箱中，一個(gè)為37℃、5％CO2、95％空氣(＝正常氧含量)，而另一個(gè)為37℃、5％CO2、94.9％氮?dú)狻?.1％氧(＝低氧)。在這些條件下培養(yǎng)6小時(shí)后，由培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，防止于冰冷的平臺(tái)上，用冷PBS清洗，使用RNazol B(Tel-Test，Inc；由Biogenesis Ltd經(jīng)銷)按照廠商的說明提取總RNA。
實(shí)驗(yàn)提供4個(gè)樣品，其差異僅在于它們用慢病毒和/或低氧處理，如下所示樣品慢病毒表達(dá)基因氧條件1 pSMART CMV-空白型 無 正常氧含量2 pSMART CMV-空白型 無 低氧3 pSMART CMV-HIF HIF-1α 正常氧含量4 pSMART CMV-HIF HIF-1α 低氧可以通過對(duì)比這些樣品之間的基因表達(dá)模式實(shí)現(xiàn)基因?qū)ふ?。按照本領(lǐng)域公開的常規(guī)方法，人們應(yīng)對(duì)比細(xì)胞類型1和細(xì)胞類型2。通過實(shí)施本發(fā)明(Smartomics)，看出其它幾種可能性。首先，可以對(duì)比細(xì)胞類型1和3。在此，對(duì)涉及低氧反應(yīng)的關(guān)鍵分子過表達(dá)的刺激可以超出對(duì)低氧的天然反應(yīng)，如細(xì)胞類型2所見。其次，可以對(duì)比細(xì)胞類型1和4。在此情況下，對(duì)低氧的天然反應(yīng)通過過表達(dá)涉及低氧反應(yīng)的關(guān)鍵分子而被放大或加強(qiáng)。
使用Research Genetics Rat GeneFilter GF300(Research Genetics，Huntsville，AL)獲得分離自4個(gè)樣品的RNA的總體mRNA表達(dá)模式。該方法使用預(yù)先制備的DNA尼龍陣列，所述DNA得自含基因的3′末端的I.M.A.G.E./LLNL cDNA克隆。所述陣列包括5,000個(gè)以上的基因，含有一系列的特征水平，包括代表未注解的EST的序列或未知功能的cDNA序列。
放射標(biāo)記由上述4個(gè)樣品中提取的RNA，并與單獨(dú)拷貝的Research Genetics Rat GeneFilter GF300雜交。對(duì)生產(chǎn)商提供的方法(http//www.resgen.com/products/GF200_protocol.php3)進(jìn)行以下修改后進(jìn)行操作將RNAsin加入到標(biāo)記反應(yīng)物中，在標(biāo)記后通過與45mMEDTA/18mM NaOH于65℃溫育30分鐘使mRNA/cDNA雜交體變性。
使用Molecular Dynamics Storm磷成像儀獲得雜交陣列的圖象。然后按照前述方法由陣列中剝離RNA。為確保重現(xiàn)性，用相同的RNA樣品重復(fù)該方法。然后輸入兩組數(shù)據(jù)，并使用Research GeneticsPathways 3.0軟件按照Pathways 3.0說明書的解釋進(jìn)行分析。以下概述該分析的關(guān)鍵方面程序結(jié)構(gòu)設(shè)置“條件對(duì)”模式用于同時(shí)分析多個(gè)實(shí)驗(yàn)。在此情況下一個(gè)條件等于一個(gè)樣品(例如樣品3，在正常氧含量下過表達(dá)HIF-1α)。歸一化設(shè)置按照Pathways 3.0說明書的解釋選擇數(shù)據(jù)點(diǎn)歸一化。該技術(shù)通過將所有的樣品強(qiáng)度除以陣列上所有克隆(對(duì)照點(diǎn)除外)的平均樣品強(qiáng)度產(chǎn)生歸一化強(qiáng)度。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)作為單獨(dú)的歸一化組處理，使得同一實(shí)驗(yàn)不同陣列之間的雜交信號(hào)總體差異得到校正。對(duì)比分析條件1(即樣品1)對(duì)應(yīng)于用對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)并置于正常氧濃度(正常氧含量)下的細(xì)胞。該條件在與條件2、3和4(即樣品2、3和4)的成對(duì)對(duì)比中用作參比條件。
以此方式對(duì)Research Genetics GF300陣列上存在的所有基因進(jìn)行對(duì)比。通過對(duì)比這些條件，該分析判斷兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。4個(gè)代表性的已知HIF-1α/低氧調(diào)節(jié)基因的結(jié)果就發(fā)現(xiàn)的真實(shí)低氧調(diào)節(jié)基因來說，證實(shí)在低氧細(xì)胞中過表達(dá)HIF-1α優(yōu)于使用非轉(zhuǎn)導(dǎo)低氧細(xì)胞或在正常氧含量細(xì)胞中過表達(dá)HIF-1α，本領(lǐng)域已知受低氧和HIF-1α調(diào)節(jié)的基因的結(jié)果示于以下。比率表示為歸一化強(qiáng)度的平均比率。
表2.已知的HIF-1α/低氧調(diào)節(jié)基因的反應(yīng)
