專利名稱：特效菌劑的制備與處理化工廢水或常規(guī)有機(jī)廢水的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備特效微生物菌劑的生物技術(shù)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
國際上已有多種處理廢水特效菌劑，但是沒有制備與應(yīng)用原生質(zhì)體融合菌劑處理廢水的專利。典型的如日本的EM，又如美國PARADISF公司的高智能微生物制劑HIMP(High-Intelligence Microorganism Preparation)，1升/24元。由于成本和售價(jià)太高，國內(nèi)廠家一般不用進(jìn)口的處理廢水特效菌劑，而國內(nèi)這方面產(chǎn)品目前仍是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種制備與應(yīng)用NJU-Fhhh1特效菌劑高效處理廢水的方法。尤其是應(yīng)用本發(fā)明構(gòu)建的原創(chuàng)性的基因工程特效菌NJU-Fhhh1為出發(fā)菌株，制備NJU-Fhhh1特效菌劑，具有白腐真菌的高降解性、土著細(xì)菌YZ1的高適應(yīng)性、釀酒酵母的高絮凝性，利于高效處理有機(jī)廢水。本發(fā)明目的還在于本特效菌劑，成本低，可供國內(nèi)廠家廣為使用，并配套相關(guān)的應(yīng)用技術(shù)，在國內(nèi)有持久性。
本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)將原創(chuàng)性特效菌，發(fā)酵制備成處理廢水的特效菌劑。
(1).技術(shù)構(gòu)思以本課題構(gòu)建的原創(chuàng)性的基因工程特效菌NJU-Fhhh1為出發(fā)菌株，制備處理廢水的NJU-Fhhh1特效菌劑，具有白腐真菌的高降解性、土著細(xì)菌YZ1的高適應(yīng)性、釀酒酵母的高絮凝性，利于高效處理有機(jī)廢水。在國內(nèi)生產(chǎn)NJU-Fhhh1特效菌劑，成本僅為進(jìn)口的1/4左右，國內(nèi)的廠家用得起。配套相關(guān)的應(yīng)用技術(shù)，在國內(nèi)有持久性。
(2).技術(shù)構(gòu)成出發(fā)菌株NJU-Fhhh1特效菌是本課題組的原創(chuàng)性科研成果。NJU-Fhhh1特效菌由白腐真菌(親株1)、土著細(xì)菌YZ1(親株2)、釀酒酵母(親株3)三個(gè)親株菌體的原生質(zhì)體融合，通過基因在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的重組整合，構(gòu)建獲得的基因工程菌。NJU-Fhhh1特效菌集中了三個(gè)親株的高降解性、高適應(yīng)性、高絮凝性的三高優(yōu)勢，利于高效處理有機(jī)廢水。國際公認(rèn)原生質(zhì)體融合構(gòu)建的新菌株，不存在基因污染問題，所以NJU-Fhhh1特效菌劑也不存在基因污染問題。
NJU-Fhhh1特效菌由親株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)、親株2土著細(xì)菌YZ1(Pseudomonas)、親株3釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)原生質(zhì)體融合而成。先經(jīng)原生質(zhì)體制備用蝸牛酶脫去真菌的細(xì)胞壁或用溶菌酶脫去細(xì)菌的細(xì)胞壁、生成原生質(zhì)體并經(jīng)離心收集原生質(zhì)體、緩沖液清洗后獲得，然后進(jìn)行二次融合，第一次融合等量的親株1白腐真菌細(xì)胞和親株2土著細(xì)菌YZ1細(xì)胞的原生質(zhì)體混合、并在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配制的誘導(dǎo)液中融合，經(jīng)離心后收集融合產(chǎn)物、高滲緩沖液離心清洗后分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上、30℃培養(yǎng)7天，同時(shí)能在三種培養(yǎng)基上長出的菌落，為第一次雙親跨界融合的產(chǎn)物Fhh；而親株1白腐真菌細(xì)胞和親株2土著細(xì)菌YZ1細(xì)胞，只能分別在SIM1和SIM2上生長；第二次融合上次得到的等量的Fhh和親株3釀酒酵母細(xì)胞的原生質(zhì)體混合、在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的誘導(dǎo)液中融合，經(jīng)離心后收集融合產(chǎn)物、含蔗糖高滲緩沖液離心清洗后、分別涂布于SIM1、SIM2、SIM3三種固體鑒別培養(yǎng)基上，同時(shí)能在SIM1、SIM2、SIM3三種培養(yǎng)基上長出的菌落為三親跨界融合的產(chǎn)物NJU-Fhhh1或Fhh。
