專利名稱：序列號22的生物活性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的肽及其藥物組合物。
表A

相應(yīng)地，本發(fā)明的一個方面涉及基本上純化的肽，其具有SEQ IDNO1至SEQ ID NO30所示的序列。因此，本發(fā)明還涉及包含選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列的基本上純化的肽。本發(fā)明還涉及基本上由選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列組成的基本上純化的肽。在一具體實施方案中，本發(fā)明的肽可以調(diào)節(jié)，但不限于調(diào)節(jié)，如下一或多種作用免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；腎炎；癌癥的生長，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及體重。
本發(fā)明的另一方面涉及是具有SEQ ID NOs1-30的氨基酸序列的肽的功能衍生物的基本上純化的肽。因此，本發(fā)明還涉及包含一種氨基酸序列的基本上純化的肽，該氨基酸序列是選自SEQ IDNOs1-30的一種氨基酸序列的功能衍生物。本發(fā)明還涉及基本上由一種氨基酸序列組成的基本上純化的肽，該氨基酸序列是選自SEQID NOs1-30的一種氨基酸序列的功能衍生物。在一具體實施方案中，本發(fā)明的肽可以調(diào)節(jié)，但不限于調(diào)節(jié)，如下一或多種作用免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；腎炎；癌癥的生長，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及體重。
本發(fā)明的另一個方面涉及具有上述SEQ ID NO1至SEQ IDNO30之肽的編碼序列的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有如下SEQ IDNO1至SEQ ID NO30所示肽的核酸序列的表達(dá)載體。因此，本發(fā)明的這一方面還涉及一種包含編碼一種肽的核苷酸序列的遺傳載體，所述的肽包含選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列。本發(fā)明還涉及一種包含編碼一種肽的核苷酸序列的遺傳載體，所述的肽基本上由選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列組成。本發(fā)明還涉及一種包含編碼一種肽的核苷酸序列的遺傳載體，所述的肽包括選自SEQ ID NOs1-30的一種生物活性氨基酸序列的功能衍生物。本發(fā)明還涉及一種包含編碼一種肽的核苷酸序列的遺傳載體，所述的肽基本上由是選自SEQ ID NOs1-30的一種生物活性氨基酸序列的功能衍生物的功能氨基酸序列組成。
本發(fā)明的再一方面涉及含有與一種包含選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列的肽相鄰的前導(dǎo)或信號肽的雜合肽。本發(fā)明還涉及含有與一種肽相鄰的前導(dǎo)肽的雜合肽，該肽包括具有選自SEQ IDNOs1-30的一種氨基酸序列的肽的功能衍生物。
本發(fā)明還涉及一種包含編碼一種肽的核苷酸序列的遺傳載體，所述肽包含與一種包含一功能氨基酸序列的肽相鄰的前導(dǎo)氨基酸序列，所述功能氨基酸序列是選自SEQ ID NOs1-30的一種生物活性氨基酸序列的功能衍生物。本發(fā)明還涉及一種包含編碼一種肽的核苷酸序列的遺傳載體，所述肽包含與一種基本上由一功能氨基酸序列組成的肽相鄰的前導(dǎo)氨基酸序列，所述功能氨基酸序列是選自SEQID NOs1-30的一種生物活性氨基酸序列的功能衍生物。
在一具體的實施方案中，由上述任一種遺傳載體產(chǎn)生的肽可以調(diào)節(jié)，但不限于調(diào)節(jié)，如下一或多種作用免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；腎炎；癌癥的生長，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及體重。
本發(fā)明的再一方面涉及具有包含編碼一種肽的核苷酸序列的基因組的微生物，所述肽包含選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列。本發(fā)明還涉及具有包含編碼一種肽的核苷酸序列的基因組的微生物，所述肽基本上由選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列組成。
本發(fā)明的再一方面涉及具有包含編碼一種外源肽的核苷酸序列的遺傳物質(zhì)的微生物，所述外源肽包含一種是選自SEQ ID NOs1-30的一種生物活性氨基酸序列的功能衍生物的功能氨基酸序列。本發(fā)明還涉及具有包含編碼一種外源肽的核苷酸序列的遺傳組成的微生物，所述外源肽基本上由一種是選自SEQ ID NOs1-30的一種生物活性氨基酸序列的功能衍生物的功能氨基酸序列組成。本文所用的外源肽是指具有與天然未修飾形式的該微生物正常表達(dá)的任何其它肽不同的氨基酸序列的肽。
本發(fā)明的再一方面涉及具有包含編碼一種外源雜合肽的核苷酸序列的遺傳組成的微生物，所述外源雜合肽包含與一種肽相鄰的前導(dǎo)氨基酸序列，該肽包含選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列。本發(fā)明還涉及具有包含編碼一種雜合肽的核苷酸序列的基因組的微生物，所述雜合肽包含與一種基本上由選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列組成的肽相鄰的前導(dǎo)氨基酸序列。
本發(fā)明的再一方面涉及具有包含編碼一種外源雜合肽的核苷酸序列的遺傳組成的微生物，所述外源雜合肽包含與一種肽相鄰的前導(dǎo)氨基酸序列，該肽包含一種是選自SEQ ID NOs1-30的一種生物活性氨基酸序列的功能衍生物的功能氨基酸序列。本發(fā)明還涉及具有包含編碼一種外源雜合肽的核苷酸序列的遺傳組成的微生物，所述外源雜合肽包含與一種肽相鄰的前導(dǎo)氨基酸序列，所述肽基本上由一種是選自SEQ ID NOs1-30的一種生物活性氨基酸序列的功能衍生物的功能氨基酸序列組成。
在一具體的實施方案中，由上述任一種微生物產(chǎn)生的肽可以調(diào)節(jié)，但不限于調(diào)節(jié)，如下一或多種作用免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；腎炎；癌癥的生長，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及體重。
本發(fā)明的另一個方面涉及包含一種基本上純化的肽的藥物組合物，所述基本上純化的肽包含選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列。本發(fā)明還涉及包含一種基本上純化的肽的藥物組合物，所述肽基本上由選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列組成。
本發(fā)明的另一個方面涉及包含一種基本上純化的肽的藥物組合物，所述基本上純化的肽包含選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列的功能衍生物。本發(fā)明還涉及包含一種基本上純化的肽的藥物組合物，所述肽基本上由選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列的功能衍生物組成。本發(fā)明還涉及基本上由一種基本上純化的肽組成的藥物組合物，所述肽基本上由選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列的功能衍生物組成。
在一具體的實施方案中，上述任一種藥物組合物中存在的肽可以調(diào)節(jié)，但不限于調(diào)節(jié)，如下一或多種作用免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；腎炎；癌癥的生長，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及體重。
本發(fā)明的另一方面涉及制備藥物組合物的方法，包括提供一種包含選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列的基本上純化的肽，并將所述基本上純化的肽與一種藥物可接受載體混合。本發(fā)明還涉及制備藥物組合物的方法，包括提供基本上由SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列組成的基本上純化的肽。
本發(fā)明的另一方面涉及制備藥物組合物的方法，包括提供一種基本上純化的肽，并將所述基本上純化的肽與一種藥物可接受載體混合，所述基本上純化的肽包含一種是選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列的功能衍生物的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及制備藥物組合物的方法，包括提供一種基本上純化的肽，所述肽基本上由是選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列的功能衍生物的一種氨基酸序列組成。在上述任一種方法中，所述的肽可以調(diào)節(jié)，但不限于調(diào)節(jié)，如下一或多種作用免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；腎炎；癌癥的生長，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及體重。
本發(fā)明的另一個方面涉及人的治療方法，包括給予人藥學(xué)上有效量的包含選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列的基本上純化的肽。本發(fā)明還涉及人的治療方法，包括給予人藥學(xué)上有效量的基本上純化的肽，所述肽包含是選自SEQ ID NOs1-30的一種氨基酸序列的功能衍生物的氨基酸序列。。
在一具體的實施方案中，用于治療人的肽可以調(diào)節(jié)，但不限于調(diào)節(jié)，如下一或多種作用免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；腎炎；癌癥的生長，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及體重。
從上述任一種核酸序列表達(dá)的肽和/或雜合肽可以調(diào)節(jié)，但不限于調(diào)節(jié)，如下一或多種作用免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；腎炎；癌癥的生長，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及體重。
本發(fā)明的另一方面涉及治療疾病的方法，包括給予藥物學(xué)有效量的具有SEQ ID NO1至SEQ ID NO30的序列的基本上純化的肽。在一具體實施方案中，如此給予的肽可以調(diào)節(jié)，但不限于調(diào)節(jié)，如下一或多種作用免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；腎炎；癌癥的生長，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及體重。
如上所述，本發(fā)明的另一實施方案是基本上由本發(fā)明的肽組成的肽或多肽。本文所用術(shù)語“基本上由…組成”是指這樣的一種肽或多肽，其包括本發(fā)明的肽的氨基酸序列和羧基末端和/或氨基末端的額外氨基酸并保持本文提供的本發(fā)明的肽的活性。因此，作為一非限制性例子，當(dāng)本發(fā)明的肽的活性是能調(diào)節(jié)免疫活性時，“基本上由”本發(fā)明的肽“組成”的肽或多肽將具有本文提供的與該肽有關(guān)的調(diào)節(jié)免疫活性的活性，并且不具有實質(zhì)上降低肽或多肽的調(diào)節(jié)免疫活性的能力或者構(gòu)成對該肽作為免疫活性調(diào)節(jié)劑這一基本新特征的實質(zhì)改變的任何特征。因此，在前述例子中，其主要活性不是調(diào)節(jié)免疫活性并且在其中的某處含有本發(fā)明的肽的氨基酸序列的全長天然存在的多肽不是“主要由”本發(fā)明的肽“組成”的肽或多肽。類似地，在前述例子中，其主要活性不是調(diào)節(jié)免疫活性但是在其中的某處包括本發(fā)明的肽的氨基酸序列的基因工程化肽或多肽不是“主要由”本發(fā)明的肽“組成”的肽或多肽。
除了上述舉例的免疫活性調(diào)節(jié)作用的例子外，前述定義也適用于本發(fā)明的所有多肽的各種活性。特別是，前述定義適用于具有下述詳細(xì)描述中所述的調(diào)節(jié)病毒感染程度、調(diào)節(jié)肝炎感染程度、調(diào)節(jié)腎炎程度、調(diào)節(jié)癌癥生長或調(diào)節(jié)體重等活性的本發(fā)明的肽。
通過使用本文提供的針對本發(fā)明具體肽的測定調(diào)節(jié)病毒感染程度、調(diào)節(jié)肝炎感染程度、調(diào)節(jié)腎炎程度、調(diào)節(jié)癌癥生長或調(diào)節(jié)體重等活性的分析來測定一種肽或多肽的活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地確定所述肽或多肽是否符合前述定義基本上由本發(fā)明的肽組成。
在優(yōu)選的實施方案中，術(shù)語“基本上由…組成”是指除了本發(fā)明的肽之外另外還有少于20個氨基酸殘基的肽或多肽。在更優(yōu)選的實施方案中，該術(shù)語是指除了本發(fā)明的肽之外另外還有少于15個氨基酸殘基的肽。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，該術(shù)語是指除了本發(fā)明的肽之外另外還有少于10個氨基酸殘基的肽。在另一優(yōu)選的實施方案中，該術(shù)語是指除了本發(fā)明的一個肽之外另外還有少于6個氨基酸殘基的肽或多肽。在另一優(yōu)選的實施方案中，該術(shù)語是指除了本發(fā)明的一個肽之外另外還有少于4個氨基酸殘基的肽或多肽。在最優(yōu)選的實施方案中，該術(shù)語是指除了本發(fā)明的一個肽之外另外還有少于2個氨基酸殘基的肽或多肽。
使用T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗、NK細(xì)胞胞毒活性的檢測、T淋巴細(xì)胞分泌IL-2和γ-IFN細(xì)胞因子活性測試檢測這些肽對特異細(xì)胞免疫功能的任何可能的作用。使用小鼠碳粒清除測試檢測這些肽對非特異性細(xì)胞免疫功能的任何可能作用。使用綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)溶血測試檢測這些肽對體液免疫功能的任何可能作用。使用免疫器官重量測試檢測這些肽在器官水平的任何可能作用。
本研究中，肽樣品選擇了4個任意濃度，相鄰濃度間差距為10倍，因此最高與最低濃度相差1000倍。同時以生理鹽水組作為陰性對照，以目前較公認(rèn)的免疫增強劑IL-2和IFN-γ組[10]作為陽性對照。另外，由于缺乏對劑量應(yīng)答關(guān)系的了解，而機(jī)體的免疫反應(yīng)又具有相當(dāng)?shù)膹?fù)雜性，因此無論在任何劑量組與陰性對照比較具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異均被認(rèn)為具有生物活性。
本研究所得結(jié)論如下1.肽CMS001、CMS002、CMS003、CMS007、CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS015、CMS019、CMS021、CMS029、CMS034能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。肽CMS014及CMS036能抑制T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。2.肽CMS001，CMS002，CMS003，CMS008，CMS009，CMS010，CMS011，CMS012，CMS013，CMS015，CMS016，CMS020，CMS021，CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036具有增強NK細(xì)胞殺傷活性的作用，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。肽CMS008及CMS012在適當(dāng)濃度，亦具有降低NK細(xì)胞殺傷活性的作用，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。3.肽CMS001、CMS003、CMS007、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS015、CMS020、CMS022、CMS034能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌自介素-2(IL-2)，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。4.肽CMS001、CMS003、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS013、CMS016、CMS021、CMS022、CMS028能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。5.肽CMS001、CMS002、CMS003、CMS007、CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS013、CMS014、CMS015、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS021、CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036能促進(jìn)在抗原攻擊時合成抗SRBC抗體，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。肽CMS002、CMS003、CMS009、CMS010、CMS011、CMS013、CMS014、CMS015、CMS018、CMS019、CMS020、CMS026、CMS028、CMS029、CMS030、CMS034、及CMS036在適當(dāng)濃度，亦能抑制在抗原攻擊時合成抗SRBC抗體，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。6.肽CMS003，CMS008，CMS009，CMS010，CMS011，CMS013，CMS016，CMS018，CMS019，CMS020，CMS022，CMS024，CMS027，CMS030，CMS035，CMS036能夠增強單核吞噬細(xì)胞的吞噬功能，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。7.肽CMS001、CMS002、CMS008、CMS010、CMS012、CMS013、CMS014、CMS015、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS021、CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036能夠增加胸腺的重量，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。8.肽CMS019、CMS020、CMS030能夠增加脾臟的重量，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。肽CMS001、CMS003、CMS007、CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS013、CMS014、CMS015、CMS021、CMS023、CMS024、CMS027、CMS029、及CMS036在適當(dāng)濃度能降低脾臟的重量，與生理鹽水組比較具有顯著性差異。
