專利名稱：轉(zhuǎn)染gfp的克隆豬、敲除gt的克隆豬及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
概括地說，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)克隆豬的方法和使用這種方法生產(chǎn)的豬，所述方法通過將所需的基因?qū)塍w細(xì)胞的基因?qū)ぐ屑夹g(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)而使所述克隆豬具有特定的遺傳特性。
背景技術(shù)：
在過去的20年中轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)一直備受矚目。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提供高價值的產(chǎn)品方面極其重要，并被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究。在工業(yè)上可將轉(zhuǎn)基因技術(shù)廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)高質(zhì)量家畜產(chǎn)品、高附加值的藥用活性物質(zhì)、增強(qiáng)了抗多種病原物的抗性的動物和動物疾病模型以及基因治療。
在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的基因?qū)ぐ胁襟E中通常使用綠色熒光蛋白(GFP)，由于它具有以下特征便于標(biāo)記染色體蛋白及標(biāo)記染色體DNA的特定區(qū)域，并可與許多細(xì)胞質(zhì)蛋白結(jié)合且是無毒的，所以將其廣泛用于在活體細(xì)胞中表達(dá)同源的細(xì)胞骨架絲。1994年，Chalfie等使用從水母(Aequoreavictoria)中獲得的GFP作為熒光指示劑在包括豬胚胎在內(nèi)的活體細(xì)胞中觀察到多種分子生物學(xué)變化。從那以后，開發(fā)了增強(qiáng)型GFP(EGFP)，并將其作為在多種轉(zhuǎn)基因動物中使用的標(biāo)記。
由Gordon等提出的原核顯微注射是一種將異源基因?qū)爰?xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)，其特征是將異源基因直接注射到受精的卵母細(xì)胞的原核中，已將其廣泛應(yīng)用于包括小鼠在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)動物中。然而，如下所述，原核顯微注射方法有明顯的缺點(diǎn)。當(dāng)將原核顯微注射應(yīng)用于工業(yè)動物時，轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)量非常低(牛為0.5％、豬為1.5％、羊?yàn)?.5％)。另外，經(jīng)常發(fā)生遺傳鑲嵌現(xiàn)象。為了克服這些問題，提出一種替代的動物克隆技術(shù)，它采用轉(zhuǎn)染了異源基因的體細(xì)胞。這種轉(zhuǎn)基因動物克隆技術(shù)以100％的轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生重組的受精胚胎，且由于只對轉(zhuǎn)染了異源基因的體細(xì)胞進(jìn)行核移植而消除了遺傳鑲嵌現(xiàn)象，然后將重組的胚胎移植到代孕母體內(nèi)，由此能有效地產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因克隆動物。另外，通過預(yù)先分析經(jīng)轉(zhuǎn)染的體細(xì)胞的性染色體，可人工決定轉(zhuǎn)基因動物的性別，因此最大程度發(fā)揮其工業(yè)應(yīng)用性。
當(dāng)用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬時，優(yōu)選地，應(yīng)分離所需的基因，并應(yīng)構(gòu)建攜帶該所需基因的載體，除了體細(xì)胞克隆技術(shù)外，還應(yīng)使用能將所需的基因?qū)塍w細(xì)胞的分子生物學(xué)技術(shù)。典型地，所述基因是從豬基因組DNA文庫中通過篩選分離出來。根據(jù)預(yù)期應(yīng)用，在考慮了外源啟動子、所需基因的大小、及正或負(fù)選擇性標(biāo)記等因素情況下制備載體?？墒褂蒙椒ā⑽锢矸椒ɑ虿《窘閷?dǎo)的基因轉(zhuǎn)染的方法，通過轉(zhuǎn)染將基因?qū)牒斯w細(xì)胞。所述生化方法的例子包括使用鈣離子作為媒介的鈣沉淀法、使用質(zhì)膜組分的陽離子脂的脂轉(zhuǎn)染法和使用非脂陽離子聚合體的方法。由于這些轉(zhuǎn)染方法簡單、有效且穩(wěn)定，所以得到了廣泛應(yīng)用。物理方法包括電穿孔、基因槍和胞質(zhì)內(nèi)顯微注射方法。病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法是通過將所需的DNA克隆到腺病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒的病毒基因組中，然后用獲得的病毒侵染細(xì)胞而完成的。本申請人于2000年6月30日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/KR00/00707中公開了體細(xì)胞克隆技術(shù)，發(fā)明名稱是“生產(chǎn)克隆母牛的方法”，其中體細(xì)胞克隆是通過下述方法完成的從母牛卵母細(xì)胞中除去含有遺傳物質(zhì)的細(xì)胞核，然后將來源于另一不同細(xì)胞的細(xì)胞核注射到去核的未受精的卵母細(xì)胞中。將得到的受精胚胎稱為“重組胚胎”。重組胚胎經(jīng)過后激活和體外培養(yǎng)后，被轉(zhuǎn)移到代孕母體內(nèi)以產(chǎn)生成活后代。
人類器官移植是治療與器官相關(guān)的不可治愈疾病的有用工具，并在過去大約10年中得到不斷的發(fā)展。然而在這期間，相對于器官移植方法的這種發(fā)展，需要接受器官移植的病人數(shù)目增加了三倍。這是由于供求的不平衡造成的，意味著用于外科移植手術(shù)的人體器官的短缺。雖然器官供應(yīng)來源嚴(yán)重缺乏，至今還沒有令人滿意的方法能解決這個問題。已經(jīng)嘗試各種努力來克服這種人類外科移植手術(shù)用器官的缺乏，其中包括使用醫(yī)學(xué)工程方法開發(fā)人造器官及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。當(dāng)從轉(zhuǎn)基因動物獲得可替代人類患病器官的器官時，通常選擇豬作為器官供體，這是因?yàn)樗腿祟愒谏硖卣鳌⒀芟到y(tǒng)的大小甚至在紅血球直徑方面類似。另外，與靈長類比較，使用豬器官沒有倫理問題。
然而，當(dāng)將豬器官移植到人體內(nèi)，由于對異種移植物的超急性免疫排斥，移植一般來說并不成功，因此會在受體患者體內(nèi)引起嚴(yán)重的副作用。人血液中的抗半乳糖抗體結(jié)合到豬細(xì)胞或組織的異種抗原gal(半乳糖)抗原決定簇上，誘導(dǎo)了超急性免疫排斥。已經(jīng)提出了幾種克服這種免疫排斥反應(yīng)的方法，這些方法包括進(jìn)行遺傳操作以抑制人體內(nèi)補(bǔ)體蛋白的活性以及持續(xù)施用能降低人類免疫系統(tǒng)活性的藥物。然而，證明上述方法并不安全，因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害使病人易受病原體微生物或病毒的侵染。相反，在本發(fā)明中，通過基因?qū)ぐ屑夹g(shù)預(yù)先破壞了負(fù)責(zé)形成異種抗原的α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)基因，因此可以將異源移植物從獲得的轉(zhuǎn)基因豬成功地移植到人體中，而不產(chǎn)生對異種移植物的超急性免疫排斥，同時也不會損害人體內(nèi)的保護(hù)性免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