SIM1＝SM+100u鏈霉素/ml(streptomycin，Sm)；SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)；SIM3＝SM+100u鏈霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)。
制備NJU-Fhhh1特效菌劑的液體培養(yǎng)基1000ml中K2HPO43g；KH2PO41g；NH4NO30.5g；Na2SO40.1g；MgSO4·7H2O 10mg；MnSO4·4H2O 1mg；CaCl20.5mg；FeSO4·7H2O 1mg；CH3COONa 5g；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；葡萄糖10g；200g馬鈴薯浸出汁，調(diào)pH至7.0；121℃、103kPa、濕熱滅菌20min。最適培養(yǎng)溫度35℃；最適pH7.0。
制備NJU-Fhhh1特效菌劑的發(fā)酵工藝發(fā)酵設(shè)備全自控生物反應(yīng)器；發(fā)酵工藝連續(xù)穩(wěn)定發(fā)酵系統(tǒng)；發(fā)酵溫度，33±2℃；pH值，7.0±1；反應(yīng)器中溶解氧，≥2mg/L；，礦物鹽流量，0.001-0.005V/(V.d)；菌體濃度，2-10g/L；在含C、P、N培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
表1.NJU-Fhhh1特效菌劑發(fā)酵工藝參數(shù)工藝參數(shù) 數(shù)值 工藝參數(shù) 數(shù)值T，發(fā)酵溫度，℃ 33±2 Sp，培養(yǎng)液P源濃度，gTP/L 0.10P，罐壓，(1大氣壓＝1055×105＜ Sf，C/N/P培養(yǎng)液流0.33Pa)，Pa 量，V/(V.d)Fa，清潔空氣供氣量， 75≤ Mr，礦物鹽流量，V/(V.d) 0.003m3/kgCODRr，攪拌轉(zhuǎn)速，rpm 1000 X，菌體濃度，g/L 4.99PH7.0±1 HRT，反應(yīng)液發(fā)酵時(shí)間，h 8DO，反應(yīng)器中溶解氧，mg/L ≥2Fr，加硅油消泡劑流速 Sf＜Va，反應(yīng)液裝量，％80≤ μ，比增長率，mg/mgL h-10.1 27So，培養(yǎng)液C源濃度，gCOD/L 8.48 q，培養(yǎng)液比利用率，h-10.211Sn，培養(yǎng)液N源濃度，gTN/L 0.50 Yo，菌體產(chǎn)量率系數(shù)，％ 59發(fā)明的有益效果(1)NJU-Fhhh1特效菌劑的生產(chǎn)成本低，僅為500元/噸左右，售價(jià)可以遠(yuǎn)低于進(jìn)口的菌劑；(2)NJU-Fhhh1特效菌劑具有三親株的三高優(yōu)勢；提高處理效率和節(jié)約費(fèi)用25％以上；(3)NJU-Fhhh1特效菌劑既可處理有毒有機(jī)廢水，也可處理常規(guī)有機(jī)廢水；(4)NJU-Fhhh1特效菌劑應(yīng)用原生質(zhì)體融合工程菌，不產(chǎn)生新基因，沒有基因污染問題。
總之，本發(fā)明菌劑比土著菌提高降解廢水效率和節(jié)約運(yùn)行費(fèi)用25％以上。本發(fā)明是應(yīng)用原生質(zhì)體融合的原創(chuàng)性特效菌，是制備處理廢水特效菌劑的首例。尤其是應(yīng)用具有國際原創(chuàng)性的特效菌，制備的特效菌劑在成本和售價(jià)上具有國內(nèi)推廣的優(yōu)勢。降解精對苯二甲酸(PTA)石化廢水等有機(jī)廢水具有高降解、高絮凝、高適應(yīng)優(yōu)勢。
四

圖1為本發(fā)明親株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)電子顯微鏡照片圖2為本發(fā)明親株2土著細(xì)菌YZ1(Pseudomonas)，電子顯微鏡照片圖3為本發(fā)明親株3釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)電子顯微鏡照片圖4為本發(fā)明三株融合后得到的NJU-Fhhh1菌株電子顯微鏡照片圖五具體實(shí)施方式