列于表2的全部4個(gè)基因都是本領(lǐng)域已知的低氧調(diào)節(jié)基因，并已經(jīng)RNA印跡分析證實(shí)在HIF1-α敲除時(shí)下調(diào)(Iyer等，(1998)，低氧誘導(dǎo)因子1α對(duì)O2穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞和發(fā)育控制，Genes Dev 12149-162)。在烯醇化酶1α的情況下，通過陣列雜交未檢測(cè)到正常氧含量下對(duì)低氧或Hif-1α過表達(dá)的反應(yīng)。僅在Hif-1α于低氧下過表達(dá)時(shí)檢測(cè)到表達(dá)水平比正常氧含量增加。在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的情況下，低氧下Hif-1α過表達(dá)使檢測(cè)的低氧反應(yīng)增加。在甘油醛-3-磷酸脫氫酶和乳酸脫氫酶A的情況下，檢測(cè)到低氧反應(yīng)，但正常氧含量下Hif-1α過表達(dá)增加反應(yīng)，低氧下Hif-1α過表達(dá)甚至更是如此。過濾設(shè)置然后進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，以減少數(shù)據(jù)組，并選擇以上詳述的三對(duì)對(duì)比中至少一對(duì)的表達(dá)比率在2.0以上的基因。使用最小0.2的IntensityII濾器將在所有4種條件下信號(hào)強(qiáng)度都低的基因自動(dòng)去除。使用Students t檢驗(yàn)濾器(90％可信度)將在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中都以重復(fù)方式不反應(yīng)的基因自動(dòng)去除。
結(jié)果以各個(gè)基因的表達(dá)模式輸出，顯示歸一化信號(hào)強(qiáng)度和表達(dá)比率。Pathways 3.0分析的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)在于顯示的原始圖象的各個(gè)點(diǎn)的高放大倍數(shù)微型圖象。這使得可以目測(cè)鑒別確實(shí)覆蓋包含雜交陣列點(diǎn)區(qū)的檢測(cè)部位。已知基因和新基因的注解就發(fā)現(xiàn)的新低氧調(diào)節(jié)基因來說，證實(shí)在低氧細(xì)胞中過表達(dá)HIF-1α優(yōu)于使用非轉(zhuǎn)導(dǎo)低氧細(xì)胞或在正常氧含量細(xì)胞中過表達(dá)HIF-1α，本領(lǐng)域已知受低氧調(diào)節(jié)但不受HIF-1α調(diào)節(jié)的基因和未注解基因的結(jié)果示于以下。比率表示為歸一化強(qiáng)度的平均比率。
表3.新HIF-1α調(diào)節(jié)基因的反應(yīng)
a代表性的金屬硫蛋白EST在陣列上點(diǎn)樣兩次，所以數(shù)據(jù)是兩個(gè)點(diǎn)的平均值。
由文獻(xiàn)可知金屬硫蛋白-I受低氧調(diào)節(jié)(Murphy等(1999)，低氧激活金屬硫蛋白基因表達(dá)涉及金屬效應(yīng)元件和金屬轉(zhuǎn)錄因子-1，CancerRes 59(6)1315-22)，但不知道受HIF-1α調(diào)節(jié)。表3的數(shù)據(jù)顯示，對(duì)低氧下HIF-1α過表達(dá)的反應(yīng)遠(yuǎn)超過對(duì)單獨(dú)低氧的反應(yīng)和對(duì)正常氧含量下HIF-1α過表達(dá)的反應(yīng)。該EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)是完全沒有注解的DNA序列。同樣，表3的數(shù)據(jù)顯示，對(duì)低氧下HIF-1α過表達(dá)的反應(yīng)遠(yuǎn)超過對(duì)單獨(dú)低氧的反應(yīng)和對(duì)正常氧含量下HIF-1α過表達(dá)的反應(yīng)。
該數(shù)據(jù)顯示，上述方法使已知基因的其它功能注解和功能未知的完全未注解新基因的功能注解成為可能。實(shí)施例7使用Smartomis鑒定細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的基因嗜酸性粒細(xì)胞與諸如哮喘的變應(yīng)性疾病有關(guān)，哮喘的特征為在患病組織有大量的嗜酸性粒細(xì)胞。IL-5是涉及嗜酸性粒細(xì)胞分化和存活的關(guān)鍵細(xì)胞因子。IL-5刺激嗜酸性粒細(xì)胞生成作用，并由骨髓釋放，還延長了外周血嗜酸性粒細(xì)胞的存活。因此，IL-5在哮喘的發(fā)生機(jī)理中可能扮演起因的角色。
在IL-5刺激作用下激活的基因作為哮喘治療的潛在標(biāo)靶引人矚目。
代表本領(lǐng)域發(fā)展水平的簡(jiǎn)單方法涉及采用嗜酸性粒細(xì)胞群，將其分為兩組，一組置于存在IL5的條件下，而另一組置于沒有IL5的條件下。然后將兩組的RNA或蛋白用于合適的差異分析中。目標(biāo)是鑒定在IL5存在的條件(IL5+)下存在但在無IL5培養(yǎng)基保持細(xì)胞(IL5-)中不存在的蛋白或cDNA。
用于在嗜酸性粒細(xì)胞中鑒定IL5誘導(dǎo)基因和蛋白的本發(fā)明試圖放大IL5+和IL5-之間的差異，以便增加信噪比。這可以通過將IL5受體基因傳遞至處于過表達(dá)形態(tài)的嗜酸性粒細(xì)胞中來增加對(duì)IL5信號(hào)的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。
IL5α受體以兩種同種型存在，一種為起IL5激動(dòng)劑作用的膜結(jié)合形式，一種為起IL5拮抗劑作用的溶解形式。因?yàn)榧?xì)胞通常表達(dá)兩種同種型，所以似乎它們以保持二者之間平衡的方式調(diào)節(jié)其反應(yīng)。一種或另一種的表達(dá)應(yīng)當(dāng)以一種不可能僅改變外源IL5濃度的方式‘強(qiáng)行影響’嗜酸性粒細(xì)胞的反應(yīng)。