基于傳統(tǒng)技術(shù)，本發(fā)明通過使用轉(zhuǎn)染方法的基因?qū)ぐ屑夹g(shù)和體細(xì)胞核移植，提供表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的克隆豬和敲除α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)基因的克隆豬的生產(chǎn)方法以及用該方法生產(chǎn)的豬。
更具體地說，本發(fā)明涉及含有特定基因的克隆豬和生產(chǎn)這種豬的方法，所述特定基因，即綠色熒光蛋白(GFP)基因編碼在特定波長的光下發(fā)出綠色的蛋白。本發(fā)明還涉及一種克隆豬及生產(chǎn)這種豬的方法，在所述克隆豬中，敲除了與豬異種移植物的超急性排斥有關(guān)的基因即α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)基因。
另外，本發(fā)明涉及一種基因?qū)ぐ蟹椒?，該方法包括將GFP基因或遺傳操作的GT基因有效地導(dǎo)入細(xì)胞中。
本發(fā)明還涉及能有效移除GT基因的載體。
本發(fā)明將異源GFP基因成功地導(dǎo)入豬，顯示出大規(guī)模生產(chǎn)動物疾病模型的潛在性，并且能生產(chǎn)敲除GT基因的豬，因此可將豬的器官可以移植到人體中而不會發(fā)生超急性異種移植排斥。


結(jié)合附圖，從下列具體描述中將更清楚地理解本發(fā)明的上述或其他目的、特性和其他優(yōu)點(diǎn)，其中，圖1是表達(dá)GFP的體細(xì)胞的照片；圖2是通過將表達(dá)GFP的體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體卵母細(xì)胞而獲得的核移植(NT)胚胎的照片；圖3是表達(dá)GFP的核移植(NT)胚胎在胚泡期的照片；圖4是顯示將轉(zhuǎn)基因核移植胚胎移植到代孕母體輸卵管中的照片；圖5是顯示在豬基因組初級BAC(細(xì)菌人工染色體)文庫中篩選GT基因的結(jié)果的照片；圖6是顯示在豬基因組次級BAC文庫篩選GT基因的結(jié)果的照片；圖7是顯示在豬基因組三級BAC文庫篩選GT基因的結(jié)果的照片；圖8是顯示克隆的GT基因的限制性圖譜結(jié)果的照片；和圖9是用于GT基因?qū)ぐ械妮d體的示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的特征是提供表達(dá)所需基因或敲除另一個所需基因的轉(zhuǎn)基因克隆豬，其中所述克隆豬通過使用轉(zhuǎn)染方法的基因?qū)ぐ屑夹g(shù)和體細(xì)胞核移植方法獲得。
具體來說，本發(fā)明通過以下方法提供了表達(dá)GFP或敲除GT基因的轉(zhuǎn)基因克隆豬使用轉(zhuǎn)染方法產(chǎn)生表達(dá)GFP或敲除GT基因的體細(xì)胞，用核移植技術(shù)產(chǎn)生重組胚胎并將重組胚胎轉(zhuǎn)移到代孕母體內(nèi)。
首先，表達(dá)GFP基因的克隆豬的生產(chǎn)方法包括下列步驟(a)通過培養(yǎng)來源于豬的細(xì)胞系制備核供體細(xì)胞；(b)將攜帶GFP基因的DNA構(gòu)建體和脂組分或非脂陽離子聚合體介質(zhì)混合，以形成脂(或陽離子聚合體)-DNA復(fù)合物，將得到的復(fù)合物加到核供體細(xì)胞的培養(yǎng)基中并進(jìn)一步培養(yǎng)所述核供體細(xì)胞，以將所述GFP基因?qū)胨龊斯w細(xì)胞并在其中表達(dá)GFP基因；(c)將轉(zhuǎn)染的核供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到去核的豬受體卵母細(xì)胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的核移植(NT)胚胎，并激活所述NT胚胎；和(d)將所述NT胚胎移植到代孕母豬中，以產(chǎn)生成活后代。
依照各個步驟以下將具體描述表達(dá)GFP基因的克隆豬的生產(chǎn)方法步驟1核供體細(xì)胞的制備、體外培養(yǎng)和保存在使用體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)產(chǎn)生表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因動物時需要核供體細(xì)胞。包括體細(xì)胞衍生的細(xì)胞和受精胚胎衍生的細(xì)胞在內(nèi)的幾種細(xì)胞可以用作在核移植方法中提供細(xì)胞核的核供體細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，通常使用從胎豬分離的體成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞具有如下優(yōu)點(diǎn)在分離其的最初步驟中就能獲得大量細(xì)胞，并且相對來說易于體外培養(yǎng)和操作。
對從懷孕母豬體內(nèi)獲得的胎豬的頭-尾長度進(jìn)行測量，根據(jù)其生育史計(jì)算母豬妊娠時間的長短，從而分離主要用作核供體的胎豬成纖維細(xì)胞。通過除去胎膜，然后靠近胎豬切開臍帶來分離胎豬。隨后，用含有抗生素和牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)將胎豬洗滌幾次。然后通過手術(shù)除去胎豬的四肢、頭部和內(nèi)臟，再用PBS洗幾次胎體。將剩余組織用機(jī)械方法細(xì)細(xì)磨碎，制備外植體培養(yǎng)物，或在磨碎的組織中加入胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)來釋放細(xì)胞，從而從組織中獲得成纖維細(xì)胞。
然后，將分離的胎豬成纖維細(xì)胞在95％濕度、5％CO2和38℃的條件下培養(yǎng)，從而制成核供體細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)物的鋪滿率達(dá)到90％-100％時，繼代培養(yǎng)細(xì)胞并冷藏剩余的細(xì)胞。
步驟2通過將GFP基因?qū)塍w細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)基因?qū)ぐ袑⑹惺踦EGFP-N1載體(Clontech Laboratories公司，Palo Alto，加拿大)用于GFP基因的尋靶。pEGFP-N1載體表達(dá)野生型GFP的一種修飾形式，這種修飾的GFP表達(dá)水平高且發(fā)出亮熒光。用生化媒介如FuGENE6(Roche Diagnosis公司，美國印第安那州)、LipofectAmine Plus(LifeTechnologies)或ExGen 500(MBI Fermentas)將所述載體導(dǎo)入體細(xì)胞。FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑是一種多組分脂試劑，其優(yōu)點(diǎn)包括在多種細(xì)胞類型中轉(zhuǎn)染效率高且細(xì)胞毒性低、血清存在與否都有功能并且易于以極小的體積與DNA形成復(fù)合物。LipofectAmine Plus是陽離子脂，ExGen 500是非脂陽離子聚合體，據(jù)報(bào)道它們在多種細(xì)胞類型中都具有高的轉(zhuǎn)染效率。
