專利名稱：用己糖基轉(zhuǎn)移酶制備麥芽糖漿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備麥芽糖漿的方法，其中用己糖基轉(zhuǎn)移酶和β-淀粉酶和/或麥芽糖淀粉酶、或它們的變體來處理淀粉。此外，本發(fā)明還涉及一種適用于制備麥芽糖的原料。
背景技術(shù)：
麥芽糖麥芽糖是一種雙糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-吡喃葡萄糖(C12H22O11)，并且其是麥芽糖漿的主要成份。
麥芽糖漿的應(yīng)用麥芽糖被用來替代許多食品和糖果中的蔗糖，麥芽糖還被用作為氫化成麥芽糖醇的起始原料。
麥芽糖不易結(jié)晶，而象葡萄糖即使在高濃度的雜質(zhì)的存在下也能結(jié)晶。麥芽糖不能結(jié)晶而因此能被進一步純化，除非用作起始原料的麥芽糖的純度為90％以上。此外，麥芽糖不易結(jié)晶的事實是麥芽糖成為糖果工業(yè)中的有價值的原料的原因之一。
麥芽糖還有其它的應(yīng)用，如作為為病人提供糖的靜脈注射液的活性成份、及作為冷凍甜點中(由于麥芽糖的低結(jié)晶能力)、焙烤及釀造工業(yè)中的成份、及用于制備麥芽糖醇，麥芽糖醇和山梨糖醇一樣能被用作為甜味劑，參見Glycose Sirups，科學(xué)與技術(shù)，ElsevierApplied Science出版社1984，117-135頁。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種制備麥芽糖漿的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備高濃度麥芽糖漿(high maltose syrup)的方法。
至少在本發(fā)明的上下文中，所述高濃度麥芽糖漿是麥芽糖含量至少是80％、優(yōu)選至少是90％的糖漿。
制備麥芽糖的傳統(tǒng)方法用于制備麥芽糖的起始原料為玉米淀粉、土豆淀粉、甘薯淀粉(sweetpotato starch)、木薯淀粉(manioc starch)、米淀粉及木薯淀粉(cassava starch)，對于制備藥用級麥芽糖(medical grade maltose)來說，其濃度為約10-20％，對于制備食用級麥芽糖(food grade maltose)來說，其濃度為20-40％。
各種制備麥芽糖的方法是已知的，且由這些方法得到的麥芽糖的純度為75-90％。這些方法中的一個典型的實例包括加熱并用α-淀粉酶處理淀粉淤漿，由此使淀粉液化，然后用β-淀粉酶和支鏈淀粉酶(α-1，6-葡萄糖苷酶)水解該液化后的淀粉得到麥芽糖溶液，然后可以純化該麥芽糖溶液。
在該麥芽糖溶液中的大部分“雜質(zhì)”包括葡萄糖、低聚糖如麥芽三糖、和有限量的糊精，該糊精由三個或更多的葡萄糖單體組成。
本發(fā)明的方法本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與用α-淀粉酶液化淀粉相比，通過用己糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1)及隨后用β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和/或麥芽糖淀粉酶(maltogenicamylase)、或它們的變體來處理淀粉淤漿能夠得到麥芽糖含量更高的麥芽糖漿。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種制備麥芽糖的方法，其中用以下酶處理淀粉i)己糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1)，和然后ii)β-淀粉酶和/或麥芽糖淀粉酶、或它們的變體。
本發(fā)明的方法優(yōu)選包括下列步驟a)用己糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1)處理淀粉直至得到的產(chǎn)物具有i)如果使用分支酶(branching enzyme)，增加的分支度(ADB)為10-150％，和/或ii)粘度相當(dāng)于用野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶處理30％DS淀粉直至DE值為8-15、優(yōu)選至DE值為10-12所獲得的液化淀粉的粘度，b)用β-淀粉酶和/或麥芽糖淀粉酶、或它們的變體來處理步驟a)中得到的產(chǎn)物，和可選擇地c)從步驟b)中得到的產(chǎn)物中回收和/或純化麥芽糖。
葡萄糖當(dāng)量值(DE)和增加的分支度(ADB)
