專利名稱：煙草細(xì)胞內(nèi)氧化還原酶制劑的純化、分子修飾和低聚物保護方法及生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及烤煙的自然發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙葉發(fā)酵是卷煙加工中極為重要的環(huán)節(jié)，未經(jīng)發(fā)酵處理的煙葉不同程度的帶有多種品質(zhì)缺陷，不能直接用來生產(chǎn)卷煙。目前煙草工業(yè)普遍使用的自然發(fā)酵工藝周期過長，盡管能使煙葉品質(zhì)有所改善和提高，但制約著卷煙業(yè)企業(yè)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)卷煙所需的原料。150年前英國科學(xué)家曾試圖用微生物來提高煙草發(fā)酵質(zhì)量，這方面的系統(tǒng)研究始于1950年(Frankenburg，W.G 1950 Enzymology10325-431)，當(dāng)時提出了煙葉發(fā)酵由酶催化的系統(tǒng)理論；之后前蘇聯(lián)科學(xué)家和其他國家的科研人員做了大量的微生物發(fā)酵實驗，均未取得成功；隨后又對用人為的方法控制溫濕度條件的人工發(fā)酵方法進行了大量的研究。但其所處理的煙葉遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達到自然發(fā)酵的煙葉品質(zhì)，因而沒有被煙草工業(yè)普遍接受。
中國專利CN 86 1 02596 A公開了一種“煙葉的強化發(fā)酵方法”，它是在調(diào)制的煙葉上噴灑淀粉酶和過氧化氫混合溶液，然后采用除雜劑處理?！逗幽限r(nóng)業(yè)科學(xué)》-1998(12)報導(dǎo)的“煙草發(fā)酵增質(zhì)劑對烤煙發(fā)酵質(zhì)量的影響”，《山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報》-1999，18(4)報導(dǎo)的“微生物發(fā)酵對考煙內(nèi)在品質(zhì)的影響”，《河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報》-2000，34(3)報導(dǎo)的“烤煙發(fā)酵高菌株的篩選”以及《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報》-2000，19(6)報導(dǎo)的“陳化期間烤煙葉片中生物活性變化的研究”等，上述文件闡述的微生物、酶及活性主要表現(xiàn)為微生物、胞外酶；所闡述的縮短陳化周期在自然發(fā)酵領(lǐng)域無明確的時間；所闡述的應(yīng)用未說明產(chǎn)品的耐高溫性；所闡述的內(nèi)容對處理煙葉的含水率未說明。
近年來，煙葉尤其是烤煙缺乏足夠的酶活性強度被越來越多的研究證明，見盧紅、王晶晶發(fā)表于《云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報》-2000(2)。煙葉發(fā)酵酶工程是應(yīng)用生物酶的高專性和高效酶解性能，有選擇地加速煙草某些不良成分的分解，形成許多有利于提高煙草品質(zhì)的致香成分，使煙草的發(fā)酵周期明顯縮短，煙草潛在的優(yōu)良品質(zhì)得到充分發(fā)揮。由于卷煙工藝特殊的低含水條件限制了酶制劑的活性作用，使這一領(lǐng)域的研究成果一直沒有得到推廣應(yīng)用并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
