專利名稱：Dna微陣列的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA微陣列，更具體地涉及DNA芯片的質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
DNA微陣列指的是通過使寡核苷酸探針(每個探針具有幾個至數(shù)百個核苷酸的已知序列)固定在固體表面上的數(shù)百至成千上萬個適當位置而制備的DNA芯片，其中所述固體表面由，例如，硅，表面-改性的玻璃，聚丙烯，或活化的聚丙烯酰胺制成。當將待分析的靶DNA上樣于DNA芯片時，靶DNA的片段與固定于DNA芯片上的寡核苷酸探針互補雜交。通過光學或放射化學可以檢測和分析雜交，從而鑒定出靶DNA的核苷酸序列，這就是所謂的雜交測序(SBH)。
利用制備成微陣列的DNA芯片能使DNA分析系統(tǒng)的規(guī)模變小，并且能夠用極少量的樣品進行遺傳學分析。另外，還可以同時分析靶DNA的多個序列，從而能經(jīng)濟快速地提供靶DNA的遺傳信息。DNA微陣列芯片可以在短時間內(nèi)分析大量遺傳信息，并可分析基因的相關(guān)性。因此，DNA芯片有望能廣泛應用于例如遺傳疾病和癌癥的診斷，突變體和病原體的檢測，基因表達分析，藥物篩選等。此外，DNA芯片也可用作微生物或污染物的檢測器(detector)，以找出解毒基因，并進一步基于基因重組技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)解毒劑。DNA芯片可大大改善包括藥用作物或低脂肉類生產(chǎn)在內(nèi)的大多數(shù)生物產(chǎn)業(yè)。
根據(jù)其表面所固定的探針類型，將DNA微陣列分為寡核苷酸-芯片(oligo-chip)和cDNA芯片。根據(jù)制備方法，可將DNA微陣列分為平版影印芯片(lithography chip)，針式點樣芯片(pin-type spotting chip)和噴墨式點樣芯片(ink-jet spotting chip)。根據(jù)固定化探針的類型，采用各式各樣的復雜的化學方法來制備DNA微陣列。由于極少量的DNA探針被固定于玻璃表面很小的區(qū)域內(nèi)，點與點和芯片與芯片之間探針的量有相當大的差異，因此雜交結(jié)果不一致。
為了著手解決這一問題，有人提出了在雜交前對DNA芯片進行質(zhì)量控制的技術(shù)。Brown等(“Quantitative Monitoring of Gene Expression Pattemswith a Complimentary DNA Microarray″M.Schena，D.Shalon，R.W Davis andP.O.Brown.Science 270467-470(1995).)研究出一種通過用激光掃描玻璃表面上因固定化DNA探針斑點中存在的鹽所導致的光散射，來檢查DNA探針斑點的均一性(uniformity)和玻璃表面損害的方法。該方法僅方便在DNA探針點樣后立即使用，在完成DNA芯片制備之后使用受限，因為點樣之后，通過固定化和清洗過程從DNA探針斑點中除去了鹽。
最近，有人研究出使用能與DNA探針結(jié)合的熒光材料染色玻璃表面上的DNA斑點(spot)的方法(Battaglia C，Salani G，Consolandi C，RossiBernardi L，De Bellis G.，Analysis of DNA Microarrays by Non-destructiveFluorescent Staining Using SYBR Green II，Biotechniques，2000 July，2978-81)。根據(jù)此方法，用對單鏈DNA(ssDNA)具有高親和力的熒光SYBR GreenII處理DNA芯片玻璃表面上固定化的DNA探針，并通過激光掃描進行檢測。據(jù)報道，通過清洗可以完全除去與DNA探針結(jié)合的熒光材料。與Brown的方法相比，熒光染色方法可在芯片制備完畢之后用于檢查DNA微陣列，但染色和除去染料時需要多個清洗過程。不幸的是，清洗之后，熒光材料仍然很可能殘留在玻璃表面，從而會影響隨后的雜交過程。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供了一種便利的，非破壞性的控制DNA微陣列上DNA斑點的質(zhì)量和大小的方法，該方法無需染色和除去染料的過程。