通過在用異淀粉酶(假單胞菌異淀粉酶，得自Hayashibara，日本)脫支后測量淀粉產(chǎn)物的DE值來確定淀粉產(chǎn)物的分支度(degree of branching)。DE值(脫支后)越高，分支度就越高。由己糖基轉(zhuǎn)移酶帶來的增加的分支度(ADB)以下式計算 X是天然淀粉(即起始原料)脫支后的DE值。
用己糖基轉(zhuǎn)移酶處理淀粉的方法為了獲得對淀粉的有效酶處理，在優(yōu)選實施方案中，該淀粉可以經(jīng)凝膠化的(gelatinized)。根據(jù)酶的熱穩(wěn)定性和具體淀粉的凝膠化溫度，所述凝膠化能夠與酶處理一起進行，或在酶處理前進行。凝膠化可以在間歇式體系中進行或在蒸汽加壓鍋(jet-cooker)中連續(xù)進行。能夠使用實驗室用簡單的加熱裝置如油浴、加壓蒸煮鍋(pressure cooker)或高壓鍋(autoclave)。隨后的酶處理或凝膠化/酶聯(lián)合處理的具體反應(yīng)條件即溫度、pH、％DS、劑量和培養(yǎng)時間取決于所用酶和淀粉源的性質(zhì)。
在一實施方案中，在本發(fā)明的方法的步驟a)中處理淀粉淤漿的溫度是50-150℃、優(yōu)選50-100℃。在用1，4-α-葡聚糖分支酶作為己糖基轉(zhuǎn)移酶時，該處理溫度為50-70℃、優(yōu)選約65℃。在一實施方案中，當(dāng)使用1，4-α-葡聚糖分支酶時，先通過在105-140℃下噴射使淀粉凝膠化，然后使淀粉冷卻至約65℃。
在使用4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(淀粉麥芽酶或D-酶)和CGT酶的情況下，凝膠化步驟是可選擇性的并可以省略。因此，處理淀粉(直接用這些酶培養(yǎng))的溫度為80-100℃，優(yōu)選約90℃。
在步驟b)中可加入支鏈淀粉酶。通常，所述淀粉原料為10-50％DS淀粉淤漿、優(yōu)選為20-40％DS淀粉淤漿、特別優(yōu)選約30％DS的淀粉淤漿。
本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)品，該產(chǎn)品是通過用己糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1)處理淀粉直至產(chǎn)物具有以下特征而得到的i)當(dāng)使用分支酶時，增加的分支度(ADB)為10-150％，和/或ii)粘度相當(dāng)于用野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶處理30％DS淀粉直至DE值為8-15、優(yōu)選至DE值為10-12所獲得的液化淀粉的粘度。
該產(chǎn)品適合作為加工麥芽糖的原料。該產(chǎn)品是穩(wěn)定的并且具有降低的老化(retrograde)傾向，及能溶于水溶液中。
本發(fā)明的另一方面涉及一種由本發(fā)明的方法得到的含麥芽糖的產(chǎn)品。由此方法得到的產(chǎn)品的麥芽糖(DP2)含量為大于80％、優(yōu)選85％、特別優(yōu)選大于90％。
進而，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的產(chǎn)品作為制備麥芽糖的起始原料(底物)的用途，該產(chǎn)品是通過用己糖基轉(zhuǎn)移酶處理淀粉得到的。
己糖基轉(zhuǎn)移酶己糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1)的實例包括1，4-α-葡聚糖分支酶(E.C.2.4.1.18)；4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(淀粉麥芽糖酶或D-酶)(E.C.2.4.1.25)；環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)(E.C.2.4.1.19)。
1，4-α-葡聚糖分支酶在一實施方案中，己糖基轉(zhuǎn)移酶為1，4-α-葡聚糖分支酶，該酶形成支鏈淀粉的附加的1，6-糖苷鍵并將直鏈淀粉轉(zhuǎn)化為支鏈淀粉。支鏈淀粉分支酶通常被稱為Q-酶。
特別提到的1，4-α-葡聚糖分支酶得自于紅嗜熱鹽菌屬(Rhodotherums)、優(yōu)選Rhodothermus obamensis、尤其是包含來自Rhodothermus obamensis的glgB基因的被保藏的菌株E.coli DSM 12607。
4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(淀粉麥芽糖酶或D-酶)在一實施方案中，己糖基轉(zhuǎn)移酶為4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶，該酶將1，4-α-D-葡聚糖轉(zhuǎn)移至受體中的新的4-位置，該受體可以是葡萄糖或1，4-α-D-葡聚糖。4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶通常被稱為D-酶。
