專利名稱：：純化可溶性ssao的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的重組構(gòu)建體，所述融合蛋白質(zhì)含有可溶形式的人氨基脲-敏感性胺氧化酶(SSAO)、可分泌的融合配偶體、信號(hào)肽和蛋白酶裂解位點(diǎn)。本發(fā)明還涉及純化可溶形式的人SSAO的方法，所述方法使用該重組構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
：氨基脲-敏感性胺氧化酶(SSAO)屬于含銅胺氧化酶的酶家族(CuAO；EC.1.4.3.6)，并且廣泛分布于真核和原核生物體內(nèi)(Buffoni，1993)。這種豐富的酶的生理學(xué)作用基本上是未知的，而且盡管芐胺是一種高親和力的人工底物，但是至今還沒有鑒定出具有高親和力的內(nèi)源性底物(Buffoni，1993；Callingham等，1995；Lyles，1996，Hartmann和McIntire，1997；Holt等，1998)。在人體內(nèi)的血管平滑肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SSAO的活性很高(Lewinsohn1984；Nakos和Gossrau，1994；Yu等，1994；Lyles和Pino，1998；Jaakkola等，1999)。已經(jīng)在非血管類的平滑肌細(xì)胞中和內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到了SSAO活性(Lewinsohn1984；Castillo等，1998；Jaakkola等，1999)。在血液中也發(fā)現(xiàn)了少量的SSAO蛋白質(zhì)，與組織-結(jié)合形式的蛋白質(zhì)具有相似的特性(Yu和Zuo，1993；Yu等，1994；Kurkijrvi等，1998)。許多研究表明對(duì)于若干種人類病癥如心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病，血漿中的SSAO活性升高(Lewinsohn1984；Boomsma等，1997；Ekblom，1998；Boomsma等，1999；Meszaros等，1999)。目前對(duì)酶活性發(fā)生這些改變的機(jī)理還不確定。已經(jīng)證實(shí)由內(nèi)源性胺氧化酶產(chǎn)生的反應(yīng)性醛和過氧化氫可能是導(dǎo)致心血管病的原因，而且還證實(shí)了抑制糖尿病患者體內(nèi)的SSAO活性可能會(huì)減少血管并發(fā)癥(Ekblom1998)。最近發(fā)現(xiàn)人SSAO的cDNA序列(Zhang和McIntire，1996)與血管粘附蛋白1(VAP-1)的cDNA序列相同，所述血管粘附蛋白1(VAP-1)通過介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與外周淋巴結(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合而參與了淋巴細(xì)胞的再循環(huán)過程(Smith等，1998；同時(shí)參見WO98/53049)。SSAO/VAP-1的cDNA序列在GenBank中的登記號(hào)為U39447和NM003734(SEQIDNO1)。還發(fā)現(xiàn)在有炎癥的情況下，內(nèi)皮細(xì)胞表面的VAP-1上調(diào)(Smith等，1998)。然而，只在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了SSAO的粘附特性。在平滑肌細(xì)胞中，SSAO不輔助淋巴細(xì)胞的結(jié)合(Jaakola等，1999)。DNA序列分析、結(jié)構(gòu)模擬和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明人SSAO是一種由兩個(gè)90-100kDa的亞基組成的同型二聚體糖蛋白，所述亞基通過單個(gè)N-端跨膜區(qū)固著在血漿膜上(Morris等，1997；Smith等，1998；Salminen等，1998)。至今還沒有關(guān)于純化重組哺乳動(dòng)物SSAO或從自然界大量純化出接近同質(zhì)性的人SSAO的報(bào)道。有一個(gè)報(bào)道已經(jīng)記載了為了檢測(cè)目的的FLAG肽用于與全長人SSAO的N-端融合在一起，但是沒有提及該肽用于純化人SSAO蛋白質(zhì)的用途(Smith等，1998)。