一方面，本發(fā)明的DNA芯片質(zhì)量控制方法包括制備含有熒光染料的DNA點樣溶液；將DNA點樣溶液點樣于基質(zhì)以制備DNA芯片；和檢測DNA斑點發(fā)出的熒光信號。


通過參照附圖詳細描述本發(fā)明例舉的實施方案，本發(fā)明的上述目的和優(yōu)點將更加顯而易見，其中圖1顯示了實施例1中進行的，在與靶DNA雜交之前(質(zhì)量控制檢驗(QCTest))和之后(應用檢驗(Use Test))對固定于DNA微陣列上的寡核苷酸探針斑點進行掃描的結(jié)果；和圖2顯示了實施例2中進行的，在與靶DNA雜交之前(QC Test)和之后(Use Test)對固定于DNA微陣列上的cDNA探針斑點進行掃描的結(jié)果。
具體實施例方式
常規(guī)的DNA芯片質(zhì)量控制方法是將DNA探針點樣于DNA芯片基質(zhì)上，然后使熒光染料與DNA探針結(jié)合，與之不同的是，在本發(fā)明的DNA芯片質(zhì)量控制方法中，用熒光染料制備將要上樣于DNA芯片基質(zhì)的DNA點樣溶液，熒光染料與基質(zhì)表面共價結(jié)合，而DNA探針被固定于DNA芯片基質(zhì)上。DNA芯片制備完畢之后，掃描DNA斑點發(fā)出的熒光，從而非-破壞性地測定DNA斑點的均一性。
通過DNA探針斑點的直徑和外形以及熒光的強度，測定DNA探針斑點發(fā)出的熒光信號的均一性。
本發(fā)明所用熒光染料具有用于產(chǎn)生熒光信號的染料基團(F)和與固體基質(zhì)共價結(jié)合的官能團(R)，其結(jié)構(gòu)式如下所示 FFITC，熒光素，Cy3，Cy5，德克薩斯紅，TAMRAR胺，活化酯，異硫氰酸鹽，醛用于產(chǎn)生熒光信號的適當染料基團，對于用來標記靶DNA，以便在DNA芯片制備完畢之后用于檢測雜交的染料沒有光譜干擾，其包括無光譜干擾作用的異硫氰酸熒光素(FITC)，熒光素，Cy3，Cy5，德克薩斯紅(Texas Red)，N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)等。
根據(jù)DNA微陣列的類型，與固體基質(zhì)結(jié)合的官能團應能與固體基質(zhì)表面的官能團，如胺，醛或聚-賴氨酸共價結(jié)合。熒光染料的適當官能團包括胺，異硫氰酸鹽(-NCS)，活化酯和醛。
可根據(jù)所用熒光染料的類型改變按上述制備的DNA芯片上的DNA斑點的質(zhì)量控制方法。例如，當熒光染料的染料基團是FITC或熒光素時，用氬離子激光可在波長為488nm時激發(fā)該染料基團，使用520nm波長的濾光片可分析熒光信號。
本發(fā)明的DNA微陣列質(zhì)量控制方法可適用于另一種類型的微陣列，如RNA芯片或蛋白質(zhì)芯片。
下文將參照實施例詳細描述本發(fā)明。給出下列實施例是為了闡明本發(fā)明，并不想限制本發(fā)明的范圍。在下列實施例中，實驗性地測定了，制備DNA芯片時與DNA探針一起被固定于基質(zhì)上的熒光染料，在DNA探針與經(jīng)熒光標記的靶DNA在DNA芯片上雜交之后，是否會影響DNA斑點發(fā)出的熒光強度。使用了兩種DNA芯片，即寡核苷酸探針-固定化DNA芯片和cDNA-固定化DNA芯片。