用于分析肽對小鼠的作用的材料與方法現(xiàn)描述如下材料1.實驗動物純系健康BALB/c小鼠，體重18-22g，雌雄各半，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。2.給藥方法重組鼠干擾素-γ(rmIFN-γ)組3×105IU/kg/天重組人白介素-2(rhIL-2)組3×105IU/kg/天生理鹽水組0.5ml/只/天CMS肽劑量I組500μg/kg/天CMS肽劑量II組50μg/kg/天CMS肽劑量III組5μg/kg/天CMS肽劑量IV組0.5μg/kg/天各組藥物均溶于0.5ml生理鹽水中，經(jīng)腹腔注射，每日一次，連續(xù)給藥15天。1. 主要藥品及試劑肽美國肽類公司重組鼠干擾素γ(rmIFN-γ)北京邦定生物技術(shù)有限公司重組人IL-2(rhIL-2)上海華新生物高技術(shù)有限公司RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清美國GIBCO公司四甲基偶氮唑鹽(MTT)、刀豆蛋白A(ConA)美國SIGMA公司淋巴細(xì)胞分離液中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所水泡性口膜炎病毒(VSV)、IFN-γ、IL-2標(biāo)準(zhǔn)品中國藥品生物制品樣品檢定所。HT-2細(xì)胞、L929細(xì)胞北京大學(xué)免疫學(xué)系WF Chen教授惠贈。方法1.肽對細(xì)胞免疫性的作用1.1脾細(xì)胞懸液的制備[1，2]BALB/c小鼠，隨機(jī)分為肽組、IFN-γ組、IL-2組、生理鹽水組，每組10只。于末次給藥后次日，將小鼠頸椎脫臼致死，無菌操作取脾，用注射針輕輕捻碎脾組織，使單個細(xì)胞通過100目不銹鋼網(wǎng)(孔徑150μm)進(jìn)入冷Hanks液中，將細(xì)胞懸液移至離心管中，200g離心10min后棄上清，加10倍體積的Tris-NH4Cl至細(xì)胞沉淀中，混勻后，室溫下靜置10min，150g離心10min，再用冷Hanks液洗滌細(xì)胞2～4次，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至所需濃度。1.2肽對T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化影響實驗[1，2]將1×106/ml脾細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100μl/孔，每份樣品設(shè)3個復(fù)孔。向分析孔中加入100μl/孔的100μg/ml ConA，，加100μl/孔的RPMI-1640作為對照。然后將96孔培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66hr，再將細(xì)胞培養(yǎng)板150g離心10min，取上清，-20℃保存，以備檢測細(xì)胞因子IL-2和IFN。
向去上清后的細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞沉淀中加1mg/ml MTT液50μl/孔，振蕩2min后，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4hr。再將細(xì)胞培養(yǎng)板150g，離心10min，棄上清。向細(xì)胞沉淀中加入40mM鹽酸-異丙醇120μl/孔，振蕩3min后，在ELISA-reader上測吸光度(OD值)，測定波長570nm，參考波長630nm。計算每個小鼠形成3個分析孔和3個對照孔。每個小鼠的刺激指數(shù)(SI)是通過首先計算3個復(fù)孔的平均OD值，然后將分析孔的值除以對照孔的值而獲得。1.3肽對NK細(xì)胞殺傷活性影響實驗[3，4]將小鼠的脾細(xì)胞按1.1中的方法制備成4×106/ml，將已達(dá)到對數(shù)生長期的YAC-1細(xì)胞制成1×105/ml。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入脾細(xì)胞100μl/孔和細(xì)胞培養(yǎng)基100μl/孔，作為效應(yīng)細(xì)胞孔；加YAC-1細(xì)胞100μl/孔和培養(yǎng)基100μl/孔，作為靶細(xì)胞孔；加YAC-1細(xì)胞100μl/孔和脾細(xì)胞100μl/孔，作為實驗孔。每份樣品均設(shè)3個復(fù)孔。將加好樣品的96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4hr。
將細(xì)胞培養(yǎng)板150g，離心10min，棄上清。加1mg/ml MTT液50μl/孔，振蕩2min后，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4hr。將細(xì)胞培養(yǎng)板150g，離心10min，棄上清。加入40mM鹽酸-異丙醇120μl/孔，振蕩3min后，在ELISA-reader上測吸光度(OD值)，測定波長570nm，參考波長630nm。計算每個小鼠有9個孔3個僅含脾細(xì)胞的對照，3個僅含靶細(xì)胞的對照，3個含有脾細(xì)胞和靶細(xì)胞的分析孔。每個小鼠的NK細(xì)胞活性指數(shù)通過首先得出每一組合的三個復(fù)孔的平均OD值，然后將這一平均OD值代入如下公式而獲得NK細(xì)胞活性指數(shù)＝[1-(脾細(xì)胞和靶細(xì)胞孔平均OD值-僅含脾細(xì)胞孔的平均OD值)÷(靶細(xì)胞孔平均OD值)]×100％1.4肽對T淋巴細(xì)胞分泌IL-2活性影響實驗[5]取已達(dá)對數(shù)生長期的HT-2細(xì)胞，150g離心10min，棄上清，冷Hanks液重懸并離心洗細(xì)胞三次，在RPMI-1640中重懸收集的HT-2細(xì)胞，37℃、5％CO2培養(yǎng)30min，再用RPMI-1640重懸并離心洗細(xì)胞兩次，用RPMI-1640配成2×105/ml濃度的細(xì)胞懸液。
將1.2中獲得的上清液用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，倍比稀釋成以下濃度100％、50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％。
用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基將rIL-2稀釋成以下濃度500IU/ml、250IU/ml、125IU/ml、62.5IU/ml、31.25IU/ml、15.5IU/ml。
在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按以下每一組合設(shè)置3個平行孔陰性對照孔100μlRPMI-1640+100μlHT-2細(xì)胞懸液rIL-2標(biāo)準(zhǔn)品孔100μlrIL-2溶液+100lHT-2細(xì)胞懸液分析孔100μl稀釋好的細(xì)胞上清液+100lHT-2細(xì)胞懸液將加好樣品的細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)68小時，150g離心15min，輕輕甩去上清，于各孔中加入用無酚紅RPMI-1640配制的0.5mg/ml MTT，100μl/孔，振蕩3～4min，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。150g離心15min，輕輕甩去上清，加鹽酸-異丙醇(1∶300v/v)，120μl/孔，振蕩混勻3～4min。酶標(biāo)儀上選擇檢測波長570nm，參考波長630nm測定OD值。計算取每-稀釋度的3個平行孔的平均OD，并在半對數(shù)紙上繪圖，濃度為X軸。獲得測試上清和rIL-2的50％OD飽和度時的濃度。樣品IL-2活性＝(樣品達(dá)50％最大反應(yīng)時的稀釋度÷rIL-2標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)50％最大反應(yīng)時的稀釋度)×rIL-2標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)50％最大反應(yīng)時的稀釋度(IU/ml)1.5肽對T淋巴細(xì)胞分泌IFN活性影響實驗[6]將1.2中獲得的上清液用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，倍比稀釋成以下濃度100％、50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％。
用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基將rIFN標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成以下濃度500IU/ml、250IU/ml、125IU/ml、62.5IU/ml、31.25IU/ml、15.5IU/ml。
用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，將已達(dá)對數(shù)生長期的L929靶細(xì)胞調(diào)整至2×105/ml，調(diào)整VSV病毒原液的攻擊強度為100TCID50。
在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按以下方法設(shè)置3個平行孔。
陰性對照孔150μlRPMI-1640+100μlL929細(xì)胞陽性對照孔100μlRPMI-1640+100μlL929細(xì)胞+50μLVSV病毒rIFN活性孔100μlrIFN標(biāo)準(zhǔn)品+100μlL929細(xì)胞+50μLVSV病毒分析孔100μl稀釋好的細(xì)胞上清液+100μlL929細(xì)胞+50μLVSV病毒將加好樣品的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24hr。于倒置顯微鏡下定期觀察陽性對照孔以證實細(xì)胞裂解，然后如上述1.4部分所述收集、洗滌并讀所有孔的OD。計算如1.4部分相同方式獲得在50％最大反應(yīng)時的濃度。如下計算樣品的IFN活性樣品IFN活性＝(樣品達(dá)50％最大反應(yīng)時的稀釋度÷rIFN標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)50％最大反應(yīng)時的稀釋度)×rIFN標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)50％最大反應(yīng)時的稀釋度(IU/ml)2.肽對抗體形成影響的實驗研究[7]
綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)如下制備無菌條件下自健康成年綿羊外頸靜脈取血，置于有玻璃珠的三角燒瓶中，搖動三分鐘，然后將血液與Alsever溶液(葡萄糖2.05g，氯化鈉0.4g，檸檬酸鈉0.8g，加蒸餾水至100ml)混勻，置4℃冰箱備用。臨用前樣品在130g離心5分鐘以收集SRBC。通過在生理鹽水中重懸并離心洗滌細(xì)胞2次，然后經(jīng)180g離心10分鐘收集細(xì)胞沉淀。按2％(v/v)以生理鹽水稀釋，即得所需的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)懸液。
將新鮮豚鼠血清按10∶1(v/v)加入離心壓積SRBC中，于4℃輕輕振蕩30min，制備補體。200g離心10min吸取上清液，用生理鹽水1∶10稀釋制備成所需補體工作溶液。
BALB/c小鼠，隨機(jī)分為肽組、IFN組、IL-2組、生理鹽水組，每組10只。按照1.1部分中描述的給藥方法給藥，在給藥后第12天，腹腔注射SRBC懸液0.2ml，進(jìn)行免疫。免疫4天后，摘除眼球取血，室溫下放置1h，使血清充分滲出。以200g離心10分鐘，取上層血清，用生理鹽水稀釋500倍。
在反應(yīng)試管內(nèi)先加已稀釋鼠血清樣品1ml，再加入SRBC懸液0.5ml，冰浴中冷卻試管，向每管內(nèi)加入補體工作溶液1ml。將試管移至37℃恒溫水浴中，保溫10min，隨即置入冰浴中終止反應(yīng)。以200g離心10min，取上清液供比色測定用。
測定樣品的吸光度值分別取上述上清液1ml置入試管中，加入Drabkin試劑(碳酸氫鈉1.0g，高鐵氰化鉀0.2g，氰化鉀0.05g，蒸餾水1000ml)3ml，充分搖勻，室溫放置10min后，于540nm波長下比色，記錄吸光度。計算測定SRBC溶血時的對照吸光度值取SRBC懸液0.25ml，加Drabkin試劑至4ml，搖勻，室溫放置10min，于540nm波長下比色，記錄吸光度值。
樣品血清指數(shù)＝(測試樣品OD540nm÷參照OD540nm)×5003.肽對單核吞噬細(xì)胞吞噬功能及免疫器官的重量影響的實驗研究[8，9]于末次給藥后次日(第16天)，每只鼠尾靜脈注射1∶5生理鹽水稀釋的印度墨汁0.1ml/kg體重。
分別于注射墨汁后1min和5min，采用經(jīng)肝素溶液預(yù)先濕潤過的采血吸管，從眶后靜脈叢取血20μl。將取出的血與2ml 0.1％Na2CO3溶液混合。測定OD680nm。按下列公式計算廓清指數(shù)K值K＝(lgA1-1gA2)÷(t2-t1)式中A1為1min OD680nm，A2為5min OD680nm，t2為5分鐘，t1為1分鐘于末次給藥后次日(第16天)，分離肝、脾和胸腺并用濾紙吸干，稱重。按下列公式計算吞噬指數(shù)α值α＝(3√K)(W÷WLS)其中W為體重，WLS為肝脾和重。
胸腺指數(shù)(％)＝(胸腺重量/體重)×100％，脾指數(shù)(％)＝(脾重量/體重)×100％結(jié)果由于所得結(jié)果原始數(shù)據(jù)數(shù)量較多，只記錄了最終統(tǒng)計結(jié)果，其中凡與生理鹽水組比較，無統(tǒng)計學(xué)差別的組均省略。1.肽對T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響以500μg/kg/天，CMS002、CMS007、CMS008、CMS009、CMS010、CMS012、CMS015、CMS019、CMS021、CMS029，能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS010、CMS015與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表1
表1組別 動物數(shù)X±SD(刺激指數(shù))CMS002 8 1.8±0.3*CMS007 9 1.6±0.1*CMS008 9 1.7±0.1*CMS009 101.7±0.2*CMS010 9 2.0±0.3*@^CMS012 9 1.6±0.2*CMS015 9 1.9±0.3*@^CMS019 9 1.8±0.3*CMS021 101.6±0.1*CMS029 9 1.7±0.3*IFN-γ101.6±0.2*IL-2 101.7±0.2*生理鹽水 101.3±0.1注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為50μg/kg/天時，CMS001、CMS002、CMS003，能夠刺激小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與生理鹽水組、IFN-γ組、IL-2組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義。CMS014及CMS036能夠抑制小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果詳見于表2
表2組別 動物數(shù) X±SD(刺激指數(shù))CMS00110 2.2±0.5*@^CMS00210 2.6±0.3*@^CMS00382.2±0.5*@^CMS01491.0±0.1*CMS03691.0±0.1*IFN-γ 91.7±0.2*IL-2 10 1.8±0.2*生理鹽水 10 1.3±0.1注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為5μg/kg/天時，CMS001、CMS003、CMS007、CMS034能夠刺激小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果詳見于表3表3組別動物數(shù)X±SD(刺激指數(shù))CMS001 101.7±0.2*CMS003 101.6±0.2*CMS007 8 1.7±0.1*CMS034 9 1.5±0.2*IFN-γ 101.6±0.2*IL-29 1.6±0.1*生理鹽水101.3±0.1注*與生理鹽水組比較，P＜0.05
當(dāng)給藥劑量為0.5μg/kg/天時，CMS008、CMS010、CMS011能夠刺激小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果詳見于表4表4組別動物數(shù) X±SD(刺激指數(shù))CMS008 10 1.7±0.3*CMS010 91.7±0.3*CMS011 10 1.6±0.4*IFN-γ 10 1.6±0.2*IL-210 1.6±0.1*生理鹽水10 1.3±0.1注*與生理鹽水組比較，P＜0.052.肽對NK細(xì)胞胞毒活性的作用當(dāng)CMS肽給藥劑量為500μg/kg/天時，CMS010、CMS013、CMS016、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036能夠增強NK細(xì)胞胞毒活性，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS010、CMS016、CMS030肽組與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表5