單克隆抗體已被用來從血清和組織勻漿中免疫親和純化少量的人SSAO用于免疫印跡(Smith等，1998；Kurkijrvi等，1998)。因此，需要一種用于大量純化人SSAO的其它方法。源于日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是一種同型二聚體胞質(zhì)酶，該酶可以通過利用固定化的輔因子谷胱甘肽進(jìn)行親和層析，接著通過利用還原型谷胱甘肽(GSH)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性洗脫來純化。通過利用這種特定的相互作用，Smith及其同事研制出一種適于大腸桿菌(E.coli)胞內(nèi)表達(dá)的基因融合系統(tǒng)(Smith&Johnson，1988；同時(shí)參見WO88/09372)，該系統(tǒng)便于檢測(cè)和純化融合了GST的重組蛋白質(zhì)。以GST作為融合配偶體的潛在缺點(diǎn)是當(dāng)暴露給氧化環(huán)境時(shí)其表面上的游離半胱氨酸可能會(huì)與例如被融合的靶蛋白質(zhì)上的游離半胱氨酸進(jìn)行交聯(lián)。為了減少這種風(fēng)險(xiǎn)以及使GST-融合蛋白質(zhì)能夠分泌，最近研制出了突變型的GST，其既保留了形成同型二聚體的能力又保留了酶活性(Tudyka和Skerra，1997)。GST易于形成同型二聚體的性質(zhì)可以被用來誘導(dǎo)被融合的靶蛋白質(zhì)的二聚體化，這種二聚體化的目的例如是為了增強(qiáng)親和作用(Tudyka和Skerra，1997)。文獻(xiàn)記載的另一種同型二聚體融合配偶體例如是免疫球蛋白的Fc區(qū)(Hollenbaugh等，1992；Sakurai等，1998；Lo等，1998；Dwyer等，1999)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)如GCN4(Rieker和Hu，2000；Müller等，2000)。已經(jīng)將數(shù)種不同的蛋白質(zhì)融合到這些同型二聚體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域上用于不同的目的，例如為了增加親和性(Dwyer等，1999；Müller等，2000)和為了保留截短的DNA-結(jié)合蛋白質(zhì)與DNA的高親和力結(jié)合(Rieker和Hu，2000)。Fc-融合蛋白質(zhì)可以通過包括采用低pH緩沖液的洗脫的蛋白A-親和層析來純化(Sakurai等，1988，Lo等)，但該層析方法可能會(huì)降低被融合的靶蛋白質(zhì)的活性(Grslund等，1997)。以Fc作為融合配偶體帶來的另一個(gè)問題是要采用細(xì)胞生長所需的血清，由于血清含有大量的免疫球蛋白從而使得對(duì)分泌的Fc-融合體的檢測(cè)和純化復(fù)雜化(Sakurai等，1998)。所述亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)GCN4大多被用作由大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)的融合配偶體(Müller等，2000)而且需要融合一種便于純化的親和-標(biāo)記物。附圖簡(jiǎn)述圖1是GST-SSAODNA構(gòu)建體的圖解圖。GST融合配偶體中的三個(gè)半胱氨酸向絲氨酸的突變(GeneBank登記序號(hào)為M14654的序列上的第85，138和178位殘基)以黑體字母表示。方框內(nèi)的序列表示3C-蛋白酶的識(shí)別序列。圖2是SSAO純化過程的流程圖。標(biāo)出了每個(gè)純化步驟的測(cè)定比活性。圖3是被命名為pMB887的GST-SSAO表達(dá)載體圖。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明，出乎預(yù)料地發(fā)現(xiàn)通過利用能夠使可溶性SSAO二聚體化的融合配偶體的純化系統(tǒng)能夠生產(chǎn)毫克級(jí)的可溶性人SSAO。因此，本發(fā)明第一個(gè)方面提供了含有編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的重組構(gòu)建體，該融合蛋白質(zhì)含有(i)可溶形式的人SSAO；(ii)能夠使SSAO二聚體化的可分泌融合配偶體；(iii)使多肽從宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中的信號(hào)肽；(iv)位于人SSAO變異體和融合配偶體之間的蛋白酶裂解位點(diǎn)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，所述重組構(gòu)建體可以任選地含有一個(gè)或多個(gè)編碼各種長度間隔氨基酸序列的核苷酸序列。