預(yù)期膜結(jié)合形式的IL5α受體過表達(dá)應(yīng)使細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子反應(yīng)過強(qiáng)。在差異篩選中，該形式受體的過表達(dá)將導(dǎo)致IL-5特異性cDNA或蛋白水平增加。檢測(cè)藥物開發(fā)靶的可能性因此而增加。本發(fā)明應(yīng)用于該情況時(shí)包括對(duì)比在IL5配體不存在時(shí)沒有過表達(dá)膜結(jié)合形式的IL5α受體的嗜酸性粒細(xì)胞和接觸IL5并過表達(dá)膜結(jié)合形式的IL5α受體的嗜酸性粒細(xì)胞。
同樣，預(yù)期起IL-5拮抗劑作用的溶解形式受體過表達(dá)將減弱嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)IL-5刺激的反應(yīng)。對(duì)比在IL5配體不存在時(shí)過表達(dá)溶解形式的IL5α受體的嗜酸性粒細(xì)胞和接觸IL5(但不過表達(dá)溶解IL5α受體)的嗜酸性粒細(xì)胞的表達(dá)模式。這些方法中的任一種都可用于辨別在IL5作用下表達(dá)、其產(chǎn)物是治療諸如哮喘的變應(yīng)性疾病的潛在標(biāo)靶的基因。
可以使用任何表達(dá)IL5受體的細(xì)胞系，例如AML14.3D10、TF1.8或HL-60。可通過各種方式實(shí)現(xiàn)膜結(jié)合形式和溶解形式的IL5α受體的傳遞和表達(dá)。例如，可以用以上實(shí)施例和以下實(shí)施例8描述的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞。
以如下所述的眾多方式對(duì)比轉(zhuǎn)導(dǎo)和未轉(zhuǎn)導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞群的基因表達(dá)，以獲得在IL5作用下表達(dá)的基因讀數(shù)。對(duì)比IL5不存在時(shí)用表達(dá)溶解性IL5α受體的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和IL5存在時(shí)的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對(duì)比IL5存在時(shí)用表達(dá)膜結(jié)合IL5α受體的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和IL5不存在時(shí)的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
制備總RNA樣品用于差異基因表達(dá)分析。這些樣品或者放射標(biāo)記或者熒光標(biāo)記，并與固相支持物上的cDNA陣列雜交。IL5上調(diào)的基因產(chǎn)生數(shù)量上更強(qiáng)的雜交信號(hào)。陣列方案可以包括尼龍或玻璃支持物的任一種，綜述于Bowtell，1999。涉及玻璃支持物方案的方法學(xué)細(xì)節(jié)詳述于Eisen和Brown，1999。在此情況下使用熒光標(biāo)記探針，并使用激光共聚焦掃描儀檢測(cè)雜交。對(duì)于尼龍支持物方法，包括點(diǎn)印跡和雜交的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法詳述于Molecular CloningALaboratory Manual，Sambrook，J等，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。在此情況下，放射標(biāo)記對(duì)比的RNA樣品，并使用磷成像儀檢測(cè)雜交。
陣列可購自Research Genetics，Huntsville，AL，或使用通過扣除克隆產(chǎn)生的cDNA克隆自己制作(PCR選擇法，由Clontech，Palo Alto，CA擁有)。制作包括應(yīng)用點(diǎn)陣機(jī)器人(MicroGrid，BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)。
可以將分離自細(xì)胞的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并由此篩選cDNA?；蛘?，如上所述，可以使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法(例如雙向凝膠電泳)鑒定差異表達(dá)產(chǎn)物?？梢詤⒖糂1ackstock和Weir(1999)和其中提到的參考文獻(xiàn)，其中論述了各種各樣的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。
還可以使用以上方法測(cè)定對(duì)IL5起反應(yīng)的其它細(xì)胞(例如嗜堿性粒細(xì)胞和骨髓前體細(xì)胞)的差異表達(dá)模式。還可以使用通常對(duì)IL5無反應(yīng)的其它細(xì)胞，只要IL5的β鏈與α鏈共表達(dá)。對(duì)此，應(yīng)當(dāng)注意的是，IL-5、IL-3和GM-CSF受體共用相同的β鏈。實(shí)施例8過表達(dá)人IL5αR同種型本實(shí)施例描述了兩種EIAV載體(pONY8.1SMIL5Rm和pONY8.1SMIL5Rs)的產(chǎn)生，這兩種載體能夠由內(nèi)部CMV啟動(dòng)子表達(dá)IL5α膜受體(pONY8.1SMIL5Rm)或IL5α溶解性受體(pONY8.1SMIL5Rs)。人IL5αR的登錄號(hào)為A26251。。