表5組別動物數(shù) X±SD(％)CMS010 991±4*@^CMS013 884±9*CMS016 991±7*@^CMS023 10 79±12*CMS024 10 89±8*CMS026 10 89±7*CMS027 10 88±8*CMS028 10 90±5*CMS029 10 87±4*CMS030 10 91±5*@^CMS032 10 87±5*CMS033 989±8*CMS034 11 85±9*CMS035 890±10*CMS036 10 88±7*IFN-γ 10 77±8*IL-210 77±8*生理鹽水863±9注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為50μg/kg/天，CMS001、CMS003、CMS015、CMS021、CMS026、CMS035能夠增強NK細(xì)胞胞毒活性，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。其中CMS021與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。CMS012能抑制NK細(xì)胞胞毒活性，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表6表6組別動物數(shù) X±SD(％)CMS001 10 85±10*CMS003 10 85±6*CMS012 9 40±9*CMS015 8 78±8*CMS021 8 88±12*@^CMS026 10 76±9*CMS035 10 72±9*IFN-γ 10 73±10*IL-210 74±8*生理鹽水10 56±8注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為5μg/kg/天，CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS020、CMS024、CMS034、CMS036能夠增強NK細(xì)胞胞毒活性，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS008、CMS009與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表7
表7組別動物數(shù) X±SD(％)CMS008 10 92±4*@^CMS009 8 92±6*@^CMS010 10 82±9*CMS011 10 76±10*CMS012 10 85±7*CMS020 9 91±6*CMS024 9 78±3*CMS034 8 90±5*CMS036 10 75±9*IFN-γ 10 80±8*IL-210 80±8*生理鹽水10 60±9注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為0.5μg/kg/天，CMS002、CMS011、CMS012、CMS022、CMS028、CMS035能夠增強NK細(xì)胞胞毒活性，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS008能夠抑制NK細(xì)胞胞毒活性，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表8
表8組別 動物數(shù) X±SD(％)CMS002 8 76±9*CMS008 10 46±12*CMS011 9 79±3*CMS012 9 77±6*CMS022 10 73±11*CMS028 8 79±3*CMS035 10 76±10*IFN-γ10 72±9*IL-2 10 74±10*生理鹽水 11 58±7注*與生理鹽水組比較，P＜0.053.肽對T淋巴細(xì)胞分泌IL-2活性的影響當(dāng)給藥劑量為500μg/kg/天，CMS007、CMS009、CMS010、CMS015能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IL-2，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS007、CMS015組與IL-2組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS009、CMS010與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表9表9組別動物數(shù) X±SD(IU)CMS007 986±15*^CMS009 10 114±13*@^CMS010 9125±17*@^CMS015 985±17*^IFN-γ 10 100±18*IL-210 70±13*生理鹽水10 39±10注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05
當(dāng)給藥劑量為50μg/kg/天，CMS001、CMS003能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IL-2，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS003與IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表10表10組別 動物數(shù) X±SD(IU)CMS001 10 60±10*CMS003 8 86±9*^IFN-γ 9 99±16*IL-2 10 72±12*生理鹽水 10 39±10注*與生理鹽水組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為5μg/kg/天，CMS007、CMS012、CMS020能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IL-2，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表11表11組別動物數(shù) X±SD(IU)CMS007 8 64±12*CMS012 9 65±16*CMS020 8 63±11*IFN-γ 10 96±14*IL-210 77±13*生理鹽水10 37±9注*與生理鹽水組比較，P＜0.05
當(dāng)給藥劑量為0.5μg/kg/天，CMS010、CMS011、CMS012、CMS022、CMS034能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IL-2，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS034與IL-2組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS011、CMS022組與IL-2組、IFN-γ組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表12表12組別動物數(shù) X±SD(IU)CMS010 9 66±11*CMS011 10 101±19*@^CMS012 8 59±13*CMS022 9 109±14*@^CMS034 10 85±10*^IFN-γ 10 87±15*IL-210 73±13*生理鹽水10 38±13注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.054.肽對T淋巴細(xì)胞分泌IFN活性的影響當(dāng)給藥劑量為500μg/kg/天，CMS010、CMS013、CMS016能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IFN，與生理鹽水組、IFN-γ組、IL-2組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表13
表13組別 動物數(shù) X±SD(IU)CMS010 9 167±13*@^CMS013 9 154±15*@^CMS016 6 162±19*@^IFN10 139±16*IL-2 10 120±13*生理鹽水 10 65±11注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為50μg/kg/天，CMS001、CMS003、CMS021能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IFN，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS021與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表14表14組別 動物數(shù) X±SD(IU)CMS001 10 110±15*CMS003 8 106±16*CMS021 8 143±17*@^IFN-γ9 125±18*IL-2 10 113±17*生理鹽水 10 61±11注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05
當(dāng)給藥劑量為5μg/kg/天，CMS009、CMS012能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IFN，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS009與IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表15表15組別 動物數(shù) X±SD(IU)CMS009 10 121±15*^CMS012 9 86±9*IL-2 9 105±14*生理鹽水 10 66±10注*與生理鹽水組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為0.5μg/kg/天，CMS010、CMS011、CMS022、CMS028能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IFN，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS010、CMS022與IFN-γ、IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表16表16組別 動物數(shù) X±SD(IU)CMS010 9 142±18*@^CMS011 10 89±18*CMS022 9 145±13*@^CMS028 10 96±13*IFN-γ10 124±16*IL-2 10 107±13*生理鹽水 10 64±13注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.055.肽對抗體形成的影響當(dāng)給藥劑量為500μg/kg/天，CMS002、CMS003、CMS007、CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS013、CMS014、CMS015、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS022、CMS023、CMS024、CMS029、CMS033、CMS035能夠促進(jìn)抗SRBC抗體形成，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS002、CMS003、CMS007、CMS008、CMS013、CMS019、CMS024、CMS035與IFN-γ組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS014、CMS015、CMS016、CMS020、CMS023、CMS029、CMS033與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果詳見表17
表17組別 動物數(shù) X±SDCMS002 10 87±18*@CMS003 10 96±18*@CMS007 10 69±17*@CMS008 10 82±15*@CMS009 10 113±22*@^CMS010 10 112±30*@^CMS011 8 188±16*@^CMS012 8 141±21*@^CMS013 10 80±16*@CMS014 10 130±24*@^CMS015 10 136±22*@^CMS016 8 143±38*@^CMS018 10 66±16*CMS019 10 91±26*@CMS020 6 155±35*@^CMS022 8 68±31*CMS023 9 109±45*@^CMS024 8 75±29*@CMS029 8 115±22*@^CMS033 10 143±27*@^CMS035 10 88±16*@IFN-γ 9 37±10IL-2 10 71±11*生理鹽水 10 32±7注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為50μg/kg/天，CMS003、CMS011、CMS012、CMS013、CMS015、CMS021、CMS022、CMS023、CMS026、CMS027、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036能夠促進(jìn)抗SRBC抗體形成，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。其中CMS011、CMS013、CMS015組與IFN-γ組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS021、CMS022、CMS023、CMS026、CMS027、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CMS009則能夠抑制形成抗SRBC抗體，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果詳見于表18表18組別動物數(shù) X±SD(HC50)CMS003 10 52±11*CMS009 8 13±5*CMS011 9 67±9*@CMS012 8 50±14*CMS013 8 70±9*@CMS015 10 54±9*@CMS021 9 94±20*@^CMS022 9 110±16*@^CMS023 8 84±11*@^CMS026 9 98±9*@^CMS027 9 93±11*@^CMS029 10 143±13*@^CMS030 10 141±33*@^CMS032 9 131±24*@^CMS033 8 112±15*@^CMS034 10 136±11*@^CMS035 8 97±10*@^CMS036 10 118±11*@^IFN-γ 9 37±10IL-210 71±11*生理鹽水10 32±7注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05
當(dāng)給藥劑量為5μg/kg/天，CMS001、CMS003、CMS007、CMS008、CMS009、CMS011、CMS012、CMS013、CMS015、CMS016、CMS019、CMS020、CMS021、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036能夠促進(jìn)抗SRBC抗體形成，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS003、CMS008、CMS009、CMS012、CMS015、CMS016、CMS020、CMS021組與IFN-γ組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS001、CMS007、CMS011、CMS019、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果詳見于下表19
表19組別動物數(shù) X±SD(HC50)CMS001 9 110±24*@CMS003 9 91±24*@CMS007 9 122±12*@^CMS008 9 97±26*@CMS009 8 79±18*@CMS011 10 115±27*@^CMS012 10 81±22*@CMS013 10 93±28*@CMS015 8 94±37*@CMS016 9 93±32*@CMS019 10 118±20*@^CMS020 10 89±24*@CMS021 9 82±30*@CMS023 10 166±27*@^CMS024 7 171±39*@^CMS026 9 191±17*@^CMS027 9 117±45*@^CMS028 10 121±48*@^CMS029 9 147±23*@^CMS030 9 158±37*@^CMS032 9 157±37*@^CMS033 7 128±39*@^CMS034 8 172±37*@^CMS035 9 176±39*@^CMS036 8 179±34*@^IFN-γ 9 37±10IL-210 71±11*生理鹽水10 32±7注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為0.5μg/kg/天，CMS021、CMS023、CMS024、CMS027、CMS033能夠促進(jìn)抗SRBC抗體形成，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS023、CMS024、CMS027與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CMS021、CMS033組與IFN-γ組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS002，CMS003，CMS009，CMS010，CMS011，CMS013，CMS014，CMS015，CMS018，CMS019，CMS020，CMS026，CMS028，CMS029，CMS030，CMS034，及CMS036能抑制形成抗SRBC抗體，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表20
表20組別動物數(shù) X±SDCMS002 9 4±1*CMS003 9 2±1*CMS009 9 2±1*CMS010 10 10±3*CMS011 10 5±3*CMS013 10 7±1*CMS014 10 15±6*CMS015 9 13±4*CMS018 9 3±1*CMS019 9 12±3*CMS020 9 10±3*CMS021 9 57±9*@CMS023 10 108±21*@^CMS024 10 98±6*@^CMS026 10 19±6*CMS027 10 99±14*@^CMS028 10 18±5*CMS029 9 18±7*CMS030 9 19±7*CMS033 9 78±12*@CMS034 10 20±2*CMS036 9 20±6*IFN-γ 9 37±10IL-210 71±11*生理鹽水10 32±7注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.056.肽對單核吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響當(dāng)給藥劑量為500μg/kg/天，CMS003、CMS008、CMS020、CMS022、CMS024能夠增強單核吞噬細(xì)胞吞噬功能，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。其中CMS022與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表21表21組別動物數(shù) X±SD(吞噬指數(shù))CMS003 10 6.6±0.7*CMS008 10 6.5±1.2*CMS020 10 6.4±0.6*CMS022 10 7.4±0.6*@^CMS024 10 6.4±1.0*IFN-γ 10 6.4±0.9*IL-29 5.7±0.8生理鹽水10 5.1±0.6注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為50μg/kg/天，CMS019、CMS024、CMS030能夠增強單核吞噬細(xì)胞吞噬功能，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。其中CMS019與IL-2組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表22表22組別動物數(shù) X±SD(吞噬指數(shù))CMS019 9 6.7±0.9*^CMS024 8 6.6±0.7*CMS030 10 6.3±0.5*IFN-γ 10 6.4±0.9*IL-29 5.7±0.8生理鹽水10 5.1±0.6注*與生理鹽水組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為5μg/kg/天，CMS003、CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS013、CMS016、CMS018、CMS019、CMS035能夠增強單核吞噬細(xì)胞吞噬功能，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。其中CMS003、CMS009、CMS010、CMS016、CMS019、CMS035與IL-2組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于下表23表23組別 動物數(shù) X±SD(吞噬指數(shù))CMS003 9 6.9±0.9*^CMS008 9 6.4±0.5*CMS009 9 6.9±0.9*^CMS010 10 7.1±0.7*^CMS011 10 6.4±1.1*CMS013 10 6.7±0.2*CMS016 9 6.9±0.8*^CMS018 8 6.7±1.2*CMS019 8 6.8±0.6*^CMS035 9 6.9±0.9*^IFN-γ10 6.4±0.9*IL-2 9 5.7±0.8生理鹽水 10 5.1±0.6注*與生理鹽水組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為0.5μg/kg/天，CMS024、CMS027、CMS036能夠增強單核吞噬細(xì)胞吞噬功能，與生理鹽水組比較具有顯著性差異(P＜0.05)。其中CMS024組與IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表24