這種間隔序列可被用于增強(qiáng)融合蛋白質(zhì)內(nèi)的柔性，或者被用于增大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的間隔以便相鄰結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行折疊。而且，間隔區(qū)可被用于增強(qiáng)柔順性以便蛋白酶對(duì)被引進(jìn)的裂解識(shí)別序列進(jìn)行裂解。可溶形式的人SSAO優(yōu)選地缺乏野生型人SSAO的跨膜區(qū)。SSAO多肽的跨膜區(qū)在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的(Morris等，1997；Holt等，1998；Smith等，1998)，并且基本上如SEQIDNO2的第5至27，優(yōu)選地第6至26位氨基酸所示。人SSAO的氨基酸序列，除了跨膜區(qū)以外，優(yōu)選地含有SEQIDNO2中的第29至763位氨基酸，或者基本上由SEQIDNO2中的第29至763位氨基酸組成。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解SSAO多肽內(nèi)可以含有部分跨膜區(qū)域，而該多肽仍基本保留其可溶特性。因此，人SSAO的氨基酸序列可以含有例如SEQIDNO2的第27至763，或第28至763位氨基酸，包括基本具有人SSAO生物活性的其片段。而且術(shù)語“人SSAO多肽”旨在包括人SSAO的突變體和自然存在的變異體，所述突變體或變異體或者保留了酶活性或蛋白質(zhì)相互作用(例如粘附功能)，或者被設(shè)計(jì)成便于進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究(例如結(jié)晶性能的改進(jìn))，或者被突變成便于進(jìn)行結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系的研究(其包括非活性突變體)。所述融合配偶體可被融合到人SSAO多肽的C-端或N-端部分。可以將融合蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)成可以含有多于一個(gè)的融合配偶體，例如一個(gè)被融合到SSAO的N-端部分和一個(gè)被融合到C-端部分。附加的融合配偶體可能是一種附加的親和標(biāo)記物或一種報(bào)道蛋白如增強(qiáng)綠熒光蛋白(EGFP)。已經(jīng)記載了大量的不同基因融合系統(tǒng)和融合配偶體。在這些系統(tǒng)中，利用了不同類型的相互作用，如酶-底物、細(xì)菌受體-血清蛋白、聚組氨酸-金屬離子和抗體-抗原(Uhlén等，1992)。用于親和純化的多種基因融合系統(tǒng)在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中也是已知的。用于這種系統(tǒng)的融合配偶體的實(shí)例(這方面的綜述，參見例如Nilsson等。1997；或Sheibani，1999)包括葡萄球菌蛋白A及其衍生物Z；源自鏈球菌蛋白G的白蛋白-結(jié)合蛋白質(zhì)；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)；聚組氨酸標(biāo)記物；生物素化親和標(biāo)記物(例如BiotinAviTag)；大腸桿菌麥芽糖-結(jié)合蛋白質(zhì)；纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；FLAG肽和Ttrep-標(biāo)記物。利用蛋白支架結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生另一種用于產(chǎn)生新型配體受體的系統(tǒng)(參見Skerra，2000，以及其中的引用的參考文獻(xiàn))。然后這些新型結(jié)合蛋白質(zhì)，例如親和體(affibody)，可以被用作不同用途的融合配偶體(Nygren和Uhlén，1997；Nord等，1997)。根據(jù)本發(fā)明，所述融合配偶體應(yīng)當(dāng)能夠使SSAO二聚體化。