特別提到的4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶是得自Thermococcus litoralis(Jeon，Beong-Sam等得自超嗜熱Thernococcus litoralis的4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(1997)，Eur.J.Biochem.248171-178.)。
CGT酶在一實施方案中，CGT酶或CGT酶變體得自于芽孢桿菌菌株、短桿菌菌株、梭菌菌株、棒桿菌菌株、克雷伯氏菌菌株、微球菌菌株、熱厭氧菌(Thermoanaerobium)菌株、熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter)菌株、熱厭氧桿菌菌株(Thermoanaerobacterium)、熱厭氧桿菌菌株(Thermoanaerobacterium)、或高溫放線菌菌株(Thermoactinomyces)。
在一優(yōu)選實施方案中，CGT酶或CGT酶變體得自于自溶芽孢桿菌(Bacillus autolyticus)菌株、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)菌株、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)菌株、環(huán)狀芽孢桿菌嗜堿變種的(Bacillus circulans var.alkalophillus)菌株、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)菌株、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)菌株、嗜鹽芽孢桿菌(Bacillus halophilus)菌株、浸麻芽孢桿菌(Bacillus macerans)菌株、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)菌株、Bacillusohbensis菌株、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)菌株、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)菌株、乙醇熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)菌株、鰭棲熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter finnii)菌株、 熱解淀粉熱厭氧桿菌(Clostridiumthermoamylolyticum)菌株、 熱解糖熱厭氧桿菌(Clostridiumthermosaccharolyticum)菌株、或熱產(chǎn)硫磺熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)菌株。
在更優(yōu)選的實施方案中，CGT酶或CGT酶變體得自芽孢桿菌菌株l011、芽孢桿菌菌株38-2、芽孢桿菌菌株17-1、芽孢桿菌菌株1-1、芽孢桿菌菌株B1018，環(huán)狀芽孢桿菌菌株8、環(huán)狀芽孢桿菌菌株251、或熱厭氧桿菌菌株ATCC53627、或它們的突變體或變體。
在WO96/33267(Novozymes A/S)和WO99/15633(Novozymes A/S)中公開了所述的CGT酶變體，在此引入這些文獻作為參考。
可商購得到的CGT酶是得自Novozymes A/S的Toruzyme。
β-淀粉酶β-淀粉酶的實例(E.C.3.2.1.2)包括農(nóng)作物β-淀粉酶，如大麥β-淀粉酶、小麥β-淀粉酶、大豆β-淀粉酶，和得自芽孢桿菌種的β-淀粉酶如US4,970,158(Novozymes A/S)中公開的β-淀粉酶。
可商購得到的β-淀粉酶包括來自Genencor公司的SpezymeBBA和SpezymeDBA。
支鏈淀粉酶支鏈淀粉酶(E.C 3.2.1.41)的實例包括來自如熱球菌屬(Pyrococcus)的熱穩(wěn)定的支鏈淀粉酶，或蛋白質(zhì)工程化(protein engineered)的支鏈淀粉酶，來自如芽孢桿菌菌株如Bacillus acidopullulyticus或Bacillus deramifican(如基因庫入藏號為Q68699的Bacillus deramificans支鏈淀粉酶)。
可商購得到的支鏈淀粉酶包括來自Novozymes A/S的PromozymeD和來自Genencor公司的Optimax.
