專利名稱：具有降低與同化膽固醇能力的新穎耐酸與耐膽鹽乳桿菌分離株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有耐膽鹽與耐胃酸特性且同時具有降低血清膽固醇能力的新穎乳桿菌分離株及它的用途。
背景技術：
“乳酸菌(lactic acid bacteria)”為一群能發(fā)酵醣類并以乳酸為主要產(chǎn)物的細菌，其目前廣為接受的形態(tài)與生理特征為(1)革蘭氏陽性菌；(2)外形為球菌或桿菌；(3)過氧化氫酶試驗為陰性；(4)從它所代謝的葡萄糖可生成50％以上的乳酸；(5)不形成內生性孢子；以及(6)多不具游動性，可在微好氧情況下生長。
直到1980年眾所皆知的一般乳酸菌包含乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)等4個菌屬(W.C.Frazier和D.C.Westhoff，1978，F(xiàn)oodMicrobiology，3rd ed.McGraw-Hill，Inc.，New York，USA)，而廣義的乳酸菌還包括雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)與芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus)這兩個菌屬。而近年來，微生物在分類體系上已可依據(jù)DNA同源性和rDNA序列比對分析而被明確獨立成為一個分類群，并被賦予分類學上的位置。就申請人所知，截至1999年12月，乳酸菌家族已擴增至包含16個菌屬以及223個物種。
經(jīng)由人類或動物宿主的攝食后，可改善該人類或動物宿主的腸內微生物相平衡的單一或混合菌種是所謂的益生菌(O’sullivan等，(1992)，Trends in Food Sci.Technol.，3309-314；Fuller，R.，P.J.Heidt，V.Rush和D.van der Waaij.(eds.)(1995)，Probioticsprospects of use in opportunisticinfections.Old Herborn University Seminar Monograph No.8，pp.1)，其中最為人所熟知及使用的益生菌是乳桿菌(Lactobacillus)與雙歧桿菌(Bifidobacterium)。
自1908年Eli Metchnikoff提出“食用含乳桿菌的酸乳，可以取代正常存在于腸內的產(chǎn)毒菌體，而不只有益健康更能延年益壽”(EliMetchnikoff，1908，The Prologation Of Life，Ed.P.Chalmers Mitchell，G.P.Putnam’s Sons，The Knicherbocker Press，New York & London)的理論后，近年來的研究及臨床試驗結果也顯示“乳桿菌與健康具有重要關連性”。乳桿菌因此受到廣泛的重視。
乳酸菌不只能在腸道復雜的生態(tài)系中占有重要地位，而且對宿主還有健康上的助益。乳酸菌已被發(fā)現(xiàn)的功效包括增進宿主所攝食的食物的營養(yǎng)品質與促進維生素合成及酶產(chǎn)生(J.Denter和B.Bisping，1994，Int.J.Food Microbiol.，2223-31)、抑制腸道內致病菌的生長以及穩(wěn)定腸道內正常菌相平衡(Hose，H.和Sozzi，T.(1991)，J.Chem.Technol.And Biotech.51540-544)、產(chǎn)生抗體物質增加宿主的抵抗力(H.Majamaa等，(1995)，Journal of Pediatric Gastro-enterology and Nutrition，20333-338)以及降低大腸癌的風險及抑制腫瘤(E.J.Schiffrin等，1997，Am.J.Clin.Nutr.，66515S-520S)。同時，也有研究顯示，服用經(jīng)乳桿菌發(fā)酵的乳品也可以降低血清膽固醇的含量。
心血管疾病被列為工業(yè)國家人民的一主要死因。在美國，因心血管疾病而死亡的人數(shù)多于癌癥及其它疾病，其中有四分之三的死因是歸因于動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥，而高血清膽固醇是造成心血管疾病及動脈粥樣硬化的原因之一(Kannel等，(1979)，Ann.Intern.Med.，9085-91；Pekkanen等，(1990)，New England J.Med.，3221700-1707)。在臺灣地區(qū)，近年來腦血管及心臟疾病也一直名列十大死因前茅，且更是老年人最主要的病因與死因，因此，高膽固醇血癥是一不容忽視的病因。
1974年Mann及Spoerry發(fā)現(xiàn)，飲用經(jīng)乳桿菌發(fā)酵后的酸牛乳可降低人體血清膽固醇濃度，而食用新鮮牛奶則無影響(Am.J.Clin.Nutr.，27464-469，1974)。因此，近年來人們對乳酸菌降低膽固醇的處理與功效進行了廣泛的研究。
1982年，K.K.Grunewald于J.of Food Science，472078-2079中報導，當大鼠被喂食以含有經(jīng)過嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)發(fā)酵的10％酸牛乳的食物歷時4周后，大鼠的血清膽固醇濃度顯著下降。1989年，Danielson等人于J.Anim.Sci.，67966-974中報導，以經(jīng)嗜酸乳桿菌LA16分離株發(fā)酵的嗜酸菌酸牛乳(acidophilus yogurt)來喂食被給予高膽固醇飲食的豬歷時56天后，會降低豬的血清膽固醇與低密度脂蛋白(LDL)，而對血清三酸甘油脂與高密度脂蛋白(HDL)則無效用。
上述有關嗜酸乳桿菌LA16分離株的論文，是Dr.khem M.Shahani所領導的研究組所進行的有關嗜酸乳桿菌的特性與生物活性的多項研究之一。特別地，Dr.khem M.Shahani所領導的研究組曾針對一人類來源的嗜酸乳桿菌DDS-1分離株的特性與生物活性而進行相當多的研究，其中包括降低血清膽固醇水平的研究，該DDS-1分離株后來有獲得專利權保護(參見Nebraska Cultures，Inc.公開于網(wǎng)際互聯(lián)網(wǎng)上有關于DDS-1TM的資料，http//www.nebraskacultures.com.benefits.html)。
1997年，Akalin等人比較一般的酸牛乳[由嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)及德氏乳桿菌物種(Lactobacillus delbrueckiisp.)發(fā)酵而來]與嗜酸菌酸牛乳[由嗜熱鏈球菌及嗜酸乳桿菌發(fā)酵而來]對于小鼠血清膽固醇的影響，而發(fā)現(xiàn)嗜酸菌酸牛乳降低血清膽固醇濃度的能力明顯要高于一般的酸牛乳(A.S.Akalin等，(1997)，J.Dairy Sci.，802721-2725)。
1998年Smet等人于British J.of Nutrition，79185-194中報導豬在食用嗜酸乳桿菌的第3至7周內，糞便中膽鹽中的排出量有明顯增加，且在第3至7周內，豬體內總血清膽固醇濃度也有明顯的下降。因此，乳桿菌所具有的BSH的酶活性，可能是造成試驗豬的血清膽固醇降低的作用機制之一。
人體內的膽固醇可由肝臟自行合成，也可由動物性食物中攝取。膽固醇的排泄作用途徑有二(1)因肝臟的代謝作用而形成膽酸，繼而與甘氨酸或?；撬峤Y合而可溶于水，再與鉀或鈉離子形成諸如甘氨膽酸鹽(glycocholates)或牛磺膽酸鹽(taurocholates)等的膽鹽，這些鹽類可經(jīng)由糞便被排出體外；以及(2)形成類固醇激素，再因激素的代謝作用而由尿中排出體外，但此途徑只占小部分。
膽鹽是膽固醇代謝過程中的水溶性終產(chǎn)物物質，而這些膽鹽可能進入至腸肝循環(huán)中，因為腸內菌[包括乳桿菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、雙歧桿菌屬、梭菌屬(Clostridium)和類細菌(Bacteroid)等]的膽鹽水化酶(BSH，E.C.3.5.1.24)的酶作用可使膽酸與甘氨酸或牛磺酸分開，而產(chǎn)生去結合的膽鹽(deconjugated bile salts)。這些去結合的膽鹽不溶于水，且易與血清中膽固醇形成共沉淀而被排出體外。
除上述以外，根據(jù)報導，膽固醇的代謝機制尚有同化作用及共沉淀作用。
1985年，S.E.Gilliland等人在Appl.Environ.Microbiol，49377-381中報導，嗜酸乳桿菌對膽固醇有吸附及同化作用，且在0.3％牛膽汁的環(huán)境下，乳桿菌降低膽固醇的能力較佳。同樣地，Noh等人在J.Dairy Sci.(1997)，823107-3113報導，嗜酸乳桿菌的細胞膜可結合膽固醇，而被吸附的膽固醇會進一步被同化代謝成細胞所需物質。
另一方面，F(xiàn).A.M.Kalver和R.van der Meer在Appl.Environ.Microbiol(1993)，591120-1124中報導，乳桿菌和雙歧桿菌對于膽固醇沒有同化作用，而是在pH值低于6.0時，因為菌體對膽鹽的共軛活性增加(此現(xiàn)象也可能和菌體所具有的BSH活性有關)，而使膽固醇與膽鹽形成共沉淀，而降低了培養(yǎng)基中的膽固醇含量。
1997年，M.M.Brashears和S.E.Gililland指出，在不控制pH值的情況下(即正常pH值為4.5至5.5)，乳桿菌具有良好的膽固醇共沉淀，而若控制pH值維持在6.0左右，該菌降低膽固醇的能力明顯地減低(M.M.Brashears和S.E.Gililland(1997)，Influences of pH during growth onremoval of cholesterol from MRS broth by Lactobacillus casei andLactobacillus acidophilus，Animal Science Research Report，pp.32-37；http//www.ansi.okstate.edu/research/1997rr/006.htm)。
1998年，張佳程與駱承庠以高脂乳、食用油脂來進行試驗，而認為“同化作用”是乳酸菌得以降低膽固醇的主要作用。(張佳程與駱承庠(1998)，“乳酸菌對食品中膽固醇脫除作用的研究--乳酸菌菌種(株)的篩選，”食品科學(中國)，1920-22)。