表24組別動物數(shù)X±SD(吞噬指數(shù))CMS024 106.7±0.5*^CMS027 106.4±0.6*CMS036 9 6.2±0.3*IFN-γ 106.4±0.9*IL-29 5.7±0.8生理鹽水105.1±0.6注*與生理鹽水組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.057.肽對免疫器官的重量的影響當(dāng)給藥劑量為500μg/kg/天，CMS008、CMS010、CMS016、CMS019、CMS020、CMS022、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036能夠增加小鼠胸腺的重量，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS027、CMS034組與IL-2組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS008、CMS022、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS035與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表25
表25組別動物數(shù) X±SD(％)CMS008 8 0.21±0.03*@^CMS010 10 0.19±0.04*CMS016 9 0.18±0.05*CMS019 10 0.19±0.02*CMS020 10 0.19±0.04*CMS022 9 0.26±0.05*CMS026 10 0.20±0.03*CMS027 8 0.20±0.03*^CMS028 10 0.19±0.02*CMS029 10 0.22±0.04*@^CMS030 8 0.30±0.03*@^CMS032 8 0.25±0.03*@^CMS033 9 0.25±0.04*@^CMS034 9 0.20±0.05*^CMS035 10 0.21±0.03*@^CMS036 9 0.18±0.02*IFN-γ 10 0.15±0.04IL-29 0.14±0.04生理鹽水9 0.12±0.02注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為500μg/kg/天，CMS019能夠增加小鼠脾的重量，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS001，CMS003，CMS007，CMS009，CMS011，CMS013，CMS014，CMS015，CMS021，CMS023，CMS024，CMS027，及CMS036能夠減輕小鼠脾的重量，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表26表26組別動物數(shù) X±SD(％)CMS001 10 0.43±0.07*CMS003 8 0.40±0.04*CMS007 9 0.32±0.05*CMS009 9 0.41±0.03*CMS011 9 0.41±0.04*CMS013 10 0.44±0.07*CMS014 10 0.04±03*CMS015 9 0.36±0.07*CMS019 9 0.63±0.08*CMS021 9 0.36±0.04*CMS023 9 0.36±0.06*CMS024 9 0.34±0.05*CMS027 10 0.37±0.03*CMS036 10 0.40±0.03*生理鹽水10 0.53±0.05注*與生理鹽水組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為50μg/kg/天，CMS002、CMS008、CMS012、CMS014、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS036能夠增加小鼠胸腺的重量，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS034與IL-2組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS002、CMS008、CMS012、CMS014、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS030、CMS032、CMS036與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表27表27組別 動物數(shù) X±SD(％)CMS002 10 0.21±0.02*@^CMS008 10 0.20±0.04*@^CMS012 10 0.26±0.02*@^CMS014 10 0.21±0.02*@^CMS016 10 0.20±0.03*@^CMS018 10 0.23±0.02*@^CMS019 10 0.20±0.03*@^CMS020 10 0.27±0.03*@^CMS022 10 0.30±0.03*@^CMS023 10 0.20±0.02*@^CMS024 10 0.27±0.02*@^CMS026 10 0.27±0.02*@^CMS027 8 0.21±0.03*@^CMS028 10 0.18±0.04*CMS029 9 0.18±0.05*CMS030 10 0.25±0.04*@^CMS032 10 0.27±0.03*@^CMS033 9 0.18±0.03*CMS034 8 0.19±0.04*^CMS036 9 0.22±0.02*@^IFN-γ10 0.15±0.04IL-2 9 0.14±0.04生理鹽水 9 0.12±0.02注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為50μg/kg/天，CMS008，CMS010，及CMS029能夠減輕小鼠脾的重量，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表28表28組別動物數(shù) X±SD(％)CMS008 10 0.39±0.08*CMS010 10 0.38±0.05*CMS029 10 0.42±0.04*IFN-γ 10 0.50±0.04IL-29 0.62±0.07生理鹽水9 0.53±0.05注*與生理鹽水組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為5μg/kg/天，CMS001、CMS002、CMS010、CMS011、CMS012、CMS013、CMS014、CMS015、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS021、CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS036能夠增加小鼠胸腺的重量，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS002、CMS014、CMS024、CMS030組的胸腺指數(shù)與IL-2組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS010、CMS012、CMS018、CMS019、CMS020、CMS022、CMS026、CMS028、CMS032、CMS034、CMS036與IFN-γ組、IL-2組比較，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表29
表29組別 動物數(shù) X±SD(％)CMS001 10 0.22±0.05*CMS002 9 0.24±0.05*^CMS010 9 0.27±0.05*@^CMS011 10 0.22±0.04*CMS012 10 0.27±0.06*@^CMS013 10 0.21±0.05*CMS014 10 0.23±0.06*^CMS015 9 0.20±0.08*CMS016 10 0.22±0.06*CMS018 10 0.24±0.04*@^CMS019 10 0.24±0.02*@^CMS020 10 0.24±0.07*@^CMS021 9 0.20±0.06*CMS022 9 0.25±0.04*@^CMS023 10 0.23±0.06*CMS024 9 0.23±0.06*^CMS026 10 0.31±0.05*@^CMS028 10 0.28±0.06*@^CMS029 10 0.21±0.03*CMS030 10 0.23±0.07*^CMS032 10 0.29±0.04*@^CMS033 10 0.20±0.02*CMS034 9 0.27±0.06*@^CMS035 10 0.21±0.04*CMS036 10 0.25±0.04*@^IFN-γ 10 0.15±0.04IL-2 9 0.14±0.04生理鹽水 9 0.12±0.02注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為5μg/kg/天，CMS030能夠增加小鼠脾的重量，與生理鹽水組、IFN組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS015則能夠減輕小鼠脾的重量，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表30表30組別動物數(shù) X±SD(％)CMS015 90.38±0.15*CMS030 10 0.64±0.09*生理鹽水10 0.53±0.05注*與生理鹽水組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為0.5μg/kg/天，CMS002、CMS008、CMS010、CMS012、CMS014、CMS018、CMS020、CMS022、CMS026、CMS028、CMS030、CMS032能夠增加小鼠胸腺的重量，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，其中CMS008、CMS012與IL-2組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS002、CMS020、CMS030與IFN組、IL-2組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見于表31
表31組別 動物數(shù) X±SD(％)CMS00280.26±0.06*@^CMS00810 0.22±0.07*^CMS01090.21±0.03*CMS01210 0.22±0.06*^CMS01410 0.20±0.04*CMS01810 0.20±0.03*CMS02090.23±0.05*@^CMS02210 0.21±0.06*CMS02690.21±0.05*CMS02810 0.20±0.06*CMS03080.24±0.05*@^CMS03210 0.21±0.06*IFN-γ 10 0.15±0.04IL-2 90.14±0.04生理鹽水 90.12±0.02注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05當(dāng)給藥劑量為0.5μg/kg/天，CMS020能夠增加小鼠脾的重量，與生理鹽水組，IFN-γ組，及IL-2組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。CMS001則能減輕小鼠脾的重量，與生理鹽水組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)果詳見表32
表32組別 動物數(shù) X±SD(％)CMS001 10 0.40±0.05*CMS020 80.68±0.09*@^生理鹽水 10 0.53±0.05IFN-γ10 0.50±0.04IL-2 10 0.62±0.07注*與生理鹽水組比較，P＜0.05@與IFN-γ組比較，P＜0.05^與IL-2組比較，P＜0.05綜上所述，經(jīng)動物實驗證實肽CMS001、CMS002、CMS003、CMS007、CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS013、CMS014、CMS015、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS021、CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、 CMS036在動物體內(nèi)具有生物活性。II.肽的體內(nèi)抗病毒作用為了明確這些肽是否對病毒性感染有治療應(yīng)用價值，我們使用鴨乙型肝炎感染動物模型來檢驗上述肽對染病動物的體內(nèi)作用效果。
建立重慶麻鴨乙型肝炎感染模型，給予腹腔注射肽(50微克/公斤體重/天，每天1次)，療程4周。用斑點雜交法測定血清鴨乙肝病毒DNA(DHBV-DNA)水平。同時設(shè)拉米夫定和生理鹽水分別作為陽性、陰性對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肽CMS001在用藥第4周可以顯著降低血清DHBV-DNA水平(P＜0.05)。由此得出結(jié)論CMS001在合適劑量水平能單獨或聯(lián)合用于治療乙型肝炎病毒感染。材料和方法1.肽由美國肽公司(American Peptide Company，Inc.)從L-氨基酸合成。
2.動物模型[1]1日齡重慶麻鴨經(jīng)腹腔注射接種0.1ml DHBV-DNA陽性血清，接種量為5×107拷貝/ml。1周后，從鴨頸外靜脈取血，分離血清，與地高辛標(biāo)記的DHBV-DNA探針做斑點雜交，以確定感染是否成功[2]。感染成功的鴨飼養(yǎng)至2周大小即可進(jìn)入實驗研究。
3.分組及治療DHBV感染鴨隨機(jī)分為下列各組(1)陰性對照組(n＝9)每只鴨腹腔注射1ml生理鹽水，每天1次。
(2)拉米夫定組(n＝8)為陽性對照組。每只鴨口服(灌胃)拉米夫定[4]50mg/kg/d，每天1次。
(3)肽組(n＝9)每只鴨每天1次腹腔注射50μg/kg/d肽(用生理鹽水調(diào)節(jié)至終體積為0.5-1ml)。
以上各組療程4周，停藥后再觀察1周。于給藥第0、7、14、21、28、35天分別從鴨頸外靜脈取1ml血，立即分離血清置-20℃待測[3]。
4.血清DHBV-DNA滴度測定DHBV-DNA探針按試劑盒制造商(Amersham Pharmacia BiotechCo.)提供的操作說明標(biāo)記熒光。40μl鴨血清以每樣本1個復(fù)制點在硝化纖維素膜上形成斑點，然后與熒光標(biāo)記的DHBV-DNA探針雜交[2]。雜交完成后，斑點經(jīng)CDP-Star熒光測定試劑(RPN3690)處理，用Vuego Scan(Brisa-620st)掃描儀進(jìn)行掃描。用ImageMaster TotalLabV1.11.Ink軟件對斑點作定量分析，統(tǒng)計學(xué)分析采用配對t檢驗，使用SPSS軟件。結(jié)果表II.1用藥前后血清DHBV-DNA水平的變化血清DHBV-DNA滴度(103單位)第0天 第7天 第14天第21天 第28天第35天生理鹽水26±1245±3149±23102±6660±3850±43拉米夫定21±9 6±4*7±6*8±7*8±5*20±19CMS001 21±1811±1320±1814±14 5±3*18±16配對t檢驗與同一動物給藥第0天比較，*P＜0.05.
陰性(生理鹽水)對照組和陽性(拉米夫定)對照組數(shù)據(jù)表明乙型肝炎感染動物模型的成功建立。與給藥前相比，肽CMS001以50μg/kg/d劑量給藥4周時能顯著降低血清DHBV-DNA滴度(P＜0.05)，停藥后血清DHBV-DNA反跳較為明顯，提示CMS001抗病毒作用是可逆的，可能需要增加劑量和/或延長療程才能鏟除病毒。討論鴨乙型肝炎感染模型[1]是研究人類乙型肝炎和篩選乙肝治療藥物的較為理想而成熟的工具。本研究發(fā)現(xiàn)，肽CMS001用藥4周能夠顯著降低血清DHBV-DNA水平，表明CMS001在適當(dāng)劑量和合理用藥方案下，可以單獨或與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用作為人類乙型肝炎綜合治療的手段。
本研究僅檢驗了腹腔注射這一給藥途徑，但不排除其它可能有效的給藥途徑。肽可以經(jīng)靜脈注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射或皮下植入等途徑給藥，可以用或不用諸如脂質(zhì)體、持續(xù)釋放保護(hù)等藥物傳遞易化裝置。該肽也可以用片劑、膠囊、懸液、溶液等任何口服給藥形式，以及有或沒有胃腸保護(hù)的不作修飾的普通形式或緩釋形式。該肽還可進(jìn)一步用于局部，制成如油膏、乳膏、膠體等，可用或不用透皮易化裝置，或制成吸入粉劑、溶劑或脂質(zhì)體保護(hù)形式。該肽也可以翻譯成基因序列，克隆進(jìn)入一個表達(dá)系統(tǒng)，單獨或者與其它肽序列結(jié)合產(chǎn)生一個經(jīng)純化或不經(jīng)純化的肽分子，其可利用的活性如本文所描述。表II.2對乙型肝炎有效的肽CMS代碼SEQ ID NOCMS001 1參考文獻(xiàn)1.陳壓西，郭樹華，張定鳳，等。重慶麻鴨乙型肝炎模型建立和應(yīng)用，中華肝病學(xué)雜志，1993；1(2)89-912.陳壓西，郭樹華，陳雪華。地高辛標(biāo)記DHBV-DNA探針的制備與應(yīng)用，重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1994；19(4)295-2973.唐霓，黃愛龍，郭樹華，等。鴨乙肝病毒體液免疫血清學(xué)指標(biāo)的系統(tǒng)建立與應(yīng)用，中華肝病學(xué)雜志，2001；9(1)13-154.陳壓西，郭樹華，齊珍元，等。拉米夫定聯(lián)合泛昔洛韋抗鴨乙肝病毒的實驗研究，中華肝病學(xué)雜志，2001；9(4)209-211III.肽對腎炎的作用為研究這些肽對腎炎是否有可能的治療作用，我們使用動物模型大鼠Masugi腎炎以測試上述肽對患病動物的體內(nèi)作用[3，4]。