為制備pONY8.1SMIL5Rm，由分離自人外周血嗜酸性粒細(xì)胞的mRNA產(chǎn)生的cDNA對(duì)IL5αR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物為下述的IL5R1和IL5R2。它們包含SbfI克隆位點(diǎn)，并使用Kozak序列增強(qiáng)翻譯。該方式產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物包含位于IL5αR可讀框側(cè)翼的SbfI克隆位點(diǎn)。用SbfI切割所述PCR引物，并插入到用SbfI切割的pONY8.1SM中。重要的是檢查IL5αR以正確的方向插入。該方式產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pONY8.1SMIL5Rm。
該構(gòu)建物表達(dá)野生型IL5αR。修飾IL5αR可讀框，以制備表達(dá)溶解形式的IL5αR的pONY8.1SMIL5Rs。
這可通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行，以去除所述受體的C末端(表位標(biāo)記的溶解性人IL-5受體，親和交聯(lián)標(biāo)記、IL-5結(jié)合和生物活性，BrownPM，Tagari P，Rowan KR，Yu VL，O′Neill GP，Middaugh CR，Sanyal G，F(xiàn)ord-Hutchinson AW，Nicholson DW)。前332個(gè)氨基酸保留，同時(shí)去除包含跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的后88個(gè)氨基酸。PCR引物為下述的IL5R1和IL5R3。它們包含SbfI克隆位點(diǎn)，并使用Kozak序列增強(qiáng)翻譯。該方式產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物包含位于IL5αR可讀框側(cè)翼的SbfI克隆位點(diǎn)。用SbfI切割所述PCR引物，并插入到用SbfI切割的pONY8.1SM中。重要的是檢查IL5αR以正確的方向插入。該方式產(chǎn)生的質(zhì)粒叫做pONY8.1SMIL5Rs。IL5R1引物ATCGCCTGCAGG ATGATCATCGTGGCGCATGTATTACSbfI位點(diǎn)＝下劃線Kozak序列＝粗斜體ATG起始密碼子＝下劃線斜體IL5R2引物ACTGCCTGCAGGTCAAAACACAGAATCCTCCAGGGTCSbfI位點(diǎn)＝下劃線IL5R3引物ACTGCCTGCAGGTCATCCCACATAAATAGGTTGGCTCSbfI位點(diǎn)＝下劃線其它實(shí)施例·在多巴胺能細(xì)胞系中過表達(dá)抗凋亡基因(即Bcl-2、Bcl-x)產(chǎn)生抗諸如MPTP的神經(jīng)毒素的神經(jīng)保護(hù)。因?yàn)樽钣写硇缘亩喟桶纺苌窠?jīng)元(初級(jí)細(xì)胞)為培養(yǎng)的有絲分裂期后細(xì)胞，所以可以使用慢病毒載體將所述基因引入這些神經(jīng)元中并過表達(dá)，然后篩選發(fā)生差異表達(dá)的細(xì)胞標(biāo)靶。
·還可以通過在神經(jīng)元中過表達(dá)(凋亡)死亡受體如Fas，并提供限制量的配體(FasL)，鑒定抗凋亡標(biāo)靶。這些細(xì)胞將通過誘導(dǎo)其神經(jīng)保護(hù)基因試圖存活。
·可以在細(xì)胞系中過表達(dá)類似的生長因子(NGF、GDNF等)及其受體，使所述細(xì)胞對(duì)生長因子的存活作用敏感。
·在幾種不同的神經(jīng)系統(tǒng)傷害模型中，刺激性傷害神經(jīng)系統(tǒng)之后表達(dá)諸如HSP70的熱激蛋白(HSP)及其過量產(chǎn)生產(chǎn)生保護(hù)作用。HSP涉及腦部局部缺血、神經(jīng)變性疾病、癲癇和創(chuàng)傷。HSP是通常結(jié)合熱激因子(HSF)的分子伴侶，其在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后于細(xì)胞溶膠中解離、磷酸化并三聚化，然后進(jìn)入細(xì)胞核中，它們?cè)谄渲薪Y(jié)合熱激基因啟動(dòng)子中的熱激元件(HSE)，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄激活。因此，HSP在神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)或內(nèi)皮細(xì)胞中的過表達(dá)可以和Hif1相似的方式進(jìn)行差異篩選。
·APP(淀粉樣前體蛋白)為Aβ肽前體的一種跨膜蛋白，于Alzheimer病的神經(jīng)斑中發(fā)現(xiàn)。已鑒定出引起某些家族(早期發(fā)生)形式疾病的突變。
·早老蛋白1和2對(duì)加工APP和某些其它膜蛋白很重要的跨膜蛋白。已經(jīng)在某些家族形式疾病中分離出幾種突變。
·α-synuclein一種與神經(jīng)元突觸結(jié)合的細(xì)胞質(zhì)蛋白。已經(jīng)在一些Parkinson病家系、部分Lewy體(Parkinson病的胞內(nèi)病灶特征，還見于Alzheimer病和Lewy體癡呆)中發(fā)現(xiàn)了突變。
·Tau一種微管結(jié)合蛋白。已經(jīng)在與染色體17連鎖的Parkinson綜合征前顳性癡呆和Pick病中發(fā)現(xiàn)突變。
·Parkin未知功能的蛋白，與遍在蛋白在N端具有一定同源性，在C端具有環(huán)指基序。在青少年型Parkinson病中鑒定出缺失。
·遍在蛋白(UCH-L1)形成部分Lewy體的巰基蛋白酶。已經(jīng)在德國Parkinson病家系中鑒定出突變。