1999年，Usman及Hosono于J.Dairy Sci.，82243-248中報導，一種新發(fā)現(xiàn)的乳桿菌物種加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)在無膽鹽的培養(yǎng)條件下可吸收膽固醇。
以生物方法來降低人體血清膽固醇含量是一種比較經(jīng)濟且有效的方式。而由以上文獻資料可知，乳酸菌在體內和體外均可能展現(xiàn)出有效的降低膽固醇效用，其中可能的作用機制包括了膽鹽水解酶的去結合作用、膽固醇與去結合的膽鹽于酸性pH值下產(chǎn)生共同沉淀以及乳酸菌細胞對膽固醇的同化作用。
但乳酸菌在被攝入人體后，會面臨人體腸胃環(huán)境壓力以及對腸道吸附性的專一性，因此，乳酸菌要在腸道中發(fā)揮功效，首先就必須要能克服消化道的惡劣環(huán)境，并能夠定居(colonization)在腸道。再者，嗜酸乳桿菌是一群營養(yǎng)要求復雜的菌種，除了在酸牛乳品中較穩(wěn)定外，其余市售的各種乳酸菌是以干燥菌粉或其它加工型態(tài)(粉末狀、粒狀及錠狀)而制成產(chǎn)品，菌體經(jīng)長時間在室溫或冷藏儲存下皆存活不易，而造成菌數(shù)不易維持在起始儲存的數(shù)目。因此，市售非酸牛乳品的產(chǎn)品內所含實際菌數(shù)，往往不及其包裝上所標示的菌數(shù)。所以，在乳酸菌產(chǎn)品的生產(chǎn)上，在銷售及儲存過程中如何維持乳酸菌的菌數(shù)，是極為重要的課題。而具有耐酸、耐膽鹽及良好降低血清膽固醇能力等特性的菌株篩選，是開發(fā)優(yōu)良乳桿菌產(chǎn)品的一重要目標。
從上述可知，若在篩選菌種時能直接針對菌株的耐酸、耐膽鹽以及儲存穩(wěn)定性等特性來進行篩選，可以節(jié)省后續(xù)過程的開銷，更可將所篩選得的菌株做更廣泛的應用。而分離源與地域性也和有效菌株的選出有關，因此，近年來人體來源已成為菌株篩選源的一主要訴求。
目前，在日本厚生省所核準的171件特定保健用食品中，有36件(約占全部的21％)為益生性菌種，但產(chǎn)值卻占總數(shù)的82％。在歐洲，益生性菌種于食品市場的產(chǎn)值高達10億美元。在美國，2000年酸酪乳的銷售值即達18.6億美元。在臺灣，于2000年，益生性菌種的市場已成長至42億元，而產(chǎn)品的應用形式也從發(fā)酵乳品、牛奶、冰淇淋、糖果、膳食補充劑等逐年擴增，應用的對象更包含了成人、嬰兒及各種家禽、家畜類。由此可預期，益生性菌種的市場有一廣大的成長空間。
截至目前為止，世界各地對乳酸菌的發(fā)展研究眾多，其中有關于乳桿菌菌株的耐酸性以及降膽固醇能力所公開的專利與發(fā)表文獻，大多以嗜酸乳桿菌菌株為主，且主要是揭示膽鹽耐受性及耐酸性菌株，或是只有強調降低膽固醇能力及膽鹽耐受性部分。目前有關乳桿菌的膽鹽耐受性的研究，是強調菌株可在含0.3％甘氨膽酸鹽(glycocholate)下生長，而耐酸性則以出現(xiàn)于胃液分泌初期的pH 2來進行耐胃酸狀態(tài)試驗。
查已公開的專利，乳桿菌降低血清膽固醇能力約在20％左右，而在發(fā)表文獻方面，依照使用方法而有10～80％左右的差異。
在US 4,839,281、US 5,032,399中提到一種由人類糞便分離出的嗜酸乳桿菌GG(ATCC 53103)，它可生長在含0.15％膽鹽中，而其在pH1～2的酸性環(huán)境下培養(yǎng)2小時后的菌數(shù)殘存數(shù)為103CFU。
S.E.Gilliland與D.K.Walker于J.Dairy Sci.(1990)，73905-911中報導，由豬為來源的嗜酸乳桿菌ATCC 43121(對應于CCRC 17064)及由人類來源的嗜酸乳桿菌ATCC 4356(對應于CCRC 10695)皆可在含0.3％膽鹽中生長，并具有降低血清膽固醇能力。
又，Danieloson等人于J.Anim.Sci.(1989)，67966-974中所報導的由豬分離出的嗜酸乳桿菌LA16菌株以及Dr.khem M.Shahani等人所研究并成為Nebraska Cultures，Inc.的專利產(chǎn)品的人類來源的嗜酸乳桿菌DDS-1分離株(為內源性人類菌株)顯示具有降低血清膽固醇的能力(參見http//www/nebraskacultures.com./benefits.html)。
Usman及Hosono于J.Dairy Sci.(1999)，82243-248中報導，一株被分離出的乳桿菌物種加氏乳桿菌具有耐酸、耐膽鹽及降膽固醇能力。
Yoshio Saito與Jun Mizutani在US 5,516,684與US 5,707,584中公開了兩種嗜酸乳桿菌菌株，也即嗜酸乳桿菌FERM-P-14204與嗜酸乳桿菌FERM-P-14205，這些菌株不會展現(xiàn)膽汁酸的去結合作用、不會抑制養(yǎng)份吸收以及會降低血液與肝中的膽固醇。
就上述所提的非本土來源的乳桿菌菌株，若能由本土分離篩選出具有耐酸、耐膽鹽及良好降低血清膽固醇能力等特性的本土性乳桿菌菌株，應較能確保其于國人腸道環(huán)境的適應性，這樣的本土性乳桿菌菌株在作為引子或是添加至加工產(chǎn)品中，可確保食用后有效到達腸內并定居的訴求，而因此提高產(chǎn)品的機能性。
發(fā)明內容
于是，本發(fā)明的第一方面是從本土人類腸道樣品中篩選出具有耐酸、耐膽鹽及良好降低血清膽固醇能力等多重特性的乳桿菌分離株(isolate)。
申請人以臺灣本土健康幼兒糞便作為菌株分離來源，就腸胃環(huán)境耐酸性、膽鹽耐受性與降低膽固醇能力來篩選所分離出的菌株，而得到6株具有這些多重特性的新穎乳桿菌分離株，即加氏乳桿菌B21T1、B21T6、C21T1、X21B7與B38T38，以及嗜酸乳桿菌B6T7，這些分離株已于公元2002年6月18日保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所的“生物資源保存及研究中心”(BCRC，簡稱生資中心)](臺灣省300新竹市食品路331號)，保藏號分別為CCRC 910195、CCRC 910196、CCRC910198、CCRC 910199、CCRC 910197以及CCRC 910194。這些分離株也有依據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定，于公元2002年6月21日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，保藏號分別為PTA-4483、PTA-4484、PTA-4479、PTA-4480、PTA-4481以及PTA-4482。
經(jīng)與以往的菌株嗜酸乳桿菌ATCC 43121、ATCC 4356與DDS-1比較，本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株被證實具有更佳的降低膽固醇能力。
本發(fā)明的第二方面是提供一種包含有至少一種依據(jù)本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株或其傳代培養(yǎng)后代或由它們衍生出的突變株以及合適的賦形劑的組合物來供以制備諸如飲料、糕點、嬰兒食品、酸牛乳、營養(yǎng)補充品、動物飼料等等的食用品。
本發(fā)明的第三方面是提供一種包含有益生有效量的至少一種依據(jù)本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株或其傳代培養(yǎng)后代或由它們衍生出的突變株的藥物組合物，來供用于治療與預防腸胃疾病以及降低血清膽固醇。
下面結合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細說明，所以本發(fā)明在上述以及其它目的與特征，可借由參照下文的描述、隨附的權利要求書和伴隨的圖式而變得更為明顯，附圖中圖1為顯示本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株與以往乳桿菌菌株在耐酸性上的比較，其中耐酸性以Δlog(a-b)來表示，a為以生理鹽水(pH7)處理2小時后的存活細胞數(shù)，而b為以生理鹽水(pH2)處理2小時后的存活細胞數(shù)；圖2為顯示本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株與以往乳桿菌菌株在膽鹽耐受性上的比較，其中膽鹽耐受性以Δlog(c-d)來表示，c為以MRS肉湯處理24小時后的存活細胞數(shù)，而d為以加有0.3％牛膽汁的MRS肉湯處理24小時后的存活細胞數(shù)；圖3為顯示本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株與以往的乳桿菌菌株，在加與未加0.3％牛膽汁的MRS肉湯內的生長比較；圖4為顯示本發(fā)明所進行菌株降低膽固醇能力的試驗而參考S.Razin等，(1980)，Biochimica Biophysica Acta，598628-640所制備的磷脂酰膽堿-膽固醇容積與膽固醇濃度的關系。
圖5為顯示本發(fā)明所分離出的一株乳桿菌物種加氏乳桿菌B21T1分離株的16SrDNA的核苷酸序列；圖6顯示本發(fā)明所分離出的一株乳桿菌物種加氏乳桿菌B21T6分離株的16SrDNA的核苷酸序列；圖7顯示本發(fā)明所分離出的一株乳桿菌物種加氏乳桿菌C21T1分離株的16SrDNA的核苷酸序列；圖8顯示本發(fā)明所分離出的一株乳桿菌物種加氏乳桿菌X21B7分離株的16SrDNA的核苷酸序列；圖9顯示本發(fā)明所分離出的一株乳桿菌物種加氏乳桿菌B38T38分離株的16SrDNA的核苷酸序列；以及圖10顯示本發(fā)明所分離出的一株嗜酸乳桿菌B6T7分離株與嗜酸乳桿菌以及植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)之間的16SrDNA核苷酸序列差異，其中“以加框標示者”是該B6T7分離株與嗜酸乳桿菌之間的核苷酸差異地址處，而“以*標示者”是該B6T7分離株與植物乳桿菌之間的核苷酸差異地址處。
具體實施例方式
為得到符合本土習性以確保能適應本國人的腸道環(huán)境的本土性乳桿菌，申請人以居住于臺灣新竹地區(qū)的1至6歲健康嬰幼兒的糞便作為期望菌株的篩選源，使用一系列以Rogosa瓊脂基選擇性培養(yǎng)基來篩選乳桿菌疑似菌株(suspected strains)，而從43個樣品中所得的828個分離株中找到400株疑似菌株。這些疑似菌株被進一步測試是否具有于上述“發(fā)明內容”一節(jié)內所說的特性，也就是1.對酸的穩(wěn)定性，2.對膽鹽的穩(wěn)定性，以及