將待導(dǎo)入GFP基因的細(xì)胞培養(yǎng)在合適的條件下，然后用胰蛋白酶-EDTA處理進(jìn)行繼代培養(yǎng)以將粘附的細(xì)胞分散成單個細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天，用新鮮的培養(yǎng)基培育繼代細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前4小時再次更換為新鮮培養(yǎng)基。根據(jù)生化介質(zhì)的不同，當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到與之相對應(yīng)的最適細(xì)胞密度時，將GFP基因?qū)肱囵B(yǎng)的細(xì)胞中。
在本發(fā)明中，脂和非脂生化介質(zhì)通過將GFP基因?qū)牒斯w細(xì)胞而被用于GFP基因的尋靶。將GFP基因與脂或非脂介質(zhì)混合，形成復(fù)合物，將這種復(fù)合物導(dǎo)入核供體細(xì)胞。為了有效地將GFP基因?qū)爰?xì)胞中，選擇幾個參數(shù)并對其進(jìn)行優(yōu)化，這些參數(shù)包括GFP基因DNA的數(shù)量、介質(zhì)的體積、細(xì)胞的密度、轉(zhuǎn)染時間及是否加入血清，由此可以最大限度地提高GFP基因的導(dǎo)入效率和表達(dá)水平。
步驟3對轉(zhuǎn)染GFP基因的核供體細(xì)胞進(jìn)行選擇、增殖及冷藏轉(zhuǎn)染了GFP基因后，將核供體細(xì)胞培養(yǎng)3-5天直到培養(yǎng)物完全鋪滿，在其中GFP基因被整合到細(xì)胞的染色體上。然后用胰蛋白酶處理細(xì)胞，在帶有紫外線(UV)濾光片的熒光顯微鏡下觀察獲得的單個細(xì)胞，以選擇只帶綠色的細(xì)胞。另外，在特定的抗生素存在的情況下，通過體外培養(yǎng)選擇轉(zhuǎn)染了GFP基因的核供體細(xì)胞。帶有GFP基因的pEGFP-N1載體含有作為正選擇性標(biāo)記的新霉素抗性基因。將新霉素抗性基因和GFP基因一起導(dǎo)入細(xì)胞中，在細(xì)胞中表達(dá)新霉素抗性蛋白。因此，當(dāng)在含有新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)靶向細(xì)胞(targeted cell)時，只有轉(zhuǎn)染了該載體的細(xì)胞可以存活，沒有轉(zhuǎn)染該載體的細(xì)胞由于新霉素的作用而死亡，因此在培養(yǎng)皿中只有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以增殖(圖1)。
通過確定抗生素的最佳處理濃度，可以有效地使用抗生素進(jìn)行這種篩選。用新霉素處理2-3周后選出靶向細(xì)胞，其中每4-5天在培養(yǎng)基中加入濃度為200-800μg/ml的新霉素。依據(jù)細(xì)胞類型，細(xì)胞增殖模式會有所不同。然而，因?yàn)榧?xì)胞都是從一個細(xì)胞增殖出來的，應(yīng)使該靶向細(xì)胞至少增殖到下一步所需的水平。
完成靶向細(xì)胞的選擇后，在正常的培養(yǎng)基中培養(yǎng)選出的細(xì)胞，其中在所述培養(yǎng)基中加入合適的生長因子和抑制凋亡的試劑，從而誘導(dǎo)快速增殖并降低由凋亡造成的無謂的細(xì)胞損失。為有效地保存增殖的細(xì)胞，建立了保存細(xì)胞的最佳條件，冷藏在每一繼代過程中增殖的細(xì)胞。
步驟4用體細(xì)胞核移植方法產(chǎn)生重組胚胎為了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，該轉(zhuǎn)基因動物具有轉(zhuǎn)染的核供體細(xì)胞的遺傳特性，本發(fā)明采用體細(xì)胞核移植的克隆技術(shù)，由此產(chǎn)生重組胚胎。首先，使未成熟的卵母細(xì)胞在體外成熟而制成受體卵母細(xì)胞，方法如下。主要從屠宰場收集豬的卵巢，檢測是否畸形，用合適的洗滌液洗三次。然后，將未成熟的卵母細(xì)胞在可使其成熟的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其在體外成熟，這種培養(yǎng)基是不含牛血清白蛋白的NCSU23培養(yǎng)基(North Carolina StateUniversity 23(NCSU23-M)，見表1)，其含有10％豬卵泡液(PFF)、促性腺激素(GTH)、懷孕母馬血清促性腺激素(PMSG)(Intervet Folligon)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)(Intervet Chorulon)和10ng/ml表皮生長因子(EGF)。
為進(jìn)行核移植，需準(zhǔn)備受體卵母細(xì)胞、核供體細(xì)胞和用于切開、去核及注射的吸液管。用NCSU23(NCSU23-W，見表2)洗滌培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)來制備培養(yǎng)基。將每個受體卵母細(xì)胞放到添加0.1％透明質(zhì)酸酶的NCSU23-W培養(yǎng)基中以除去卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞。用NCSU23-W培養(yǎng)基的微滴洗滌完全裸露的卵母細(xì)胞。
用固定吸液管固定裸露的卵母細(xì)胞，用尖的吸液管切開第一極體上部透明帶的一部分，產(chǎn)生一條裂縫。
用切透明帶的吸液管擠壓細(xì)胞，使含有第一極體的一部分細(xì)胞質(zhì)從裂縫處擠出，從而產(chǎn)生去核卵母細(xì)胞。用NCSU23-W培養(yǎng)基洗滌去核卵母細(xì)胞，并將其置于NCSU23-W培養(yǎng)基的微滴中，直到進(jìn)行核移植。將卵母細(xì)胞透明帶上的裂縫與固定吸液管置于一條直線上后，用注射吸管抽吸供體細(xì)胞，并通過裂縫將每個供體細(xì)胞注射到各去核卵母細(xì)胞的卵周隙中，從而使準(zhǔn)備好的核供體細(xì)胞被轉(zhuǎn)染到去核受體卵母細(xì)胞中，由此產(chǎn)生核移植胚胎(圖2)。
核移植胚胎需用電融合方法處理，其中用BTX電細(xì)胞操縱裝置(BTXElectro Cell Manipulator，ECM2001，BTX，美國)產(chǎn)生30微秒、1.8kV/cm的單向直流電脈沖，使去核卵母細(xì)胞與供體細(xì)胞電融合。用NCSU23-W培養(yǎng)基洗滌電融合的重組胚胎，在NCSU23培養(yǎng)基(NCSU23-D，見表3)中培養(yǎng)。培養(yǎng)后第4天，在NCSU23培養(yǎng)基中添加10％血清。在第七天，對重組胚胎的胚泡期發(fā)育和GFP表達(dá)進(jìn)行評估(圖3)。
表1NCSU-M的組成

表2 NCSU-W的組成

表3NCSU-D的組成

步驟5將重組胚胎移植到代孕母豬體內(nèi)并產(chǎn)生成活后代選擇出適用于重組胚胎移植并能使重組胚胎發(fā)育成正常胎豬的代孕母豬。通過監(jiān)測所選的母豬的動情周期決定移植的最佳時機(jī)。一般來說，在母豬顯出動情信號后約30-40小時進(jìn)行受精比較合適。因此，根據(jù)適合的受精時期，并考慮重組胚胎在體外發(fā)育所需時間，可計(jì)算出胚胎移植的最適時間。
通過剖腹術(shù)打開代孕母豬的腹部，靠近子宮將重組胚胎注射到輸卵管2cm深處，從而將重組胚胎移植到代孕母豬體內(nèi)(圖4)。胚胎移植4周后，用超聲波對母豬的妊娠情況進(jìn)行評價。此后，每兩周進(jìn)行一次超聲波檢測以監(jiān)控代孕母豬的妊娠情況和胎豬的生長情況。