以上說明書中提及的所有出版物都通過引用結(jié)合到本文中。在不背離本發(fā)明范圍和精神的情況下對(duì)本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)進(jìn)行各種修改和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。盡管結(jié)合特別優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但顯然要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)不恰當(dāng)?shù)叵抻谶@些具體的實(shí)施方案。實(shí)際上，用于實(shí)施本發(fā)明的所述模式的各種修改對(duì)分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，屬于以下權(quán)利要求的范圍。
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序列表SEQ ID NO1ires-GFP DNA片段的核苷酸序列CTAGAGTGTGATTTTAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCACTAGAGGAATTCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGTGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTAGTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGAATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAGCTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCGACTSEQ ID NO2含人HIF-1α蛋白編碼序列的DNA片段的核苷酸序列CTAGCCGTAGAATCCGACCGATTCACCATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGAACGACAAGAAAAAGATAAGTTCTGAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCGAGATGCAGCCAGATCTCGGCGAAGTAAAGAATCTGAAGTTTTTTATGAGCTTGCTCATCAGTTGCCACTTCCACATAATGTGAGTTCGCATCTTGATAAGGCCTCTGTGATGAGGCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTGAGGAAACTTCTGGATGCTGGTGATTTGGATATTGAAGATGACATGAAAGCACAGATGAATTGCTTTTATTTGAAAGCCTTGGATGGTTTTGTTATGGTTCTCACAGATGATGGTGACATGATTTACATTTCTGATAATGTGAACAAATACATGGGATTAACTCAGTTTGAACTAACTGGACACAGTGTGTTTGATTTTACTCATCCATGTGACCATGAGGAAATGAGAGAAATGCTTACACACAGAAATGGCCTTGTGAAAAAGGGTAAAGAACAAAACACACAGCGAAGCTTTTTTCTCAGAATGAAGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAAGAACTATGAACATAAAGTCTGCAACATGGAAGGTATTGCACTGCACAGGCCACATTCACGTATATGATACCAACAGTAACCAACCTCAGTGTGGGTATAAGAAACCACCTATGACCTGCTTGGTGCTGATTTGTGAACCCATTCCTCACCCATCAAATATTGAAATTCCTTTAGATAGCAAGACTTTCCTCAGTCGACACAGCCTGGATATGAAATTTTCTTATTGTGATGAAAGAATTACCGAATTGATGGGATATGAGCCAGAAGAACTTTTAGGCCGCTCAATTTATGAATATTATCATGCTTTGGACTCTGATCATCTGACCAAAACTCATCATGATATGTTTACTAAAGGACAAGTCACCACAGGACAGTACAGGATGCTTGCCAAAAGAGGTGGATATGTCTGGGTTGAAACTCAAGCAACTGTCATATATAACACCAAGAATTCTCAACCACAGTGCATTGTATGTGTGAATTACGTTGTGAGTGGTATTATTCAGCACGACTTGATTTTCTCCCTTCAACAAACAGAATGTGTCCTTAAACCGGTTGAATCTTCAGATATGAAAATGACTCAGCTATTCACCAAAGTTGAATCAGAAGATACAAGTAGCCTCTTTGACAAACTTAAGAAGGAACCTGATGCTTTAACTTTGCTGGCCCCAGCCGCTGGAGACACAATCATATCTTTAGATTTTGGCAGCAACGACACAGAAACTGATGACCAGCAACTTGAGGAAGTACCATTATATAATGATGTAATGCTCCCCTCACCCAACGAAAAATTACAGAATATAAATTTGGCAATGTCTCCATTACCCACCGCTGAAACGCCAAAGCCACTTCGAAGTAGTGCTGACCCTGCACTCAATCAAGAAGTTGCATTAAAATTAGAACCAAATCCAGAGTCACTGGAACTTTCTTTTACCATGCCCCAGATTCAGGATCAGACACCTAGTCCTTCCGATGGAAGCACTAGACAAAGTTCACCTGAGCCTAATAGTCCCAGTGAATATTGTTTTTATGTGGATAGTGATATGGTCAATGAATTCAAGTTGGAATTGGTAGAAAAACTTTTTGCTGAAGACACAGAAGCAAAGAACCCATTTTCTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAGATGTTAGCTCCCTATATCCCAATGGATGATGACTTCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGTTGTCACCATTAGAAAGCAGTTCCGCAAGCCCTGAAAGCGCAAGTCCTCAAAGCACAGTTACAGTATTCCAGCAGACTCAAATACAAGAACCTACTGCTAATGCCACCACTACCACTGCCACCACTGATGAATTAAAAACAGTGACAAAAGACCGTATGGAAGACATTAAAATATTGATTGCATCTCCATCTCCTACCCACATACATAAAGAAACTACTAGTGCCACATCATCACCATATAGAGATACTCAAAGTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGCAGGAAAAGGAGTCATAGAACAGACAGAAAAATCTCATCCAAGAAGCCCTAACGTGTTATCTGTCGCTTTGAGTCAAAGAACTACAGTTCCTGAGGAAGAACTAAATCCAAAGATACTAGCTTTGCAGAATGCTCAGAGAAAGCGAAAAATGGAACATGATGGTTCACTTTTTCAAGCAGTAGGAATTGGAACATTATTACAGCAGCCAGACGATCATGCAGCTACTACATCACTTTCTTGGAAACGTGTAAAAGGATGCAAATCTAGTGAACAGAATGGAATGGAGCAAAAGACAATTATTTTAATACCCTCTGATTTAGCATGTAGACTGCTGGGGCAATCAATGGATGAAAGTGGATTACCACAGCTGACCAGTTATGATTGTGAAGTTAATGCTCCTATACAAGGCAGCAGAAACCTACTGCAGGGTGAAGAATTACTCAGAGCTTTGGATCAAGTTAACTGAGCGGATCCGACGGGGATCCTSEQ ID 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權(quán)利要求
1.一種用于鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的遺傳因子的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括對(duì)比(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；和(b)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的參與細(xì)胞活動(dòng)的生物分子；以及鑒定差異表達(dá)的遺傳因子，其中在至少兩種與所述細(xì)胞活動(dòng)有關(guān)的不同環(huán)境條件下對(duì)比所述第一種和/或第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中在至少兩種與所述細(xì)胞活動(dòng)有關(guān)的不同環(huán)境條件下對(duì)比所述第一種和第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)。
3.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，該方法包括對(duì)比(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(b)在接觸了第一種類型環(huán)境變化的第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(c)在接觸了第二種類型環(huán)境變化的第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(d)在接觸了或者沒有接觸所述第一種和/或第二種類型環(huán)境變化的條件下在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子的活性對(duì)b)和c)項(xiàng)所述的環(huán)境變化中的一種或兩種產(chǎn)生反應(yīng)；以及鑒定差異表達(dá)的遺傳因子。
4.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述不同的環(huán)境條件是不同水平的生物信號(hào)。
5.按照權(quán)利要求4的方法，該方法包括對(duì)比(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(b)在接觸了與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的生物信號(hào)的第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中所述生物信號(hào)為第一種水平；(c)在觸了與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的生物信號(hào)的第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中所述生物信號(hào)為第二種水平；和(d)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子的活性對(duì)所述生物信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)，其中沒有所述信號(hào)或者所述信號(hào)為第一種水平或第二種水平；以及鑒定差異表達(dá)的遺傳因子。