3.具有降低膽固醇的能力，并將這些疑似菌株拿來與公開菌株就上述的特性作比較，而篩選出6株符合上述所求且具良好能力的新穎乳桿菌分離株。
所得到的6株分離株進一步使用API鑒定系統(tǒng)、微生物計算機鑒定系統(tǒng)(Micro-IS System)與16S rDNA序列分析等來作菌株鑒定，而依據(jù)鑒定結果，這6株分離株分別被分類命名為加氏乳桿菌B21T1、B21T6、C21T1、X21B7與B38T38，以及嗜酸乳桿菌B6T7，這些分離株已于公元2002年6月18日保藏于食品工業(yè)發(fā)展研究所(臺灣省300新竹市食品路331號)，保藏號分別為CCRC 910195、CCRC 910196、CCRC 910198、CCRC 910199、CCRC 910197以及CCRC 910194。這些菌株也有依據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定，于公元2002年6月21日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，保藏號分別為PTA-4483、PTA-4484、PTA-4479、PTA-4480、PTA-4481以及PTA-4482。
基于上述的有利特性，依據(jù)本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株適用作為一種益生菌。例如，這些分離株可被配制于廣泛種類的可食性材料內，可食性材料包括流體乳品(牛奶、濃縮牛奶)、發(fā)酵乳品(優(yōu)酪乳、酸乳、冷凍優(yōu)格、乳酸菌發(fā)酵飲料)、奶粉、冰淇淋、乳酪、干酪、豆奶與發(fā)酵豆奶、蔬果汁、果汁及運動飲料等飲料、甜點、糖果、嬰兒食品、食療產(chǎn)品、動物飼料、膳食補充品等。每種產(chǎn)品的含菌量可為每公克或每毫升有約106至109菌落形成單位(CFU)。
明顯地，本領域技術人員可明了，本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株可被當作食品添加成分，借由以往的方法而在原料制備時被添加，或是不參與發(fā)酵而于發(fā)酵過程之后添加，以被配制成任何適用的形式來供人類及非人類動物的吸收。優(yōu)選地，本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株可單獨地或與至少一種其它益生性生物共同配制于可食性材料內，所述其它益生性生物包括乳桿菌屬物種，如嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種(Lactobacillus lactis)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、植物乳桿菌、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、雙歧雙歧桿菌(Lactobacillus bifidus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、高加索乳桿菌(Lactobacillus causasicus)以及鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)；鏈球菌屬物種，如嗜熱鏈球菌、乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)；酵母菌，如念珠菌屬物種Candida Kefyr、弗羅棱酵母菌(Saccharomyces florentinus)；或這些菌種的組合。
另有一種應用形式是將本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株本身或含有此菌株的上述產(chǎn)品予以制成冷凍干燥粉末或噴霧干燥粉末，而使每個產(chǎn)品中約含108至109以上的活性乳桿菌菌體。將此產(chǎn)品添加以酵母粉、醣類或其它填充劑，可再制成錠劑或膠囊形式，例如含有乳桿菌的消化整腸藥劑或者即溶沖泡食品以及供直接食用的菌體粉末。
另外，本發(fā)明也預期將上述新穎乳桿菌分離株單獨地或與其它活性組份共同使用作為控制非期望腸道微生物在哺乳動物的消化道內集生的藥物，以減輕該非期望腸道微生物所造成的不適腸胃癥狀。該組合物可被配制成溶液、乳劑、粉末、錠劑、膠囊或供用于口服給藥的其它適合形式。
又，基于本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株所具有的降低膽固醇能力，本發(fā)明也預期這些乳桿菌分離株用于制備用以降低血清膽固醇的保健食品與非處方醫(yī)藥品的使用。
就以上所述，預期落在本發(fā)明的技術概念范疇內的是那些具有與本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株的細菌學特征的菌株，本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株的傳代培養(yǎng)后代，或是由本發(fā)明的新穎乳桿菌分離株衍生出的突變株。
如本文所用，術語“突變株”意指一種所具遺傳組成相對于參考菌株或親株有至少一個核苷酸差異(例如，經(jīng)由核苷酸的取代、插入或刪除所致)的菌株。除天然突變以外，本發(fā)明的突變株可借由多種方法來生成。例如，這些突變株可借由親株的隨機誘變，例如借由化學突變劑、轉座子或輻射照射而獲得。此外，本發(fā)明的突變株可包含重組型核酸序列。舉例來說，突變株可為帶有額外的核酸序列(例如經(jīng)轉化、轉導或其他方式而插入至親株的細胞內的序列)的菌株。該額外的核酸序列可被編碼成通常地或有條件地表現(xiàn)的聚勝肽。另擇地，該額外的核酸序列可被編碼成一段能改變細胞生理學的核酸序列，例如反義、核酶或其它核酸序列。在另一例中，插入的核酸插入至內源性基因內，并改變(例如增強或破壞)該內源性基因的功能。舉例來說，插入的核酸可為一種將內源性基因去活化的剔除建構物(knockout construct)；或為一種會增加內源性基因的轉錄作用的人工增強子或啟動子。
本發(fā)明將就下面實施例來作進一步說明，但應了解的是，這些實施例只做為例示說明使用，而不應被解釋為本發(fā)明的實施限制。
實施例1乳桿菌分離株的分離與篩選材料與方法一、培養(yǎng)基及稀釋液1.篩選培養(yǎng)基(A)蕃茄汁瓊脂培養(yǎng)基酪蛋白酶促水解產(chǎn)物(Sigma，Louis，Mo，USA) 10g脫脂乳 10g蕃茄汁 400ml
瓊脂 12g蒸餾水 加至1L(B)Rogosa瓊脂培養(yǎng)基Rogosa瓊脂(Merck，Darmstadt，Germany)74.5g蒸餾水 1L經(jīng)微波加熱溶解后，待冷卻至55℃，以醋酸調整pH值至pH5.5(C)乳桿菌選擇培養(yǎng)基(LBS)Rogosa瓊脂 8.4g蕃茄汁 40ml蒸餾水 60ml經(jīng)微波加熱溶解后，待冷卻至55℃，以醋酸調整pH值至pH5.5(D)Rogosa+X-glu瓊脂培養(yǎng)基將80mg的5-溴-4-氯-3-吲哚基1-β-D-吡喃葡糖苷(X-glu)(Sigma，Louis，MO，USA)加入至100ml的0.2M Tris緩沖液(pH8.5)中，并利用超聲振蕩溶解。將10ml所形成的溶液加入至190ml的55℃Rogosa瓊脂中，即成為含X-glu最終濃度為40μg/mL的Rogosa+X-glu瓊脂。
2.細菌活化培養(yǎng)基(A)Bacto乳桿菌MRS肉湯(Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)(B)MRS瓊脂Bacto乳桿菌MRS肉湯再添加細菌瓊脂(Agarbacteriological)(Scharlau Chemie S.A.，Barcelona，Spain，歐盟制造的)(15g/L)。
3.核糖利用性培養(yǎng)基基礎培養(yǎng)基的組成
Bacto 蛋白胨3號 10gBacto酵母提取物 5g(上述兩種組份的制造商為Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)吐溫80 1g檸檬酸氫銨 2g乙酸鈉 5g硫酸鎂 0.1g硫酸錳 0.05g磷酸氫二鉀 2g氯酚紅 0.05％蒸餾水 1L利用HCl將pH值調整至pH6.3將配好的基礎培養(yǎng)基分裝至試管中，每管含4.5ml，經(jīng)121℃滅菌15分鐘后，再加入0.5ml經(jīng)過濾滅菌后的10％核糖溶液。
4.稀釋液5.1％的蛋白胨水(BACTOTMPeptone，Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)二、分離及篩選菌株的操作程序1.取1至6歲幼兒的糞便中段，以長竹簽取出約一小截指頭大小的樣品，并將樣品加入至一內含9ml稀釋液(0.1％蛋白胨水)的試管中，而制成一經(jīng)10倍稀釋的檢液，將試管管內的樣品充分均勻攪拌后靜置數(shù)分鐘，以使樣品中所含微生物釋放至稀釋液中；2.取出1ml的上述稀釋檢液，并將稀釋檢液置入至另一支內含9ml稀釋液的試管中，依此重復進行系列稀釋直至達成104-倍稀釋。
3.就上述步驟2中所做的系列稀釋，分別取出0.2ml已經(jīng)過102-、103-、104-倍稀釋的檢液，并將個別將取出的檢液置于各種篩選培養(yǎng)基(Rogosa瓊脂、蕃茄汁瓊脂、乳桿菌選擇培養(yǎng)基以及Rogosa+X-glu瓊脂)上，以一L型玻棒予以涂抹均勻后，將篩選培養(yǎng)基置于一設定在37℃的溫度下的厭氧培養(yǎng)箱(內含混和氣體5％H2、10％CO2與85％N2)內培養(yǎng)2至4天；4.挑選在Rogosa+X-glu瓊脂上呈現(xiàn)藍色且經(jīng)顯微鏡檢查為無移動性(non-mobile)的桿菌菌落，或是在其它篩選培養(yǎng)基上外觀為半透明且經(jīng)顯微鏡檢查也為無移動性的桿菌菌落，以竹簽挑菌并將挑出的菌置入一含有MRS肉湯以及一發(fā)酵內管的試管中，于37℃下培養(yǎng)1至2天后，收集生長但不產(chǎn)生氣體且經(jīng)革蘭氏染色顯示為陽性的菌株。
