專(zhuān)利名稱(chēng)：非甲－庚型肝炎診斷試劑及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病診斷技術(shù)領(lǐng)域，具本地說(shuō)是非甲-庚型肝炎診斷試劑及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在肝炎病原學(xué)診斷中，約有10％-20％的急慢性輸血后肝炎、散發(fā)性肝炎、肝硬化和暴發(fā)型肝炎仍不能用現(xiàn)有的檢測(cè)方法檢出其病毒學(xué)標(biāo)志，提示可能存在非甲庚型病毒。1997年，日本在輸血后非甲庚肝炎病人血清中分離出了一種新的DNA病毒，稱(chēng)為輸血傳播病毒(transfusion-transmitted Virus，TTV)，它極有可能成為第八種肝炎病毒。研究表明，TTV呈全球性分布，是一種無(wú)胞膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒，它與不明原因的非甲-庚型肝炎病人轉(zhuǎn)氨酶異常升高和肝功能異常有關(guān)，可通過(guò)血制品和腸道途徑傳播。目前，TTV的分類(lèi)、基因型、病因?qū)W機(jī)理、流行病學(xué)規(guī)律等尚不完全清楚，只知其線狀DNA長(zhǎng)3.7kb，含有ORF1與ORF2兩個(gè)開(kāi)放讀碼框，分別編碼770與220個(gè)氨基酸。
由于，TTV感染者血清TTV DNA滴度為50-5000拷貝/ml，較其他的一些經(jīng)血傳播的病毒(如HCV RNA的滴度為103-10拷貝/ml)低，因此，現(xiàn)在尚不能利用血清免疫學(xué)診斷方法檢測(cè)TTV，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)就成為診斷TTV感染的主要手段。盡管PCR技術(shù)有較高的特異性和敏感性，但檢測(cè)TTV需經(jīng)過(guò)兩次PCR擴(kuò)增，操作較繁瑣，技術(shù)要求高，易引起交叉污染而出假陽(yáng)性，從而影響結(jié)果判斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中TTV診斷中存在的問(wèn)題和困難，提供一種敏感性高、特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好、無(wú)溴乙錠污染的非甲-庚型肝炎診斷試劑及其檢測(cè)方法。
本發(fā)明將PCR技術(shù)與微孔板核酸雜交酶呈色技術(shù)聯(lián)用，用于臨床檢測(cè)非甲-庚肝型肝炎，即檢測(cè)特異的TTV DNA。
本發(fā)明的非-甲庚型肝炎診斷試劑的檢測(cè)方法按以下步驟進(jìn)行檢測(cè)1)人血清、膽汁或肝臟組織中提取DNA；2)設(shè)計(jì)TTV DNA特導(dǎo)性引物，并將其用生物素(biotin)標(biāo)記；
3)用上述標(biāo)記特異性引物對(duì)樣本組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用于微孔板雜交；4)將鏈酶親合素(streptavidin)包被并封閉于微孔板上；5)合成TTV DNA特異性探針并用異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記；6)取用變性液變性后的TTV DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，加入已包被好的微孔板中，用FITC標(biāo)記的特異性探針進(jìn)行雜交；7)洗滌后在核酸雜交產(chǎn)物中加入酶標(biāo)熒光素抗體并溫育；8)洗滌后再加入酶反應(yīng)底物并溫育；9)洗滌后用酶標(biāo)儀檢測(cè)核酸雜交后酶呈色結(jié)果，用于臨床診斷樣本是否TTV DNA攜帶者。
上述的檢測(cè)方法中設(shè)計(jì)的TTV DNA引物為5′-biotin-CAT GTA TAGGAT AGA CTG、5′-biotin-CCT GGC AAT TTA CCA TTCC、5′-biotin-GCAGAA AGC GTC TAG CCAT、5′-biotin-CTC GCA AGC ACC CTA TCA GGCA、5′-biotin-TGA GGA AAT AAG GAC TG、5′-biotin-GTG TAC TGG AAGGCG TAA GC和探針為5′-FITC-CTA CCT CTA TAA GCA GCA GCA、5′-FITC-GGA GAG CCA TAG TGG TCT GCG、5′-FITC-TGG GCT GGGGAT CTA AGG TGTC。
本發(fā)明的診斷試劑及檢測(cè)方法應(yīng)用單式PCR，無(wú)需經(jīng)過(guò)兩次PCR擴(kuò)增；應(yīng)用生物素-親和素將PCR產(chǎn)物包被于微孔板上，再與熒光素標(biāo)記的探針雜交，使特異性的酶標(biāo)記與熒光素抗體進(jìn)行呈色反應(yīng)，消除了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的影響，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性，結(jié)果更為可靠。因此，本發(fā)明具有敏感性高、特性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好、無(wú)溴乙錠污染等優(yōu)點(diǎn)，有望成為T(mén)TV DNA臨床診斷的常規(guī)檢測(cè)方法。