麥芽糖淀粉酶麥芽糖淀粉酶(E.C.3.1.133)水解多糖中的1，4-α-D-糖苷鍵以從鏈的非還原端除去連續(xù)的α-麥芽糖殘基。麥芽糖淀粉酶作用于淀粉和相關(guān)的多糖和低聚糖。
適用的麥芽糖淀粉酶的一個實例是由在EP120,693(Novo Industri A/S)中公開的嗜熱脂肪芽孢桿菌C599制成的麥芽糖淀粉酶。提到的麥芽糖淀粉酶變體公開在WO99/43794和WO99/43793中，在此引入這些文獻作為參考。
可商購得到的麥芽糖淀粉酶的商品名為Maltogenase(Novozymes A/S，丹麥)。
材料和方法分支酶在WO00/58445(Novozyme A/S，丹麥)中公開的Rhodothermusobamensis D-酶。
SpezymeBBA1500是大麥β-淀粉酶(得自于Genencor公司，美國)PromozymeD是得自于芽孢桿菌菌株的支鏈淀粉酶(得自于NovozymesA/S，丹麥)。
異淀粉酶假單胞菌異淀粉酶(得自Hayashibara，日本)。
Toruzyme是得自于熱厭氧桿菌菌株的熱穩(wěn)定的環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)(得自于Novozymes A/S，丹麥)。
TermamylLC是得自于地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶(得自于NovozymesA/S，丹麥)。
Maltogenase(得自于Novozymes A/S，丹麥)。
野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶是在WO99/19467(Novozymes A/S，丹麥)中公開的SEQ ID No4。
方法β-淀粉酶活性(DP°)SpezymeBBA1500的活性用糖化力度(Degree of Diastatic Power)(DP°)表示。其是包含在0.1ml的5％樣本酶制劑溶液中的酶的量，當(dāng)該樣本用100ml底物在20℃下培養(yǎng)1小時時，該量產(chǎn)生足以還原5ml的費林溶液的還原糖。
支鏈淀粉酶活性(Novo制定的新支鏈淀粉酶單位(NPUN))Novo制定的新支鏈淀粉酶單位(NPUN)是內(nèi)-支鏈淀粉酶活性單位，是根據(jù)Novozymes標(biāo)準(zhǔn)測量的，該標(biāo)準(zhǔn)是基于0.7％紅支鏈淀粉，40℃、pH4.5，反應(yīng)時間30分鐘制定的。詳細(xì)的分析方法根據(jù)請求可以得到(SOP No.EB-SM.0420.02/01)。
分支酶活性分支酶活性是根據(jù)改進后的“Takata等，Applied and EnvironmentalMicrobiology(1994)，第3097頁(檢測A)”所述的方法來測量的將20微升酶溶液與50微升水和50微升底物溶液混合，并在測試溫度下培養(yǎng)30分鐘。該底物溶液是溶解于Tris緩沖劑中的0.1％的III型淀粉酶。通過加入2ml碘試劑來終止該反應(yīng)。碘是日常由0.5ml原液(在10ml水中的0.26g I2和2.6g KI)與0.5ml的1N HCl混合并稀釋至130ml制成的。將該混合物在室溫下培養(yǎng)15分鐘以穩(wěn)定色澤。活性是以測試樣與對照樣在A660下之差來測量的，在對照樣中用水替代細(xì)胞抽提物。1單位分支酶活性被定義為在60℃及pH7.0下每分鐘能夠?qū)⒅辨湹矸?碘復(fù)合物的A660降低1％的酶的量。
用己糖基轉(zhuǎn)移酶處理淀粉的方法a)當(dāng)使用分支酶時，可以采用以下方法在蒸汽加壓鍋或高壓鍋中凝膠化10-30％DS、pH7-8的淀粉懸浮液。然后將該淤漿冷卻至60-70℃，并加入分支酶。當(dāng)達到規(guī)定的轉(zhuǎn)化時(總時間取決于劑量)，通過加熱至100℃并保持15分鐘來終止該反應(yīng)。
b)對于葡聚糖轉(zhuǎn)移酶或CGT’酶，可按以下方法進行制備制備30％DS、pH5-7的淀粉懸浮液并加入酶。然后將該懸浮液加熱至70-90℃并培養(yǎng)4-24小時。當(dāng)達到規(guī)定的轉(zhuǎn)化時(總時間取決于劑量)，通過加熱至140℃并保持5-15分鐘來終止該反應(yīng)。
實施例實施例1麥芽糖的制備制備經(jīng)分支酶液化的30％DS土豆淀粉底物。該淀粉淤漿是澄清的和穩(wěn)定的。然后在60℃及pH5.0下用β-淀粉酶(1DP°/g DS)和支鏈淀粉酶(1NPUN/g DS)處理該淀粉淤漿。
經(jīng)72小時培養(yǎng)后得到89％麥芽糖。與此相比，在相同條件下使用Termamyl LC DE 10麥芽糖糊精僅能得到75％的麥芽糖。
權(quán)利要求
1.一種制備麥芽糖的方法，其中用以下酶處理淀粉i)己糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1)，和然后ii)β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和/或麥芽糖淀粉酶(E.C.3.2.1.133)或它們的變體。