實施例1寡核苷酸探針-固定化DNA芯片的斑點質(zhì)量控制A.使用凝膠基質(zhì)制備DNA-寡核苷酸芯片在凝膠基質(zhì)溶液中攪拌加入兩種寡核苷酸探針(精確匹配的(PM)-5’-TGTAGACACGCACCTCCGTG-3’；或錯配的(MM)-5’-TGTAGACACCCACCTCCGTG-3’)和熒光染料4’-(氨基甲基)熒光素(0μM，1μM，和2μM)，于37℃放置14小時以形成基質(zhì)-DNA綴合物(conjugate)。將所得溶液用作點樣溶液。將點樣溶液點在經(jīng)處理已暴露出胺基團的玻璃表面，于37℃的濕槽(wet chamber)中放置4小時。接著，對玻璃表面未加載點樣溶液的區(qū)域進行處理，使該區(qū)域的胺基團帶負電，從而防止靶DNA吸附于非一點樣區(qū)域，這是控制背景噪聲所必需的過程。為此，將5g琥珀酐溶解于315ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，在溶液中攪拌加入35ml硼酸鈉。用該溶液處理玻璃表面，用蒸餾水清洗并置于干燥器中。
用作熒光材料的4-(氨基甲基)熒光素具有下式 B.通過Cy3的熒光測定雜交敏感性使用掃描僅(ScanArray Scanner，GSI Lunonics)，以10-μm-象素的分辨率檢測經(jīng)熒光標記的靶物質(zhì)發(fā)出的熒光信號，所述靶物質(zhì)與DNA微陣列上的探針雜交。使用GenePix軟件得出斑點的強度。
圖1顯示了在與靶DNA雜交之前掃描按上述使用凝膠基質(zhì)制備的DNA微陣列上斑點的結(jié)果(質(zhì)量控制(QC)檢驗(Test))，以及與靶DNA雜交之后掃描DNA微陣列上斑點的結(jié)果(應用檢驗(Use Test))。
對QC Test而言，在掃描DNA斑點時，通過用氬離子激光在波長為488nm時進行掃描而激發(fā)DNA斑點，使用520nm波長的濾光片獲得熒光發(fā)射信號。在Use Test中，與DNA斑點雜交的靶DNA在550nm處被激發(fā)，使用570nm波長的濾光片獲得熒光發(fā)射信號。在Use Test中，將20個核苷酸長的序列用作靶DNA，該序列中間(middle)具有對應于肝細胞核因子(HNF)-1α基因外顯子4的密碼子264的核苷酸C(胞苷)堿基，5’-末端結(jié)合有Cy3，被表示為(5’-Cy3-CACGGAGGTGCGTGTCTACA-3’)。
如圖1所示，用精確匹配的和錯配的探針各點9個斑點。斑點的直徑為170±15μm，將斑點之間的間隔調(diào)整為375μm。
C.實驗結(jié)果如圖1所示，在Use Test中，與4’-(氨基甲基)熒光素一起被固定化的探針斑點的熒光強度與無染料的探針斑點的熒光強度沒有顯著差異。顯然，使用4’-(氨基甲基)熒光素不會影響靶DNA與探針斑點的雜交。
表1.QC Test和Use Test中使用凝膠基質(zhì)的DNA微陣列上的探針斑點的熒光強度

實施例2cDNA芯片的斑點質(zhì)量控制A.通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增探針基因使用DNA提取試劑盒(GAIGEN)分離能產(chǎn)生甘油醛孑-磷酸脫氫酶(GAPDH)的重組基因。在終體積為100μL的反應溶液中，通過PCR選擇性擴增經(jīng)分離的重組GAPDH基因。
使用50g純的重組GAPDHDNA，2.5U熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，每種dNTP(dATP，dTTP，dGTP和dCTP)各200μM，50mM Tris-HCl，40mMKCl，1.5mMMgCl2，以及有義引物(5’-CTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTC-3’)和反義引物(5’-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’)各100pmol。進行35輪PCR循環(huán)，每輪循環(huán)包括94℃變性30秒，55℃退火60秒，和72℃延伸90秒。于94℃預變性5分鐘，最后于72℃再延伸5分鐘。使用DNA提取試劑盒(GAIGEN)純化擴增子，并將其用作探針固定于玻璃基質(zhì)上。