隨著煙葉發(fā)酵機理研究的進一步深入，煙草的香氣來源和直接導(dǎo)致不良吸吃味成分的確定，本發(fā)明提出一種煙草細(xì)胞內(nèi)氧化還原酶制劑的純化、分子修飾和低聚物保護方法及生產(chǎn)工藝，它從鮮活烤煙細(xì)胞內(nèi)純化分離氧化還原酶群，并用輔酶和輔基置換對該酶群進行酶分子修飾，有效提高該類胞內(nèi)酶活性；通過水含低聚物活性保護，有效延長了酶群活性半衰期，并實現(xiàn)低含水介質(zhì)條件下的高效酶解作用，配合調(diào)制復(fù)烤后烤煙的胞內(nèi)酶群放活處理。
本發(fā)明解決了酶制劑在煙草打葉復(fù)烤工藝中高溫條件下對酶活性的保護以及在卷煙工藝特定的低含水條件下酶制劑活性的發(fā)揮，從而在發(fā)酵過程中應(yīng)用酶工程技術(shù)增加煙葉純正天然煙香，提供的酶制劑通過在卷煙工業(yè)中實際應(yīng)用證明，能大幅度縮短煙草發(fā)酵周期，高選擇地降低煙葉品質(zhì)缺陷，進一步發(fā)揮其潛在優(yōu)良品質(zhì)，提高煙草的可用性和安全性，適宜煙草工業(yè)中普遍推廣應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點或積極效果本發(fā)明闡述的酶為細(xì)胞內(nèi)酶基礎(chǔ)上的酶分子修飾，可應(yīng)用于復(fù)烤線上經(jīng)受復(fù)烤煙葉面80℃高溫后仍能發(fā)生作用，可在儲存煙葉12％±0.5的含水率條件下產(chǎn)生作用。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明具有加快自然發(fā)酵過程，縮短自然發(fā)酵周期，除去烤煙內(nèi)部不良缺陷，提高烤煙品質(zhì)的特點。主要具有下列六個方面的作用1、降解烤煙殘留葉綠素，消除青雜氣。在底物(葉綠素)分解后作用自然終止；2、降解烤煙萜烯類化合物中的大分子成分為小分子香氣成分，增強烤煙天然香氣，發(fā)揮烤煙潛在優(yōu)良品質(zhì)；3、加速烤煙適當(dāng)酸化過程，降低PH值一個單位，醇化烤煙，明顯提高烤煙可用性；4、速氨氮化合物脫氨揮發(fā)，降低烤煙總氮含量，降低刺激性，改善吃味，易轉(zhuǎn)化氨氮分解后作用自然終止；5、當(dāng)降解烤煙煙堿含量，降解產(chǎn)物為煙酸，改進烤煙吸吃味，提高烤煙安全性。6、比烤煙自然發(fā)酵的時間縮短5～6倍，由原來2～3年縮短為夏季100～150天、冬季150～200天。
圖面說明

圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
圖2為打葉復(fù)烤活性因子處理工藝流程。
如圖所示本發(fā)明的工藝流程如下A、鮮活煙葉或頂杈于4～8℃下加鮮組織3～5倍的5％～10％亞硫酸氫鈉溶液勻漿10～20分鐘至0.2mm，按常規(guī)工藝過濾或壓濾排除固形物。
B、濾液于1～9℃、4000～145000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離，取液體于棉纖維或石英柱PH3～8醋酸洗脫液柱沉析，排除廢液。
C、酶坯溶液加入0.01～0.1％EDTA等1號輔料，在1～9℃沉淀10～20分鐘后，過濾排除沉淀物獲得凈化液。
D、凈化液于1～9℃下加入適量工程輔酶和輔基等2號輔料進行分子修飾工程輔酶置換，完成后酶液由淡黃色轉(zhuǎn)為淡綠色，即加入0.01％的糖類低聚物活性保護。
E、酶溶液于-4℃至-8℃冷凍干燥濃縮，制劑液體縮小2～8倍時，于8℃解凍包裝。
在打葉復(fù)烤處理流程的烤煙解把、第一次潤葉、第二次潤葉、打葉、復(fù)烤、緊壓打包過程中，本發(fā)明制得的烤煙發(fā)酵活性因子在第二次潤葉時加入。
實施例1A、鮮活煙葉或頂杈6℃，加鮮組織4倍的7.5％亞硫酸氫鈉溶液勻漿15分鐘，壓濾排除固形物。B、濾液5℃、14500轉(zhuǎn)/分鐘離心分離，取液體于棉纖維或石英柱PH5.5醋酸洗脫液柱沉析。C、酶坯溶液加入0.06％EDTA等1號輔料，5℃沉淀10分鐘后，過濾排除沉淀物。D、凈化液5℃加入適量工程輔酶和輔基等2號輔料進行分子修飾工程輔酶置換。完成后酶液由淡黃色轉(zhuǎn)為淡綠色，即加入0.01％的糖類低聚物活性保護。E、酶溶液于-6℃冷凍干燥濃縮，制劑液體縮小5倍時，于8℃解凍包裝。