如果生產(chǎn)過程超過30分鐘還沒有生出小豬，應(yīng)該用有經(jīng)驗(yàn)的助手幫助母豬生產(chǎn)。當(dāng)預(yù)期的生育期過去時，給母豬注射激素或進(jìn)行如剖腹產(chǎn)這樣的外科手術(shù)來促使生產(chǎn)。
基于上述方法，本發(fā)明人使用胎豬成纖維細(xì)胞作為核供體細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染了GFP基因的體成纖維細(xì)胞采用核移植方法移植到去核的受體胚胎中，產(chǎn)生表達(dá)GFP的重組胚胎；在體外培養(yǎng)得到的核移植胚胎7天，使其發(fā)育到胚泡期。將重組胚胎稱為“SNU-P1[豬核移植胚胎，Porcine NTEmbryo]”，并于2001年12月27日將其保藏于國際保藏機(jī)構(gòu)KCTC(韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)；KRIBB，52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，韓國)，保藏編號為KCTC 10145BP。本發(fā)明人將重組胚胎移植到代孕母豬體內(nèi)，獲得了正常的克隆后代。
另一方面，生產(chǎn)敲除GT基因的克隆豬的方法包括下列步驟(a)通過培養(yǎng)來源于豬的體細(xì)胞系制備核供體細(xì)胞；(b)從豬基因組BAC文庫中分離GT基因，用分離的GT基因構(gòu)建基因?qū)ぐ休d體，其中該載體攜帶經(jīng)過修飾的GT基因，以抑制正常GT蛋白的表達(dá)，所述經(jīng)過修飾的GT基因是通過同源重組用編碼選擇性標(biāo)記的基因取代野生型GT基因的一部分而得以修飾的；(c)將載體與脂或非脂組分混合，形成脂(或非脂)-DNA復(fù)合物，并將該復(fù)合物加到核供體細(xì)胞的培養(yǎng)基中，在核供體細(xì)胞中導(dǎo)入重組的GT基因，由此實(shí)現(xiàn)基因?qū)ぐ校?d)將轉(zhuǎn)染了重組GT基因的核供體細(xì)胞移植到去核的豬受體卵母細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的核移植(NT)胚胎，并激活所述NT胚胎；(e)將所述NT胚胎移植到代孕母豬體內(nèi)以產(chǎn)生成活后代。
如下，依照各個步驟具體描述敲除GT基因的克隆豬的生產(chǎn)方法
步驟1核供體細(xì)胞的制備、體外培養(yǎng)和保存在使用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)敲除GT基因的轉(zhuǎn)基因動物時需要核供體細(xì)胞。核供體細(xì)胞的制備與生產(chǎn)表達(dá)GFP基因的克隆豬的方法的步驟1相同。
步驟2GT基因的分離對總共含有三個庫(pool)的豬基因組BAC文庫進(jìn)行篩選，分離GT基因(人類基因組作圖計(jì)劃公司Human Genome Mapping Project Inc.，英國)。用已知的豬GT cDNA序列(GeneBank編號AF221517)設(shè)計(jì)用于篩選的引物。為檢測引物和使用所述引物的PCR方法的特異性，用豬基因組DNA和所述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得出陽性PCR結(jié)果。通過PCR方法用所述引物對豬基因組BAC文庫的三個庫進(jìn)行篩選，得到一個單克隆，在其中可用PCR擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA片斷。然后，用Southern印跡(DNA印跡)驗(yàn)證獲得的GT基因克隆。
步驟3構(gòu)建含有敲除GT基因的基因?qū)ぐ休d體，并將該載體導(dǎo)入核供體細(xì)胞用獲得的GT基因克隆制備基因?qū)ぐ休d體。通過同源重組，用編碼選擇性標(biāo)記的基因取代GT基因的一部分，破壞了GT基因，由此阻止正常的GT蛋白的產(chǎn)生。
為了有效地選擇靶向細(xì)胞，用啟動子陷阱方法構(gòu)建了不含外源啟動子的載體。該載體含有與GT基因的部分第8內(nèi)含子、第9外顯子及部分第9內(nèi)含子對應(yīng)的核酸序列，以及編碼連有SV40聚腺苷酸(SV40 poly(A))序列的嘌呤霉素抗性基因的核酸序列，其中所述嘌呤霉素抗性基因取代了對應(yīng)于第9外顯子中AvaI-DraIII片段的核酸序列。通過同源重組，將連有SV40聚腺苷酸的嘌呤霉素抗性基因的核酸序列插入GT基因的第9外顯子，由此破壞了GT基因(圖9)。用在表達(dá)GFP的克隆豬的生產(chǎn)方法中提到的FuGENE 6將基因?qū)ぐ休d體導(dǎo)入核供體細(xì)胞中。
將獲得的核供體細(xì)胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2周以選擇靶向的體成纖維細(xì)胞。此后，用本領(lǐng)域常用的方法驗(yàn)證選出的體成纖維細(xì)胞，所述方法包括Southern印跡和PCR方法。
步驟4用體細(xì)胞核移植方法產(chǎn)生重組胚胎該步驟與生產(chǎn)表達(dá)GFP的克隆豬的方法中的步驟4相同。
步驟5將重組胚胎移植到代孕母豬中并產(chǎn)生成活后代該步驟與表達(dá)GFP基因的克隆豬的生產(chǎn)方法中的步驟5相同。基于上述方法，本發(fā)明人使用豬胎成纖維細(xì)胞作為核供體細(xì)胞，用帶有敲除GT基因的載體轉(zhuǎn)染體成纖維細(xì)胞并將所述轉(zhuǎn)染的體成纖維細(xì)胞核移植到去核的受體胚胎中，產(chǎn)生了敲除GT基因的重組胚胎。將得到的重組胚胎稱為“SNU-P2[豬核移植胚胎]，并于2001年12月27日將其保藏于國際保藏機(jī)構(gòu)KCTC(韓國典型培養(yǎng)物保藏中心；KRIBB，52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，韓國)，保藏編號為KCTC 10146BP。本發(fā)明人將重組胚胎“SNU-P2”移植到代孕母豬體內(nèi)，獲得了正常的克隆后代。
下面將結(jié)合附圖并參照下列實(shí)施例更具體地解釋本發(fā)明。然而，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，很顯然，下列實(shí)施例只是用來闡明本發(fā)明，本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1核供體細(xì)胞的制備、體外培養(yǎng)和保存收集懷孕豬的子宮后，在無菌環(huán)境中進(jìn)行下列操作。主要分離頭-尾長大約25mm的30天大的胎豬。無菌操作分離被羊膜包圍的胎豬。在除去頭、四肢和內(nèi)臟后用含有幾種抗生素和抗真菌素的磷酸緩沖液洗滌胎豬幾次。在含有0.25％胰蛋白酶-EDTA的培養(yǎng)皿中，用手術(shù)剪從胎豬上分離胎組織。將分離的胎組織在5％CO2培養(yǎng)箱中于38℃培養(yǎng)30分鐘。此后用多次離心方法從胎豬組織中除去胰蛋白酶，然后在含10％FCS的DMEM(Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基，Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium)中培養(yǎng)胎豬組織外植體。
當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％-100％鋪滿率時，繼代培養(yǎng)細(xì)胞，并冷藏剩余的細(xì)胞。在體細(xì)胞核移植技術(shù)中使用所述的冷藏細(xì)胞作為細(xì)胞核供體，在含有生長因子和凋亡抑制劑的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，以刺激細(xì)胞生長并抑制細(xì)胞死亡。
