專利名稱：攜帶抗血管和抗內(nèi)皮細(xì)胞因子融合基因的重組皰疹病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其是指一種攜帶抗血管和抗內(nèi)皮細(xì)胞因子融合基因的重組皰疹病毒。
背景技術(shù)：
單純皰疹一型病毒，簡(jiǎn)稱HSV-1，可以感染許多不同類型的人和動(dòng)物細(xì)胞，包括上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。野生型病毒在體內(nèi)感染非神經(jīng)細(xì)胞后通常在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制并造成細(xì)胞裂解，而在它感染神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，則通常僅有限的復(fù)制或不復(fù)制而很快進(jìn)入潛伏期。由于HSV-1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷在通常情況下要小于非神經(jīng)細(xì)胞，早在60年代就有人試圖用它來(lái)治療惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤。由于野生型HSV-1畢竟毒性較大，該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)未能實(shí)施下去。
到了1991年，國(guó)外首次用缺失tk基因的重組HSV-1病毒tk(-)HSV-1在免疫缺陷動(dòng)物裸鼠的腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤模型上證明，tk(-)HSV-1病毒可以選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞而不造成嚴(yán)重的腦神經(jīng)組織損害，由于tk(-)HSV-1病毒裂解腫瘤的能力有限，不能在瘤體上產(chǎn)生生物擴(kuò)散效應(yīng)，影響了臨床的治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于尋求一種攜帶抗血管和抗內(nèi)皮細(xì)胞因子融合基因的重組皰疹病毒，由于在這種HSV-1病毒中部分地去除了有害的ICP6基因，插入了人的Endostatin和Angiostatin的融合基因，使這種病毒可有效地用來(lái)治療惡性膠質(zhì)瘤腫瘤。
其主要技術(shù)方案是原病毒為HSV-1病毒，其結(jié)構(gòu)包含一個(gè)長(zhǎng)非重復(fù)區(qū)(UL)和一個(gè)短非重復(fù)區(qū)(US)，這兩個(gè)非重復(fù)區(qū)的兩端各有一對(duì)重復(fù)區(qū)(ab-a’b’和c-c’)，本發(fā)明的特征是將位于長(zhǎng)非重復(fù)區(qū)內(nèi)的ICP6基因部分地去除后，再插入人的Endostatin和Angiostatin的融合基因。
位于重復(fù)區(qū)內(nèi)的ICP34.5基因的兩個(gè)拷貝均被部分地去除；位于重復(fù)區(qū)內(nèi)的兩個(gè)ICP4基因拷貝屬溫度敏感型基因，在攝氏39度時(shí)失去活性。
原有的HSV-1用于腫瘤的基因治療具有下列優(yōu)點(diǎn)，其中有些是其它的病毒載體所沒(méi)有的。
HSV-1的基因組較大，并有許多空問(wèn)用于插入外源基因用于治療，據(jù)估計(jì)，HSV-1可插入至少30kb的外源基因不會(huì)影響病毒的組裝，目前還沒(méi)有一個(gè)其它病毒有如此大的裝載能力。
HSV-1具有很好的遺傳穩(wěn)定性，大多數(shù)重組HSV-1病毒在多次感染動(dòng)物，再在體外大量繁殖之后，仍然保持其原來(lái)的遺傳及表象特征，而其它有些病毒，尤其是RNA病毒容易產(chǎn)生遺傳變異，從而影響其安全性。
HSV-1具有很強(qiáng)的感染力，并有廣泛的細(xì)胞宿主，HSV-1的感染能力可與腺病毒相當(dāng)，比逆轉(zhuǎn)錄病毒要強(qiáng)幾乎一千倍以上，HSV-1可以感染從神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞到淋巴細(xì)胞等許多細(xì)胞種類。