本研究旨在觀察肽對大鼠慢性腎小球腎炎的體內(nèi)治療作用。通過給健康Sprague Dawley大鼠注射兔抗鼠腎皮質(zhì)IgG構(gòu)造大鼠Masugi腎炎模型，然后立即給予腹腔注射各肽。劑量為50μg/kg/天，給藥3周。糖皮質(zhì)激素氫化可的松為陽性對照藥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CMS014、CMS018、CMS030、及CMS036處理的大鼠蛋白尿、血清肌酐水平和脾指數(shù)與對照組相比均明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)顯著性(p＜0.05)。死亡后腎臟的顯微鏡檢查提示這些肽的治療作用類似于氫化可的松治療。因此，CMS014、CMS018、CMS030、及CMS036可用作慢性腎炎控制的手段。材料Sprague Dawley(SD)雄性大鼠，分別購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心及第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，平均體重120±20g。青紫蘭兔，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，體重約3kg。
肽為L-氨基酸來源，由American Peptide Company，Inc.，USA合成，使用時以生理鹽水稀釋為10μg/ml的注射液。陽性對照藥氫化可的松由揚州市制藥廠生產(chǎn)。
血清肌酐水平測定試劑盒購自上海榮盛生物技術(shù)公司。方法(1)制備兔抗鼠腎皮質(zhì)抗血清[1]20只健康SD大鼠經(jīng)3％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉后暴露腹主動脈，以冷生理鹽水注入，充分洗滌至腎變蒼白，取出腎臟分離皮質(zhì)部分，加入5容積0.01M，pH8.1的Tris-HCl緩沖液后2次勻漿，再經(jīng)140目不銹鋼篩濾過，收集濾過液，與GIBCO-RPE完全或不完全弗氏佐劑1∶1混合乳化，獲得接種工作溶液。
給10只健康家兔皮下多點注射此接種溶液，首先用完全弗氏佐劑，隨后用不完全佐劑。每10天1次，每次6點(0.1ml/點)。第6周起取兔耳緣靜脈血，倍比稀釋血清，測定抗體效價(雙擴(kuò)散法)[2]。第8周后即可將家兔用3％戊巴比妥鈉(20mg/kg)靜脈麻醉后暴露頸動脈，放血取抗血清。
另從15只健康SD大鼠收集全血。以生理鹽水洗滌鼠紅細(xì)胞3次，加入250ml左右的兔抗血清中，混勻4℃孵育過夜，離心去除紅細(xì)胞，上清液56℃滅活30分鐘，離心去除沉淀，再經(jīng)三次硫酸銨(50％，33％，33％)沉淀[5]后上清液被分離、部分純化，制備成粗IgG。將粗IgG再溶于125ml雙蒸水，透析去除硫酸銨。雙擴(kuò)散法測定抗腎皮質(zhì)抗體效價。(2)誘導(dǎo)大鼠腎小球腎炎[5]誘導(dǎo)前5天給健康大鼠腹腔注射0.25ml兔IgG-完全弗氏佐劑(含非特異的IgG約4mg)以加速誘導(dǎo)反應(yīng)。除下述生理鹽水對照組外，其它各組大鼠腹腔注射1.0ml如方法1中所述制備的兔抗鼠腎皮質(zhì)IgG，誘導(dǎo)腎小球腎炎。(3)分組及給藥雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常健康對照組(正常)、腎炎安慰劑對照組(安慰劑)、腎炎肽治療組、腎炎氫化可的松治療對照組(氫化可的松)，每組12只。誘導(dǎo)腎炎當(dāng)天即用藥，腹腔注射給藥，肽劑量50μg/kg/天，陽性藥氫化可的松劑量為3.3mg/kg/天，生理鹽水用作安慰劑，療程均為3周。(4)觀察指標(biāo)[4]①尿蛋白水平每只大鼠置于1個代謝籠內(nèi)，自由飲水進(jìn)食，收集24小時尿，考馬斯藍(lán)法測定蛋白含量，每周測定1次。
②血清肌酐水平3周治療結(jié)束時取大鼠血，測定血清肌酐水平。使用上海榮盛生物技術(shù)公司提供的肌酐試劑盒。
③脾重指數(shù)平均脾重量÷平均體重即為脾重指數(shù)。
④腎臟組織病理檢查每組選6個重量最大的腎臟制作病理切片，顯微鏡下觀察記錄。統(tǒng)計學(xué)分析組間比較采用t檢驗。截斷值設(shè)定為p＜0.05。為保證模型的可靠性，規(guī)定每組大鼠刪去2個尿蛋白最低值。結(jié)果1.肽治療對大鼠尿蛋白水平的影響表III.1肽對尿蛋白水平的影響(單位mg)組別 例數(shù)(n) 第1周第2周第3周CMS014組10 5.5±4.0*6.3±6.8*2.8±1.9*CMS018組10 7.0±3.7*5.5±7.9*3.3±3.4*CMS030組10 5.4±3.4*9.5±16.22.4±1.5*CMS036組10 7.9±5.8*5.0±7.1*1.3±0.9*氫化可的松組10 3.1±2.0*7.5±7.7 7.6±7.1安慰劑組10 22.9±22 17.2±14.5 20.2±29.0正常組 91.7±1.3*2.3±1.1*0.4±0.2*注與安慰劑組比較，*P＜0.05發(fā)現(xiàn)肽CMS014、CMS018、CMS030和CMS036在50微克/kg/天，每天1次的劑量下可降低Masugi腎炎大鼠模型的尿蛋白水平，與安慰劑治療的對照組有統(tǒng)計學(xué)顯著差異，p＜0.05。還注意到CMS014、CMS030和CMS036以及氫化可的松組的生長速率比正常組低。氫化可的松組的生長速率降至這樣的程度，1周后治療劑量不得不減半以避免嚴(yán)重的不耐受。2.肽對血清肌酐水平的影響表III.2肽對大鼠血清肌酐水平的影響組別例數(shù)(n)血清肌酐水平(μM)CMS014組 10 159±1*CMS018組 10 67±1*CMS030組 10 93±1*CMS036組 10 80±1*氫化可的松組 10 239±107安慰劑組 10 265±212正常組980±1*注與安慰劑治療的腎炎大鼠比較，*P＜0.05從表可見，Masugi腎炎大鼠血清肌酐水平在安慰劑治療組明顯高于正常對照組(P＜0.05-0.01)，提示腎炎大鼠伴有腎功能異常。與安慰劑治療的腎炎大鼠相比，肽CM014、CMS018、CMS030、CMS036在50微克/kg/天，每天1次的劑量可以降低血清肌酐水平，與腎炎大鼠安慰劑治療組有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。3.肽對大鼠脾指數(shù)的影響表III.3肽對大鼠脾指數(shù)的影響組別 例數(shù)(n) 脾指數(shù)(×10-3)CMS014組10 3.6±1.3*CMS018組10 3.3±0.8*CMS030組10 3.0±0.5*CMS036組10 3.4±0.8*氫化可的松組10 4.5±1.4安慰劑組10 4.8±1.1正常組 9 2.4±0.1*注與安慰劑治療組比較，*P＜0.05所有被誘導(dǎo)腎炎的大鼠的脾指數(shù)均大于正常組，即有明顯脾臟腫大，提示免疫因素參與腎炎的形成。CMS014、CMS018、CMS030、CMS036在50微克/kg/天，每天1次的劑量均顯著降低脾指數(shù)，與安慰劑治療組有統(tǒng)計學(xué)顯著差異，p＜0.05。這提示這些肽可能通過免疫抑制機(jī)制而發(fā)揮抗腎炎效應(yīng)。4.肽對大鼠腎臟病理改變的影響病理檢查發(fā)現(xiàn)，安慰劑組大鼠腎小球球囊腔內(nèi)有少許纖維素性滲出物，球囊壁層上皮細(xì)胞增生，部分形成新月體，腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，近曲小管上皮細(xì)胞有輕度水變性，遠(yuǎn)曲小管及集合管內(nèi)可見少許管型，符合慢性腎小球腎炎的病理改變，表明誘導(dǎo)腎炎成功。CMS014組僅有1個大鼠顯示腎小球囊腔內(nèi)有纖維素性滲出物，球囊壁層上皮細(xì)胞增生。該大鼠其它參數(shù)及同組其它大鼠與正常大鼠有基本相同的腎組織學(xué)。CMS018、CMS030、CMS036組的所有大鼠的所有病理學(xué)參數(shù)均是正常的。結(jié)論實驗結(jié)果表明，肽CMS014、CMS018、CMS030、CMS036以劑量50μg/kg/天，每天1次腹膜給藥對實驗Masugi腎炎大鼠模型有治療作用。這些肽可校正治療大鼠的蛋白尿，肌酐水平和腎組織學(xué)，與安慰劑治療對照組有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。由這些肽對脾重指數(shù)的影響指示這些肽可能提供免疫學(xué)機(jī)制起作用，但不排除其它可能的藥理機(jī)制。討論肽CMS014，CMS018，CMS030，CMS036本身或作為一部分而可以用于人類腎炎的治療，例如用來減少尿蛋白排出或改善腎功能。這些肽可以單獨使用、或兩個以上肽合用、或與其它藥物或食品添加劑聯(lián)合用于腎炎的綜合治療。表III.4對腎炎有效的肽CMS代碼 SEQ ID NOCMS014 7CMS018 10CMS030 21CMS036 26參考文獻(xiàn)1.中華人民共和國衛(wèi)生部編.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則，199496(即抗腎炎藥項下)2.徐叔云，等.藥理實驗方法學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，北京，第2版，199110713.陳奇，等.中藥藥理研究方法學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，北京，第1版，19933904.杜冠華主譯.藥理學(xué)實驗指南—新藥發(fā)現(xiàn)和藥理學(xué)評價，科學(xué)出版社，北京，第1版，20015985.王叔咸.腎臟病學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，北京，第11版，1987244IV.CMS肽對癌癥的作用為了探討這些肽可能的抗癌治療作用，我們在本研究中用各種標(biāo)準(zhǔn)動物癌癥模型測試它們對患病動物的生物學(xué)效應(yīng)。材料1.實驗動物BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠、DBA/2小鼠，體重18～22g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。2.細(xì)胞株小鼠肉瘤180(S180)細(xì)胞、小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞、小鼠白血病L1210細(xì)胞中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。YAC-1細(xì)胞天津醫(yī)科大學(xué)免疫教研室姚智教授惠贈。3.主要藥品及試劑肽美國肽類公司重組鼠干擾素γ(rmIFN-γ)北京邦定生物技術(shù)有限公司重組人白介素2(rhIL-2)上海華新生物高技術(shù)有限公司RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清美國GIBCO公司四甲基偶氮唑鹽(MTT)、刀豆蛋白A(ConA)美國SIGMA公司淋巴細(xì)胞分離液中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所環(huán)磷酰胺(CTX)上海第十二制藥廠方法1.給藥方法各種治療藥物均經(jīng)腹腔注射，除環(huán)磷酰胺組于腫瘤接種后次日給藥外，其余各組在腫瘤接種前5天開始給藥，連續(xù)給藥30天或直至動物死亡時結(jié)束。2.肽對BALB/C小鼠中的移植的S180肉瘤相比的生長速率的影響以及對宿主的免疫學(xué)功能的影響B(tài)ALB/c小鼠隨機(jī)分成肽組、環(huán)磷酰胺組、rmIFN-□組、rhIL-2組和生理鹽水組，每組20只動物。
將凍存的小鼠肉瘤S180細(xì)胞，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，用無菌Hanks液室溫下洗滌細(xì)胞3～4次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1～2×109個/L。將0.2ml細(xì)胞懸液于腋窩皮下進(jìn)行BALB/c小鼠接種。將已接種并飼養(yǎng)10～12天的S180瘤源小鼠頸椎脫臼處死，收集生長旺盛且無破潰的腫瘤塊并用無菌生理鹽水洗。將組織分散在生理鹽水中，每克瘤組織加入4ml滅菌生理鹽水，制成均一的細(xì)胞懸液。腋下注入懸液0.2ml制備荷瘤小鼠模型[1]。依方法1給藥。2.1肽對荷瘤小鼠單核吞噬細(xì)胞胞吞功能的檢測[2，3]是通過于末次給藥后次日，每只鼠尾靜脈注射15稀釋的印度墨汁0.1ml/10g而進(jìn)行。分別于注射墨汁后1min和5min，采用經(jīng)肝素溶液預(yù)先濕潤過的采血吸管，從眶后靜脈叢取血20μl。將取出的血與2ml 0.1％Na2CO3溶液混合，測定OD680nm。按下列公式計算廓清指數(shù)K值K＝(lgA1-lgA2)÷(t2-t1)式中A1為1min OD680nm，A2為5min OD680nm，t2為5分鐘，t1為1分鐘胞吞指數(shù)研究后，頸椎脫臼處死小鼠，分離肝、脾和胸腺并用濾紙吸干，稱重。
按下列公式計算吞噬指數(shù)α值α＝(3√K)(W÷WLS)其中W為體重，WLS為肝脾和重。2.2按下式計算腫瘤生長抑制指數(shù)腫瘤生長抑制指數(shù)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)÷對照組平均瘤重3.肽對BALB/C小鼠腹水型肝癌H22的作用將BALB/c小鼠隨機(jī)分為肽組、環(huán)磷酰胺組、rmIFN-γ組、rhIL-2組、生理鹽水組，每組20只。
將凍存的小鼠腹水型肝癌H22細(xì)胞，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，用無菌Hanks液洗滌細(xì)胞3～4次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1～2×109個/L。將收集好的細(xì)胞，進(jìn)行BALB/c小鼠腹腔接種，每鼠0.2ml。取接種6～8天的荷瘤小鼠，頸椎脫臼致死，消毒后剪開并剝?nèi)テつw，用無菌注射器穿過腹壁肌層抽取腹水，放入無菌小瓶。將收集的腹水用Hanks液稀釋至1×106/ml，無菌操作。分組后的每鼠腹腔注射腹水稀釋液0.2ml，依方法1給藥。記錄小鼠存活數(shù)據(jù)。如動物在實驗結(jié)束時仍生存，生存天數(shù)按實驗天數(shù)計算。使用SPSS統(tǒng)計軟件，應(yīng)用Kaplan-meier方法統(tǒng)計平均生存時間。按以下公式計算存活指數(shù)存活指數(shù)＝(實驗組平均生存天數(shù)-對照組平均生存天數(shù))/對照組平均生存天數(shù)×100％。4.肽對移植腹水型肝癌H22的BALB/c小鼠的細(xì)胞免疫性的作用4.1脾細(xì)胞懸液的制備[1，4]將健康BALB/c小鼠，隨機(jī)分為肽組、rmIFN-γ組、rhIL-2組、生理鹽水組，每組15只，依照方法3，制作荷H22腹水型肝癌小鼠模型。植入癌細(xì)胞后，給藥15日，之后將小鼠頸椎脫臼致死，無菌操作取脾，用注射器的針芯輕輕捻碎脾組織，使單個細(xì)胞通過100目不銹鋼網(wǎng)(孔徑150μm)進(jìn)入冷Hanks液中，將細(xì)胞懸液移至離心管中，200g離心10min后棄上清，加10倍體積的Tris-NH4Cl至細(xì)胞沉淀中，混勻后，室溫下靜置10min，150g離心10min，再用冷Hanks液洗滌細(xì)胞2～4次，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至所需濃度。4.2肽對荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響將各組小鼠的脾細(xì)胞，制成1×106/ml懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100μl/孔，每份樣品設(shè)3個平行孔。向孔中加入100μl/孔的于RPMI-1640中的100μg/ml ConA，作為分析孔，加入100μl/孔的RPMI-1640的孔作為對照孔。然后將96孔培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66hr，再將細(xì)胞培養(yǎng)板150g離心10min，取上清，-20℃保存，以備檢測細(xì)胞因子IL-2和IFN。
向細(xì)胞沉淀中加50μl/孔的1mg/ml MTT液，振蕩2min重懸細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)4hr。150g，離心10min，棄上清。加入120μl/孔的40mM鹽酸-異丙醇，振蕩3min。在ELISA-reader上測吸光度(OD570nm值)，參考波長630nm。
每個小鼠形成3個分析孔和3個對照孔。
每個小鼠的刺激指數(shù)(SI)是通過首先計算3個復(fù)孔的平均OD值，然后將分析孔的值除以對照孔的值而獲得。4.3肽對荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷活性影響實驗[5，6]
將4.1中獲得的小鼠脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×106/ml。將已達(dá)到對數(shù)生長期的YAC-1靶細(xì)胞制成1×105/ml。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將100μl脾細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基100μl加入僅含脾細(xì)胞的對照孔中；向僅含靶細(xì)胞的對照孔中加入100μl靶細(xì)胞和培養(yǎng)基100μl；向NK活性分析孔中加靶細(xì)胞100μl和脾細(xì)胞100μl。每個小鼠均如上所述設(shè)3個復(fù)孔。將加好樣品的96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4hr。
將樣品150g離心10min收集細(xì)胞。加1mg/ml MTT液50μl/孔，振蕩2min后，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4hr。150g離心10min，棄上清。加入40mM鹽酸-異丙醇120μl/孔，振蕩3min后，在ELISA-reader上測吸光度(OD值)，測定波長570nm，參考波長630nm。
每個小鼠有9個孔3個脾細(xì)胞對照，3個靶細(xì)胞對照，3個含有脾細(xì)胞和靶細(xì)胞的分析孔。每個小鼠的NK細(xì)胞活性指數(shù)通過首先獲得每個組合的3個平行孔的平均OD值，然后將這一平均OD代入下式計算NK細(xì)胞活性指數(shù)＝[1-(脾細(xì)胞和靶細(xì)胞孔平均OD值-脾細(xì)胞孔平均OD值)÷(靶細(xì)胞孔平均OD值)]×100％5.肽對具有移植的L1210白血病的DBA/2小鼠的存活的影響將DBA/2小鼠，6～8周齡，體重18～22g，隨機(jī)分為肽組、環(huán)磷酰胺組、rmIFN-γ組、rhIL-2組、生理鹽水組，每組20只。