實(shí)施例2在豬BAC基因組文庫中篩選GT基因在篩選豬BAC基因組文庫前，為獲得陽性對照，首先按如下方法制備豬基因組DNA。從懷孕六個月的丹麥母豬獲取大約5g卵巢后，將其充分切割并在含液氮的研缽里研磨以破環(huán)組織。用濃度為11mg/ml的蛋白酶K處理研磨好的組織，并用苯酚抽提，這樣得到豬基因組DNA。
用豬BAC基因組文庫篩選豬GT基因。為獲得單克隆，對含有三個庫的文庫依次進(jìn)行篩選。初級庫由17個小瓶組成，將這些小瓶按字母順序標(biāo)記為A到R(不包括K)。次級庫由96孔板組成，每一個初級庫的小瓶對應(yīng)15個單獨(dú)的庫，三級庫由384孔板組成，每一個板對應(yīng)于次級庫中的一個庫。首先，用已知的豬GT cDNA(GeneBank編號NoAF221517)，制備含有正向引物和反向引物的PCR引物對豬GT5(5’-GAT CAA GTC CGAGAA GAG GTG GCA A-3’)；豬GT3(5’-TCC TGG AGG ATT CCC TTG AAG CACT-3’)。當(dāng)用該引物對針對豬基因組DNA進(jìn)行PCR時，預(yù)期的PCR產(chǎn)物大小是342bp。為獲得篩選中鑒定GT信號的陽性對照，使用下列PCR混合物，在下列條件下進(jìn)行PCR。PCR混合物包括1單位Taq DNA聚合酶、10mMdNTPs、200mM Tris-Cl(pH8.8)、100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、1％TritonX-100(粹通X-100)、1mg/ml BSA、100ng/μl豬基因組DNA和2μl引物對(正向引物40pmol/μl和反向引物40pmol/μl)，總體積為20μl。PCR條件包括95℃變性5分鐘，然后40個循環(huán)的95℃變性1分鐘、55℃退火1分鐘和72℃延伸1分鐘30秒，最后72℃延伸15分鐘。得到的PCR反應(yīng)混合物在瓊脂糖凝膠上通過電泳分析。
用豬基因組DNA(100ng/μl)進(jìn)行PCR，鑒定了大小為342bp的PCR產(chǎn)物，并在篩選豬BAC基因組文庫中將其作為陽性對照。使用豬BAC基因組文庫的初級庫(從A到R的17個庫，不含K)時，用豬引物對GT5和GT3進(jìn)行PCR，該P(yáng)CR條件與用豬基因組DNA時的PCR條件相同。在F和G庫中獲得與豬基因組DNA的PCR產(chǎn)物大小相同的PCR產(chǎn)物，即342bp(圖5)。用PCR法對與初級庫中顯示陽性信號的F和G庫相對應(yīng)的次級庫(F:76號庫到90號庫；G:91號庫到105號庫，F(xiàn)和G庫分別由15個庫構(gòu)成)進(jìn)行篩選，PCR條件與上述一致，結(jié)果產(chǎn)生與豬基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同的擴(kuò)增產(chǎn)物。篩選次級庫時，在F庫的81和82號庫、G庫的91號庫中發(fā)現(xiàn)342bp大小的PCR產(chǎn)物(圖6)。在選出的庫中，88號庫顯示出最強(qiáng)的信號。當(dāng)用對應(yīng)于88號的三級庫進(jìn)行PCR反應(yīng)時，在8F中獲得了與用豬基因組DNA進(jìn)行PCR中的信號相同的信號(圖7)，所述對應(yīng)于88號庫的三級庫由384孔板構(gòu)成(1A到24P)，其中每一個孔包含一個單克隆。
實(shí)施例3構(gòu)建帶有敲除GT基因的載體用Webcutter程序(http//www.firstmarket.com/firstmarket/cutter/)獲得豬GT基因(GeneBank登記號AF221517)的粗略的限制性酶切圖譜。按照如下方法制備以下用于southern雜交(DNA雜交)的探針。通過PCR方法并在8％PAGE凝膠上進(jìn)行電泳(聚丙烯酰胺凝膠電泳)后電洗脫純化，獲得與豬GT基因的一部分對應(yīng)的351bp長的DNA片段，然后用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Life Technologies，美國)將其標(biāo)記上α-32P[dCTP]。
為分離含有豬GT基因的BAC DNA，從實(shí)施例2中鑒定的三級庫8F中取1μl克隆的大腸桿菌(E.coli)，先將其接種到3ml LB肉湯培養(yǎng)基(CM+)中，在37℃條件下300rpm震蕩培養(yǎng)12小時。然后，再將培養(yǎng)的大腸桿菌接種到500ml LB肉湯培養(yǎng)基(CM+)中，在同樣條件下培養(yǎng)16小時。用大劑量構(gòu)建試劑盒(large construct kit，Qiagen，德國)從大量培養(yǎng)的大腸桿菌中純化BAC DNA。此后，用10個單位的EcoRI、HindIII、BamHI和NotI消化5μg得到的BAC DNA，消化時間為3小時，在50V電壓下用1％的瓊脂糖凝膠電泳12小時。將得到的凝膠浸入變性液中(0.5M NaOH，1.5M NaCl)15分鐘，然后浸入中和液中(0.5M Tris-Cl，1.5M NaCl，pH8.0)15分鐘，用真空轉(zhuǎn)移法將凝膠上已分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。預(yù)雜交3小時后，使尼龍膜與已制備的探針雜交16小時。然后，將膜曝光在X-射線膠片上以鑒定含有豬GT基因的BAC DNA片段。
按照如下方法將鑒定的BAC DNA片段克隆到pUC19。用EcoRI消化pUC19載體1小時30分，通過酚/氯仿抽提純化，使用前儲存在-20℃。在微管中將BAC DNA片段與100ng EcoRI消化過的pUC19載體、10×連接緩沖液及2μl T4 DNA連接酶(10個單位/μl)混合，然后在15-16℃溫育16小時以進(jìn)行連接。
在10μl連接混合物中加入200μl感受態(tài)細(xì)胞，將混合物放于冰上30分鐘，42℃熱激90秒，添加800μl LB肉湯培養(yǎng)基，然后37℃培養(yǎng)45分鐘。此后，將細(xì)胞涂于含有氨芐青霉素、IPTG(異丙基硫代-β-D半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的LB平板上并在37℃培養(yǎng)過夜。選擇白色菌落并培養(yǎng)，通過PCR鑒定是否含有所需的DNA片段。
根據(jù)克隆豬GT基因的限制性酶切圖譜，發(fā)現(xiàn)第9外顯子沒有EcoRI、HindIII和NotI的限制性酶識別位點(diǎn)，而只含有BamHI位點(diǎn)?？寺〕鰜淼暮胸iGT基因的BAC DNA片段用EcoRI、HindIII、BamHI和NotI的各個酶處理，在1％瓊脂糖凝膠上分離，發(fā)現(xiàn)各種大小的DNA帶(圖8)。將所述凝膠進(jìn)行Southern雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了BamHI消化的片段外，含有豬GT基因第9外顯子的DNA片段以單一條帶存在，分子量大約8-12kb左右。特別是，EcoRI片段大約8kb長，其含有豬GT基因的第9外顯子及第9外顯子相鄰的兩個內(nèi)含子的一部分。
因此，用EcoRI切割克隆出的豬BAC DNA后，亞克隆得到的EcoRI片段。此后，按照如下方法用亞克隆的EcoRI片段制備用于基因?qū)ぐ械妮d體。為了更有效地選擇靶向細(xì)胞，用啟動子陷阱策略制備用于基因?qū)ぐ休d體。亞克隆的豬GT基因(1μg)和帶有puro cassette(Clontech)的質(zhì)粒分別用AvaI和DraIII及HindIII和BamHI在37℃消化2小時以上。用Klenow片段DNA聚合酶和dNTP處理消化的產(chǎn)物以產(chǎn)生平端，然后在1％瓊脂糖凝膠上電泳，再用DNA洗脫試劑盒純化(Qiagen，德國)。用T4 DNA連接酶在嘌呤霉素抗性基因-SV40多聚(A)片段上連上所述純化的GT基因片段，由此得到基因?qū)ぐ休d體(圖9)。