2.權(quán)利要求1的方法，包括步驟a)用己糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1)處理淀粉直至產(chǎn)物具有i)如果使用分支酶，增加的分支度(ADB)為10-150％，和/或ii)粘度相當(dāng)于用野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶處理30％DS淀粉直至DE值為8-15、優(yōu)選DE值為10-12所獲得的液化淀粉的粘度，b)用β-淀粉酶和/或麥芽糖淀粉酶或它們的變體處理步驟a)中得到的產(chǎn)物，和可選擇地c)由步驟b)中得到的產(chǎn)物回收和/或純化麥芽糖。
3.權(quán)利要求2的方法，其中步驟a)中處理淀粉的溫度為50-150℃，優(yōu)選50-100℃。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中在步驟b)中進一步加入支鏈淀粉酶。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中用10-50％DS的淀粉淤漿、優(yōu)選用20-40％DS的淀粉淤漿及特別優(yōu)選用約30％DS的淀粉淤漿作為起始原料。
6.權(quán)利要求1的方法，其中己糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1)是選自1，4-α-葡聚糖分支酶(E.C.2.4.1.18)、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(淀粉麥芽糖酶或D-酶)(E.C.2.4.25)、環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)(E.C.2.4.1.19)中的一種或多種酶。
7.權(quán)利要求1-6的方法，其中在步驟a)中，用D-酶和麥芽糖淀粉酶或它們的變體的組合來處理淀粉。
8.權(quán)利要求1的方法，其中β-淀粉酶(E.C.2.4.1.2)是大麥β-淀粉酶。
9.權(quán)利要求1的方法，其中支鏈淀粉酶是芽孢桿菌支鏈淀粉酶。
10.權(quán)利要求6的方法，其中1，4-α-葡聚糖分支酶(E.C.2.4.1.18)是得自于紅嗜熱鹽菌，優(yōu)選Rhodothermus obamensis。
11.通過用己糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1)處理淀粉直至產(chǎn)物具有以下特征而得到的產(chǎn)品i)如果使用分支酶，獲得增加的分支度(ADB)為10-150％，和/或ii)粘度相當(dāng)于用野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶處理30％DS淀粉直至DE值為8-15、優(yōu)選DE值為10-12所獲得的液化淀粉的粘度。
12.權(quán)利要求11的產(chǎn)品，其中己糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1)是選自1，4-α-葡聚糖分支酶(E.C.2.4.1.18)、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(淀粉麥芽糖酶或D-酶)(E.C.2.4.25)、環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)(E.C.2.4.1.19)中的一種或多種酶。
13.權(quán)利要求12的方法，其中1，4-α-葡聚糖分支酶(E.C.2.4.1.18)是得自紅嗜熱鹽菌，優(yōu)選得自Rhodothermus obamensis，特別優(yōu)選得自包含來自Rhodothermus obamensis的glgB基因的被保藏的菌株E.coli DSM 12607。
14.由權(quán)利要求1-10中任一項的方法得到的糖漿產(chǎn)品。
15.權(quán)利要求14的糖漿產(chǎn)品，其中麥芽糖(DP2)含量為大于80％、優(yōu)選85％、特別優(yōu)選大于90％。
16.權(quán)利要求11-13中任一項的產(chǎn)品作為制備麥芽糖的起始原料(底物)的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中產(chǎn)品的一部分被用作制備麥芽糖的起始原料(底物)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備麥芽糖漿的方法，其中用己糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1)、及隨后用β－淀粉酶和/或麥芽糖淀粉酶或它們的變體來處理淀粉。本發(fā)明還涉及一種中間產(chǎn)品，該產(chǎn)品適合作為制備麥芽糖的原料。
文檔編號C12P19/18GK1444660SQ01813510
公開日2003年9月24日 申請日期2001年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月28日
發(fā)明者巴里·E·諾曼, 漢尼·V·亨德里克森 申請人:諾維信公司