將凍存的小鼠白血病L1210細(xì)胞株，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，用無菌Hanks液洗滌細(xì)胞3～4次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml。將0.1ml細(xì)胞懸液植入數(shù)只健康DBA/2小鼠腹腔。取接種6～8天的白血病小鼠，頸椎脫臼致死，無菌取腹水。將收集的腹水用無菌Hanks液稀釋至1×105/ml。將0.1ml細(xì)胞懸液植入每個測試動物中并記錄動物的存活數(shù)據(jù)。測試動物依方法1給藥。使用SPSS統(tǒng)計軟件，應(yīng)用Kaplan-meier方法統(tǒng)計各組的生存時間。如動物在實驗結(jié)束時仍生存，生存天數(shù)按實驗天數(shù)計算。按以下公式計算存活指數(shù)存活指數(shù)＝(實驗組平均生存天數(shù)-對照組平均生存天數(shù))÷對照組平均生存天數(shù)×100％6.肽對攜帶移植的B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠的體液免疫性的影響將C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重18～22g，隨機(jī)分為肽組、環(huán)磷酰胺組、rmIFN-γ組、rhIL-2組、生理鹽水組，每組20只。
將凍存的小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，用無菌Hanks液洗滌細(xì)胞3～4次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1～2×105/ml。每鼠尾靜脈注射0.1ml腫瘤細(xì)胞懸液以產(chǎn)生攜帶B16黑色素瘤的動物模型[7，8]。依方法1給藥。6.1肽對荷瘤小鼠體液免疫性的作用[9]綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)如下制備無菌條件下自健康成年綿羊外頸靜脈取血，置于有玻璃珠的三角燒瓶中，搖動三分鐘，然后將血液與Alsever溶液(葡萄糖2.05g，氯化鈉0.4g，檸檬酸鈉0.8g，加蒸餾水至100ml)混勻，置4℃冰箱備用。臨用前樣品在130g離心5分鐘以收集SRBC。通過在生理鹽水中重懸并離心洗滌細(xì)胞2次，然后經(jīng)180g離心10分鐘收集細(xì)胞沉淀。按2％(v/v)以生理鹽水稀釋，即得所需的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)懸液。
將新鮮豚鼠血清按10∶1(v/v)加入離心壓積SRBC中，于4℃輕輕振蕩30min，制備補體。200g離心10min吸取上清液，用生理鹽水1∶10稀釋制備成所需補體工作溶液。
將各組小鼠在給藥后第27天，腹腔注射0.2ml SRBC懸液以產(chǎn)生抗體。末次給藥后次日，摘除眼球取血，室溫下放置1h，使血清充分滲出。以200g離心10分鐘，取上層血清，用生理鹽水稀釋500倍。
向1ml稀釋的鼠血清樣品中加入SRBC懸液0.5ml，冰浴中冷卻，然后加入補體工作溶液1rnl，在37℃恒溫水浴中保溫10min，隨即置入冰浴中終止反應(yīng)。以200g離心10min，取上清液。
向1ml上述上清液中加入Drabkin試劑(碳酸氫鈉1.0g，高鐵氰化鉀0.2g，氰化鉀0.05g，蒸餾水1000ml)3ml，室溫放置10min后，測定OD540nm。
取SRBC懸液0.25ml，加Drabkin試劑至4ml，搖勻，室溫放置10min，測定參考OD540nm。
溶血指數(shù)＝(樣品OD540nm值÷參考OD540nm)×5006.2體液免疫研究后，頸椎脫臼處死小鼠。取肺組織肉眼及顯微鏡下觀察肺的病理形態(tài)學(xué)改變，計算肺轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)。
結(jié)果1.肽對荷瘤小鼠(S180)吞噬細(xì)胞功能的影響實驗結(jié)果(方法2.1)表IV.1 CMS肽對攜帶移植的S180肉瘤的BALB/c小鼠吞噬指數(shù)的影響組別 藥物劑量 動物數(shù) 吞噬指數(shù)CMS001 50μg/kg20 6.24±0.33*^CMS001 5μg/kg 19 6.67±0.43*^CMS034 5μg/kg 19 6.20±0.44*^CMS034 0.5μg/kg 20 6.35±1.02*IL-2 3×105IU/kg19 6.96±1.37*IFN-γ3×105IU/kg17 5.45±0.71環(huán)磷酰胺 20mg/kg 19 5.92±2.47生理鹽水 0.5ml 19 5.38±0.85*與生理鹽水組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。^與IFN-γ組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。
CMS001在50微克/kg/天和5微克/kg/天，CMS034在5微克/kg/天和0.5微克/kg/天的劑量能增加吞噬指數(shù)，與生理鹽水組有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。2.肽對BALB/C小鼠的移植S180肉瘤的生長速率的影響(方法2.2)表IV.2肽對移植性S180腫瘤生長的影響組別藥物劑量 動物數(shù) 瘤重(g) 抑瘤指數(shù)(％)CMS010 500μg/kg20 0.67±0.35*48.4CMS034 0.5μg/kg20 0.83±0.48*35.9CMS035 5μg/kg 20 0.71±0.37*44.6rhIL-2 3×105IU/kg 20 0.69±0.37*46.2rmIFN-γ 3×105IU/kg 18 0.96±0.45 25.3環(huán)磷酰胺20mg/kg 20 0.68±0.32*47.3生理鹽水0.5ml20 1.29±0.50*與生理鹽水組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。
CMS010(500μg/g/天)、CMS034(0.5μg/kg/天)和CMS035(5μg/kg/天)能降低移植的S180肉瘤的生長，與生理鹽水組比較有統(tǒng)計學(xué)顯著差異，P＜0.05。3.肽對移植腹水型肝癌H22的BALB/C小鼠的存活的影響(方法3)表IV.3肽對小鼠移植性腹水型肝癌H22存活指數(shù)的影響組別 藥物劑量 動物數(shù)生存時間(天) 存活指數(shù)(％)CMS0085μg/kg 20 50.7±20.9*&67.8CMS0115μg/kg 20 36.4±14.8*&60.2CMS02450μg/kg20 36.3±12.7*&$38.4CMS0245μg/kg 19 40.6±14.6*&$54.8CMS0240.5μg/kg 19 46.4±14.8*^&$76.9CMS0320.5μg/kg 20 42.8±12.2*^&$63.3rhIL-23×105IU/kg18 13.6±0.5rmIFN-γ 3×105IU/kg20 27.8±7.56.1環(huán)磷酰胺 20mg/kg 20 24.7±10.2生理鹽水 0.5ml 19 26.2±6.8*與生理鹽水組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。^與IFN-γ組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。&與IL-2組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。$與環(huán)磷酰胺組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。
CMS008(5μg/kg/天)、CMS011(5μg/kg/天)、CMS024(0.5μg/kg/天、50μg/kg/天)、CMS032(0.5μg/kg/天)，能夠明顯延長腹水型H22小鼠的存活時間，與生理鹽水組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。還觀察到CMS024(0.5μg/kg/天)組中，超過30％(n＝6)的小鼠可存活超過90天(實驗結(jié)束后2個月)。小鼠的postmortum檢查未示出有腫瘤跡象。因此，CMS024(0.5μg/kg/天)可通過感染腫瘤建立或誘導(dǎo)已建立的癌癥的完全治愈而感染移植的H22的生長。4.肽對腹水型肝癌H22小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響(方法4.2)表IV.4肽對T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響組別藥物劑量 動物數(shù) 刺激指數(shù)CMS010 500μg/kg 20 1.45±0.21*$CMS019 0.5μg/kg 19 1.50±0.19*$CMS024 0.5μg/kg 19 1.46±0.19*$CMS024 5μg/kg 20 1.45±0.21*$CMS034 0.5μg/kg 20 1.37±0.10*$CMS035 0.5μg/kg 20 1.40±0.13*$CMS035 5μg/kg 20 1.46±0.16*$rhIL-2 3×105IU/kg 19 1.46±0.21*rmIFN-γ 3×105IU/kg 18 1.2715±0.1416環(huán)磷酰胺20mg/kg 19 1.0051±0.2317*生理鹽水0.5ml 20 1.2514±0.0651*與生理鹽水組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。$與環(huán)磷酰胺組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。
CMS010(500μg/kg/天)、CMS019(0.5μg/kg/天)、CMS024(0.5μg/kg/天和5μg/kg/天)、CMS035(0.5μg/kg/天和5μg/kg/天)能顯著提高T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，與生理鹽水組比較，有顯著增加(P＜0.05)。5.肽對腹水型肝癌H22小鼠NK細(xì)胞活性的影響(方法4.3)表IV.5肽對NK細(xì)胞胞毒活性指數(shù)的影響組別藥物劑量 動物數(shù) NK活性指數(shù)(％)CMS003 500μg/kg 1737.9±14.5*^$CMS014 0.5μg/kg 1740.7±19.7*$CMS024 0.5μg/kg 1839.3±18.7*$CMS024 5μg/kg 2034.9±12.1*^$CMS024 50μg/kg2043.6±13.9*^$&CMS032 5μg/kg 2052.6±12.5*^$&CMS032 50μg/kg1941.0±18.7*^$&CMS034 50μg/kg2057.3±17.9*^$&rhIL-2 3×105IU/kg1926.0±9.0rmIFN-γ 3×105IU/kg1820.9±3.3環(huán)磷酰胺20mg/kg 1916.5±7.2*生理鹽水0.5ml 2024.0±8.2*與生理鹽水組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。^與IFN-γ組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。&與IL-2組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。$與環(huán)磷酰胺組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。
CMS003(500μg/kg/天)、CMS014(0.5μg/kg/天)、CMS024(0.5μg/kg/天、5μg/kg/天和50μg/kg/天)、CMS034(50μg/kg/天)能顯著提高NK細(xì)胞胞毒活性，與生理鹽水組比較，有顯著增加(P＜0.05)。6.肽對具有移植的L1210白血病的DBA/2小鼠的存活的影響(方法5)表IV.6肽對小鼠移植性L1210白血病存活時間的影響組別 藥物劑量 動物數(shù) 生存時間(d) 存活指數(shù)(％)CMS019 0.5μg/kg20 21.1±5.8*26.8CMS035 0.5μg/kg20 29.3±15.4*76.1rhIL-2 3×105IU/kg 20 32.0±13.7*92.3rmIFN-γ3×105IU/kg 20 15.6±2.2環(huán)磷酰胺 20mg/kg 20 24.0±5.3*44.2生理鹽水 0.5ml21 16.6±5.6*與生理鹽水組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。
CMS019(0.5μg/kg/天)、CMS035(0.5μg/kg/天)能夠明顯延長移植性L1210白血病DBA/2小鼠的存活時間，與生理鹽水組比較有顯著性差異(P＜0.05)。7.肽對具有移植的B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠的體液免疫性的影響(方法6.1)表IV.7肽對具有移植的B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠溶血指數(shù)的影響組別藥物劑量 動物數(shù) 溶血指數(shù)CMS001 0.5μg/kg 20 51.0±16.2*$CMS001 5μg/kg 20 41.3±17.7*$CMS001 50μg/kg19 45.0±31.9*$CMS001 500μg/kg 20 36.0±10.2*$CMS003 0.5μg/kg 20 61.6±26.9*$CMS003 5μg/kg 20 37.2±15.9*$CMS003 50μg/kg20 38.7±13.5*$CMS003 500μg/kg 20 35.9±13.0*$CMS008 0.5μg/kg 19 42.7±18.4*$CMS008 5μg/kg 20 38.9±12.0*$CMS008 50μg/kg20 37.1±16.7*$CMS008 500μg/kg 20 50.1±17.8*$CMS010 0.5μg/kg 18 34.9±10.5*$CMS010 5μg/kg 20 51.0±14.6*$CMS010 50μg/kg20 39.6±7.7*$CMS010 500μg/kg 20 50.1±16.7*$CMS011 0.5μg/kg 20 32.0±14.7*CMS011 500μg/kg 20 34.4±19.4*CMS016 500μg/kg 20 43.3±30.0*CMS019 0.5μg/kg 20 42.0±12.0*$CMS019 5μg/kg 20 35.4±15.1*$CMS019 50μg/kg20 28.3±7.6*CMS024 0.5μg/kg 20 43.0±10.7*$CMS024 5μg/kg 20 42.2±11.8*$CMS024 50μg/kg20 27.8±9.1*CMS024 500μg/kg 18 30.1±10.0*CMS034 0.5μg/kg 18 50.8±18.4*$CMS034 5μg/kg 19 43.0±11.7*$CMS034 50μg/kg20 30.2±10.9*CMS035 5μg/kg 20 38.9±21.2*$CMS035 50μg/kg20 44.7±22.7*$CMS035 500μg/kg 19 40.5±25.8*rhIL-2 3×105IU/kg19 49.3±24.7*rmIFN-γ 3×105IU/kg19 60.5±17.4*環(huán)磷酰胺20mg/kg 19 20.7±19.1生理鹽水0.5ml 20 19.0±9.1*與生理鹽水組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。^與IFN-γ組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。&與IL-2組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。$與環(huán)磷酰胺組比較，具有顯著性差異。P＜0.05。
CMS001、CMS003、CMS008、CMS010、CMS011、CMS016、CMS019、CMS024、CMS034、CMS035，在表IV.7所示給藥劑量時，能增強體液應(yīng)答(溶血指數(shù)增加)，與生理鹽水組比較有顯著差異(P＜0.05)。8.肽對C57BL/6小鼠中的接種的B16黑色素瘤細(xì)胞的存活性的影響(方法6.2)在用CMS008(0.5μg/kg/天、5μg/kg/天、50μg/kg/天)、CMS016(5μg/kg/天、500μg/kg/天)處理的小鼠肺中沒有任何存在B16黑色素瘤灶的跡象。
結(jié)論本研究依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局1993年頒布的《新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則》中的抗腫瘤藥效學(xué)指導(dǎo)原則，觀察肽對小鼠移植性腫瘤的治療作用，得出以下結(jié)論1.CMS010、CMS034、CMS035在合適劑量能夠明顯抑制小鼠中移植S180肉瘤的生長；2.CMS001、CMS034在合適劑量能夠增強荷S180肉瘤小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬免疫活性；3.CMS008、CMS011、CMS024、CMS032在合適劑量能夠延長腹水型肝癌H22小鼠的存活時間；4.CMS010、CMS019、CMS024、CMS034、CMS035在合適劑量能促進(jìn)腹水型肝癌H22小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化；5.CMS003、CMS014、CMS024、CMS032、CMS034在合適劑量可以增強用腹水型肝癌H22移植的小鼠的NK細(xì)胞胞毒活性；6.CMS019、CMS035在合適劑量能夠延長移植性L1210白血病小鼠的存活時間；7.CMS008、CMS016在合適劑量可抑制小鼠中移植性B16黑色素瘤的發(fā)展；8.CMS001、CMS003、CMS008、CMS010、CMS011、CMS016、
CMS019、CMS024、CMS034、CMS035在合適劑量能夠促進(jìn)移植有B16黑色素瘤的小鼠的體液免疫應(yīng)答。
討論CMS001、CMS003、CMS008、CMS010、CMS011、CMS014、CMS016、CMS019、CMS024、CMS032、CMS034、CMS035自己或作為一部分可用于人類癌癥控制。比如，CMS001、CMS003、CMS008、CMS010、CMS011、CMS014、CMS016、CMS019、CMS024、CMS032、CMS034、CMS035可用于提高癌癥病人的機(jī)體免疫功能；CMS008、CMS010、CMS016、CMS034、CMS035可用干擾腫瘤細(xì)胞的生長；CMS008、CMS011、CMS019、CMS024、CMS032、CMS035可用于延長腫瘤病人的生存時間。這些肽，可單獨或聯(lián)合使用、或與其它藥物或食物成分共同作用，用于腫瘤的全程控制。