B.點樣經(jīng)擴增的GAPDH基因制備cDNA微陣列在兩個獨立的試管中將擴增的GAPDH基因與50％ DMSO混合，使基因的終濃度為0.25mg/mL。在其中一個試管中加入FITC染料至終濃度為8uM。用Voltex混合器充分混合每個試管中的擴增基因，DMSO和FITC染料。將試劑混合物轉(zhuǎn)移至384-孔板中以進行點樣。以20×4的陣列將點樣溶液點在經(jīng)處理具有胺基團的玻璃基質(zhì)上，80℃加熱4小時。接著，處理玻璃表面未加載點樣溶液的區(qū)域，使該區(qū)域的胺基團帶負電，從而防止靶DNA吸附于非-點樣區(qū)域，這是控制背景噪聲所必需的過程。為此，將5g琥珀酐溶解于315ml1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，在該溶液中攪拌加入35ml硼酸鈉。玻璃表面用該溶液處理，用蒸餾水清洗并置于干燥器中。
用作熒光染料的FITC具有下式 C.通過PCR制備經(jīng)熒光標記的靶DNA將上述實驗中使用DNA提取試劑盒分離得到的，產(chǎn)生GAPHD的重組基因用于制備經(jīng)熒光標記的靶DNA。在終體積為50μL的反應溶液中，通過PCR選擇性擴增經(jīng)分離的重組GAPDH基因。
使用50g純的重組GAPDHDNA，2.5U熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶，每種dNTP(dATP，dGTP，和dCTP)200μM，65μM dTTP，130μMCy3-dUTP，50mMTris-HCl，40mMKCl(pH8，3)，1.5mMMgCl2，以及有義引物(5’-CTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTC-3’)和反義引物(5’-CAGTGCCAAGCTTGCATGC CT-3’)各為100pmol。按照與上述實驗相同的條件進行PCR。擴增子使用DNA提取試劑盒(GAIGEN)純化，通過分光光度法測定其濃度。為了保持雜交的有效性，將純化的GAPDH DNA的濃度恒定地調(diào)節(jié)至50ng/μL。在PCR過程中，通過加入Cy3-dUTP，用Cy3對GAPDH基因靶DNA進行熒光標記，所述靶DNA包括600個堿基對。
D.經(jīng)熒光標記的靶DNA與cDNA微陣列雜交于50℃，在4X SSC(標準的鹽水-檸檬酸鹽)，0.1％ SDS(十二烷基硫酸鈉)，和10mg/mL BSA(牛血清白蛋白)的溶液中，將按上述制備的cDNA芯片預雜交45分鐘，并用異丙醇和純水洗滌。通過以500rpm離心3分鐘從cDNA芯片上除去水。
于95℃將1μg上述實驗中制備的經(jīng)熒光標記的靶DNA變性5分鐘，于冰上放置3分鐘，與3XSSC，0.1％SDS，0.5mg/mL酵母tRNA和30μg/mL鯡精(herring sperm)DNA的溶液混合，并滴在cDNA芯片上。用蓋玻片覆蓋cDNA芯片以便所述溶液擴散，于50℃雜交過夜。于25℃用0.1XSSC(1.5mM檸檬酸鈉，15mMNaCl，pH7.0)和0.1％ SDS的溶液將芯片基質(zhì)洗滌1次，時間為5分鐘，并用0.1XSSC洗滌2次，每次5分鐘。接著，按照與上述相同的條件通過離心除去芯片基質(zhì)中的水。
E.通過Cy3的熒光測定雜交敏感性按照與實施例1相同的方法測定雜交敏感性。
圖2顯示了按上文所述進行的，在與靶DNA雜交之前掃描cDNA微陣列上斑點的結(jié)果(QC Test)，和與靶DNA雜交之后掃描cDNA微陣列上斑點的結(jié)果(Use Test)。
對QC Test而言，在掃描DNA斑點時，通過用氬離子激光在波長為488nm時進行掃描而激發(fā)DNA斑點，使用520nm波長的濾光片獲得熒光發(fā)射信號。在Use Test中，與DNA斑點雜交的靶DNA在550nm處被激發(fā)，使用570nm波長的濾光片獲得熒光發(fā)射信號。
如圖2所示，在每個DNA芯片上點80個斑點。斑點的直徑為170±15μm，將斑點之間的間隔調(diào)整為375μm。