合適的融合配偶體是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，這是由于它傾向于形成二聚體，而且還由于利用含有固定化谷胱甘肽的色譜介質(zhì)(例如，源自AmershamPharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)就能夠在溫和條件下進(jìn)行純化。另外，通過其酶活性或通過利用GST特異性抗體或谷胱甘肽，采用商購GST檢測(cè)系統(tǒng)(例如，來源AmershamPharmaciaBiotech)能夠方便地檢測(cè)GST。所述融合配偶體也可以是GST的一種功能等價(jià)變異體，仍然保留了形成二聚體的傾向，并且具有能夠進(jìn)行親和純化的結(jié)合特性。所述融合配偶體更優(yōu)選地是日本血吸蟲(S.japonicum)GST的變異體(GenBank登記號(hào)M14654；SEQIDNO3和4)，該變異體被設(shè)計(jì)成能夠分泌到宿主細(xì)胞外，在第85、138和178位上具有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基被其它氨基酸殘基所取代。最優(yōu)選地是，所述變異體在第85、138和178位上的所有半胱氨酸殘基被絲氨基酸殘基所取代(參見Tudyka&Skerra，1997和SEQIDNO5)。另外，所述重組構(gòu)建體應(yīng)當(dāng)含有編碼N-端信號(hào)肽的核苷酸序列，所述信號(hào)肽使得所述融合蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。為了在真核細(xì)胞中生產(chǎn)人蛋白質(zhì)如SSAO，同源信號(hào)肽是優(yōu)選的。為了在HEK293細(xì)胞中生產(chǎn)SSAO，可以使用小鼠IgG1重鏈信號(hào)肽(Kabat等，1991)。其它合適的信號(hào)肽在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的，并被記載在例如Kabat等的文獻(xiàn)中，見上文。已經(jīng)記載了幾種用于位點(diǎn)特異性裂解融合蛋白質(zhì)的方法，所述方法基于采用化學(xué)劑如CNBr或羥胺，或者酶如腸激酶、因子Xa、凝血酶、枯草桿菌蛋白酶或其它蛋白酶(參見，例如Nilsson等，(1997)以及其中引用的參考文獻(xiàn))處理。根據(jù)本發(fā)明，通過蛋白酶裂解反應(yīng)可以方便地從人SSAO上除去所述融合配偶體。用于裂解的蛋白酶可以例如是源自細(xì)小核糖核酸病毒家族的3C蛋白酶，例如鼻病毒或腸病毒3C蛋白酶(Walker等，1994)。因此，所述蛋白酶裂解位點(diǎn)可以優(yōu)選地是源自細(xì)小核糖核酸病毒家族的3C蛋白酶，例如鼻病毒或腸病毒3C蛋白酶的裂解位點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述3C蛋白酶裂解位點(diǎn)包含氨基酸序列EALFQG(SEQIDNO6)。然而，技術(shù)人員能夠鑒定出其它合適的裂解位點(diǎn)，參見例如Blom等，(1996)以及其中引用的文獻(xiàn)。本發(fā)明的重組構(gòu)建體可例如含有基本編碼圖1所示氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備的表達(dá)載體，該載體含有本發(fā)明的重組構(gòu)建體。這種表達(dá)載體通過圖3所示的被命名為pMB887的表達(dá)載體來例示。另一方面，本發(fā)明提供了純化重組人SSAO多肽的方法，該方法包括步驟(i)用上述本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(ii)在允許由所述載體表達(dá)的融合蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；(iii)使獲得的融合蛋白質(zhì)與含有對(duì)所述融合配偶體具有親和性的配體的介質(zhì)結(jié)合；(iv)分離所述的融合配偶體和SSAO多肽；和(v)回收所純化的人SSAO多肽。當(dāng)所述融合蛋白質(zhì)仍然與親和配體相連時(shí)，或者當(dāng)所述融合蛋白質(zhì)從所述親和配體上釋放出來時(shí)，可以將所述融合配偶體與人SSAO變異體分離開來。當(dāng)所述融合配偶體是GST時(shí)，對(duì)配偶體具有親和性的所述配體優(yōu)選地是谷胱甘肽或其衍生物。