實施例2A、鮮活煙葉或頂權(quán)4℃加鮮組織3倍的5％亞硫酸氫鈉溶液勻漿10分鐘，壓濾排除固形物。B、濾液1℃、4000-5000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離，取液體于棉纖維或石英柱PH3醋酸洗脫液柱沉析。C、酶坯溶液加入0.01％EDTA等1號輔料，1℃沉淀20分鐘后，過濾排除沉淀物。D、凈化液1℃加入適量工程輔酶和輔基等2號輔料進行分子修飾工程輔酶置換。完成后酶液由淡黃色轉(zhuǎn)為淡綠色，即加入0.01％的糖類低聚物活性保護。E、酶溶液于-8℃冷凍干燥濃縮，制劑液體縮小8倍時，于8℃解凍包裝。
實施例3A、鮮活煙葉或頂權(quán)8℃加鮮組織5倍的10％亞硫酸氫鈉溶液勻漿20分鐘，壓濾排除固形物。B、濾液9℃、5000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離，取液體于棉纖維或石英柱PH8醋酸洗脫液柱沉析。C、酶坯溶液加入0.1％EDTA等1號輔料，9℃沉淀20分鐘后，過濾排除沉淀物。D、凈化液9℃加入適量工程輔酶和輔基等2號輔料進行分子修飾工程輔酶置換。完成后酶液由淡黃色轉(zhuǎn)為淡綠色，即加入0.01％的糖類低聚物活性保護。E、酶溶液于-8℃冷凍干燥濃縮，制劑液體縮小8倍時，于8℃解凍包裝。
權(quán)利要求
1.一種煙草細(xì)胞內(nèi)氧化還原酶制劑的純化、分子修飾和低聚物保護方法及生產(chǎn)工藝，其特征在于工藝流程如下A、鮮活煙葉或頂杈于4～8℃下加鮮組織3～5倍的5％～10％亞硫酸氫鈉溶液勻漿10～20分鐘至0.2mm，按常規(guī)工藝過濾或壓濾排除固形物。B、濾液于1～9℃、4000～145000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離，取液體于棉纖維或石英柱PH3～8醋酸洗脫液柱沉析，排除廢液。C、酶坯溶液加入0.01～0.1％EDTA等1號輔料，在1～9℃沉淀10～20分鐘后，過濾排除沉淀物獲得凈化液。D、凈化液于1～9℃下加入適量工程輔酶和輔基等2號輔料進行分子修飾工程輔酶置換，完成后酶液由淡黃色轉(zhuǎn)為淡綠色，即加入0.01％的糖類低聚物活性保護。E、酶溶液于-4℃至-8℃冷凍干燥濃縮，制劑液體縮小2～8倍時，于8℃解凍包裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，在打葉復(fù)烤處理流程的烤煙解把、第一次潤葉、第二次潤葉、打葉、復(fù)烤、緊壓打包中，其特征在于烤煙發(fā)酵活性因子在第二次潤葉時加入。
全文摘要
本發(fā)明提出一種煙草細(xì)胞內(nèi)氧化還原酶制劑的純化、分子修飾和低聚物保護方法及生產(chǎn)工藝,它從鮮活烤煙細(xì)胞內(nèi)純化分離氧化還原酶群,并用輔酶和輔基置換對該酶群進行酶分子修飾,有效提高該類胞內(nèi)酶活性;通過水含低聚物活性保護,有效延長了酶群活性半衰期,并實現(xiàn)低含水介質(zhì)條件下的高效酶解作用,配合調(diào)制復(fù)烤后烤煙的胞內(nèi)酶群放活處理,本發(fā)明解決了酶制劑在煙草打葉復(fù)烤工藝中高溫條件下對酶活性的保護以及在卷煙工藝特定的低含水條件下酶制劑活性的發(fā)揮。
文檔編號C12N9/02GK1362515SQ0211327
公開日2002年8月7日 申請日期2002年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月25日
發(fā)明者盧紅 申請人:云南萬芳生物技術(shù)有限公司