具體實(shí)施方案將PCR技術(shù)與微孔板核酸雜交酶呈色技術(shù)聯(lián)用，按以下方法檢測(cè)非-甲庚型肝炎1)從人血清、膽汁或肝臟組織中提取DNA；2)計(jì)TTV DNA特導(dǎo)性引物5′-biotin-CAT GTA TAG GAT AGA CTG、5′-biotin-CCT GGC AAT TTA CCA TTCC，通過(guò)PCR對(duì)TTV DNA進(jìn)行擴(kuò)增；3)用上述標(biāo)記特異性引物對(duì)樣本組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用于微孔板雜交；4)將鏈酶親合素(streptavidin)包被并封閉于微孔板上；5)合成TTV DNA特異性探針5′-FITC-CTA CCT CTA TAA GCA GCAGCA；6)取用變性液變性后的TTV DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，加入已包被好的微孔板中，用FITC標(biāo)記的特異性探針進(jìn)行雜交；7)洗滌后在核酸雜交產(chǎn)物中加入酶標(biāo)熒光素抗體并溫育；8)洗滌后再加入酶反應(yīng)底物并育溫；9)洗滌后用酶標(biāo)儀檢測(cè)核酸雜交后酶呈色結(jié)果，用于臨床診斷樣本是否TTV DNA攜帶者。
權(quán)利要求
1.一種非甲-庚型肝炎診斷試劑，其特征在于將PCR技術(shù)與微孔板核酸雜交酶呈色技術(shù)聯(lián)用，用于臨床檢測(cè)非甲-庚肝型肝炎。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非-甲庚型肝炎診斷試劑的檢測(cè)方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行檢測(cè)1)從人血清、膽汁或肝臟組織中提取DNA；2)設(shè)計(jì)TTV DNA特導(dǎo)性引物，并將其用生物素(biotin)標(biāo)記；3)用上述標(biāo)記特異性引物對(duì)樣本組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用于微孔板雜交；4)將鏈酶親合素(streptavidin)包被并封閉于微孔板上；5)合成TFV DNA特異性探針并用異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記；6)取用變性液變性后的TTV DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，加入已包被好的微孔板中，用FITC標(biāo)記的特異性探針進(jìn)行雜交；7)洗滌后在核酸雜交產(chǎn)物中加入酶標(biāo)熒光素抗體并溫育；8)洗滌后再加入酶反應(yīng)底物并育溫；9)洗滌后用酶標(biāo)儀檢測(cè)核酸雜交后酶呈色結(jié)果，用于臨床診斷樣本是否TTV DNA攜帶者。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于設(shè)計(jì)的TTV DNA引物為5′-biotin-CAT GTA TAG GAT AGA CTG、5′-biotin-CCT GGC AAT TTACCA TTCC、5′-biotin-GCA GAA AGC GTC TAG CCAT、5′-biotin-CTC GCAAGC ACC CTA TCA GGCA、5′-biotin-TGA GGA AAT AAG GAC TG、5′-biotin-GTG TAC TGG AAG GCG TAA GC
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于探針為5′-FITC-CTACCT CTA TAA GCA GCA GCA、5′-FITC-GGA GAG CCA TAG TGG TCTGCG、5′-FITC-TGG GCT GGG GAT CTA AGG TGTC。
全文摘要
本發(fā)明是種非甲－庚型肝炎診斷試劑及檢測(cè)方法。其特征在于將PCR技術(shù)與微孔板核酸雜交酶呈色技術(shù)聯(lián)用，用于臨床檢測(cè)非甲－庚肝型肝炎。本發(fā)明的診斷試劑及檢測(cè)方法應(yīng)用單式PCR，無(wú)需經(jīng)過(guò)兩次PCR擴(kuò)增；應(yīng)用生物素－親和素將PCR產(chǎn)物包被于微孔板上，再與熒光素標(biāo)記的探針雜交，使特異性的酶標(biāo)記與熒光素抗體進(jìn)行呈色反應(yīng)，消除了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的影響，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性，結(jié)果更為可靠。因此，本發(fā)明具有敏感性高、特性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好、無(wú)溴乙錠污染等優(yōu)點(diǎn)，有望成為T(mén)TV DNA臨床診斷的常規(guī)檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1436855SQ0211336
公開(kāi)日2003年8月20日 申請(qǐng)日期2002年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月9日
發(fā)明者張 杰 申請(qǐng)人:昆明廣博科技有限公司