NJU-Fhhh1特效菌劑制備技術(shù)的發(fā)酵工藝流程實(shí)例名稱NJU-Fhhh1特效菌劑制備及其降解精對苯二甲酸PTA石化廢水(1)應(yīng)用NJU-Fhhh1特效菌株制備NJU-Fhhh1特效菌劑的條件控制制備菌劑的生物反應(yīng)器德國產(chǎn)B.Braun全自控生物反應(yīng)器，有效容積1L；自控參數(shù)設(shè)定DO(溶解氧)＝2mg/L；pH＝7.0；T＝35℃；Sf(液體培養(yǎng)基流量)＝0.33(V/V)；攪拌轉(zhuǎn)速1000rpm；除泡沫硅油；液面達(dá)1L有效容積；礦物鹽流量0.003(V/V)；液體培養(yǎng)基同于上述液體培養(yǎng)基(2)NJU-Fhhh1特效菌劑制備物的參數(shù)測定NJU-Fhhh1特效菌體生物量濃度X4.99g/L；比增長率μ0.127h-1；培養(yǎng)基的比利用率q0.211h-1；產(chǎn)率系數(shù)Yo59.84％；制備液中底物剩余濃度Se0.15g(COD)/L.
(3)NJU-Fhhh1特效菌劑制備物的保存配方(4℃)配方1NJU-Fhhh1特效菌劑發(fā)酵液，不加任何其它成份；配方2NJU-Fhhh1特效菌劑發(fā)酵液+抗氧化劑巰基乙醇(SH)；(終濃度0.2‰)；配方3NJU-Fhhh1特效菌劑發(fā)酵液+Fe3+，(終濃度0.14％)；配方4NJU-Fhhh1特效菌劑發(fā)酵液+Fe3++巰基乙醇(SH)；(終濃度0.2‰)；(4)最佳保存配方的NJU-Fhhh1特效菌劑降解精對苯二甲酸PTA石化廢水參數(shù)經(jīng)過2002/5/11-2002/7/21的70天(4℃)的保存，測定配方2NJU-Fhhh1特效菌劑原發(fā)酵液體產(chǎn)物+抗氧化劑巰基乙醇(SH)為最佳配方。降解精對苯二甲酸PTA石化廢水參數(shù)為NJU-Fhhh1特效菌體最大比增長率μmax，為0.067h-1；最大比降解率qmax，為0.226h-1；產(chǎn)率系數(shù)Y為29.64％；自身衰減系數(shù)為0.0026h-1。
(5)NJU-Fhhh1特效菌劑制備實(shí)例總結(jié)制備特效菌劑的發(fā)酵工藝控制條件是DO(溶解氧)＝2mg/L；pH＝7.0；T＝35℃；Sf(液體培養(yǎng)基流量)＝0.33(V/V)；攪拌轉(zhuǎn)速1000rpm；硅油除泡沫；礦物鹽流量0.003(V/V)；保存NJU-Fhhh1特效菌劑的最佳條件是4℃保存，特效菌發(fā)酵液+巰基乙醇(SH)；NJU-Fhhh1特效菌劑解精對苯二甲酸石化廢水參數(shù)μmax＝0.067h-1；最大比降解率qmax＝0.226h-1；產(chǎn)率系數(shù)Y為29.64％；自身衰減系數(shù)為0.0026h-1。NJU-Fhhh1特效菌劑具有高降解、高絮凝、高適應(yīng)優(yōu)勢；提高效率節(jié)約費(fèi)用25％以上。
Fhhh1特效菌劑處理廢水實(shí)例的應(yīng)用研究結(jié)果廢水種類 PTA廢水 剝絨廢水 汰頭廢水時(shí)間地點(diǎn) 2002南京 2002張家港 2001金湖工藝活性污泥法活性污泥法活性污泥法原廢水COD，kg/m34.3441.030 9.45原廢水BOD，kg/m32.8280.4777 8.18原廢水SS，kg/m30.1030.035 21.69原廢水pH 4.9 ＞14 12原廢水流量，m3/d10,000 9608廢水反應(yīng)溫度，℃ 35 35 35Yobs，％ 0.1976 0.4638 0.6687Qmax，d-10.2261.078 22.46Ksq，kg/m30.01 0.12.70μmax，d-10.0670.615.02Ksμ，kg/m30.02 0.02 2.7Yt，％ 0.2046 0.5566 0.6688Kd，d-10.0020.0455 0.0001q，d-10.113 0.40000.1651μ，d-10.02230.86240.1104出水COD，mg/L 0.01 0.04 0.02出水SS，mg/L0.00050.08180.067出水pH 7.0 7.0 7.0Qr，m3/d 10000 908Xr，m3/d 0.57 0.76 5.35Θc，d 44.78 2.5 9.05HRT，d 0.04 1.34 0.11X，kg/m30.28550.13992.708土著菌所需體積V，m32293 1900 156Fhhh所需體積V，m31624 1524 19.4Fhhh節(jié)約建設(shè)投資，％29.18 19.79 87.56本發(fā)明的微生物保藏資料2002年7月26日保減，保藏編號是CGMCCNo.0783三親株跨界融合特效菌是白腐真菌(phanerochaete chrysoporium)釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、土著細(xì)菌(YZ1)三者原生質(zhì)體融合產(chǎn)物。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址北京海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號中國科學(xué)院微生物研究所。
