專利名稱：Sod臍橙及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物利用領(lǐng)域，具體地說是一種微生物制劑及其利用該制劑生產(chǎn)SOD臍橙的方法。技術(shù)背景
臍橙屬于柑桔類水果，主要栽培在長江中上游地區(qū)。該區(qū)雨量充沛、氣候溫和、無霜期長、相對濕度低、霧日少、日照時間長，所產(chǎn)的臍橙果型美觀、芳香濃郁，肉質(zhì)脆嫩，無核少絡(luò)、汁多爽口。但是近年來由于生產(chǎn)規(guī)模發(fā)展過快，果園管理粗糙，加之大量使用化肥，品質(zhì)日趨下降。改善和提高臍橙的品質(zhì)目前已成為臍橙產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。
SOD酶是生物重要保護(hù)酶之一，能增強機體抗逆能力，防衰老。目前SOD酶主要用于醫(yī)藥、化妝品行業(yè)。由于SOD酶普遍存在于各種植物中，因此有關(guān)SOD酶的提取技術(shù)廣見于報道，但迄今未發(fā)現(xiàn)利用微生物生產(chǎn)SOD酶的生物制劑，進(jìn)而通過栽培方法開發(fā)出高含量的SOD農(nóng)產(chǎn)品的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用篩選地新微生物開發(fā)出一種臍橙專用SOD制劑；本發(fā)明的另一目的在于提出一種SOD臍橙的生產(chǎn)方法。
一種微生物，它是蠟狀芽孢桿菌，拉丁文為Bacillus cereus，它已保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.0760和CGMCC NO.0761。
一種臍橙專用SOD制劑，該制劑含有保藏號為CGMCC NO.0760和/或CGMCC NO.0761的芽孢桿菌。
一種臍橙專用SOD制劑，該制劑含有保藏號為CGMCC NO.0760和/或CGMCC NO.0761的芽孢桿菌，其芽孢桿菌含量為2.5×1010cfu/g-3.5×1010cfu/g。
以下敘述利用本發(fā)明SOD制劑生產(chǎn)SOD臍橙的方法
1.樹盤基施臍橙專用SOD制劑每棵結(jié)果臍橙樹施用15-25克臍橙專用SOD制劑，將SOD制劑均勻撒在樹盤內(nèi)，然后使SOD制劑與樹盤內(nèi)的土充分混勻。
在中國臍橙產(chǎn)區(qū)，基施時間一般在2月下旬到3月上旬。
2.樹冠噴霧臍橙專用SOD制劑基施后的臍橙樹每月中旬，收獲前二個月每10-15天樹冠噴霧臍橙專用SOD制劑，每次每畝用量為40-60g，全生產(chǎn)過程中噴次為10-12次。
在中國臍橙產(chǎn)區(qū)，從3月到9月，每月中旬噴一次SOD制劑1000倍液，每畝噴稀釋液40-60千克；10月上旬和下旬各噴1次，11月上、中、下旬各噴1次，稀釋液濃度和用量同前。從3月到11月共噴10-12次SOD制劑。
本發(fā)明的SOD制劑在噴施過程中可與其他栽培管理結(jié)合，不發(fā)生矛盾。
本發(fā)明的SOD制劑可與殺蟲劑、殺菌劑(殺細(xì)菌劑除外)、植物生長調(diào)節(jié)劑、葉面肥等混和使用。
本發(fā)明所述的SOD臍橙生產(chǎn)過程中，除去SOD制劑的處理外，其他栽培措施仍可按照當(dāng)?shù)爻Ｄ攴e累總結(jié)形成的操作規(guī)程執(zhí)行。
本發(fā)明較已有技術(shù)相比具有如下典型優(yōu)點
1、本發(fā)明臍橙專用SOD制劑施用到臍橙樹上，其臍橙內(nèi)的SOD耐熱性好，在深加工和貯藏過程中不易失活。本發(fā)明的制劑用到臍橙上，通過芽孢桿菌在臍橙樹體內(nèi)繁殖、轉(zhuǎn)移，提高臍橙體內(nèi)的SOD活性和含量。本發(fā)明制劑產(chǎn)生的SOD酶有較強的耐溫抗熱性和抗逆能力，在70℃條件下處理1小時，酶活為原酶活的47％；100℃條件下處理30分鐘，酶活為原酶活的37％；對臭氧、高溫和高酸的耐性很強。