或者，可以將針對(duì)GST的抗體用作親和配體。如上所述，可以通過采用例如細(xì)小核糖核酸病毒如鼻病毒3C-蛋白酶的蛋白酶裂解反應(yīng)來將所述融合配偶體與人SSAO分離開來。所述蛋白酶可以被融合到融合配偶體上，從而獲得“融合蛋白酶”(參見Walker等，1994；Grslund等，1997)。方便地是，這種融合配偶體可以與用于SSAO多肽的融合配偶體，例如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶相同。然而，對(duì)于蛋白酶的其它合適融合配偶體，諸如源自鏈球菌的蛋白G的白蛋白-結(jié)合蛋白，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的，例如參見Grslund等，1997。所述融合蛋白酶通過包括以下步驟的方法與SSAO多肽分離開來將融合蛋白酶與含有配體的基質(zhì)結(jié)合，該配體對(duì)所述融合配偶體具有親和性。因此，當(dāng)融合配偶體是GST時(shí)，所述配體優(yōu)選地是谷胱甘肽或其衍生物。如上所述，針對(duì)融合配偶體的抗體也可以被用作親和配體。從商業(yè)途徑獲得的系統(tǒng)是PreScissionProtease(AmershamPharmaciaBiotech)，其是一種由日本血吸蟲GST和人鼻病毒3C蛋白酶組成的基因工程融合蛋白質(zhì)。針對(duì)某些應(yīng)用，將SSAO固定化可能是有利的。這可以例如通過采用如上所述的親和-標(biāo)記物如GST來實(shí)現(xiàn)。通過親和-標(biāo)記物將融合蛋白質(zhì)固定化的應(yīng)用實(shí)例包括蛋白質(zhì)配體的捕獲、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用的分析以及在生物反應(yīng)器中的用途(Nilsson等，1996；Nord等，1997；Shpigel等，1999)。然而，記載了其它多種用于蛋白質(zhì)固定化的方法如共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)吸附(參見例如Tischer和Kasche，1999以及其中引用的參考文獻(xiàn))，其也可以被用于GST-SSAO或經(jīng)去除了融合配偶體后的SSAO的固定化。另外，SSAO蛋白質(zhì)還可以被包囊在例如溶膠-凝膠或人工細(xì)胞，例如脂質(zhì)體(參見例如Liang等，2000以及其中引用的文獻(xiàn))中。采用親和-標(biāo)記物如GST的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以實(shí)現(xiàn)定向固定化，經(jīng)常是以一步法直接由例如細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物進(jìn)行定向固定化(Nilsson等，1997；Saleemuddin，1999)。這可以使得在空間上容易接近活性結(jié)合位點(diǎn)并且增強(qiáng)了穩(wěn)定性(Saleemuddin，1999；Turkova，1999)。已被用于蛋白質(zhì)固定化的其它親和-標(biāo)記物方法的實(shí)例是例如為了利用生物素與鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白之間的非常強(qiáng)的相互作用(Kd～10-15)(Nilsson等，1997)而被生物素連接酶特異生物素化以及被用作融合配偶體的肽和蛋白質(zhì)和與纖維素特異性結(jié)合的CBD(Linder等，1998；Tomme等，1998)。通過利用與蛋白質(zhì)結(jié)合的固定化抗體或者通過蛋白質(zhì)表面可能存在的碳水化物部分也可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定向固定化(Turkova，1999)。最近，通過利用改構(gòu)的碳糊(carbonpaste)將源自豌豆苗的胺氧化酶固定化以生產(chǎn)用于測(cè)定生物產(chǎn)生的和合成的胺的生物傳感器(Wimmerova和Macholan，1999)。類似地，為了構(gòu)建檢測(cè)例如心血管毒素烯丙胺的生物傳感器，可將重組人SSAO固定化，所述心血管毒素烯丙胺被用于有機(jī)工業(yè)過程并且是SSAO的底物(Boor和Hysmith，1987；Conklin等，1998)。當(dāng)進(jìn)行固定化時(shí)，可以預(yù)測(cè)重組SSAO以模擬膜-定位的SSAO及其特性，這可能不同于溶解狀態(tài)。