5.就上述步驟4所收集到的菌株，以MRS肉湯活化兩次后，依下面所述來進行生長溫度及核糖利用性試驗(i)將1％接種物接種至一MRS肉湯內，并將該培養(yǎng)基置于15℃下靜置培養(yǎng)歷時14天，若有菌體生長，則表示該菌株可以于15℃生長，而若于第14天仍無菌體生長，則表示該菌株無法于15℃下生長；(ii)將1％接種物接種至一MRS肉湯內，并將該培養(yǎng)基置于45℃下靜置培養(yǎng)歷時2天，若有菌體生長，則表示該菌株可以于45℃生長，而若無菌體生長，則表示該菌株無法于45℃下生長；(iii)將1％接種物接種至一核糖利用性培養(yǎng)基，并于37℃下靜置培養(yǎng)數(shù)天，若培養(yǎng)液由紫變黃，表示菌體可以利用核糖生長并產(chǎn)生酸；若7天后培養(yǎng)液仍為紫色，再繼續(xù)靜置培養(yǎng)，若第14天培養(yǎng)液仍未變成黃色，則表示此菌株無法利用核糖生長并產(chǎn)生酸。
三、結果在此實施例中，有關乳桿菌的篩菌培養(yǎng)基主要以Rogosa瓊脂為基礎，有的則再添加以番茄汁或X-glu。番茄汁含豐富維他命B群，而有利于乳桿菌的生長，而Rogosa瓊脂中的醋酸除了降低pH值以抑菌外，高濃度的醋酸根離子同時也有抑制微生物生長的效果。
嗜酸乳桿菌生長在Rogosa瓊脂上的外觀是呈現(xiàn)白色菌落，而不易與其它的乳桿菌分辨。若于Rogosa瓊脂中添加X-glu，嗜酸乳桿菌菌落的外觀即會變成藍色，這是因為嗜酸乳桿菌具有β-D-糖苷酶活性而會打斷X-glu的β-D-糖苷鍵，而產(chǎn)生藍色的發(fā)光團(chromogene)，進而使嗜酸乳桿菌菌落呈現(xiàn)藍色。但是，于細胞中擁有此酶的微生物并不在少數(shù)，故仍須作進一步鏡檢、革蘭氏染色及進行上述的醣類與生長溫度等生理生化的試驗，再挑出具有期望性質的疑似菌株。
申請人從居住于臺灣新竹市地區(qū)的1至6歲健康嬰幼兒糞便中，共收集了43個樣品，每個樣品經(jīng)稀釋后涂抹于各選擇性培養(yǎng)基中，菌株長出后，再從選擇性培養(yǎng)基中挑出顏色與型態(tài)不同的菌落進行鏡檢，若鏡檢結果為桿菌，再進行革蘭氏染色，挑選出革蘭氏陽性的桿菌，并將稱為分離株。將這些分離株置于含發(fā)酵內管的MRS肉湯中，再從中挑選出不會產(chǎn)生氣體的菌株來進行生長溫度與核糖利用性試驗。若測試的菌株能在45℃下生長但不能在15℃下生長，且不能利用核糖作為生長所需碳源的菌株則進行保存，于此階段所收集的菌株被稱作為疑似菌株。
參見表1，申請人在所收集的43個樣品中總計挑選出828株分離株，其中有400株疑似菌株。關于菌株編號方式，舉B6T7為例，B是指培養(yǎng)基種類(LBS)，6是指樣品來源標號，T是指菌株顏色(外觀透明)，而7是指菌落的流水標號。
表1.收集的樣品*標號及其分離株數(shù)
*樣品來源臺灣新竹市的1至6歲幼兒的糞便**本發(fā)明分離株的樣品來源編號這些疑似菌株接著進行下面實施例所描述的耐酸性、膽鹽耐受性試驗及降低膽固醇能力試驗，其中6株經(jīng)試驗而顯示具有良好特性的分離株，即B21T1、B21T6、C21T1、X21B7、B38T38與B6T7，被拿來下列以往的菌株進行這些性質的比較1.嗜酸乳桿菌CCRC 17064(對應于ATCC 43121，分離來源為豬)，此菌為具降低血清膽固醇能力的乳桿菌(S.E.Gilliland等，(1985)，Appl.Environ.Microbiol.，49377-381；S.E.Gilliland和D.K.Walker(1990)，J.Dairy Sci.，73905-911；F.A.M.Kalver and R.van der Meer(1993)，Appl.Environ.Microbiol，591120-1124；D.O.Noh等，(1997)，J.Dairy Sci.，823107-3113)；2.嗜酸乳桿菌CCRC 10695T(對應于ATCC 4356，分離來源為人類)，此菌為來自人體的嗜酸乳桿菌標準株(D.K.Walker和S.E.Gilliland(1993)，J.Dairy Sci.，76956-961)，3.嗜酸乳桿菌DDS-1(分離來源為人類)，此菌為目前市面有售的產(chǎn)品(Nebraska Cultures，Inc.)；4.嗜酸乳桿菌CCRC 14065[對應于CSCO 2401，商業(yè)上可獲自于Commonwealth Scientific Industrial Research Organization(CSIRO)，Canberra，Austrilia]；以及5.一種乳桿菌物種的保藏物加氏乳桿菌CCRC 14619T(對應于ATCC 33323，分離來源為人類)(Int.J.Syst.Bacteriol.(1980)，30，601；E.Lauer and O.Kandler，Bakteriol.Parasitenkd.Infektionskr.Hyg.Abt.1Orig.Reihe C，1980，1，75-78)。
實施例2耐酸性試驗一、實驗操作程序參考J.E.Holcombe等，(1991)，Cult.Dairy Prod.J.，26(3)4-5以及授予Y.S.Yang等人的US 5,711,977中所公開的方法，以中性(pH7)及仿胃酸環(huán)境(pH2)中來作存活菌數(shù)的測試。
各試驗菌株以MRS肉湯活化兩次后，取其菌液離心(3000rpm，10分鐘)，去除上清液后，添加1ml的生理食鹽水溶液(0.85％NaCl，pH7)，先以竹簽將菌體攪散，再振蕩均勻，然后分別取0.5ml經(jīng)散浮的菌液置于pH7及pH2的生理食鹽水溶液中，于37℃的恒溫培養(yǎng)箱內靜置2小時后，分別測其存活菌數(shù)。Δlog菌數(shù)[＝log(在pH7下的菌數(shù)-在pH2下的菌數(shù))]的數(shù)值越小，視為耐酸性較佳的菌株。
二、結果大部分的微生物在酸性環(huán)境中均無耐受性。乳酸菌本身雖為產(chǎn)酸菌，但其生長環(huán)境只能達pH3.2至4.5，因此，在胃中極低pH的環(huán)境(pH2.0至3.2)也成為影響它存活的主要因素。胃酸pH值會隨胃內容物進入時間及種類而有pH1.5～4.5之不同，平均歷時2小時，故試驗時采用pH2作為代表，且因酸性物質與鹽酸相似，故以經(jīng)鹽酸調整pH值為2的生理食鹽水(0.85％NaCl/0.01 N HCl系統(tǒng))，于37℃下處理2小時后測試存活的菌數(shù)，并與pH7的對照組作比較。
試驗結果顯示，經(jīng)不同pH值，37℃/2h處理后，以嗜酸乳桿菌CCRC 17064耐酸性為最佳(圖1)，接受處理的菌數(shù)只降低1.9個log值，而嗜酸乳桿菌CCRC 10695T與加氏乳桿菌CCRC 14619T的耐酸性較差，菌數(shù)分別降低4.3及4.4個log值。
本發(fā)明于實施例1所得到的新分離株B21T1(后經(jīng)細菌學特征鑒定被分類為加氏乳桿菌，如下面實施例所示)與CCRC 14065的耐酸性相近，菌數(shù)降低了3.9個log值。在本發(fā)明中另外5個分離株(B21T6、C21T1、X21B7、B38T38與B6T7)的耐酸性相近，且皆達到Δlog菌數(shù)小于4的耐酸性篩選指針(參見Y.S.Yang等人的US 5,711,977)。
實施例3.膽鹽耐受性試驗一、實驗操作程序各試驗菌株以MRS肉湯活化兩次后，再分別取1％接種物接種于10ml MRS肉湯以及10mL含0.3％牛膽汁的MRS肉湯(MRSO)中，于37℃培養(yǎng)24小時后，以分光光度計分別測定菌體濃度(OD660)。另外，也計數(shù)其殘存菌數(shù)，其中Δlog菌數(shù)值＝log(MRS肉湯的菌數(shù)-MRSO肉湯的菌數(shù))，而Δlog菌數(shù)值越小，表示試驗菌株的膽鹽耐受性越佳。
二、結果乳酸菌經(jīng)膽鹽處理后，不同菌種間的存活率有很大差異，因此，篩選具有膽鹽耐受性的乳酸菌株在選用益生菌上有其重要性(S.E.Gilliland等，(1984)，J.Dairy Sci.，673045-3051；P.Marteau等，(1997)，J.Dairy Sci.，801031-1037)。于先前的研究中，牛膽汁被普遍使用于培養(yǎng)基中來供選擇培養(yǎng)人類腸內菌，因此其效力應很類似于人類膽鹽且平均濃度為0.3％(w/v)(S.E.Gilliland和D.K.Walker(1990)，J.Dairy Sci.，73905-911；D.K.Walker和S.E.Gilliland(1993)，J.Dairy Sci.，76956-961)。
試驗結果顯示，除CCRC 10695T、CCRC 14619T、CCRC 14065外，各試驗菌株不論在含有或不含0.3％牛膽汁的培養(yǎng)基中，所測得的OD660值(菌體濃度)皆在2以上(表2)，這顯示0.3％牛膽汁對于試驗菌株的生長，似乎影響不大。
表2.試驗菌株培養(yǎng)物在含有或不含0.3％牛膽汁的MRS肉湯內培養(yǎng)24小時的生長比較
但是，要注意到本發(fā)明的B6T7及C21T1這兩個菌株在MRSO肉湯的菌體濃度高于MRS肉湯，這顯示可能有其它干擾因子形成而影響到吸光。因此，進一步觀察試驗菌株在兩組培養(yǎng)基內培養(yǎng)24小時后的存活菌數(shù)。
參見圖2，由觀察到的菌數(shù)降低可知，CCRC 14619T的膽鹽耐受性較差，其次為CCRC 10695T以及本發(fā)明的B38T38菌株。而膽鹽耐受性最佳者為本發(fā)明的分離株B6T7，其余各菌株的膽鹽耐受性相近，即于含0.3％牛膽汁的MRS肉湯中培養(yǎng)24小時后，其死滅菌數(shù)皆在1至2個log值內。
另外，觀察部分菌株在含0.3％牛膽汁的MRS肉湯中的生長曲線，以生長曲線斜率代表生長速率，斜率越大，表示生長速率越快，即膽鹽耐受性較佳。由圖3可知，CCRC 17064的生長速率最快，其次為本發(fā)明的分離株X21B7與B21T1，而CCRC 14065、CCRC 10695T及DDS-1的生長最慢。
雖然由不同觀測方式所得的結果略有小差異，由這些試驗可知，本發(fā)明所篩選出的乳桿菌皆具有耐酸性及膽鹽耐受性。
實施例4.菌株降低膽固醇能力的分析一、實驗操作程序(A)膽固醇來源關于菌株降低膽固醇能力的測試，以往文獻與已公開的專利申請所用的膽固醇來源大多采用PPLO(BACT PPLO SERUM FRACTION)，但此產(chǎn)品目前已停止生產(chǎn)，因此，于本實施例中，申請人參考Huang，C.and T.E.Thomopson(1974)，Methods Enzymol.32485-489以及S.Razin等，(1980)Biochimica Biophysica Acta，598628-640中所揭示的磷脂酰膽堿-膽固醇制備方法，采用馬血清及磷脂酰膽堿-膽固醇作為膽固醇來源，而制備出一均勻分布的磷脂酰膽堿-膽固醇溶液容積與所含膽固醇濃度呈一正相關曲線關系(圖4)。
1.馬血清將馬血清溶于水中，以孔徑為0.45μm的過濾膜予以過濾后并存放于-20℃冰箱中。