F.實驗結(jié)果根據(jù)圖2的結(jié)果，比較兩種情況，即，使用FITC染料和不使用熒光染料時的熒光強度，結(jié)果示于下表2。
如表2所示，與FITC一起被固定的探針斑點的熒光強度與無染料的探針斑點的熒光強度沒有顯著差異。顯然，使用FITC不會影響靶DNA與探針斑點的雜交。
表2.QC Test和Use Test中使用GAPDH擴增子的cDNA微陣列上探針斑點的熒光強度

如上所述，在本發(fā)明的DNA微陣列質(zhì)量控制方法中，檢測與DNA探針一起共價固定于DNA芯片固體表面的熒光染料所發(fā)出的信號，并將其用于DNA微陣列的質(zhì)量控制。與包括獨立染色過程的常規(guī)質(zhì)量控制方法相比，本發(fā)明的方法無需進行染色和除去染料的過程。
此外，在與靶DNA雜交之后，與DNA探針一起共價結(jié)合于DNA芯片固體基質(zhì)上的熒光染料幾乎不會影響DNA斑點的熒光強度，從而消除了常規(guī)方法中熒光染料影響雜交的可能性。
通過上述方法制備的DNA微陣列無需染色過程即可進行質(zhì)量控制，所述DNA微陣列可提供可靠的，穩(wěn)定的雜交結(jié)果。
與常規(guī)的質(zhì)量控制方法不同的是，由于熒光染料與DNA探針一起與玻璃芯片表面的反應性基團共價結(jié)合，熒光信號的強度不會受DNA探針序列和長度的影響，從而能對不同的DNA探針斑點進行準確的質(zhì)量比較。
盡管參照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案具體顯示和描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解在形式和細節(jié)上的多種變化并不偏離所附權(quán)利要求書中限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.DNA芯片的質(zhì)量控制方法，其包括制備含有DNA探針和第一種熒光染料的DNA點樣溶液，所述熒光染料具有特定的激發(fā)和發(fā)射波長；將DNA點樣溶液上樣于DNA芯片基質(zhì)以形成DNA斑點，其中第一種熒光染料與基質(zhì)結(jié)合，和檢測DNA斑點發(fā)出的熒光信號。
2.權(quán)利要求1的質(zhì)量控制方法，其中第一種熒光染料對標記靶DNA所用的第二種熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長沒有光譜干擾。
3.權(quán)利要求1的質(zhì)量控制方法，進一步包括測定所測熒光信號的均一性。
4.權(quán)利要求3的質(zhì)量控制方法，其中所測熒光信號的均一性通過DNA斑點的直徑和外形以及熒光信號的熒光強度來測定。
5.權(quán)利要求1的質(zhì)量控制方法，其中第一種熒光染料包括異硫氰酸熒光素(FITC)，熒光素，Cy3，Cy5，德克薩斯紅和N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)。
全文摘要
本發(fā)明提供了DNA微陣列的質(zhì)量控制方法，其包括制備含有第一種熒光染料的DNA點樣溶液，所述熒光染料具有特定的激發(fā)和發(fā)射波長，將DNA點樣溶液上樣于DNA芯片的基質(zhì)上以形成DNA斑點，其中第一種熒光染料與基質(zhì)結(jié)合，和檢測DNA斑點發(fā)出的熒光信號。在DNA微陣列的質(zhì)量控制方法中，由于與DNA探針一起共價結(jié)合于固體芯片表面的熒光染料發(fā)出的信號被用于質(zhì)量控制，因此無需進行常規(guī)質(zhì)量控制方法中的染色和除去染料的過程。
文檔編號C12N15/09GK1443854SQ02147199
公開日2003年9月24日 申請日期2002年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月7日
發(fā)明者趙俊衡, 許楠, 沈儲暎, 金敬姬, 樸佳永 申請人:三星電子株式會社