實(shí)施例4將GFP基因和被破壞的GT基因?qū)胩コ衫w維細(xì)胞中的基因?qū)ぐ屑夹g(shù)按照如下方法制備用于基因?qū)ぐ械呢i胎成纖維細(xì)胞。當(dāng)豬胎成纖維細(xì)胞在60mm培養(yǎng)皿中生長至完全鋪滿時，除去培養(yǎng)基后用磷酸鹽緩沖液洗滌一次，用0.25％胰蛋白酶-EDTA處理，重懸浮于含10％FCS的2ml培養(yǎng)基中，置于35mm培養(yǎng)皿中。第二天，當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到50％-90％鋪滿率時，用GFP基因轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞。
如使用FuGENE6，在含有成纖維細(xì)胞的35mm培養(yǎng)皿的每個孔中加入1μg DNA樣品和3μl FuGENE 6。首先，在Eppendorf管中等量加入97μl的不含血清的培養(yǎng)基。在每管中依次加入1μg的pEGFP-N1載體DNA和3μl的FuGENE 6，然后在3000rpm快速離心10秒。在室溫培養(yǎng)15分鐘后，將100μl該混合物加入35mm培養(yǎng)皿的每個孔中，在CO2培養(yǎng)箱中渦旋并培養(yǎng)。即使用很少量的DNA，陽離子脂質(zhì)體LipofectAmin plus(LifeTechnologies)仍具有轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點(diǎn)。使用前將磷酸鹽緩沖液和不含F(xiàn)CS/抗生素的培養(yǎng)基在37℃預(yù)熱30分鐘。在干凈的實(shí)驗(yàn)臺上，向Eppendorf管中加入pEGFP-N1載體DNA，將100μl不含血清的培養(yǎng)基或Opti-MEM與4μl Plus試劑混合，并將其加到管中。用吸液管充分混合后，將混合物在室溫培養(yǎng)15分鐘。在DNA混合物的培養(yǎng)期間，將含有鋪滿率為90％的胎成纖維細(xì)胞的6孔板用磷酸鹽緩沖液洗兩次。在每個孔中加入0.8ml不含血清的培養(yǎng)基后，將上述DNA混合物加到各孔中，然后旋轉(zhuǎn)平板，接著在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。另外，如果使用陽離子多聚體試劑ExGen 500(MBI Fermentas)時，將2μl pEGFP-N1載體DNA與100μl 150mMNaCl混合，然后加入6.6μl ExGen 500并混合，將所述DNA混合物在3000rpm快速離心10秒。在室溫培養(yǎng)10分鐘后，將DNA混合物加到含有豬胎成纖維細(xì)胞的35mm培養(yǎng)皿的每個孔中，所述豬胎成纖維細(xì)胞的生長到鋪滿率達(dá)60％，然后在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)染了GFP基因的核供體細(xì)胞的選擇、增殖和冷藏將使用三種不同的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染GFP基因的胎豬成纖維細(xì)胞培養(yǎng)3-5天直到完全鋪滿，然后通過胰蛋白酶作用將其分開并分離成單個的細(xì)胞。在帶有UV濾光片的顯微鏡下觀察這些單個細(xì)胞以鑒定表達(dá)GFP蛋白的細(xì)胞。
為了只選擇表達(dá)GFP蛋白的細(xì)胞，將細(xì)胞在添加有新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，其中每隔4-5天在培養(yǎng)基中加入400μg/ml的新霉素。選出細(xì)胞后，用胰蛋白酶處理形成的克隆，稀釋到合適濃度后在96孔板中培養(yǎng)。將在96孔板各孔中增殖的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔板，然后轉(zhuǎn)移到12孔板，再轉(zhuǎn)移到6孔板，然后進(jìn)行培養(yǎng)。為研究GFP基因是否整合到豬胎成纖維細(xì)胞的染色體DNA中，從鑒定的克隆中分離基因組DNA。設(shè)計(jì)一組引物，序列如下5’-GCGATGCCACCTACGGCAAGCTGA-3’和5’-GAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGAT-3’，用這組引物對所述分離的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用GFP探針對所述分離的基因組DNA進(jìn)行Southern印跡，發(fā)現(xiàn)GFP基因已整合到所述克隆的染色體DNA中。通過以下方法冷藏鑒定的克隆豬胎成纖維細(xì)胞用含10％FCS的培養(yǎng)基和15％FCS制備冷凍培養(yǎng)基，將增殖的細(xì)胞懸浮于其中，將所述懸浮細(xì)胞在4℃放置2小時，然后在-70℃放置12小時，然后將冷凍的細(xì)胞-150℃保存。
實(shí)施例6受體卵母細(xì)胞的制備從屠宰場收集豬的卵巢，用帶有18號針的5ml注射器從卵巢中吸出直徑大約3-6mm的卵泡。將卵泡轉(zhuǎn)移到帶有平方格(1×1cm)線的100mm培養(yǎng)皿中，選擇被大量卵丘細(xì)胞包圍的帶有同質(zhì)細(xì)胞質(zhì)的卵母細(xì)胞。在35mm培養(yǎng)皿中用2ml NCSU23-W培養(yǎng)基洗滌所述的選擇的卵母細(xì)胞三次，最后用NCSU23-M培養(yǎng)基洗滌。之后，用10％的豬卵泡液(PFF)、GTH、PMSG、hCG和10ng/ml EGF添加不含F(xiàn)SC的NCSU23-M培養(yǎng)基，在四孔板的各孔中等量加入480μl所述培養(yǎng)基。在各孔中放入50-60個未成熟的卵母細(xì)胞，并在5％CO2中培養(yǎng)22小時。然后，卵母細(xì)胞在如上所述不含激素的NCSU23-M培養(yǎng)基中體外成熟20-22小時。
實(shí)施例7體細(xì)胞核移植將實(shí)施例6中制備的受體卵母細(xì)胞用NCSU23-W培養(yǎng)基洗滌一次，并轉(zhuǎn)移到含0.1％透明質(zhì)酸酶的NCSU23-W培養(yǎng)基中。然后，從受體卵母細(xì)胞上除去卵丘細(xì)胞。將裸露的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞松弛素B溶液中，該細(xì)胞松弛素B溶液的制備方法如下將濃度為7.5mg/ml溶解于DMSO(二甲基亞砜)的1μl細(xì)胞松弛素B(Sigma Chemical Co.，美國)，與1ml添加有10％FCS的NCSU23-W培養(yǎng)基混合。使用顯微操作器固定裸露的卵母細(xì)胞，利用固定吸液管與尖的微量吸液管配合，刺破卵母細(xì)胞的透明帶形成一條裂縫。然后，用尖的微量吸液管擠壓卵母細(xì)胞上部，使10％-15％的細(xì)胞質(zhì)被擠出，由此產(chǎn)生去核的卵母細(xì)胞。
將預(yù)先制備的核供體細(xì)胞移植到去核的受體卵母細(xì)胞中。首先，將5mg PHA-P(植物凝集素)溶解到10ml NCSU23-W培養(yǎng)基中制成PHA-P母液，取100μl PHA-P母液與400μl NCSU23-W培養(yǎng)基混合制成PHA-P溶液，用該P(yáng)HA-P溶液在工作盤上方的中間放置4μl的注射微滴。然后，用4μl含有0.5％FCS的PBS，在所述工作盤中注射微滴上下滴加兩個核供體細(xì)胞的微滴。用礦物油覆蓋所述微滴，將工作盤置于顯微操縱器的平板上。將NCSU-W培養(yǎng)基中的去核卵母細(xì)胞用NCSU-W培養(yǎng)基洗滌三次并轉(zhuǎn)移到注射微滴中。然后使用注射吸液管將所述核供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到注射微滴中。通過裂縫，用注射吸液管將已鑒定表達(dá)GFP的細(xì)胞或敲除GT基因的細(xì)胞注射到去核受體卵母細(xì)胞的卵周隙中(圖3)。將得到的轉(zhuǎn)基因核移植(NT)胚胎用NCSU-W培養(yǎng)基洗滌三次，然后將其放置于NCSU-W培養(yǎng)基中。