2.磷脂酰膽堿-膽固醇[蛋卵磷脂(Egg Lecithin)+膽固醇]依據(jù)S.Razin等，(1980)，Biochimica Biophysica Acta，598628-640，將蛋卵磷脂及膽固醇加入至一真空旋轉蒸發(fā)儀(EYELA)的磨砂塞瓶中，以足量的氯仿將其均勻溶解，再以氮氣吹干，以使膽固醇與蛋卵磷脂均勻混合并在磨砂塞瓶內的玻璃壁上形成一均勻薄膜，接著以0.4M蔗糖溶液予以覆溶(re-dissolved)，將氮氣吹入至該磨砂塞瓶內并封上瓶蓋，再以鋁箔包覆，以降低脂質氧化的機率。
在4℃下以水浴式超聲震蕩器震蕩該經(jīng)密封的磨砂塞瓶歷時15分鐘后，將上述混合溶液加壓通過具一孔徑為0.22μm的過濾膜2次，隨即保存于4℃冰箱內(須于3天內使用)。
(B)試驗組別試驗(1)試驗菌株以MRS肉湯活化兩次后，取1％接種物接種于10ml MRSS(內含8.8ml MRS以及1.2ml膽固醇溶液與0.3％牛膽汁)中，并于37℃的厭氧培養(yǎng)箱(10％CO2及90％N2)內培養(yǎng)歷時24小時，然后依下面(C)項中所述，收集接種有試驗菌株的培養(yǎng)物的上清液樣品以及細胞沉淀丸樣品來供膽固醇含量測定使用。
試驗(2)菌株以MRS肉湯活化兩次后，取1％接種物接種于10mLMRSO中，在37℃下培養(yǎng)歷時20至22小時，再取出1％接種物接種于10mL MRSS中，并于一為37℃的厭氧培養(yǎng)箱(10％CO2及90％N2)內培養(yǎng)歷時24小時，然后依下面(C)項中所述，收集接種有試驗菌株的培養(yǎng)物的上清液樣品以及細胞沉淀丸樣品來供膽固醇含量測定使用。
(C)膽固醇含量的測定膽固醇含量的測定是依據(jù)對苯二甲醛(o-phthalaldehyde)方法來進行(L.L.Rudel和M.D.Morris(1973)，Notes on Methodology，14364-366；S.E.Gilliland等，(1985)，Appl.Environ.Microbiol，49377-381)。
就上述試驗(1)與試驗(2)，各取1ml的測試菌液，以12000rpm離心10分鐘后，將0.5ml上清液置于一試管中，此即為接種有試菌株的培養(yǎng)物的上清液樣品。
就上述試驗(1)與試驗(2)，各取1ml的測試菌液，以3000rpm離心10分鐘后，除去上清液，所形成的細胞團粒(cell-pellet)以10ml MRSO肉湯覆溶并混合均勻后，取出0.5ml溶液置于一試管中，此即為接種有試驗菌株培養(yǎng)物的細胞沉淀丸樣品。
各測試樣品予以加入3ml的95％乙醇并振蕩均勻，再加入2ml 50％KOH振蕩均勻，接著于60℃水浴下加熱10分鐘，再置于室溫下冷卻。經(jīng)冷卻的溶液予以加入5ml己烷并振蕩均勻，再加入3ml的H2O。所形成的混合物在振蕩均勻后于室溫下靜置15分鐘，取出2.7ml的己烷層并移到另一試管內，于60℃下利用氮氣將己烷蒸發(fā)。蒸發(fā)后的固體被加入4ml的對苯二甲醛試劑溶液(0.5mg對苯二甲醛/1ml乙酸)，振蕩均勻后靜置于室溫下歷時10分鐘，再加入2ml濃硫酸，振蕩均勻后靜置于室溫下歷時10分鐘，再以分光光度計來測定OD550值。
(D)菌株降低膽固醇能力的評估依據(jù)下列公式來評估菌株降低膽固醇的能力A＝100-[(B/C)×100]A＝膽固醇的降低率(％)B＝接種有試驗菌株的培養(yǎng)物的上清液樣品內的膽固醇含量(mg)C＝未接種有試驗菌株培養(yǎng)物的上清液樣品內的膽固醇含量(對照組)若A值達80％以上，即視為具有明顯下降膽固醇能力。
(E)試驗菌株的膽固醇同化作用的評估A′＝100-[(B′+C′)×100]A′＝膽固醇的同化作用(％)B′＝接種有試驗菌株培養(yǎng)物的上清液樣品內的膽固醇含量(％)C′＝接種有試驗菌株培養(yǎng)物的細胞沉淀丸樣品內的膽固醇含量(％)若A′值達15％以上，即視為具明顯膽固醇同化能力。
二、結果
I、菌株降低膽固醇的能力比較試驗(1)(也即在MRS肉湯內的生長)與試驗(2)(也即在MRSO肉湯內的生長)，兩者間的差別在于試驗(2)中的試驗菌株有先被接種至MRSO肉湯內培養(yǎng)20至22小時，再取1％接種物予以接種至10ml MRSS中，此用意是在于再一次篩選菌株是否有好的膽鹽耐性，同時也可篩選具有降膽固醇能力的菌株。
以馬血清作為膽固醇來源的試驗結果顯示(表3)，以往的嗜酸乳桿菌CCRC 17064以及DDS-1，在此試驗同樣也有明顯效果，降低膽固醇能力達88至98％。而CCRC 14065、CCRC 10695T與CCRC 14619T的降膽固醇能力則不明顯，這可能是因為這些菌株的膽鹽耐性較差，在MRSO肉湯內的生長較差，以致所觀察到的降低膽固醇能力只達30至43％。
而本發(fā)明所得的分離株B6T7、C21T1、B21T1、B21T6、B38T38及X21B7在兩組試驗中，降低膽固醇的能力皆達91至99％以上，略高于CCRC 17064及DDS-1所具有的，而顯示出本發(fā)明所篩選的菌株也具有良好的降低血清膽固醇的能力。
表3.試驗菌株降低膽固醇(馬血清模型)a能力的評估于MRS肉湯b內的生長 于MRSO肉湯c內的生長培養(yǎng)物 膽固醇d膽固醇降低率膽固醇d膽固醇降低率(μg/ml) (％)(μg/ml) (％)B6T7 6.71 92.2 7.14 92.7C21T1 0.69 99.2 2.41 97.2B38T382.24 97.4 7.57 91.2B21T1 3.10 96.6 0.34 99.6B21T6 2.84 96.7 2.24 97.4X21B7 1.34 98.4 3.27 96.2CCRC 170641.12 98.7 9.81 88.4CCRC 106958.00 90.7 56.9733.8CCRC 1406511.7086.4 59.9030.4CCRC 146192.84 96.7 49.1442.9DDS-1 5.94 93.1 5.16 94.0Control 86.06- 86.06-
a補充有0.3％牛膽汁與12％馬血清的MRS肉湯.
b在試驗前，所有培養(yǎng)物使用1％接種物被傳代培養(yǎng)于MRS肉湯內，并于37℃下培養(yǎng)歷時24小時.
c在試驗前，所有培養(yǎng)物使用1％接種物被傳代培養(yǎng)于MRSO肉湯(MRS肉湯加上0.3％牛膽汁)內，并于37℃下培養(yǎng)歷時24小時.
d肉湯內的初始膽固醇含量為86.06μg/ml.
參見表4，比較馬血清試驗中具有降低膽固醇能力的菌株，改以磷脂酰膽堿-膽固醇作為膽固醇來源時，發(fā)現(xiàn)到各菌株的膽固醇降低率(％)有下降趨勢，這顯示乳桿菌菌株對于不同型態(tài)的膽固醇的降低能力會有變化，其中CCRC 17064對于磷脂酰膽堿-膽固醇的降低率為11至29％，而本發(fā)明所得到的菌株對于磷脂酰膽堿-膽固醇的降低率為23至48％，顯然要比CCRC 17064為高，但略低于DDS-1所具有的50％。
表4.試驗菌株降低膽固醇(磷脂酰膽堿-膽固醇模型)a能力的評估于MRS肉湯b內的生長于MRSO肉湯c內的生長培養(yǎng)物 膽固醇d膽固醇降低率膽固醇d膽固醇降低率(μg/ml) (％)(μg/ml) (％)B6T7 45.0523.92 33.70 43.10C21T1 30.7148.15 43.59 26.40B38T3833.7543.01 35.16 40.62B21T1 32.3445.39 32.83 44.57B21T6 35.4340.16 36.25 38.79X21B7 35.1140.71 39.29 33.65CCRC 1706452.6611.07 42.01 29.06DDS-1 29.2450.63 29.46 50.26Control 59.22- 59.22 -a補充有0.3％牛膽汁與12％磷脂酰膽堿-膽固醇的MRS肉湯.
b在試驗前，所有培養(yǎng)物使用1％接種物被傳代培養(yǎng)于MRS肉湯內，并于37℃下培養(yǎng)歷時24小時.
c在試驗前，所有培養(yǎng)物使用1％接種物被傳代培養(yǎng)于MRSO肉湯(MRS肉湯加上0.3％牛膽汁)內，并于37℃下培養(yǎng)歷時24小時.
d肉湯內的初始膽固醇含量為59.22μg/ml.
II、試驗菌株對膽固醇的同化作用有關乳酸菌降低膽固醇的機制，主要是利用膽固醇和去結合的膽鹽(deconjugated bile salt)產(chǎn)生共沉淀而將膽固醇排除(F.A.M.Kalver和R.van der Meer(1993)，同前述；M.M.Brashears和S.E.Gililland(1997)，同前述)，以及菌株本身對膽固醇的同化作用(Gilliland等，(1985)，同前述；D.O.Noh等，(1997)；同前述；以及張和駱等人(1998)，同前述)。
參見表5所示，可看出CCRC 17064、本發(fā)明所得到的6個分離株以及DDS-1對膽固醇皆具有同化作用，但不同菌株對于膽固醇的同化能力略有差異，所觀察到的同化率約在11至40％左右。而CCRC 14065及CCRC 10695T及CCRC 14619T的膽固醇同化能力則不明顯。
表5.試驗菌株的膽固醇a同化率的評估MRS肉湯b內的生長 于MRSO肉湯c內的生長用過的肉湯 細胞沉淀 被同化 用過的肉湯 細胞沉淀 被同化的培養(yǎng)物培養(yǎng)基內的 丸內的膽 的膽固 培養(yǎng)基內的 丸內的膽 膽固醇(％)膽固醇d(％) 固醇(％) 醇(％) 膽固醇(％) 固醇(％)B6T7 7.851.4 40.8 7.3 74.1 18.6C21T1 0.886.0 13.2 2.8 72.3 24.9B38T382.679.1 18.3 8.8 83.7 7.5B21T1 3.481.7 14.9 0.4 88.4 11.2B21T6 3.367.2 29.5 2.6 81.4 16.0X21B7 1.667.0 31.4 3.8 71.3 24.9CCRC 170641.368.5 30.2 11.6 72.9 15.5CCRC 106959.371.7 19.0 66.2 33.4 0.4CCRC 1406513.6 82.0 4.469.6 27.8 2.6CCRC 146193.380.6 16.1 57.1 42.7 0.2DDS-1 6.978.5 14.6 6.0 81.3 11.2a補充有0.3％牛膽汁與12％馬血清的MRS肉湯.
b在試驗前，所有培養(yǎng)物使用1％接種物被傳代培養(yǎng)于MRS肉湯內，并于37℃下培養(yǎng)歷時24小時.
c在試驗前，所有培養(yǎng)物使用1％接種物被傳代培養(yǎng)于MRSO肉湯(MRS肉湯加上0.3％牛膽汁)內，并于37℃下培養(yǎng)歷時24小時.
d對照組內的膽固醇濃度被界定為100份.