HSV-1感染細(xì)胞后，并不將其基因組整合進(jìn)宿主細(xì)胞的染色體，因此不具有造成宿主細(xì)胞遺傳突變的可能。在這個(gè)意義上，它比逆轉(zhuǎn)錄病毒安全。
我們對(duì)HSV-1感染人類后的病理學(xué)已有較深入地了解，并有不少相應(yīng)的動(dòng)物模型可供進(jìn)一步研究，比較其它新的被建議用來(lái)基因治療的病毒，如Reovirs，我們對(duì)HSV-1的了解要成熟得多，因此臨床使用也比較安全。
針對(duì)HSV-1感染的特效藥Acyclovir(ACV)or Ganciclovir(GCV)已在臨床使用多年，并對(duì)皰疹性腦炎有顯著療效。由于近來(lái)發(fā)展的HSV-1重組病毒多為tk(+)，在臨床基因治療時(shí)萬(wàn)一失控，上述藥物仍可用來(lái)抑制病毒生長(zhǎng)，從而提供了進(jìn)一步的安全防護(hù)。
重組HSV-1獨(dú)特的腫瘤裂解型特性是大部分其它病毒所不具備的，即使是新一代的腺病毒雖能有條件復(fù)制也適合部分腫瘤細(xì)胞，如P53缺陷，而HSV-1只要細(xì)胞分裂活躍，就能復(fù)制。由于病毒在腫瘤中復(fù)制的能力已被廣泛認(rèn)為是用病毒作為載體基因治療的關(guān)鍵，重組HSV-1的這一特點(diǎn)非常重要。
HSV-1的免疫刺激作用較弱，與腺病毒不同，HSV-1病毒具有掩蔽被感染的宿主細(xì)胞，使之不受機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊的能力，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)HSV-1腦內(nèi)感染所引起的免疫反應(yīng)十分有限。基于上述HSV-1病毒作為轉(zhuǎn)基因載體的潛在優(yōu)點(diǎn)，我們對(duì)目前已用于臨床的HSV-1重組病毒的設(shè)計(jì)作了改良，構(gòu)建了一種攜帶抗血管和抗內(nèi)皮細(xì)胞因子融合基因的重組皰疹病毒，我們稱之為VAE，制劑名為BRAINWEL，使之既保留了現(xiàn)有病毒的安全性，又增加了新的基因治療功能。
野生型HSV感染人體后首先侵入皮膚上皮細(xì)胞，并在感染部位進(jìn)行裂解性繁殖，同時(shí)，通過(guò)侵入感覺(jué)神經(jīng)末梢感染背根感覺(jué)神經(jīng)節(jié)的感覺(jué)神經(jīng)元。通常在感覺(jué)神經(jīng)元內(nèi)，HSV-1病毒很快進(jìn)入潛伏狀態(tài)，但在嚴(yán)重的情況下，病毒會(huì)處于裂解性繁殖，有可能會(huì)擴(kuò)散到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起病毒性腦炎。在設(shè)計(jì)治療性HSV-1載體時(shí)，必須使HSV-1的一些特性受到控制，以保證其臨床使用的安全性。作為第一個(gè)在國(guó)內(nèi)用于臨床的裂解型病毒，VAE的設(shè)計(jì)思想以臨床安全性為第一要求，在此基礎(chǔ)上追求其有效性。上述設(shè)計(jì)思想表現(xiàn)在VAE的主要生物學(xué)特性與較安全的G207相同，同時(shí)，針對(duì)惡性膠質(zhì)瘤腫瘤對(duì)血管增生的依賴性，VAE還插入了抗血管生成因子的融合基因，使之不但具有選擇性的裂解正增殖的腫瘤細(xì)胞的功能，還能阻斷供應(yīng)腫瘤血管的生成，從而比現(xiàn)有的任何臨床上正在試用的HSV-1重組病毒具有更好多預(yù)期療效。


圖1為HSV-1的基因結(jié)構(gòu)圖。
圖2為G207病毒基因結(jié)構(gòu)圖。
圖3為本發(fā)明所提供的VAE病毒基因結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式