2、本發(fā)明的SOD制劑是由植物體內(nèi)有益內(nèi)生共生芽孢桿菌中制備而成，具有高度的安全性。
3、用本發(fā)明所述的方法可獲得的高含SOD酶的臍橙即SOD臍橙。SOD臍橙除了保持原有臍橙的優(yōu)良性狀，SOD含量明顯提高，具有增強人體免疫力和延緩衰老的功效。因此，SOD臍橙市場前景看好，符合功能食品的發(fā)展方向，目前國內(nèi)外還未見有關(guān)SOD臍橙的宣傳報導(dǎo)。實施方式
本發(fā)明不限于下述實施例。
實施例1本發(fā)明的微生物及其利用微生物生產(chǎn)臍橙專用SOD制劑的過程
一、生產(chǎn)菌株蠟質(zhì)芽孢桿菌CGMCC NO.0760和/或CGMCC NO.0761(QC1和/或QC2)。
二、生產(chǎn)工藝流程
QC1和QC2經(jīng)液體深層發(fā)酵法制成粉劑，其主要生產(chǎn)步驟為原菌種活化、菌種擴大培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)、添加填充料、壓濾、干燥、粉碎、粉劑質(zhì)量檢測、包裝、產(chǎn)品檢測等。本工藝為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。
三、技術(shù)參數(shù)(見表1)
表1本發(fā)明微生物制劑的技術(shù)參數(shù)
四、菌種生產(chǎn)操作規(guī)程
1、儀器設(shè)備和試劑無菌室或超凈工作臺、滅菌鍋、試管、克氏瓶、冰箱、溫箱。顯微鏡、NaOH、HCl、NaCl、牛肉膏、蛋白胨和瓊脂等。
2、培養(yǎng)基制備按如下配方制備培養(yǎng)基牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，瓊脂2％。將瓊脂加熱溶化后用NaOH或Hcl調(diào)PH值至7.0-7.5，然后分裝克氏瓶或試管，置于滅菌鍋內(nèi)，在0.11MPa壓力下滅菌30min，冷卻后制成斜面?zhèn)溆谩?br> 3、菌種活化與擴大培養(yǎng)用培養(yǎng)基在無菌條件下從原菌種斜面上挑取少許菌苔，置放試管斜面內(nèi)進(jìn)行劃線，然后置28-30℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查無雜菌、菌體生長整齊，再置28-30℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24-28h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片、染色檢查無雜菌，芽孢大小一致的，可放冰箱中存放備用(4℃左右為宜)。
五、種子罐培養(yǎng)
1、培養(yǎng)基種子罐培養(yǎng)基配方豆餅粉0.5％、魚粉0.3％、玉米粉0.5％、葡萄糖0.3％，豆油0.2％-0.3％(或泡敵0.3％)。
2、空發(fā)酵罐滅菌發(fā)酵罐在應(yīng)用前清洗干凈，排除污物，并在0.14MPa壓力下，滅菌30min。
3、種子罐裝料按照上述不上述種子罐培養(yǎng)基的配方比例裝料，投料量不得超過罐容積70％。
4、種子罐滅菌裝好料后，在0.11MPa壓力下滅菌30min，冷卻至30℃后即可接種。
5、懸浮液制備在無菌條件下將每個克氏瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液，含菌量為10億個菌體/ml，并在80℃恒溫水鍋中處理20min。
6、接種將制好的孢子懸浮液，在無菌條件下接種后，按1％的比例接種于冷卻至30℃的種子罐內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