綜合以上試驗結果，本發(fā)明所篩選出的6株本土性乳桿菌分離株顯示具有良好耐酸、耐膽鹽及降膽固醇能力的特性。于下進一步進行這些分離株的細菌學特征鑒定。
實施例5.乳桿菌分離株的鑒定和表征一、實驗操作程序(1)初步試驗將新鮮培養(yǎng)(18至24小時)的菌株進行初步鑒定，試驗項目包括革蘭氏染色、形態(tài)觀察、過氧化氫酶反應、游動性(motility)、在好氧與厭氧條件下的長情形等試驗(O.Kandler和N.Weiss(1986)，Regular，nonsporing Gram-positive rods and Cocci.InBergey’s Manual ofSystematic Bacteriology.(Sneath，P.H.A.，Mair，N.S.，Sharpe，M.E.和Hotl，J.G.，ed.)Vol.II.pp.1208-1 234.The Williams & Wilkins Co.，Baltimore，USA)。
(2)API鑒定系統(tǒng)此鑒定試驗是依據(jù)G.H.Fleet等，(1984)，Appl.Environ.Microbiol.481034-1038，而乳酸菌鑒定是使用API 50 CHL套組(法國APIBioMerieux Research laboratory，La Balme Les Grottes，Montalien，Jeraeh，F(xiàn)rance)，所用的測試項目為甘油、赤蘚糖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、L-木糖、側金盞糖醇、β-甲基-木糖苷、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖、鼠李糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、甘露糖醇、山梨糖醇、α-甲基-D-甘露糖苷、α-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉苷、水楊苷、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、菊粉(inuline)、松三糖、D-棉籽糖、淀粉(amidon)、糖原、木糖醇、β-龍膽二糖、D-松二糖、D-來蘇糖、D-塔格糖、D-巖藻糖、L-巖藻糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸、2-酮-葡萄糖酸、5-酮-葡萄糖酸等49種碳源的產(chǎn)酸試驗。
此系統(tǒng)的操作程序為以無菌棉棒沾取平板上的菌落，將菌落均勻懸浮于2ml的0.85％生理食鹽水中，以滅菌過的滴管吸取懸浮菌液，置n滴于另一5ml的0.85％無菌生理食鹽水中，使其濃度與McFarland No.2(由9.8ml的1％H2SO4與0.2ml的1％BaCl2所構成的混合溶液)的標準液濃度相當。此時另取懸浮菌液，置2n滴于API 50 CHL培養(yǎng)液的玻璃管中，予以混合均勻后，分別加入適當體積至每個測試條的孔洞(tubes of the strip)中，并加蓋礦物油，然后放入培養(yǎng)盒(incubation tray)中(盒內事先加水，以使培養(yǎng)時培養(yǎng)液不被蒸干)，加上蓋子(incubation lid)后置于37℃下培養(yǎng)歷時48小時，之后取出判讀。將結果記錄下來，并與API LAB Software鑒定系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫做比對，以鑒定出最適當?shù)膶倜c種名。
(3)微生物計算機鑒定系統(tǒng)(Micro-IS System)此鑒定試驗是依據(jù)M.Rogosa等，(1971)，Method for coding data onmicrobial strains for computers(edition AB)，Int.J.Syst.Bacteriol.211A-184A，利用Micro-IS System的Matrix 5[乳桿菌物種適用]，所用的測試項目包括游動性；溫度生長試驗(15℃、45℃)；好氧下生長；D-葡萄糖及葡萄糖酸產(chǎn)氣試驗，苦杏仁苷、L-阿拉伯糖、纖維二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、乳糖、麥芽糖、D-甘露糖醇、D-甘露糖、松三糖、蜜二糖、鼠李糖、L-鼠李糖、D-核糖、水楊苷、D-山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、D-木糖等的產(chǎn)酸試驗，七葉苷的水解以及L-精胺酸脫氨基作用的生長試驗等。將各項試驗的正、負結果輸入Micro-IS計算機鑒定程序中，即可得到鑒定的屬名或種名。
(4)16SrDNA序列分析此鑒定試驗是依據(jù)Rosenblum等，(1997)，Nucleic Acid Res.，254500-4504，將新鮮的菌體刮取少許放入1.5ml微量離心管中，以蛋白酶K及RNA酶處理后，利用自旋管柱(spin column)取得基因組DNA后，進行聚合酶鏈反應擴增，接著純化。PCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)電泳確認后，以MicroSeqTM16SrDNA Gene Kit(PE Co.，USA)進行反應，接著利用ABI Prism 310 Genetic Analyzer進行DNA序列分析，再將所得的12條DNA序列以MicroSeqTM軟件(PE Co.，USA)來進行分析、整合，可得到約1500bp的16SrDNA序列，然后再與DNA數(shù)據(jù)庫(MicroSeqTMReference Manual，1999，PE CO.，USA)進行比對分析。
二、結果1.本發(fā)明的分離株B21T1(i)依初步試驗結果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具過氧化氫酶，無移動性，于好氧及厭氧條件下均可生長；(ii)利用API System的API 50 CHL鑒定套組，所得的測試結果如表6所示，鑒定分數(shù)為91.0(％ID)，鑒定結果為嗜酸乳桿菌；(iii)以微生物計算機鑒定系統(tǒng)(Micro-IS System)進行本發(fā)明的分離株B21T1的鑒定，所得結果如表7所示，鑒定菌名為嗜酸乳桿菌，鑒定分數(shù)達0.682(ID計分)；本發(fā)明的分離株B21T1的16SrDNA序列分析結果如圖5所示，將所得序列與DNA數(shù)據(jù)庫(MicroSeqTMReference Manual，1999，PE CO.，USA)進行比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分離株B21T1的16SrDNA序列(SEQ IDNO1)與加氏乳桿菌[為嗜酸乳桿菌族群中的B1群]的16SrDNA序列相似度最高(G.Klein等，(1998)，International Jourmal of Food Microbiology.41103-125)；
表6菌株編號B21T1鑒定效果的描述可疑的結果---------------------------------------------------------------------測試條API 50 CHL結果(profile)-----------+-+？-------++-++++--+-------+----------50種醣類反應結果0 - GLY - ERY - DARA - LARL - RIB - DXYL -LXYL - ADO -MDX -GAL-GLU+ FRU - MNE + SBE ？ RHA - DUL - INO -MAN - SOR -MDM -MDG-NAG+ AMY + ARB - ESC + SAL + CEL + MAL +LAC - MEL -SAC +TRE-INU- MLZ - RAF - AMD - GLYG - XLT - GEN +TUR - LYX -TAG -DFUC -LFUC - DARL - LARL - GNT - 2KG - 5KG -----------明顯的分類----------------------------- ％Id. -------- T ----------- 針對菌種的試驗 -----------可能的菌株名嗜酸乳桿菌 1 91.0 0.53 3下一個選擇一種乳桿菌物種卷曲乳桿菌(Lacto.crispatus) 2 5.4 0.35 4-----------------------------------------------------------------------------------------------嗜酸乳桿菌1∶3針對下列的試驗(注若要確立為嗜酸乳桿菌所建議的部分醣類再測試)半乳糖 (GAL)75％ D-果糖 (FRU) 100％海藻糖 (TRE)77％
表7Micro-IS系統(tǒng)菌株名稱B21T1、B21T6、C21T1、X21B7、B6T7- 013001 游動性 - 006001 內孢子- 017013 生長15℃ + 017017 生長45℃+ 016059 好氣性生長 - 024045 葡萄糖成為CO2- 028528 葡萄糖酸，氣體 + 025203 苦杏仁苷，酸- 025181 L-阿拉伯糖，酸 + 025211 纖維二糖，酸+ 025193 D-果糖，酸 + 025194 D-半乳糖，酸+ 025195 D-葡萄糖，酸 + 025212 乳糖，酸+ 025213 麥芽糖，酸 - 026371 D-甘露糖醇，酸+ 025196 D-甘露糖，酸 - 025217 落葉松糖，酸+ 025214 木蜜二糖，酸 + 025218 棉籽糖，酸- 025191 L-鼠李糖，酸 - 025184 D-核糖，酸+ 025210 水楊苷，酸 - 026374 D-山梨糖醇，酸+ 025215 蔗糖，酸 + 025216 海藻糖，酸- 025186 D-木糖，酸 + 028060 L-蘋果酸利用性*檢驗***ID計分**可能性**最佳可能性.
1嗜酸乳桿菌 0.68224 0.079110108 0.07911012犢乳桿菌(L.vitulinus) 0.31761 0.036828671 0.1104860建議再做的試驗**成組的數(shù)值**單獨的數(shù)值1 024029(L+)乳酸生成 1依上述鑒定結果，本發(fā)明的分離株B21T1最可能為嗜酸乳桿菌族群中的B1群--加氏乳桿菌。
2.本發(fā)明的分離株B21T6(i)依初步試驗結果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具過氧化氫酶，無移動性，在好氧及厭氧條件下均可生長；(ii)利用API System的API 50 CHL鑒定套組，所得的測試結果如表8所示，鑒定分數(shù)為93.6(％ID)，鑒定結果為嗜酸乳桿菌；(iii)以微生物計算機鑒定系統(tǒng)(Micro-IS System)進行本發(fā)明的分離株B21T6的鑒定，所得結果如表7所示，鑒定菌名為嗜酸乳桿菌，鑒定分數(shù)達0.682(ID計分)；(iv)本發(fā)明的分離株B21T6的16SrDNA序列分析結果如圖6所示，將所得序列與DNA數(shù)據(jù)庫(MicroSeqTMReference Manual，1999，PECO.，USA)進行比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分離株B21T6的16SrDNA序列(SEQ ID NO2)與加氏乳桿菌[為嗜酸乳桿菌族群中的B1群]的16SrDNA序列相似度最高；(v)依上述鑒定結果，本發(fā)明的分離株B21T6最可能為嗜酸乳桿菌族群中的B1群--加氏乳桿菌；
表8菌株編號B21T6鑒定效果的描述對于此菌屬顯示出有極佳的鑒定結果---------------------------------------------------------------------------------------------------測試條API 50 CHL結果(profile)-----------++---------+--+++---+------------------50種醣類反應結果0 - GLY - ERY - DARA - LARL -RIB - DXYL - LXYL - ADO- MDX- GAL-GLU+ FRU + MNE - SBE- RHA-DUL - INO- MAN- SOR- MDM- MDG-NAG+ AMY + ARB - ESC+ SAL+CEL + MAL+ LAC- MEL- SAC+ TRE-INU- MLZ - RAF - AMD- GLYG -XLT - GEN+ TUR- LYX- TAG- DFUC -LFUC - DARL - LARL - GNT- 2KG-5KG --------- 明顯的分類 --------------------------- ％Id. ------- T -----------針對菌種的試驗--------------可能的菌株名嗜酸乳桿菌 3 93.60.80 1德氏乳桿菌德氏亞種Lacto.Delb.delb. 6.0 0.65 5下一個選擇卷曲乳桿菌 0.20.39 4------------------------------------------------------------------------嗜酸乳桿菌1∶1 針對下列的試驗(注若要確立為嗜酸乳桿菌所建議的部分醣類再測試)D-麥芽糖(MAL)75％
3.本發(fā)明的分離株C21T1(i)依初步試驗結果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具過氧化氫酶，無移動性，在好氧及厭氧條件下均可生長；(ii)利用API System的API 50 CHL鑒定套組，所得的測試結果如表9所示，鑒定分數(shù)為95.6(％ID)，鑒定結果為嗜酸乳桿菌；(iii)以微生物計算機鑒定系統(tǒng)(Micro-IS System)進行本發(fā)明的分離株C21T1菌株的鑒定，所得結果如表7所示，鑒定菌名為嗜酸乳桿菌，鑒定分數(shù)達0.682(ID計分)；(iv)本發(fā)明的分離株C21T1的16SrDNA序列分析結果如圖7所示，將所得序列與DNA數(shù)據(jù)庫(MicroSeqTMReference Manual，1999，PECO.，USA)進行比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分離株C21T1的16SrDNA序列(SEQID NO3)與加氏乳桿菌[為嗜酸乳桿菌族群中的B1群]的16SrDNA序列相似度最高；(v)依上述鑒定結果，本發(fā)明的分離株C21T1最可能為嗜酸乳桿菌族群中的B1群--加氏乳桿菌。
表9菌株編號C21T1鑒定效果的描述良好的鑒定---------------------------------------------------------------------------------------------------------測試條API 50 CHL結果(profile)-----------++---------++-++++--+-------+----------50種醣類反應結果0 - GLY- ERY- DARA - LARL - RIB - DXYL - LXYL - ADO- MDX- GAL-GLU+ FRU+ MNE- SBE- RHA- DUL - INO- MAN- SOR- MDM- MDG-NAG+ AMY+ ARB- ESC+ SAL+ CEL + MAL+ LAC- MEL- SAC+ TRE-INU- MLZ- RAF- AMD- GLYG - XLT - GEN+ TUR- LYX- TAG- DFUC -LFUC - DARL - LARL - GNT- 2KG- 5KG --------- 明顯的分類 --------------------------------- ％Id. ------- T -------- 針對菌種的試驗 ----------------可能的菌株名嗜酸乳桿菌 1 95.60.70 3下-個選擇卷曲乳桿菌1.5 0.53 5----------------------------------------------------------------------------嗜酸乳桿菌1∶3針對下列的試驗(注若要確立為嗜酸乳桿菌所建議的部分醣類再測試)半乳糖 (GAL)75％ D-甘露糖 (MNE) 96％海藻糖 (TRE)77％