實(shí)施例8細(xì)胞的融合和激活將轉(zhuǎn)基因NT胚胎用BTX電細(xì)胞操縱裝置(BTX，美國)進(jìn)行電融合，方法如下。為了進(jìn)行清洗，用口吸管(mouth pipette)在含有NT胚胎的NCSU23-W培養(yǎng)基中加入15μl甘露醇溶液(見表4)，然后培養(yǎng)1分鐘。在含有NCSU23-W培養(yǎng)基的甘露醇溶液中培養(yǎng)NT胚胎1分鐘，使用口吸管使其懸浮在用于清洗的甘露醇溶液中。將所述NT胚胎放在含有甘露醇溶液的小室中，該小室的兩端帶有電極，并與BTX電細(xì)胞操縱裝置相連，放置方向?yàn)楹斯w細(xì)胞面向陰極。之后，施加一次30微秒的1.8kV/cm的單向直流電脈沖來促進(jìn)NT胚胎的細(xì)胞融合。電刺激過后20分鐘內(nèi)，在顯微鏡下觀察NT胚胎以確定細(xì)胞融合是否完成，而未融合的NT胚胎再進(jìn)行一次電融合。將已鑒定為融合的NT胚胎轉(zhuǎn)移到NCSU23-W培養(yǎng)基中，在該培養(yǎng)基中NT胚胎被激活。
表4甘露醇溶液

實(shí)施例9核移植胚胎的體外培養(yǎng)電融合的轉(zhuǎn)基因NT胚胎在NCSU23-W培養(yǎng)基中被激活后，將其培養(yǎng)在NCSU23-D培養(yǎng)基中。培養(yǎng)4天后，在NCSU23-D培養(yǎng)基中添加10％FCS。在第7天，對轉(zhuǎn)各基因NT胚胎的胚泡期發(fā)育和GFP表達(dá)進(jìn)行評估，其中在紫外光照射下觀察GFP表達(dá)(圖4)。
實(shí)施例10根據(jù)是否使用轉(zhuǎn)染了GFP基因的核供體細(xì)胞，對NT胚胎的發(fā)育水平進(jìn)行比較為了評價在核供體細(xì)胞中導(dǎo)入GFP基因?qū)艘浦才咛サ陌l(fā)育產(chǎn)生負(fù)影響還是正影響，根據(jù)實(shí)施例6到9中的相同方法，對在實(shí)施例4制備的轉(zhuǎn)染了GFP基因的核供體細(xì)胞和正常的體成纖維細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植。
在獲得的核移植胚胎中，分析分裂比率、發(fā)育到胚泡期的比率和處于胚泡期的細(xì)胞的數(shù)目(見表5)。如表5所示，發(fā)現(xiàn)在供體細(xì)胞中無論是否導(dǎo)入GFP基因，核移植胚胎的發(fā)育水平?jīng)]有明顯的差別，表明將GFP基因?qū)氤衫w維細(xì)胞并不會影響核移植胚胎的發(fā)育。
表5根據(jù)是否使用轉(zhuǎn)染了GFP基因的核供體細(xì)胞，比較核移植胚胎的發(fā)育水平

實(shí)施例11根據(jù)將GFP基因?qū)牒斯w細(xì)胞中的方法，對NT胚胎的發(fā)育水平進(jìn)行比較為了評價向核供體細(xì)胞中導(dǎo)入GFP基因時使用的轉(zhuǎn)染試劑對核移植胚胎的發(fā)育水平的影響，分別使用實(shí)施例4的三種轉(zhuǎn)染試劑中的一種將GFP基因轉(zhuǎn)染到核供體細(xì)胞中，再根據(jù)實(shí)施例6到9中的相同方法進(jìn)行體細(xì)胞核移植。
在獲得的核移植胚胎中，分析分裂比率、發(fā)育到胚泡期的比率和處于胚泡期的細(xì)胞的數(shù)目(見表6)。如下表6所示，發(fā)現(xiàn)這三種情況中核移植胚胎的發(fā)育水平?jīng)]有明顯的差別，表明使用不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方法并不會影響核移植胚胎的發(fā)育水平。
表6根據(jù)將GFP基因?qū)牒斯w細(xì)胞的不同方法，比較核移植胚胎的發(fā)育水平

實(shí)施例12將NT胚胎移植到代孕母體內(nèi)為了將實(shí)施例1到11制備的帶有GFP基因或敲除GT基因的核移植胚胎轉(zhuǎn)移到代孕母體內(nèi)，從沒有母性疾病并動情周期有規(guī)律的母豬中選出正常的豬的個體。
從體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因核移植胚胎中選出高質(zhì)量的胚胎，然后將選出的核移植胚胎與含有20％FCS的磷酸鹽緩沖液一起注射到輸卵管2cm深處，靠近卵巢的位置(圖5)。具體地說，使用常規(guī)麻醉劑阿托品，以1mg/kg體重的劑量對代孕母豬進(jìn)行肌肉注射，然后注射2-4mg/kg劑量的鎮(zhèn)定劑阿扎哌隆(azaperrone)(stresnil，P/M；Mallinckrodt)，10分鐘后注射20mg/kg的鹽酸克他命。注射2％利多卡因使待切口的皮膚周圍的區(qū)域局部麻醉。根據(jù)常規(guī)剖腹術(shù)方法，在母豬腹部中間縱向切開大約7cm長的切口，打開腹腔，但不允許血流到腹腔里。用手刺激腹腔內(nèi)部，將卵巢、輸卵管和子宮拉到腹腔打開的區(qū)域。找到輸卵管的開口后，小心地操作卵巢，將具有1.0ml結(jié)核菌素注射器(Latex free，Becton Dickinson &CO.Franklin lakes，NJ 07417)的胚胎移植管(Tom cat catheter，50cm，5French(弗倫奇)，末端開口的導(dǎo)液管，Williams A Cook，MO 63103)插到輸卵管2cm深處(圖5)。
確保插入的胚胎移植管前端留出足夠的空間后，通過該胚胎移植管將轉(zhuǎn)基因NT胚胎注射進(jìn)去。用顯微鏡觀察，確定轉(zhuǎn)基因NT胚胎被成功注射后，將500ml含有抗生素的生理鹽水溶液注射到腹腔內(nèi)部。然后，用可生物吸收的縫合線縫合打開的腹腔。手術(shù)后，給代孕母豬施用多種抗生素，施用5天，以防止感染。
實(shí)施例13評價代孕母豬的妊娠情況，及表達(dá)GFP的成活后代的產(chǎn)生和帶有敲除的GT基因的成活后代的產(chǎn)生將轉(zhuǎn)基因NT胚胎移植到代孕母豬體內(nèi)4周后，用超聲波診斷系統(tǒng)評價母豬的妊娠情況。
此后，每兩周進(jìn)行一次超聲波診斷以監(jiān)測代孕母豬的妊娠情況。在胚胎移植114天后，表達(dá)GFP的代孕母豬生產(chǎn)出7頭克隆小豬，敲除GT基因的代孕母豬生產(chǎn)出3頭克隆小豬。
實(shí)施例14轉(zhuǎn)基因克隆豬的遺傳分析用分子生物學(xué)方法對實(shí)施例13中的成活后代進(jìn)行遺傳分析，用肉眼觀察它們的表型。
通過用肉眼觀察、以及進(jìn)行Southern印跡、Western印跡(蛋白質(zhì)印跡)和用成活后代的組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)等方法，鑒定所述成活后代中GFP的表達(dá)情況和敲除GT基因的導(dǎo)入情況。
首先，用肉眼觀察所述后代的皮膚、嘴和舌頭上綠色的誘導(dǎo)情況來鑒定GFP的表達(dá)。為鑒定所述后代中GFP的表達(dá)，也可以使用Southern印跡方法分析后代的基因組DNA以及用Western印跡方法分析一些組織的蛋白樣品。另外，，用Southern印跡方法分析代孕母體(帶有敲除的GT基因)產(chǎn)生的成活后代，發(fā)現(xiàn)它們也帶有敲除的GT基因。
工業(yè)適用性如前所述，本發(fā)明用GFP基因或被破壞的GT基因轉(zhuǎn)染體細(xì)胞，并將得到的體細(xì)胞利用核移植方法移植到受體卵母細(xì)胞中，從而提供表達(dá)GFP的克隆豬和攜帶敲除GT基因的克隆豬，因此使大規(guī)模生產(chǎn)動物疾病模型成為可能，并使動物能提供可用于人類移植的器官，而不會產(chǎn)生超急性免疫排斥。