7、種子罐培養(yǎng)條件控制接種后在溫度為28-30℃，壓力0.05MPa通氣量1∶1(每min體積比)和220轉(zhuǎn)/min攪拌條件下，培養(yǎng)8-10h。
六、發(fā)酵罐發(fā)酵
1、發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方豆餅粉2％，魚粉0.5％，玉米漿1.8％，淀粉0.4％，硫酸鎂0.06％，碳酸鈣0.5％，磷酸二氫鉀0.03％，豆油0.1％或泡敵0.05％，用NaOH或HCl調(diào)PH值7-7.5左右，裝置為罐容積的70％。
2、發(fā)酵培養(yǎng)條件攪拌速度180-200轉(zhuǎn)/min，罐壓0.05MPa；通氣量移種后4h內(nèi)通氣量有1∶0.7-0.8(每分鐘進(jìn)出體積之比)，以后逐淅增大至1∶1。一般發(fā)酵培養(yǎng)周期為12-18小時，在芽孢70％形成，個別芽孢開始脫落時，即可放罐。
七、放罐指標(biāo)芽孢含量＞70％②雜菌污染＜0.3％③含菌量＞30億個菌體/ml。
八、后處理操作規(guī)程
1、儀器設(shè)備攪拌機、板框、干燥機(裝置)、超細(xì)度粉碎機等。
2、吸附劑一般采用的粒度為0.09mm的輕質(zhì)碳酸鈣為吸附填加劑，加入量
按下列公式計算
3、壓濾按2規(guī)定加入吸附劑后，機械攪拌3-6h，使菌體和芽孢全部被吸附，然后再用板框壓濾。
4、干燥將板框壓濾后的濾餅搗碎后，置于烘干機或烘干裝置內(nèi)進(jìn)行烘干，烘干溫度不超過65℃，要不斷翻動，使受熱均勻。當(dāng)含水率≤5％時，即可進(jìn)行粉碎、包裝。
5、粉碎利用高細(xì)度粉碎機粉碎，100％通過0.09mm孔徑篩。
九、成品檢驗
檢驗標(biāo)準(zhǔn)。具體方法見粉劑標(biāo)準(zhǔn)；含水率用干燥失重法(重量法)測定，含水率≤5％為合格，細(xì)度采用濕篩法測定，100％通過0.09mm篩為合格，具體方法按HG2-896標(biāo)準(zhǔn)的濕篩法測定。
用上述方法制得的產(chǎn)品即為本發(fā)明的臍橙專用SOD制劑實施例2 用本發(fā)明的臍橙專用SOD制劑生產(chǎn)SOD臍橙
生產(chǎn)地點中國重慶市奉節(jié)縣
1.春季樹盤基施每棵樹施用20克臍橙專用SOD制劑，將SOD制劑均勻撒在樹盤內(nèi)，然后用耙使SOD制劑與樹盤內(nèi)的土充分混勻。時間在2月下旬到3月上旬。
2.樹冠噴霧從3月到9月，每月中旬噴一次SOD制劑1000倍液，每畝噴稀釋液50公斤；10月上旬和下旬各噴1次，11月上、中、下旬各噴1次，稀釋液濃度和用量同前。從3月到11月共噴12次SOD制劑。
表2 SOD臍橙的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
SOD的測定
SOD的測定方法采用NBT光化學(xué)法，具體如下
(1)設(shè)備752型分光光度計；臺式離心機；光照培養(yǎng)箱；冰箱；10ml小燒杯等。
(2)試劑氯化硝基氮藍(lán)四唑(NBT)——上海前進(jìn)制劑廠生產(chǎn)
L-甲硫氨酸(L-Met)——上?？颠_(dá)氨基酸廠生產(chǎn)
乙二胺四乙酸(EDTA)——北京化工廠生產(chǎn)
核黃素(VB2)——北京西中化工廠生產(chǎn)
(3)反應(yīng)液的配制
NBT反應(yīng)液的制備配制pH7.8，50mmol/L的磷酸緩沖液1000ml，加入1.933mg的L-Met，待完全溶解后，放入45.8mg NBT，0.47mg核黃素(配成0.47mg/ml溶液，吸取1ml加入)和29.0mgEDTA，溶液終濃度Met為13mmol/L；NBT為6.3×10-3mmol/L；核黃素為1.3×10-3mmol/L；EDTA為0.1mmol/L，置于棕色試劑瓶中，用黑布罩遮光，于4℃冰箱中可保存1個月。
(4)材料的預(yù)處理