4.本發(fā)明的分離株X21B7(i)依初步試驗結果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具過氧化氫酶，無移動性，在好氧及厭氧條件下均可生長；(ii)利用API System的API 50 CHL鑒定套組，所得測試結果如表10所示，鑒定分數(shù)為94.3(％ID)，鑒定結果為嗜酸乳桿菌；(iii)以微生物計算機鑒定系統(tǒng)(Micro-IS System)進行本發(fā)明的分離株X21B7的鑒定，所得結果如表7所示，鑒定菌名為嗜酸乳桿菌，鑒定分數(shù)達0.682(ID計分)；(iv)本發(fā)明的分離株X21B7的16SrDNA序列分析結果如圖8所示，將所得序列與DNA數(shù)據(jù)庫(MicroSeqTMReference Manual，1999，PECO.，USA)進行比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分離株X21B7的16SrDNA序列(SEQ ID NO4)與加氏乳桿菌[為嗜酸乳桿菌族群中的B1群]的16SrDNA序列相似度最高；(v)依上述鑒定結果，本發(fā)明的分離株X21B7最可能為嗜酸乳桿菌族群中的B1群--加氏乳桿菌。
表10菌株編號X21B7鑒定效果的描述良好的鑒定---------------------------------------------------------------------------------------------------------------測試條API 50 CHL結果(profile)----------++？---------++-++++--+-------+----------50種醣類反應結果0 - GLY- ERY- DARA - LARL - RIB - DXYL - LXYL - ADO- MDX- GAL+GLU+ FRU？ MNE- SBE- RHA- DUL - INO- MAN- SOR- MDM- MDG-NAG+ AMY+ ARB- ESC+ SAL+ CEL + MAL+ LAC- MEL- SAC+ TRE-INU- MLZ- RAF- AMD- GLYG - XLT - GEN+ TUR- LYX- TAG- DFUC -LFUC - DARL - LARL - GNT- 2KG- 5KG ---------- 明顯的分類 --------------------------------- ％Id. -------- T ------------ 針對菌種的試驗 ----------可能的菌株名嗜酸乳桿菌1 94.30.652下一個選擇有害片球菌(Pediococcus Damnosus) 2 2.0 0.433-----------------------------------------------------------------------------------------嗜酸乳桿菌 1∶2針對下列的試驗(注若要確立為嗜酸乳桿菌所建議的部分醣類再測試)D-甘露糖E (MNE)96％ 海藻糖 (TRE) 77％
5.本發(fā)明的分離株B38T38(i)依初步試驗結果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具過氧化氫酶，無移動性，在好氧及厭氧條件下均可生長；(ii)利用API System的API 50 CHL鑒定套組，所得的測試結果如表11所示，鑒定分數(shù)為90.8(％ID)，鑒定結果為嗜酸乳桿菌；(iii)以微生物計算機鑒定系統(tǒng)(Micro-IS System)進行本發(fā)明的分離株B38T38菌株的鑒定，所得結果如表12所示，鑒定菌名為嗜酸乳桿菌，鑒定分數(shù)達0.646(ID計分)；(iv)本發(fā)明的分離株B38T38的16SrDNA序列分析結果如圖9所示，將所得序列與DNA數(shù)據(jù)庫(MicroSeqTMReference Manual，1999，PECO.，USA)進行比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分離株B38T38的16SrDNA序列(SEQ ID NO5)與加氏乳桿菌[為嗜酸乳桿菌族群中的B1群]的16SrDNA序列相似度最高；(v)依上述鑒定結果，本發(fā)明的分離株B38T38最可能為嗜酸乳桿菌族群中的B1群--加氏乳桿菌。
表11菌株編號B38T38鑒定效果的描述良好的鑒定-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------測試條API 50 CHL結果(profile)----------++++--------+-+++++--++------+----------50種醣類反應結果0 - GLY- ERY- DARA - LARL - RIB - DXYL - LXYL - ADO- MDX- GAL+GLU+ FRU+ MNE+ SBE- RHA- DUL - INO- MAN- SOR- MDM- MDG-NAG+ AMY- ARB+ ESC+ SAL+ CEL + MAL+ LAC- MEL- SAC+ TRE+INU- MLZ- RAF- AMD- GLYG - XLT - GEN+ TUR- LYX- TAG- DFUC -LFUC - DARL - LARL - GNT- 2KG- 5KG ----------- 明顯的分類 ------------------------------- ％Id. ------- T ------------ 針對菌種的試驗 -------------可能的菌株名嗜酸乳桿菌 1 90.8 0.93 0下一個選擇德氏乳桿菌乳亞種(Lacto.delb.lactis)2 6.2 0.74 2-----------------------------------------------------------------------------------嗜酸乳桿菌1∶0針對下列的試驗(注若要確立為嗜酸乳桿菌所建議的部分醣類再測試)
表12Micro-IS系統(tǒng)菌株名稱B38T38- 013001 游動性 - 006001 內孢子- 017013 生長15℃+ 017017 生長45℃+ 016059 好氣性生長 - 024045 葡萄糖成為CO2- 028528 葡萄糖酸，氣體 + 025203 苦杏仁苷，酸- 025181 L-阿拉伯糖，酸 + 025211 纖維二糖，酸+ 025193 D-果糖，酸 + 025194 D-半乳糖，酸+ 025195 D-葡萄糖，酸+ 025212 乳糖，酸+ 025213 麥芽糖，酸 - 026371 D-甘露糖醇，酸+ 025196 D-甘露糖，酸+ 025217 落葉松糖，酸+ 025214 木蜜二糖，酸+ 025218 棉籽糖，酸- 025191 L-鼠李糖，酸- 025184 D-核糖，酸+ 025210 水楊苷，酸 - 026374 D-山梨糖醇，酸+ 025215 蔗糖，酸+ 025216 海藻糖，酸- 025186 D-木糖，酸 - 028060 L-蘋果酸利用性*檢驗***ID計分**可能性**最佳可能性1 L.delbrueckll ssp lactis0.64607 0.1450380240.43511402 嗜酸乳桿0.35240 0.0791101080.0791101建議再做的試驗**成組的數(shù)值**單獨的數(shù)值1 024029(L+)乳酸生成 22 029268 L-精胺酸脫胺作用 2
6.本發(fā)明的分離株B6T7(i)依初步試驗結果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具過氧化氫酶，無移動性，在好氧及厭氧條件下均可生長；(ii)利用API System的API 50 CHL鑒定套組，所得的測試結果如表13所示，鑒定分數(shù)為92.4(％ID)，鑒定結果為植物乳桿菌。
(iii)以微生物計算機鑒定系統(tǒng)(Micro-IS System)進行本發(fā)明的分離株B6T7的鑒定，所得結果如表7所示，鑒定菌名為嗜酸乳桿菌，鑒定分數(shù)達0.682(ID計分)；(iv)本發(fā)明的分離株B6T7的16SrDNA序列分析結果如圖10所示。由于在API 50 CHL鑒定套組所的結果與Micro-IS System鑒定系統(tǒng)所得結果分別為乳桿菌屬中的植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌，故將本發(fā)明的分離株B6T7所得的16S rDNA序列(SEQ ID NO6)，與嗜酸乳桿菌的DNA序列(SEQ ID NO7)以及植物乳桿菌的DNA序列(SEQ IDNO8)進行比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分離株B6T7的16SrDNA序列與嗜酸乳桿菌的16SrDNA序列相似度最高，而與植物乳桿菌的16SrDNA序列相差甚大；
表13菌株編號B6T7鑒定效果的描述可疑的態(tài)樣-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------測試條API 50CHL結果(profile)----++----++++-+--+---+++-+++++++--+---+----------50種醣類反應結果0 - GLY- ERY- DARA - LARL + RIB + DXYL - LXYL - ADO- MDX- GAL+GLU+ FRU+ MNE+ SBE- RHA+ DUL - INO- MAN+ SOR- MDM- MDG-NAG+ AMY+ ARB+ ESC- SAL+ CEL + MAL+ LAC+ MEL+ SAC+ TRE+INU- MLZ- RAF+ AMD- GLYG - XLT - GEN+ TUR- LYX- TAG- DFUC -LFUC - DARL - LARL - GNT- 2KG- 5KG --------- 明顯的分類 ----------------------- ％Id. --------- T --------------- 針對菌種的試驗 -------------可能的菌株名植物乳桿菌 1 92.4 0.593下一個選擇唾液乳桿菌 3.4 0.454-----------------------------------------------------------------------------------------------植物乳桿菌 1∶3針對下列的試驗(注若要確立為嗜酸乳桿菌所建議的部分醣類再測試)D-山梨糖醇(SPR)75％ 七葉苷 (ESC) 99％落葉松糖 (MLE)92％
(v)依上述的鑒定結果，本發(fā)明的分離株B6T7最可能為嗜酸乳桿菌。
綜合以上鑒定結果，本發(fā)明所篩選的6株分離株皆屬于嗜酸乳桿菌株，其中B6T7為嗜酸乳桿菌，而B21T1、B21T6、C21T1、X21B7及B38T38為其B1群的加氏乳桿菌。
參見表14，當與以往專利案以及文獻中所揭示的乳桿菌菌株相比較，本發(fā)明所得的乳桿菌分離株不但可在含0.3％膽鹽環(huán)境下生長，在pH2的酸性環(huán)境下培養(yǎng)2小時后具有較高的存活率，具有良好降低膽固醇作用，且同時對膽固醇具有共沉淀作用及同化作用。由此顯見，本發(fā)明的分離株及其傳代培養(yǎng)的后代會是優(yōu)良的益生菌(probioticbacteria)，而能供用于制備諸如飲料、糕點、嬰兒食品、酸牛乳、營養(yǎng)補充品、動物飼料等的食用品，還有用于制備治療與預防腸胃疾病以及降低血清膽固醇用的藥物組合物。
舉例而言，可以參照US 5,516,684所揭示的參考例1與參考例2，將本發(fā)明所得的乳桿菌分離株拿來制造乳酸飲料以及酸牛乳飲料。
表14.本發(fā)明的分離菌與公開于前案專利及文獻中的已知菌株的比較菌株 分離源 特征 專利/文獻嗜酸乳桿菌人類1.耐膽鹽US 4839281GG可生長于含0.15％膽汁酸的環(huán)境中 US 5032399(ATCC 53103) 2.耐酸在pH5環(huán)境中，可生長至109CFU在pH3環(huán)境中，可生長至107CFU在pH2.5的胃汁中30分鐘后，菌數(shù)減少2個log值以內在pH1～2/2hr后，菌數(shù)殘存103CFU3.降膽固醇可降低人類糞便中膽固醇的排泄量嗜酸乳桿菌公豬1.降膽固醇 Danielson etLA16 可降低血清膽固醇60％(于含0.4％牛膽汁及10mg膽固al.，1989醇系統(tǒng)中)動物試驗，喂食56天后，血清膽固醇可降低10.5％，LDL-膽固醇含量可降低9％(注LA16為嗜酸乳桿菌DDS-1(人類來源)制成的酸酪乳喂食豬后，再由豬糞中所分離出具有降膽固醇能力的菌株)嗜酸乳桿菌豬 1.耐膽鹽 Gilliland andATCC 431210.3％牛膽汁下分別生長2.93及7.4小時，菌體濃度(OD620nm)Walker，1990可增加0.3單位ATCC 4356 2.降膽固醇人類 可降低血清膽固醇55.4％及12.9％(于含0.3％牛膽汁及0.1％PPLO系統(tǒng)中培養(yǎng)14小時后)L.gasseri人類 1.耐膽鹽 Usman andSBT 0274 可在含0.3％牛膽汁環(huán)境中生長 Hosono，1999SBT 0270 2.耐酸在pH2.5，37℃/3h，菌數(shù)下降2個log值在pH1.5，37℃/2h，菌數(shù)下降4～5個log值3.降膽固醇在含0.3％牛膽汁及100μg膽固醇微胞/ml系統(tǒng)中培養(yǎng)20小時后，可分別降低膽固醇含量47％及36％L.gasseri 健康幼 1.耐膽鹽 本發(fā)明菌株B21T1 兒 在含0.3％牛膽汁下生長24h，菌株殘存量達80％，即菌B21T6數(shù)減少0.5～2個log值C21T1X21B7 2.耐酸B38T38在pH2，37℃/2hr處理菌數(shù)減少3～4個log值(0.85％NaCl/0.01 N HCl系統(tǒng))嗜酸乳桿菌3.降膽固醇B6T7 在含0.3％牛膽汁及12％馬血清的MRS肉湯系統(tǒng)中，厭氧培養(yǎng)24hr，可降低膽固醇含量達93％以上在含0.3％牛膽汁及12％膽固醇微胞的MRS肉湯系統(tǒng)中，厭氧培養(yǎng)24hr，可降低膽固醇含量達25～45％對膽固醇吸附同化效果達12～40％
注ATCC 43121＝CCRC 17064ATCC 4356＝CCRC 10695PPLO(BACT PPLO SERUM FRACTION)是由DIFCO LABORARORIES所出品，目前已經(jīng)停產(chǎn)于本說明書中被引述的所有專利和文獻引入本文作參考。若有所沖突時，本發(fā)明的詳細說明(包含界定在內)將占上風。
雖然本發(fā)明已參考上述特定的具體例得到描述，明顯地在不背離本發(fā)明的范圍和精神的下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發(fā)明只受如隨文所附的權利要求書的范圍所示者的限制。