已采用示例性形式描述了本發(fā)明，應(yīng)理解，希望所用的術(shù)語本質(zhì)上是描述性的而非限制性的。根據(jù)上述教導(dǎo)，本發(fā)明還存在許多修改和變化。因此，應(yīng)理解，在所附權(quán)利要求的范疇中，可以不同于上述特定方法的其他方法實(shí)施本發(fā)明。

有關(guān)保藏的微生物或其他生物材料的說明(PCT Rule 13bis)




有關(guān)保藏的微生物或其他生物材料的說明(PCT Rule 13bis)



權(quán)利要求
1.一種表達(dá)綠色熒光蛋白基因的克隆豬的生產(chǎn)方法，該方法包括如下步驟(a)通過培養(yǎng)來源于豬的細(xì)胞系制備核供體細(xì)胞；(b)將攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因的DNA構(gòu)建體和脂組分或非脂陽離子聚合體介質(zhì)混合，以形成脂(或陽離子聚合體)-DNA復(fù)合物，將得到的復(fù)合物加到核供體細(xì)胞的培養(yǎng)基中并進(jìn)一步培養(yǎng)所述核供體細(xì)胞，以將所述GFP基因?qū)胨龊斯w細(xì)胞并在其中表達(dá)GFP基因；(c)將轉(zhuǎn)染的核供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到去核的豬受體卵母細(xì)胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的核移植胚胎，并激活所述核移植胚胎；以及(d)將所述核移植胚胎移植到代孕母豬體內(nèi)，以產(chǎn)生成活后代。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(a)中所述來源于豬的細(xì)胞系是胎成纖維細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(b)中所述攜帶GFP基因的DNA構(gòu)建體是pEFGP-N1。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(b)中所述的脂組分是FuGENE 6或LipofectAmine Plus。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述非脂陽離子聚合體是ExGen 500。
6.一種豬核移植胚胎“SNU-P1[豬NT胚胎]”，該豬核移植胚胎按照權(quán)利要求1中的步驟(a)到(c)制備并被保藏在KCTC(韓國典型培養(yǎng)物保藏中心)，保藏編號為KCTC 10145BP。
7.一種表達(dá)綠色熒光蛋白基因的克隆豬，該克隆豬是通過實(shí)施權(quán)利要求1中的步驟(d)由權(quán)利要求6所述的豬核移植胚胎“SNU-P1[豬NT胚胎]”而產(chǎn)生的。
8.一種敲除α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆豬的生產(chǎn)方法，該方法包括如下步驟(a)通過培養(yǎng)來源于豬的體細(xì)胞系制備核供體細(xì)胞；(b)從豬基因組BAC文庫中分離α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)基因克隆，并用分離的GT基因構(gòu)建基因?qū)ぐ休d體，其中，該載體攜帶經(jīng)過修飾的GT基因，以抑制正常GT蛋白的表達(dá)，所述經(jīng)過修飾的GT基因是通過同源重組用編碼選擇性標(biāo)記的基因取代野生型GT基因的一部分而得以修飾的；(c)將載體與脂或非脂組分混合以形成脂(或非脂)-DNA復(fù)合物，并將得到的復(fù)合物加到核供體細(xì)胞的培養(yǎng)基中，通過在核供體細(xì)胞中導(dǎo)入重組的GT基因?qū)崿F(xiàn)基因?qū)ぐ校?d)將轉(zhuǎn)染了重組GT基因的核供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到去核的豬受體卵母細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的核移植胚胎，并激活所述核移植胚胎；以及(e)將核移植胚胎移植到代孕母豬體內(nèi)，產(chǎn)生成活后代。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中在步驟(a)中所述來源于豬的細(xì)胞系是胎成纖維細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中在步驟(b)中所述的基因?qū)ぐ休d體通過啟動子陷阱方法構(gòu)建為不含外源啟動子的載體。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中在步驟(b)中所述的基因?qū)ぐ休d體含有與GT基因的部分第8內(nèi)含子、第9外顯子及部分第9內(nèi)含子對應(yīng)的核酸序列，其中用編碼連有SV40聚腺苷酸序列的嘌呤霉素抗性基因的核酸序列代替所述第9外顯子的AvaI-DraIII片段。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中在步驟(c)中所述的脂組分是FuGENE 6。
13.一種豬的核移植胚胎“SNU-P2[豬NT胚胎]”，該豬核移植胚胎按照權(quán)利要求8中的步驟(a)到(d)制備，并被保藏在KCTC(韓國典型培養(yǎng)物保藏中心)，保藏號為KCTC 10146BP。
14.一種敲除α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆豬，該克隆豬是通過權(quán)利要求8中的步驟(e)由權(quán)利要求13所述的豬核移植胚胎“SNU-P2[豬NT胚胎]”產(chǎn)生的。
15.一種載體，該載體攜帶與GT基因的部分第8內(nèi)含子、第9外顯子及部分第9內(nèi)含子對應(yīng)的核酸序列，其中用編碼連有SV40聚腺苷酸序列的嘌呤霉素抗性基因的核酸序列代替所述第9外顯子的AvaI-DraIII片段。
全文摘要
本發(fā)明公開了表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的克隆豬和敲除1，3－半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)基因的克隆豬。本發(fā)明還公開了生產(chǎn)這些克隆豬的方法，該方法包括下列步驟建立體細(xì)胞系；制備轉(zhuǎn)染GFP或敲除GT基因的核供體細(xì)胞；用核供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因核移植胚胎；將轉(zhuǎn)基因核移植胚胎移植到代孕母豬體內(nèi)。本發(fā)明中表達(dá)GFP的克隆豬有利于大規(guī)模生產(chǎn)動物疾病模型，而且敲除GT基因的克隆豬可以被用作器官供體，使人體中不產(chǎn)生超急性免疫排斥的異種移植成為可能。
文檔編號C12N15/09GK1582332SQ01823919
公開日2005年2月16日 申請日期2001年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月29日
發(fā)明者黃寓錫, 李柄千, 姜成根, 韓在容, 林正默, 李昌奎, 李殷松, 鄭義培, 趙鐘基, 金大暎, 玄尚桓, 李甲相, 金惠洙, 李昭炫, 李成哲, 廉受清 申請人:Seoul大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力財(cái)團(tuán)