6.按照權(quán)利要求4的方法，該方法包括對(duì)比(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(b)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞接觸了與所述細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的生物信號(hào)；(c)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子的活性對(duì)所述生物信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)，其中所述水平改變的生物分子為第一種水平，而其中所述生物信號(hào)存在或者不存在；(d)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(e)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞接觸了與所述細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的生物信號(hào)；(f)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制所述多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子，其中所述水平改變的生物分子為第二種水平，而其中所述生物信號(hào)存在或者不存在；以及鑒定差異表達(dá)的遺傳因子。
7.按照權(quán)利要求4的方法，該方法包括對(duì)比(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(b)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞接觸了與所述細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的生物信號(hào)；(c)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制第一種多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的第一種生物分子，該分子的活性對(duì)所述生物信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)，其中所述生物信號(hào)存在或者不存在；(d)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；(e)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中該細(xì)胞接觸了與所述細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的生物信號(hào)；(f)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制第二種多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的第二種生物分子，其中所述生物信號(hào)存在或者不存在；以及鑒定差異表達(dá)的遺傳因子。
8.一種用于鑒定其表達(dá)受信號(hào)調(diào)控的基因或基因產(chǎn)物的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括在兩種不同的信號(hào)水平上對(duì)比(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中所述信號(hào)為第一種水平；和(b)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的生物分子，該分子活性對(duì)所述信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)，其中所述信號(hào)為第二種水平；以及鑒定差異表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物。
9.按照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述第一種和第二種細(xì)胞為不同的細(xì)胞類型。
10.按照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述生物分子水平相對(duì)于生理水平提高。
11.按照權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中所述生物分子水平相對(duì)于生理水平降低。
12.按照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述生物分子和所述多肽相同。
13.按照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述異源核酸通過病毒載體引入到所述細(xì)胞中。
14.按照權(quán)利要求13的方法，其中所述病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒(如馬傳染性貧血病病毒(EIAV)或1型人類免疫缺陷病毒(HIV-1))、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和痘病毒(如昆蟲痘病毒)。