臍橙果肉用研缽研碎，按照果肉50mM磷酸緩沖液＝1∶2的比例加入緩沖液，10000rpm離心10分鐘，取上清液進(jìn)行SOD酶活測定。
(5)測定方法
吸取30μl樣品，放入10ml透明玻璃小燒杯中，加入3mlNBT反應(yīng)液，混勻，在28℃SOD光化反應(yīng)室中，2×15W日光燈光照20分鐘(光照為4000勒克司)，在560nm處測定吸光度，以NBT反應(yīng)液作空白對照，每組設(shè)3次重復(fù)，整個測定過程除光化反應(yīng)外，均在避光或弱光條件下進(jìn)行。同時測試過程中以美國″Sigma″公司、上海寶安公司的標(biāo)準(zhǔn)酶和貴州老來福藥業(yè)公司生產(chǎn)的SOD口服液作為測試對照。
(6)計算
式中CK——空白對照透光度
n——樣品稀釋倍數(shù)
A——樣品透光度
酶活單位IU/g
SOD臍橙中SOD酶活的測定
嚴(yán)格按照SOD臍橙的栽培生產(chǎn)過程，以僅用清水處理，不用SOD制劑處理為對照，其他栽培管理均一致。根據(jù)上述給出的SOD測定方法，測定SOD臍橙和對照臍橙的SOD酶活性(表3)。
由表3可知，SOD臍橙中SOD酶活顯著高于普通臍橙，且在a＝0.05水平差異顯著，酶活提高136.1％。說明通過該項技術(shù)可以生產(chǎn)出具有高含SOD酶活的SOD保健臍橙。
表3 SOD臍橙的SOD活性測定
SOD臍橙中SOD的抗熱性測定
嚴(yán)格按照SOD臍橙的栽培生產(chǎn)過程，以僅用清水處理，不用SOD制劑處理為對照，其他栽培管理均一致。根據(jù)已給出的SOD測定方法，只是將所測試的樣品在100C中保持20分鐘，測定SOD臍橙和對照臍橙的SOD酶活性(表4)。
由表4可知，經(jīng)過熱處理后，SOD臍橙中仍保持較高的SOD酶活，但對照含有的SOD酶活極低。說明通過該項技術(shù)生產(chǎn)的SOD臍橙，適于在常溫下保存和進(jìn)行深加工，仍能保持較高的SOD活性。
表4SOD臍橙中SOD的抗熱性測定
權(quán)利要求
1、一種微生物，其特征在于保藏號為CGMCC NO.0760 CGMCCNO.0761。
2、一種臍橙專用SOD制劑，其特征在于該制劑含有權(quán)利要求1中所述的微生物。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的SOD制劑，其特征在于所述微生物含量為2.5×1010cfu/g-3.5×1010cfu/g。
4、一種應(yīng)用權(quán)利要求2所述的臍橙專用SOD制劑生產(chǎn)SOD臍橙的方法，其特征在于下述步驟
(1)樹盤基施臍橙專用SOD制劑，每棵結(jié)果臍橙施用15-25克
臍橙專用SOD制劑，將SOD制劑均勻撒在樹盤內(nèi)，然后
使用SOD制劑與樹盤內(nèi)的土充分混勻。
(2)樹冠噴霧臍橙專用SOD制劑，基施后的臍橙樹每月中旬，
收獲前二個月每10-15天樹冠噴霧臍橙專用SOD制劑，每
畝每次用量為40-60g，全生產(chǎn)過程中噴次為10-12次。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物及其應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種微生物及其用該微生物生產(chǎn)臍橙專用SOD制劑的方法，本發(fā)明還提供了一種利用臍橙專用SOD制劑生產(chǎn)SOD臍橙的方法。試驗證明，利用本發(fā)明可開發(fā)出產(chǎn)量高、品質(zhì)好、SOD酶含量高的臍橙。
文檔編號C12N1/20GK1396257SQ02124269
公開日2003年2月12日 申請日期2002年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月15日
發(fā)明者王 琦, 李維寧, 宋慶生 申請人:北京金綠維科技發(fā)展有限公司