VAE是由野生的HSV-1病毒F(見(jiàn)圖1)經(jīng)基因工程改造而來(lái)，該野生株病毒最早于1922年在紐約由感染了HSV-1病毒的病人身上分離獲得。VAE的遺傳特征為1、位于重復(fù)基因區(qū)內(nèi)的ICP34.5基因的兩個(gè)拷貝均已部分的去除而失去功能；2、位于長(zhǎng)非重復(fù)基因區(qū)內(nèi)的ICP6基因也被部分地去除，并插入了人的Endostatin(Cirri，Donnini et al.1999)和Angiostatin(O’Reilly，Holmgrenet al.1994；O’Reilly 1997)的融合基因(Endoangio)；3、位于重復(fù)取的兩個(gè)ICP4基因拷貝屬溫度敏感型，在攝氏39度時(shí)失去活性。上述特征除了ICP6基因區(qū)所攜帶的基因不同外，與G207相同，只是G207在ICP6基因區(qū)中所插入的是大腸桿菌的β-半乳糖苷酶。因此，VAE和G207基本相同，即都為ICP34.5和ICP6雙重缺失型HSV-1重組病毒見(jiàn)圖2、4，而VAE比之G207更多出一個(gè)表達(dá)EndoAngio融合蛋白酶的功能。
VAE的基本功能如下1、選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及細(xì)胞裂解功能。如上所述，由于在ICP34.5和ICP6雙基因缺失，VAE毒株喪失了在不分裂或緩慢分裂的細(xì)胞中高蕭復(fù)制的能力。由于體內(nèi)，尤其是腦內(nèi)組織中的正常細(xì)胞是不分裂或緩慢分裂的，而惟有惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞分裂旺盛。這一正常組織和腫瘤組織細(xì)胞在分裂狀態(tài)上的明顯區(qū)別，提供VAE病毒的腫瘤特異性復(fù)制的有利條件。病毒在細(xì)胞內(nèi)的大量復(fù)制必然導(dǎo)致細(xì)胞的裂解，從而達(dá)到殺死腫瘤的目的，VAE的上一選擇性地裂解腫瘤細(xì)胞的功能，使之與其它目前用于基因治療的病毒載體明顯不同。大部分其它常用的病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒是依靠病毒所攜帶的基因達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。由于這些基因是否有效在很大程度上有賴于除了基因本身之外的許多條件，例如，基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，細(xì)胞本身對(duì)該基因的毒性的敏感度，等等。所以這些病毒攜帶了外源性基因感染了腫瘤細(xì)胞，但并不一定能殺死該細(xì)胞。而VAE則既可以用其所攜帶的外源性基因達(dá)到治療的作用，也可以依靠其本身的細(xì)胞裂解功能直接殺死分裂旺盛的腫瘤細(xì)胞，從而具有雙重作用。
2、選擇性地在腫瘤內(nèi)有效擴(kuò)散的功能。VAE有選擇地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，除了達(dá)到裂解被感染的腫瘤細(xì)胞的目的外，在裂解細(xì)胞的同時(shí)釋放出復(fù)制后代第2代病毒，從而為病毒在腫瘤實(shí)體內(nèi)的有效擴(kuò)散提供了前提條件/雖然復(fù)制出的第2代病毒對(duì)正常組織細(xì)胞有同樣的感染力，但由于它在正常細(xì)胞內(nèi)無(wú)法高效地復(fù)制，所以其在正常組織內(nèi)的擴(kuò)散是很有限的。因此，VAE在體內(nèi)的擴(kuò)散具有高度的腫瘤選擇性。早先以及目前正在進(jìn)行的大量的基因治療實(shí)踐業(yè)已證明，選擇性地在腫瘤內(nèi)有效擴(kuò)散的功能，對(duì)于基因治療是至關(guān)重要的。這主要是因?yàn)楹推渌獏^(qū)不同，病毒本身不僅體積較大，一般直徑在100毫微米左右，而且表面布滿了帶有電荷的糖蛋白(Barker，Roizman et al.1992)。因此，病毒在組織內(nèi)的物理擴(kuò)散能力是很差的。早期的逆轉(zhuǎn)錄病毒由于當(dāng)時(shí)無(wú)法做到使之有選擇性地在腫瘤內(nèi)復(fù)制，在構(gòu)建病毒載體時(shí)只能將其復(fù)制功能去除。由于這類病毒失去了賴以生存的生物擴(kuò)散能力，注射入腫瘤實(shí)體內(nèi)后，只能依靠極其有限的物理擴(kuò)散，因而只能感染很少量的細(xì)胞，大大地局限了其治療功能，VAE的在腫瘤內(nèi)選擇性地?cái)U(kuò)散的能力無(wú)疑使之優(yōu)于目前所有的用于基因治療的其它病毒。