表IV.8對癌癥有效的肽CMS代碼 SEQ ID NOCMS001 1CMS003 27CMS008 3CMS010 4CMS011 30CMS014 7CMS016 9CMS019 11CMS024 16CMS032 22CMS034 24CMS035 25參考文獻(xiàn)1.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則.中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.1993，7137-1432.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則.中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.1993，7128-1293.章元沛，蘇懷德.藥理學(xué)實驗(第二版).人民衛(wèi)生出版社.1998，137-1384.徐叔云，卞如濂，陳修主編.藥理實驗方法學(xué).1991，1221-12345.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則.中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.1993，71406.何金生，李瑞珠，宗庭益.MTT還原法檢測NK細(xì)胞活性的方法學(xué)研究.中國免疫學(xué)雜志，1996；1(6)356-3587.楊耀琴，楊虎川，陶惠紅等.吐溫對溫?zé)嵋至鲎饔玫脑鰪娦?yīng)—小鼠黑色素瘤實驗研究.腫瘤防治研究，1999；26(4)8-128.付堅，鄭杰，方偉崗等.白細(xì)胞介素12基因轉(zhuǎn)染抑制B16細(xì)胞成瘤性及轉(zhuǎn)移性的研究.中華醫(yī)學(xué)雜志，1998；78(8)627-6299.汪謙.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗方法.人民衛(wèi)生出版社.1998，482-48310.潘啟超，胥彬.腫瘤藥理學(xué)與化學(xué)治療學(xué)(第二版).河南醫(yī)科大學(xué)出版社.2000，66-6911.章元沛，蘇懷德.藥理學(xué)實驗(第二版).人民衛(wèi)生出版社1998，131V.對體重的作用喂食健康大鼠高營養(yǎng)飼料5周，伴有或不伴有同時肽治療(肌肉內(nèi)300μg/kg/day)。注射生理鹽水的正常飲食大鼠作為陰性對照組。治療5周后，停止注射，維持相同飲食3周。每周測大鼠體重及觀察行為變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肽治療過程中，接受CMS015治療的大鼠體重增長幅度明顯低于對照組，撤藥后體重增長減緩的趨勢逐漸減退。因此，表明合適劑量水平的肽CMS015對營養(yǎng)性肥胖大鼠的體重增長有可逆性抑制作用。材料Sprague Dawley(SD)大鼠，雌雄兼?zhèn)?，體重145±10g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。肽，L-氨基酸來源，由American PeptideCompany，Inc.，USA合成，使用時以生理鹽水稀釋為10μg/ml的注射液。大鼠高脂肪高營養(yǎng)飼料及普通飼料配方參照國家藥品監(jiān)督管理局頒布的新藥臨床前研究指導(dǎo)原則[1]的“減肥藥”項。方法健康大鼠隨機(jī)分為實驗組、陽性對照組及陰性對照組，每組10只，雌雄各半。實驗組大鼠給予高營養(yǎng)飼料5周，同時給予肌注肽300μg/kg/day，每天1次。陽性對照組給予相同高營養(yǎng)飼料，但以安慰劑生理鹽水注射，而陰性對照組大鼠食普通飼料和安慰劑注射，用來驗證前兩組造模是否成功。5周治療后，停止注射，保持相同飼料3周。每周測大鼠體重及觀察行為變化。統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，用配對t檢驗及單因素ANOVA分析進(jìn)行組間及組內(nèi)比較。顯著性差異為P≤0.05。結(jié)果1.肽對SD大鼠體重的影響表V.1肽對SD大鼠體重的影響

與陽性對照組相比*P＜0.05與對照組相比較，肽CMS015以300μg/kg/d給藥能明顯抑制營養(yǎng)性肥胖大鼠的體重增長(P＜0.05)。治療組和對照組的差異隨治療時間加大。CMS015組停藥后，治療組和對照組的差異逐漸降低，在3周后差異不再統(tǒng)計學(xué)顯著，表明肽對SD大鼠體重的作用是可逆的。
在整個實驗期間，各組大鼠食欲和活動均未受影響。討論從本實驗結(jié)果可以得出，給予合適劑量的肽CMS015能夠抑制營養(yǎng)性肥胖大鼠的體重增長，因此有潛力應(yīng)用于人類減肥。該肽將來可以單獨使用、或與兩個以上肽類合用、或與其它藥物或食療合用于肥胖的綜合治療。
本研究僅檢驗了肌肉注射這一給藥途徑，但不排除其它可能有效的給藥途徑。肽CMS015可以經(jīng)靜脈注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射或皮下植入等途徑給藥，可以用或不用諸如脂質(zhì)體、持續(xù)釋放保護(hù)等藥物傳遞易化裝置。該肽也可以用片劑、膠囊、懸液、溶液等任何口服給藥形式，以及有或沒有胃腸保護(hù)的不作修飾的普通形式或緩釋形式。該肽還可進(jìn)一步用于表皮，制成如油膏、乳膏、膠體等，可用或不用透皮易化裝置，或制成吸入粉劑、溶劑或脂質(zhì)體保護(hù)形式。該肽也可以翻譯成基因序列，克隆進(jìn)入一個表達(dá)系統(tǒng)，單獨或者與其它肽序列結(jié)合產(chǎn)生一個經(jīng)純化或不經(jīng)純化的肽分子，其可利用的活性正如本文所描述的那樣。
表V.2對肥胖有效的肽CMS代碼 SEQ ID NOCMS015 8參考文獻(xiàn)1.國家藥品監(jiān)督管理局，主編。新藥臨床前研究指導(dǎo)原則，1993年，第1版。
應(yīng)理解的是可以在上述肽的氨基端或羧基端增加額外的氨基酸以作為實施本發(fā)明的另一方法。例如，在所述肽中增加一個或兩個氨基酸而并未使其生物功能受到影響，也可以增加三或四個氨基酸而仍保持肽的功能。這些均稱為該肽的變異體?；蛘?，可從肽中缺失一個或兩個氨基酸而并未使其生物活性受到影響，還可進(jìn)一步缺失三或四個氨基酸而不影響肽的生物功能。這些稱為本發(fā)明肽的片段。另外，肽的衍生物如在同一功能區(qū)內(nèi)進(jìn)行一個氨基酸的保守置換也可用于實施本發(fā)明的另一方面。例如，具有非極性端或稱疏水側(cè)鏈的肽可以被取代一個側(cè)基而其生物學(xué)功能并不減弱。作為進(jìn)一步的例子，接頭/間隔基可被插入肽形成變體，但這些變體仍保持本研究中所用的原始肽的活性部分。這些被視為本發(fā)明肽的變體。本文所用術(shù)語肽類似物包括具有模擬天然氨基酸結(jié)構(gòu)的氨基酸分子的肽，例如具有不同骨架結(jié)構(gòu)或D-氨基酸取代的類似物。作為進(jìn)一步的例子，盡管用于合成肽的氨基酸是L-光學(xué)異構(gòu)形式，但是序列中一或多個氨基酸被D-型取代的肽可能具有類似的生物活性。本申請權(quán)利要求中所用術(shù)語“功能性衍生物”涵蓋本發(fā)明肽的片段、變體、類似物和化學(xué)衍生物。
本文所用術(shù)語“雜合肽”是指含有插入具有SEQ ID NO1-30的原始生物活性肽或其功能衍生物中的額外肽但仍保持基本類似的活性的肽。額外肽包括前導(dǎo)肽，其含有例如由一或多個原核或真核細(xì)胞識別作為將該雜合肽分泌至胞外的信號的氨基酸序列。分泌可以是直接分泌，或通過分泌小泡間接分泌。
“基本上純化的肽”是指純度至少為10％(w/w)的肽，優(yōu)選純度為20％，更優(yōu)選為40％，更優(yōu)選為60％，進(jìn)一步優(yōu)選為大于90％。在最優(yōu)選的實施方案中，純度大于99％。如下文所述，基本上純化的肽可做為混合物中的部分成分進(jìn)行藥物或營養(yǎng)配方的制備。
上述肽用在藥物配方中可用于治療免疫失調(diào)以及對于免疫性有繼發(fā)作用的疾病，如癌癥或感染或任何上述癥狀。在這些肽的藥物配方中，除含有一種已確定的肽外，還可能混有其它活性或非活性組分，這些組分包括其它肽，例如兩個或若干個(例如3-5個)所列肽可以加到同一配方中，可伴有或不伴有其它成分?；蛘?，一個所列肽可以與未列出的肽一起用于制備配方。此類配方可以經(jīng)靜脈、肌肉、皮內(nèi)、皮下或真皮內(nèi)給藥，或動脈注射直接作用于器官，還可以以粉末、噴霧的方式經(jīng)呼吸道吸入，經(jīng)皮吸收或本領(lǐng)域已知的其它輸送方式。配方還可以口服，并可含有可用于在口服后防肽的胃消化的載體，或本領(lǐng)域已知的任何其它載體(對于經(jīng)皮，如脂質(zhì)體)。
藥物配方可包括任何已知的藥物載體，合適的載體的例子包括本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)藥物學(xué)可接受的載體，包括但不局限于，生理鹽水、水、乳劑如油水混合物或甘油三酯乳劑，或其他制劑，填充劑、包衣片劑或膠囊等等，適宜的載體依據(jù)給藥方式進(jìn)行選擇。
肽可以經(jīng)靜脈注射、肌肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射和皮下植入而給藥。肽還可以任一口服給藥形式如片劑、膠囊、懸液、溶液等以未修飾的常用形式或緩釋形式或胃腸道保護(hù)或不保護(hù)形式給藥。肽可進(jìn)一步以任何局部應(yīng)用的形式如軟膏、霜、凝膠等經(jīng)或不經(jīng)經(jīng)皮促進(jìn)裝置給藥。肽還可轉(zhuǎn)成其遺傳序列并克隆進(jìn)表達(dá)系統(tǒng)，或以其本身或與其它肽序列組合以產(chǎn)生肽分子而利用本文所述肽活性。
每一種肽的給藥劑量可以是1ng-10g/kg體重。注射用給藥劑量可以是10ng-10mg/kg，更優(yōu)選1μg-1mg/kg。藥物的起效劑量可低至1ng/kg，這可能是通過一個或多個肽與受體結(jié)合，或者肽直接引起機(jī)體一系列級聯(lián)式反應(yīng)而起效的。對于口服，給藥劑量可以是1ng-10g/kg體重/天，優(yōu)選0.1μg-1g/kg體重/天，更優(yōu)選是1μg-10mg/kg體重/天。VI、基因治療及治療方法基于所發(fā)現(xiàn)的肽序列的基因療法是通過設(shè)計編碼這些肽之一的核酸序列而進(jìn)行。核酸可化學(xué)合成并與啟動子有效連接而克隆到表達(dá)載體內(nèi)。表達(dá)載體隨后以基因治療的形式給予人體，以在人體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。本文所采用的“基因載體”一詞包括這些表達(dá)載體?？梢杂糜诨蛑委煹妮d體包括腺相關(guān)病毒(Mizuno，M.等(1998)，日本癌癥研究雜志89，76-80)、LNSX載體(Miller，A.D.等(1993)酶學(xué)方法217，581-599)和慢病毒(Goldman，M.J.等(1997)人類基因治療8，2261-2268)。
用于肽輸送的其它載體包括可在宿主生物體中復(fù)制的生物中的編碼所需肽的表達(dá)載體，該宿主生物體希望被給予該肽而不明顯影響該宿主生物體的健康。例如，表達(dá)載體可以被轉(zhuǎn)移至對希望被給予該肽的宿主生物體是非致病性的生物體中。在某些實施方案中，表達(dá)載體在一種對希望被給予該肽的宿主生物體的健康沒有明顯有害作用的細(xì)菌或真菌生物中以產(chǎn)生所需的肽。例如，編碼所需的肽的表達(dá)載體可以是在如乳酸菌、大腸桿菌或酵母的生物體中產(chǎn)生所需的肽的表達(dá)載體。在一個實施方案中，表達(dá)載體在一種哺乳動物消化道中天然存在的微生物或哺乳動物消化道耐受的微生物中產(chǎn)生所需的肽?？梢员磉_(dá)所需的肽的一些微生物物種包括但不限于乳桿菌菌種，如L.acidophilus，L.amylovorus，L.casei，L.crispatus，L.gallinarum，L.gasseri，L.johnsonii，L.paracasei，L.plantarum，L.reuteri，L.rhamnosus，等；雙歧桿菌菌種，如B.adolescentis，B.animalus，B.bifidum，B.breve，B.infantis，B.lactis，B.longum等；Enterococcusfaecalis或Ent.facium；Sporolactobacillus inulinus；Bacillus subtilis或Bacillus cereus；Escherichia coli；Propionibacterium freudenreichii；或Saccharomyces cerevisiae或Saccharomyces boulardii。
化學(xué)合成的或以其它方式包括但不限于將mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA分子而產(chǎn)生的編碼本發(fā)明肽的核酸序列被摻入表達(dá)載體中，以通過本領(lǐng)域已知的基因工程方法基因轉(zhuǎn)移進(jìn)所希望的宿主中。表達(dá)載體可以是DNA載體或RNA載體。例如，表達(dá)載體可以基于質(zhì)粒或病毒遺傳元件。表達(dá)載體可以是染色體外復(fù)制的載體或者整合進(jìn)染色體的載體。
表達(dá)載體包括與編碼本發(fā)明肽的核酸有效連接的啟動子。啟動子可以是可調(diào)控的啟動子，如誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子。在一些實施方案中，可以選擇啟動子以提供所需水平的肽表達(dá)。另外，如果需要，表達(dá)載體可以包括其它序列以促進(jìn)肽的產(chǎn)生、呈遞和/或分泌。在一些實施方案中，編碼本發(fā)明肽的核酸與指導(dǎo)肽分泌的核酸序列有效連接。例如，編碼本發(fā)明肽的核酸可以與編碼信號肽的核酸序列有效連接。
在一些實施方案中，被工程化以編碼本發(fā)明肽的表達(dá)載體可以是適于在組成哺乳動物正常消化道菌群的細(xì)菌菌種如乳桿菌菌種和枯草芽孢桿菌中表達(dá)本發(fā)明肽的表達(dá)載體。這種表達(dá)載體的例子可參見美國專利6,100,388和5,728,571。這些文獻(xiàn)以其全文引入本文作參考。應(yīng)理解的是促進(jìn)本發(fā)明肽在不損害希望給予該肽的宿主生物體的健康的生物體中的表達(dá)的任何表達(dá)載體均可使用。
在一些實施方案中，被工程化以編碼本發(fā)明肽的表達(dá)載體可以是適于在被哺乳動物消化道耐受的酵母菌種如Saccharomycescerevisiae或更優(yōu)選地Saccharomyces boulardii(其可在人消化道中寄居并用于治療某些形式的腹瀉)中表達(dá)本發(fā)明肽的表達(dá)載體。組成性表達(dá)異源蛋白和肽的酵母表達(dá)載體可以使用，因為其非常穩(wěn)定，因此在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中可以傳遞至子代，所述載體可包括信號肽或指導(dǎo)重組蛋白高水平分泌的肽的編碼序列。這種酵母載體的例子參見美國專利6,391,585，該文獻(xiàn)引入本文作參考。
編碼本發(fā)明肽的表達(dá)載體可以經(jīng)本領(lǐng)域已知技術(shù)導(dǎo)入欲表達(dá)該肽的生物體中。這些技術(shù)包括轉(zhuǎn)化細(xì)菌、酵母或其它微生物的傳統(tǒng)方法，例如經(jīng)使用化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞、電穿孔或乙酸鋰轉(zhuǎn)化(用于酵母)，以及用這些程序無效的一些細(xì)菌菌種的轉(zhuǎn)化方法的最近進(jìn)展。在一些實施方案中，表達(dá)載體用Leer等(WO95/35389)公開的方法導(dǎo)入已知不能轉(zhuǎn)化的乳酸菌中(該文獻(xiàn)引入本文作參考)。導(dǎo)入的序列可以摻入微生物染色體DNA中或保持染色體外DNA元件的形式。
含有表達(dá)載體的這一基因工程微生物隨后可以接種消化道、陰道、氣管等以實現(xiàn)免疫治療。在一些實施方案中，表達(dá)本發(fā)明肽的生物體以無活性形式攝入，或者優(yōu)選地，以活性形式攝入。在消化道中，這些微生物產(chǎn)生所述肽，通過分泌或微生物的裂解將其釋放進(jìn)腔內(nèi)，或以其它方式將肽呈遞給宿主，由此肽產(chǎn)生其對宿主生物體的預(yù)期作用。在其它實施方案中，在鼻通道、陰道或小腸粘膜處將肽呈遞給宿主生物體。
另一種治療方法是使用脂質(zhì)體作為輸送特異核酸至人體細(xì)胞的方式。核酸(如含有編碼SEQ ID NO1-30的肽的核酸的表達(dá)載體)在有利于細(xì)胞吸收和染色體摻入的環(huán)境中被輸送，如Gao，X.和Huang，L.(1995)基因治療2，710-722和美國專利6,207,456所述?；蛘撸褂肬S6,245,427的方法，肽本身可包在脂質(zhì)體中并直接輸送。上述所有科學(xué)出版物和專利均引入本文作參考。
可用于上述基因治療和治療方法的核酸序列包括編碼這些肽及其功能衍生物的序列?；诤啿⒚艽a系統(tǒng)，許多核酸序列中的任何一種均可用于編碼這些肽及其衍生物。
下述參考文獻(xiàn)引入本文作參考1.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則.中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.1993，7134_1352.徐叔云，卞如濂，陳修主編.藥理實驗方法學(xué).1991，1221-12343.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則.中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.1993，71404.何金生，李瑞珠，宗庭益.MTT還原法檢測NK細(xì)胞活性的方法學(xué)研究.中國免疫學(xué)雜志，1996；1(6)356-3585.汪謙.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗方法.人民衛(wèi)生出版社.1998，482-4836.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則.中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.1993，71417.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則.中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.1993，7132-1338.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則.中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.1993，7128-1299.章元沛，蘇懷德.藥理學(xué)實驗(第二版).人民衛(wèi)生出版社.1998，137-13810.李家泰.臨床藥理學(xué)(第二版).人民衛(wèi)生出版社.1998，1338-1339實施例1 經(jīng)基因工程乳桿菌菌種輸送肽以下提供了將本發(fā)明肽輸送至如上所述宿主中的一個舉例方法。編碼表A中所列的一個肽的DNA序列經(jīng)化學(xué)方法合成，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)將這一DNA序列導(dǎo)入一表達(dá)載體中。所選的表達(dá)載體含有在乳桿菌中有功能的組成型啟動子，一個用于以特異的5′至3′方向?qū)隓NA序列的多克隆位點，以及一個賦予對抗生素的抗性的選擇標(biāo)記基因(以輔助克隆程序)，并且還可含有有助于肽的產(chǎn)生和/或分泌的其它序列，如信號肽序列。這種載體的一個例子參見美國專利5,592,908，其引入本文作參考。簡要地，該專利討論了在乳桿菌菌種中有功能的若干已知啟動子，以及在所述細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)新啟動子的方法，這些啟動子的任一種均可與編碼本發(fā)明肽的核酸有效連接以在乳桿菌中表達(dá)所述肽。編碼信號肽如美國專利5,592,908所述的在乳酸乳桿菌中有活性的由16-35個多數(shù)為疏水的氨基酸組成的肽的核酸被插入啟動子和編碼本發(fā)明肽的核酸之間，從而編碼信號肽的核酸與編碼本發(fā)明肽的核酸同框。