權(quán)利要求
1.一種特效菌劑的制備方法，其特征是由白腐真菌(親株1)、土著細(xì)菌YZ1(親株2)、釀酒酵母(親株3)三個(gè)親株菌體的原生質(zhì)體融合，通過基因在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的重組整合，構(gòu)建獲得的基因工程菌。其發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度，33±2℃；pH值，7.0±1；反應(yīng)器中溶解氧，≥2mg/L；礦物鹽流量，0.001-0.005V/(V.d)；菌體濃度，2-10g/L；在含C、P、N培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
2.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑的制備方法，其特征是所述礦物鹽包括Na2SO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O。
3.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑的制備方法，其特征是制備NJU-Fhhh1特效菌劑的液體培養(yǎng)基的組成是1000ml中K2HPO43g；KH2PO41g；NH4NO30.5g；Na2SO40.1g；MgSO4·7H2O 10mg；MnSO4·4H2O 1mg；CaCl20.5mg；FeSO4·7H2O 1mg；CH3COONa 5g；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；葡萄糖10g；200g馬鈴薯浸出汁，調(diào)pH至7.0；121℃、103kPa、濕熱滅菌20min。
4.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑的制備方法，其特征是最適培養(yǎng)溫度35℃；最適pH7.0。
5.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑的制備方法，其特征是NJU-Fhhh1特效菌劑制備物的保存配方，在抗氧化劑巰基乙醇(SH)；(終濃度0.1-0.3‰)；
6.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑的制備方法，其特征是NJU-Fhhh1特效菌劑制備物的保存配方，原發(fā)酵液體產(chǎn)物+Fe3+，(終濃度0.14％)。
7.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑的制備方法，其特征是NJU-Fhhh1特效菌劑制備物的保存配方，原發(fā)酵液體產(chǎn)物+Fe3++抗氧化劑巰基乙醇(SH)。
8.由權(quán)利要求1所述的特效菌劑處理化工廢水或常規(guī)有機(jī)廢水的的方法，其特征是用于降解精對苯二甲酸石化廢水、剝絨廢水、汰頭廢水。
全文摘要
一種特效菌劑的制備方法，由白腐真菌(親株1)、土著細(xì)菌YZ1(親株2)、釀酒酵母(親株3)三個(gè)親株菌體的原生質(zhì)體融合，通過基因在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的重組整合，構(gòu)建獲得的基因工程菌。其發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度，33±2℃；pH值，7.0±1；反應(yīng)器中溶解氧，≥2mg/L；礦物鹽流量，0.001－0.005V/(V.d)；菌體濃度，2－10g/L；在含C、P、N培養(yǎng)液中培養(yǎng)。NJU－Fhhh1特效菌劑生降解精對苯二甲酸石化廢水的最大比降解率q
文檔編號C12N15/08GK1405306SQ0213817
公開日2003年3月26日 申請日期2002年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月26日
發(fā)明者程樹培, 嚴(yán)俊, 石磊, 張徐祥, 郝春博, 闕子龍, 陳俊, 顧繼東, 李維新, 黃秋明, 于紅霞 申請人:南京大學(xué)