3、抗腫瘤功能。Martuza博士近幾年來(lái)的工作表明，基因改造后的HSV-1病毒如G207，在靜脈注射后，可對(duì)已形成的腦內(nèi)或腦外腫瘤產(chǎn)生抑制作用，其作用機(jī)理尚不明確(Toda，Rabkin et al.1999；Todo，Rabkin et al.1999)。但由于用病毒在一側(cè)皮下的腫瘤內(nèi)注射之后，體內(nèi)可檢測(cè)出腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)，并使另一側(cè)的未經(jīng)病毒注射腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制。據(jù)此，瘤內(nèi)注射的病毒在殺傷腫瘤的同時(shí)，可能又有刺激細(xì)胞免疫功能的作用。雖然對(duì)BRAINWEL的抗腫瘤免疫功能尚未進(jìn)行過(guò)檢測(cè)，但由于和G207結(jié)構(gòu)上的相似性，相信也應(yīng)有同樣的效果。
4、分泌抗血管生長(zhǎng)因子的功能。VAE病毒攜帶有人類Endostatin和Angiostatin的融合基因，在感染細(xì)胞之后可以生成該融合基因的融合蛋白，具有Endostatin和Angiostatin的雙重功能，Endostatin(Cirri，Donnini etal.1999)和Angiostatin(O’Reilly，Holmgrenet al.1994)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的機(jī)體自身生成的物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抑制血管生成的作用，從而造成腫瘤的凋亡，是近年來(lái)腫瘤治療方面被認(rèn)為最希望的方法之一(Bussolino，Mantovani et al.1997；O’Reilly 1997；Cao1999；Gasparini 1999；Hayes，Li et al.1999；Keshet and Ben-S asson 1999；Hagedom and Bikfalvi 2000)。由于這兩種蛋白分別是以不同的機(jī)制作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制血管生長(zhǎng)的，在人乳巢癌模型上證明，同時(shí)與這兩種蛋白產(chǎn)生協(xié)同作用(Yokoyama，Dhanabal et al.2000)，從而更有效地抑制血管在腫瘤內(nèi)的生成。
權(quán)利要求
1.攜帶抗血管和抗內(nèi)皮細(xì)胞因子融合基因的重組皰疹病毒，原病毒為HSV-1病毒，其結(jié)構(gòu)包含一個(gè)長(zhǎng)非重復(fù)區(qū)(UL)和一個(gè)短非重復(fù)區(qū)(US)，這兩個(gè)非重復(fù)區(qū)的兩端各有一對(duì)重復(fù)區(qū)(ab-a’b’和c-c’)，本發(fā)明的特征是將位于長(zhǎng)非重復(fù)區(qū)內(nèi)的ICP6基因被部分地去除后，再插入人的Endostatin和Angiostatin的融合基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其是指一種攜帶抗血管和抗內(nèi)皮細(xì)胞因子融合基因的重組皰疹病毒。其主要技術(shù)方案是原病毒為HSV－1病毒，其結(jié)構(gòu)包含一個(gè)長(zhǎng)非重復(fù)區(qū)(UL)和一個(gè)短非重復(fù)區(qū)(US)，這兩個(gè)非重復(fù)區(qū)的兩端各有一對(duì)重復(fù)區(qū)(ab－a’b’和c－c’)，本發(fā)明的特征是將位于長(zhǎng)非重復(fù)區(qū)內(nèi)的ICP6基因部分地去除后，再插入人的Endostatin和Angiostatin的融合基因。利用這種病毒可有效地用來(lái)治療惡性膠質(zhì)瘤腫瘤。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1397642SQ0213813
公開(kāi)日2003年2月19日 申請(qǐng)日期2002年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者瞿伯榮 申請(qǐng)人:無(wú)錫博生醫(yī)用生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司