除了肽的編碼序列之外，合成的DNA序列還可包括有助于將所述DNA連接并克隆進(jìn)表達(dá)載體的序列。例如，相應(yīng)于載體的多克隆位點的一個位點的限制酶識別位點可被摻入合成DNA中，從而所述序列可以正確方向克隆進(jìn)載體中。載體和合成DNA用特定限制酶消化，然后純化。載體和合成DNA連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌合適菌株中。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含有載體賦予抗性的抗生素的培養(yǎng)基上鋪板。選擇轉(zhuǎn)化細(xì)菌的菌落進(jìn)行生長培養(yǎng)和質(zhì)粒制備。證實存在正確方向的合成DNA。
然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)乳桿菌菌種如L.acidophilus的細(xì)菌宿主細(xì)胞中。通過載體序列中的選擇標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，肽的分泌可通過進(jìn)行Western印跡、進(jìn)行存在于培養(yǎng)基中的肽的凝膠電泳和其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)證實。選擇細(xì)菌轉(zhuǎn)化菌落并用于制備基因工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)物。培養(yǎng)表達(dá)所需肽的基因工程菌的培養(yǎng)物并將其至少一部分給予宿主生物體的消化道、陰道、氣管或該細(xì)菌可在其中復(fù)制的其它區(qū)域。如果需要，可以各種方式處理細(xì)菌培養(yǎng)物以產(chǎn)生由宿主腸道吸收的補劑。這些處理包括凍干或其它保存細(xì)菌的方法，另外可將細(xì)菌與載體試劑如溶液、溶劑、分散介質(zhì)、緩釋劑、乳液等組合。這些試劑制備補劑的用途是本領(lǐng)域熟知的。例如，細(xì)菌可用于制備酸奶產(chǎn)品或其它食品供人類消費，從而表達(dá)肽的微生物寄居在人消化道中。將乳酸菌的特殊菌株摻入食品如酸奶、泡菜、乳酪和奶油的各種不同方法參見美國專利6,036,952，其引入本文作參考。通過任一種途徑攝入細(xì)菌后，工程菌可寄居在消化道中使得經(jīng)消化道的粘膜層呈遞和/或吸收本發(fā)明肽。實施例2 經(jīng)基因工程形式的枯草芽孢桿菌輸送肽以下提供了將本發(fā)明肽輸送至如上所述宿主中的一個舉例方法。編碼表A中所列的一個肽的DNA序列經(jīng)化學(xué)方法合成，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)將這一DNA序列導(dǎo)入一表達(dá)載體中。所選的表達(dá)載體包括穿梭載體，如pTZ18R(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中均能繁殖并含有抗生素抗性基因以選擇轉(zhuǎn)化菌落。這一載體可以含有在枯草芽孢桿菌中有活性的啟動子，如衍生自枯草芽孢桿菌SacB基因的啟動子，以及編碼在枯草芽孢桿菌中有活性的信號或前導(dǎo)肽的核苷酸序列，該信號或前導(dǎo)肽指導(dǎo)表達(dá)的異源蛋白從細(xì)菌細(xì)胞中有效輸出。這種載體的一個例子參見美國專利6,268,169，其引入本文作參考。簡要地，如上所述，以本領(lǐng)域熟知的技術(shù)合成具有限制酶位點和/或促進(jìn)DNA克隆的其它序列的編碼本發(fā)明肽的DNA。在轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌、鋪板、選擇和繁殖質(zhì)粒產(chǎn)生質(zhì)粒原液后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌，并根據(jù)對鋪板培養(yǎng)基中的抗生素的抗性選擇轉(zhuǎn)化子。
用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)如在SDS-PAGE分析或Western印跡后放射標(biāo)記肽以放射自顯影來證實基因工程枯草芽孢桿菌對肽的產(chǎn)生和分泌。
培養(yǎng)表達(dá)所需肽的基因工程菌的培養(yǎng)物并將其至少一部分給予宿主生物體的消化道、陰道、氣管或該細(xì)菌可在其中復(fù)制的其它區(qū)域。實施例3 經(jīng)基因工程糖酵母菌種輸送肽以下提供了將本發(fā)明肽輸送至如上所述宿主中的一個舉例方法。編碼表A中所列的一個肽的DNA序列經(jīng)化學(xué)方法合成，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)將這一DNA序列導(dǎo)入一表達(dá)載體中。所選的表達(dá)載體包括一穩(wěn)定維持的酵母蛋白表達(dá)載體，包括組成型酵母啟動子如pADH1，使載體在酵母和大腸桿菌中均能復(fù)制的位點，賦予營養(yǎng)缺陷型酵母突變體以原養(yǎng)型的用于選擇目的的一個或多個基因，多克隆位點(MCS)，以及如果需要的編碼信號肽的序列。這種載體是市售的并是本領(lǐng)域熟知的或者可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建。在將合成DNA插入酵母載體、轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌、在選擇培養(yǎng)基上鋪板轉(zhuǎn)化的大腸桿菌、選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌落并從所述菌落的細(xì)菌培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA后，將載體經(jīng)熟知技術(shù)如乙酸鋰轉(zhuǎn)化或電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)啤酒糖酵母。選擇用于轉(zhuǎn)化的啤酒糖酵母菌株是突變的營養(yǎng)缺陷型菌株，其需要質(zhì)粒上的一種基因以在基本培養(yǎng)基上生長。通過將酵母在缺少該載體上提供的基因的培養(yǎng)基上鋪板而選擇轉(zhuǎn)化的酵母菌落。只有接受的載體及其選擇基因并表達(dá)該基因產(chǎn)物的酵母可在基本培養(yǎng)基上生長成菌落。通過進(jìn)行Western印跡、存在于培養(yǎng)基中的肽的凝膠電泳或其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以證實肽的表達(dá)。
選擇酵母轉(zhuǎn)化菌落并用于制備大規(guī)模培養(yǎng)物。培養(yǎng)表達(dá)所需肽的基因工程酵母的培養(yǎng)物并將其至少一部分給予宿主生物體的消化道、陰道、氣管或該酵母可在其中復(fù)制的其它區(qū)域。如果需要，可以各種方式處理酵母培養(yǎng)物以產(chǎn)生由宿主腸道吸收的補劑。這些處理包括凍干或其它保存酵母的方法，另外可將酵母與載體試劑如溶液、溶劑、分散介質(zhì)、緩釋劑、乳液等組合。這些試劑制備補劑的用途是本領(lǐng)域熟知的。在另一實施方案中，轉(zhuǎn)化的酵母可用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備食品如發(fā)酵奶制品如酸奶和kefir。與這些食品中的活乳酸菌培養(yǎng)物一樣，轉(zhuǎn)化的酵母至少短時寄居在消化道中，并經(jīng)消化道腔將肽提供給宿主。
序列表<110>王偉明林剛<120>序列號22的生物活性肽<130>WILKG3.001CP1<140>未知<141>2002-06-20<150>09/904，492<151>2001-07-13<160>30<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>10<212>PRT<213>Sus scrofa<400>1Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe1 5 10<210>2<211>9<212>PRT<213>Sus scrofa<400>2Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe1 5<210>3<211>13<212>PRT<213>Sus scrofa<400>3Lys Ala Val Gly His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu1 5 10<210>4<211>18<212>PRT<213>Sus scrofa<400>4Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn1 5 10 15Pro Lys<210>5<211>13<212>PRT<213>Sus scrofa<400>5Leu Gly Met Glu Ala Cys Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr1 5 10<210>6<211>11<212>PRT<213>Sus scrofa<400>6Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>Sus scrofa<400>7Ala Ala His His Pro Asp Asp Phe Asn Pro Ser Val1 5 10<210>8<211>13<212>PRT<213>Sus scrofa<400>8Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met1 5 10<210>9<211>13<212>PRT<213>Sus scrofa<400>9Ile Gly Met Glu Ser Ala Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr1 5 10<210>10<211>9<212>PRT<213>Sus scrofa<400>10Val Gly Met Gly Glu Lys Asp Ser Tyr1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>Sus scrofa<400>11Val Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr1 5<210>12<211>10<212>PRT<213>Sus scrofa<400>12Val Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr Val1 5 10<210>13<211>10<212>PRT<213>Sus scrofa<400>13Met Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu1 5 10<210>14<211>3<212>PRT<213>Sus scrofa<400>14Tyr Ser Phe1<210>15<211>3<212>PRT<213>Sus scrofa<400>15Ala Ala Phe1<210>16<211>3<212>PRT<213>Sus scrofa<400>16Tyr Ser Leu1<210>17<211>7<212>PRT<213>Sus scrofa<400>17Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met1 5<210>18<211>5<212>PRT<213>Sus scrofa<400>18Phe Glu Glu Asn Met1 5<210>19<211>5<212>PRT<213>Sus scrofa<400>19Phe Glu Pro Ser Phe1 5<210>20<211>4<212>PRT<213>Sus scrofa<400>20Phe Asn Glu Glu1<210>21<211>4<212>PRT<213>Sus scrofa<400>21Phe Glu Glu Met1<210>22<211>4<212>PRT<213>Sus scrofa<400>22Phe Glu Glu Glu1<210>23<211>4<212>PRT<213>Sus scrofa<400>23Phe Glu Ser Phe1<210>24<211>4<212>PRT<213>Sus scrofa<400>24Pro Glu Asn Phe1<210>25<211>4<212>PRT<213>Sus scrofa<400>25Phe Val Asn Asp1<210>26<211>5<212>PRT<213>Sus scrofa<400>26Phe Gln Pro Ser Phe1 5<210>27<211>6<212>PRT<213>Sus scrofa<400>27Phe Asn Phe Val Pro Pro1 5<210>28<211>10<212>PRT<213>Sus scrofa<400>28Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe15 10<210>29<211>11<212>PRT<213>Sus scrofa<400>29Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu1 5 10<210>30<211>10<212>PRT<213>Sus scrofa<400>30Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu1 5 10
權(quán)利要求
1.一種包含SEQ ID NO22的基本上純化的肽。
2.權(quán)利要求1的基本上純化的肽，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
3.基本上由SEQ ID NO22組成的基本上純化的肽。
4.權(quán)利要求3的基本上純化的肽，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
5.由SEQ ID NO22組成的基本上純化的肽。
6.權(quán)利要求5的基本上純化的肽，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
7.包含是SEQ ID NO22的功能衍生物的一種氨基酸序列的基本上純化的肽。
8.權(quán)利要求7的基本上純化的肽，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
9.基本上由是SEQ ID NO22的功能衍生物的一種氨基酸序列組成的基本上純化的肽。
10.權(quán)利要求9的基本上純化的肽，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
11.由是SEQ ID NO22的功能衍生物的一種氨基酸序列組成的基本上純化的肽。
12.權(quán)利要求11的基本上純化的肽，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
13.一種遺傳載體，其包含編碼包含SEQ ID NO22的肽的核苷酸序列。
14.權(quán)利要求13的遺傳載體，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
15.一種遺傳載體，其包含編碼基本上由SEQ ID NO22組成的肽的核苷酸序列。
16.權(quán)利要求15的遺傳載體，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
17.一種遺傳載體，其包含編碼包含是SEQ ID NO22的功能衍生物的一種氨基酸序列的肽的核苷酸序列。
18.權(quán)利要求17的遺傳載體，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
19.一種遺傳載體，其包含編碼基本上由是SEQ ID NO22的功能衍生物的一種氨基酸序列組成的肽的核苷酸序列。
20.權(quán)利要求19遺傳載體，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
21.一種微生物，其遺傳組成包含編碼一外源肽的核酸序列，所述肽包含SEQ ID NO22的氨基酸序列。
22.權(quán)利要求21的微生物，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
23.一種微生物，其遺傳組成包含編碼一外源肽的核酸序列，所述肽包含是SEQ ID NO22的功能衍生物的一種氨基酸序列。
24.權(quán)利要求23的微生物，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
25.一種微生物，其遺傳組成包含編碼一含有與一功能肽相鄰的信號肽的外源雜合肽的核酸序列，所述功能肽具有包含SEQ IDNO22的氨基酸序列，所述信號肽可由所述微生物識別以作為分泌信號導(dǎo)致所述雜合肽在表達(dá)時被分泌進(jìn)所述微生物的環(huán)境中。
26.權(quán)利要求25的微生物，其中所述雜合肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
27.一種藥物組合物，其包含一基本上純化的肽，該肽包含SEQID NO22。
28.權(quán)利要求27的藥物組合物，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
29.一種藥物組合物，其包含一基本上純化的肽，該肽基本上由SEQ ID NO22組成。
30.權(quán)利要求29的藥物組合物，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
31.一種藥物組合物，其包含一基本上純化的肽，該肽包含SEQID NO22的功能衍生物。
32.權(quán)利要求31的藥物組合物，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
33.一種藥物組合物，其包含一基本上純化的肽，該肽基本上由SEQ ID NO22的功能衍生物組成。
34.權(quán)利要求33的藥物組合物，其中所述肽調(diào)節(jié)至少一種如下癥狀免疫活性，癌癥的生長和肝癌的生長。
35.一種制備藥物組合物的方法，包括提供一基本上純化的肽，該肽包含SEQ ID NO22的氨基酸序列；以及將所述基本上純化的肽與一藥物學(xué)可接受載體混合。
36.一種制備藥物組合物的方法，包括提供一基本上純化的肽，該肽包含是SEQ ID NO22的功能衍生物的氨基酸序列；以及將所述基本上純化的肽與一藥物學(xué)可接受載體混合。
全文摘要
本發(fā)明公開了30種高純度并且有生物活性的肽。還公開了能夠編碼生物活性肽的核酸序列以及由肽制備的藥物配方。
文檔編號C12N1/21GK1398880SQ02140968
公開日2003年2月26日 申請日期2002年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月13日
發(fā)明者王偉明, 林剛 申請人:深圳市康哲藥業(yè)股份有限公司