15.按照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)測(cè)定基因表達(dá)。
16.按照權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，其中使用基因組或cDNA技術(shù)測(cè)定基因表達(dá)。
17.按照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述第一種目的細(xì)胞具有正常生理水平的所述生物分子。
18.按照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述多肽參與所述細(xì)胞活動(dòng)。
19.按照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述第一種細(xì)胞得自正?；颊撸龅诙N細(xì)胞得自患病患者。
20.按照權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的方法，其中所述第一種細(xì)胞得自患病患者，而所述第二種細(xì)胞得自相同患病患者。
21.按照權(quán)利要求1-7和9-20任一項(xiàng)的方法，其中所述遺傳因子為基因、基因產(chǎn)物或調(diào)節(jié)元件。
22.一種用于鑒定參與疾病過程的基因產(chǎn)物的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括(i)對(duì)比以下細(xì)胞的基因表達(dá)(a)第一種目的細(xì)胞；和(b)第二種目的細(xì)胞；(ii)對(duì)比以下細(xì)胞的基因表達(dá)(a)所述第一種目的細(xì)胞；和(b)第三種目的細(xì)胞，該細(xì)胞由于將控制侯選基因產(chǎn)物表達(dá)的異源核酸引入到所述第一種細(xì)胞中而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的所述侯選基因產(chǎn)物；以及(iii)選擇使所述第三種目的細(xì)胞中的第二種基因產(chǎn)物的表達(dá)水平相對(duì)于所述第一種目的細(xì)胞發(fā)生改變的侯選基因產(chǎn)物，所述第二種目的細(xì)胞中的第二種基因產(chǎn)物相對(duì)于所述第一種目的細(xì)胞的表達(dá)水平也發(fā)生了改變。
23.按照權(quán)利要求22的方法，其中所述侯選基因產(chǎn)物為多肽。
24.按照權(quán)利要求22或23的方法，其中通過使用核酸技術(shù)鑒定其水平在所述第一種目的細(xì)胞和第二種目的細(xì)胞之間以及所述第一種目的細(xì)胞和第三種目的細(xì)胞之間發(fā)生改變的mRNA轉(zhuǎn)錄物，從而進(jìn)行基因表達(dá)對(duì)比。
25.按照權(quán)利要求22或23的方法，其中通過使用蛋白分析技術(shù)鑒定其水平在所述第一種目的細(xì)胞和第二種目的細(xì)胞之間以及所述第一種目的細(xì)胞和第三種目的細(xì)胞之間發(fā)生改變的多肽，從而進(jìn)行基因表達(dá)對(duì)比。
26.按照權(quán)利要求22-25任一項(xiàng)的方法，其中所述基因產(chǎn)物受信號(hào)調(diào)節(jié)，而在所述信號(hào)的兩種不同水平上對(duì)比所述細(xì)胞中的基因表達(dá)。
27.一種增強(qiáng)差異表達(dá)篩選方法敏感性的方法，其中對(duì)比第一種和第二種目的細(xì)胞在兩種不同信號(hào)水平作用下的基因表達(dá)，該方法包括將異源核酸引入所述第一種或第二種細(xì)胞中，以升高調(diào)節(jié)所述細(xì)胞對(duì)所述信號(hào)反應(yīng)的生物分子的水平。
28.按照任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述異源核酸編碼選自以下的生物分子HIF1α、EPAS1、膜結(jié)合形式的IL5α受體、溶解形式的IL5α受體、Bcl-2、Bcl-x、FasL、NGF、GDNF、熱激蛋白(HSP)、APP、早老蛋白1、早老蛋白2、α-synuclein、Tau、Parkin和遍在蛋白。
29.按照權(quán)利要求7的方法，其中所述第一種多肽為HIF1-α，而所述第二種多肽為EPAS1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于鑒定參與細(xì)胞活動(dòng)的遺傳因子的差異表達(dá)篩選方法，該方法包括對(duì)比(a)在第一種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)；和(b)在第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)，該細(xì)胞由于引入控制多肽表達(dá)的異源核酸而包含相對(duì)于生理水平來說水平改變的影響細(xì)胞活動(dòng)的生物分子；并鑒定差異表達(dá)的遺傳因子，其中在至少兩種與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的不同環(huán)境條件下對(duì)比在所述第一種和/或第二種目的細(xì)胞中的基因表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1425075SQ01808359
公開日2003年6月18日 申請(qǐng)日期2001年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月22日
發(fā)明者A·J·金斯曼 申請(qǐng)人:牛津生物醫(yī)學(xué)(英國)有限公司