序列表<110>食品工業(yè)發(fā)展研究所<120>具有降低與同化膽固醇能力的新穎耐酸與耐膽鹽乳桿菌分離株<160>8<170>Microsoft Word 2000<210>1<211>500<212>DNA<213>加氏乳桿菌B21T1<220>
<223>16S核糖體DNA<400>1caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagcttg cctagatgaa 60tttggtgctt gcaccaaatg aaactagata caagcgagcg gcggacgggt gagtaacacg 120tgggtaacct gcccaagaga ctgggataac acctggaaac agatgctaat accggataac 180aacactagac gcatgtctag agtttaaaag atggttctgc tatcactctt ggatggacct 240gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaatgatgc atagccgagt 300tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 360agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa 420gggtttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt 480tatttgacgg taattactta 500
<210>2<211>500<212>DNA<213>加氏乳桿菌B21T6<220>
<223>16S核糖體DNA<400>2caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagcttg cctagatgaa 60tttggtgctt gcaccaaatg aaactagata caagcgagcg gcggacgggt gagtaacacg 120tgggtaacct gcccaagaga ctgggataac acctggaaac agatgctaat accggataac 180aacactagac gcatgtctag agtttaaaag atggttctgc tatcactctt ggatggacct 240gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaatgatgc atagccgagt 300tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 360agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa 420gggtttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt 480tatttgacgg taattactta 500<210>3<211>500<212>DNA<213>加氏乳桿菌C21T1<220>
<223>16S核糖體DNA<400>3caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagcttg cctagatgaa 60tttggtgctt gcaccaaatg aaactagata caagcgagcg gcggacgggt gagtaacacg 120
tgggtaacct gcccaagaga ctgggataac acctggaaac agatgctaat accggataac 180aacactagac gcatgtctag agtttaaaag atggttctgc tatcactctt ggatggacct 240gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaatgatgc atagccgagt 300tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 360agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa 420gggtttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt 480tatttgacgg taattactta 500<210>4<211>500<212>DNA<213>加氏乳桿菌X21B7<220>
<223>16S核糖體DNA<400>4caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagcttg cctagatgat 60tttggtgctt gcactaaatg aaactagata caagcgagcg gcggacgggt gagtaacacg 120tgggtaacct gcccaagaga ctgggataac acctggaaac agatgctaat accggataac 180aacactagac gcatgtctag agtttgaaag atggttctgc tatcactctt ggatggacct 240gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaatgatgc atagccgagt 300tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 360agtagggaat cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa 420gggtttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt 480tatttgacgg taattactta 500
<210>5<211>500<212>DNA<213>加氏乳桿菌B38T38<220>
<223>16S核糖體DNA<400>5caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagcttg cctagatgaa 60tttggtgctt gcaccaaatg aaactagata caagcgagcg gcggacgggt gagtaacacg 120tgggtaacct gcccaagaga ctgggataac acctggaaac agatgctaat accggataac 180aacactagac gcatgtctag agtttaaaag atggttctgc tatcactctt ggatggacct 240gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaatgatgc atagccgagt 300tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 360agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa 420gggtttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt 480tatttgacgg taattactta 500<210>6<211>480<212>DNA<213>嗜酸乳桿菌B6T7<220>
<223>16S核糖體DNA<400>6cagacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcgacctgaa ccaacagatt 60cacttcggtg atgacgttgg gaacgcgagc ggcggatggg tgagtaacac gtggggaccc 120
tgccccatag tctgggatac cacttggaaa caggtgcaat accggataag aaagcagatg 180ccatgatcag cttataaaag gcggcgtaag ctgtcgctat gggatggccc cgcggtgcat 240tagctagttg gtagggtaac ggcctaccaa ggcaatgatg catagccgag tttgagagac 300tgatccggcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggg caagcagtag 360ggaatcctcc acaatggacc aaagtcctga tggagcaacg ccccgtgagt tgaagaagtt 420ttcggatcgt aaagccctgt tgttggtgaa gaaggataga ggtaagaact ggcctttatt 480<210>7<211>480<212>DNA<213>嗜酸乳桿菌<220>
<223>16S核糖體DNA<400>7caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagctga accaacagat 60tcacttcggt gatgcagttg ggaacgcgag cggcggatgg gtgagtaaca cgtggggaac 120ctgccccata gtctgggata ccacttggaa acaggtgcaa taccggataa gaaagcagat 180gccatgatca gcttataaaa ggcggcgtaa gctgtcgcta tgggatggcc ccgcggtgca 240ttagctagtt ggtagggtaa cggcctacca aggcaatgat gcatagccga gttgagagac 300tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga 360atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg 420gatcgtaaag ctctgttgtt ggtgaagaag gatagaggta gtaactggcc tttatttgac 480<210>8<211>480
<212>DNA<213>植物乳桿菌<220>
<223>16S核糖體DNA<400>8caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg aacgaactct ggtattgatt 60ggtgcttgca tcatgattta catttgagtg agtggcgaaa tggtgagtaa cavgtgggaa 120acctgcccag aagcggggga taacacctgg aaacagatgc taataccgca taacaacttg 180gaccgcatgg tccgagttga aagatggctt cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg 240tattagctag atgctggggt aacggctcac catggcaatg atacgtagcc gacctgagag 300ggtaatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg 360gaatcttcca caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt 420cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga acatatctga gagtaactgt tcaggtattg 480
權利要求
1.一種乳桿菌物種(Lactobacillus sp.)的分離株，其細菌學特征與加氏乳桿菌B21T1所具有的相同，所述加氏乳桿菌B21T1保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號為ATCC PTA-4483。
2.一種乳桿菌物種的分離株，其細菌學特征與加氏乳桿菌B21T6所具有的相同，所述加氏乳桿菌B21T6保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC PTA-4484。
3.一種乳桿菌物種的分離株，其細菌學特征與加氏乳桿菌C21T1所具有的相同，所述加氏乳桿菌C21T1保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC PTA-4479。
4.一種乳桿菌物種的分離株，其細菌學特征與加氏乳桿菌X21B7所具有的相同，所述加氏乳桿菌X21B7保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC PTA-4480。
5.一種乳桿菌物種的分離株，其細菌學特征與加氏乳桿菌B38T38所具有的相同，所述加氏乳桿菌B38T38保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC PTA-4481。
6.一種乳桿菌物種的分離株，其細菌學特征與嗜酸乳桿菌B6T7所具有的相同，所述嗜酸乳桿菌B6T7保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC PTA-4482。
7.一種食品產(chǎn)品，其包含有可食性材料與如權利要求1至6之任一項的乳桿菌物種分離株或其傳代培養(yǎng)后代或由它們衍生出的突變株。
8.如權利要求7的食品產(chǎn)品，其進一步包含至少一種選自下列群組中的益生性生物乳桿菌屬物種，如嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種、短乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、唾液乳桿菌、雙歧雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、高加索乳桿菌以及鼠李糖乳桿菌；鏈球菌屬物種，如嗜熱鏈球菌、乳酸鏈球菌；酵母菌，如念珠菌屬物種Candida Kefyr、弗羅棱酵母菌；或這些菌種的組合。
9.如權利要求7的食品產(chǎn)品，其中所述可食性材料選自下列群組流體乳品(牛奶、濃縮牛奶)、發(fā)酵乳品(優(yōu)酪乳、酸乳、冷凍優(yōu)格、乳酸菌發(fā)酵飲料)、奶粉、冰淇淋、乳酪、干酪、豆奶與發(fā)酵豆奶、蔬果汁、果汁及運動飲料等飲料、甜點、糖果、嬰兒食品、食療產(chǎn)品、動物飼料，以及膳食補充品。
10.如權利要求7的食品產(chǎn)品，其被制造成為即溶沖泡食品。
11.一種藥物組合物，其含有益生性有效量的如權利要求1至6之任一項的乳桿菌物種分離株或其傳代培養(yǎng)后代或由它們衍生出的突變株。
12.如權利要求10的藥物組合物，其中所述組合物被配制成選自下列群組的供用于口服給藥的形式溶液、乳劑、粉末、錠劑以及膠囊。
13.如權利要求10的藥物組合物，其中所述組合物被制成消化整腸藥劑。
14.如權利要求10的藥物組合物，其中所述組合物被制成用以降低血清膽固醇的藥品。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有耐膽鹽與耐胃酸特性且同時具有降低與同化膽固醇能力的新穎乳桿菌分離株。本發(fā)明的乳桿菌分離株或其傳代培養(yǎng)后代或由它們所衍生出的突變株可用于制備各種食品，以及用于制備供治療與預防腸胃疾病以及降低血清膽固醇用的藥物組合物。
文檔編號C12R1/23GK1493684SQ0214694
公開日2004年5月5日 申請日期2002年10月30日 優(yōu)先權日2002年10月30日
發(fā)明者劉玉茹, 游金珠, 譚靜芬, 廖啓成 申請人:食品工業(yè)發(fā)展研究所