因此，如下列實(shí)施例所示，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)高純度可溶性重組人SSAO的方法，所述SSAO具有酶活性。所述實(shí)例性的方法包括利用突變體形式的日本血吸蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，其作為親和融合配偶體被設(shè)計(jì)用來向宿主細(xì)胞外轉(zhuǎn)移(Tudyka和Skerra，1997)。所述融合蛋白質(zhì)從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌出來，并且可以通過谷胱甘肽-親和層析可以直接從培養(yǎng)基中純化出來。通過特異性蛋白水解作用和附加的谷胱甘肽-親和層析步驟，將融合配偶體和蛋白酶除去，由此得到毫克級(jí)的純的、可溶性的和高活性的重組人SSAO蛋白質(zhì)。據(jù)發(fā)明人所知，這是第一次生產(chǎn)可溶形式的重組活性人SSAO蛋白質(zhì)并且被純化成接近同質(zhì)性。確信所公開的用于生產(chǎn)重組人SSAO的方法對(duì)于其它哺乳動(dòng)物胺氧化酶以及其它可分泌蛋白也是實(shí)用的，所述哺乳動(dòng)物胺氧化酶諸如是人胎盤二胺氧化酶(Zhang等，1995)和人視網(wǎng)膜-特異性胺氧化酶(Imamura等，1998)。所公開的方法也有利于改構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和鑒定，例如通過分離含有輔因子的肽或通過晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定來鑒定活性位點(diǎn)輔因子。在下列實(shí)施例中，表明SSAO是活性的和可溶性的而不具有跨膜區(qū)域，而且表明GST可通過蛋白水解來除去。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了SSAO通過在跨膜區(qū)域附近進(jìn)行蛋白水解裂解(脫落)而被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中的假說，該方法通用于型I和型II膜蛋白(Hooper等，1997)。裂解膜-定位的SSAO的蛋白酶的蛋白水解活性的增強(qiáng)或增強(qiáng)現(xiàn)存蛋白酶底物利用性的表面定位能力的增強(qiáng)可能會(huì)導(dǎo)致例如糖尿病人血漿中的SSAO活性的提高(Boomsma等，1999)。除非另有定義，本文所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同。盡管與本文所記載的那些方法和材料類似的或相同的方法和材料也可以被用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中，但是合適的方法和材料如以下所述。本文引用的所有出版物、專利出版物、專利和其它參考文獻(xiàn)被全文引入本文作為參考。在出現(xiàn)矛盾的情況下，包括定義在內(nèi)的本申請(qǐng)的說明書將起決定作用。另外，所述材料、方法和實(shí)施例只是說明性質(zhì)的并不是限制目的的。本發(fā)明的其它特性和優(yōu)點(diǎn)通過以下的詳細(xì)描述以及權(quán)利要求將更加明了。實(shí)例性的方法源自主動(dòng)脈cDNA的人SSAO基因的PCR-擴(kuò)增和克隆借助公開的人胎盤胺氧化酶的cDNA序列設(shè)計(jì)兩個(gè)PCR-引物(GenBank登記號(hào)U39447；Zhang和McIntire，1996)。5’-引物XNQZ-15(5’-CCGGAATTCCAACGCGTCCATGAACCAGAAGACAATCCTCGTG-3’；SEQIDNO7)被設(shè)計(jì)成與包含ATG起始密碼子的SSAO編碼序列的5’-端雜交以及含有用于克隆的限制性酶切位點(diǎn)EcoRI和MluI。3’-引物XNQZ-17(5’-CCCCCAAGCTTGTCGACTCACTAGTTGTGAGAGAGAAGCCCCCCC-3’；SEQIDNO8)被設(shè)計(jì)成與包含天然終止密碼子TAG的3’-端雜交，該終止密碼子TAG后面接著一個(gè)附加的終止密碼子TGA和用于克隆的兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)SalI和HindIII。作為PCR的模板，對(duì)0.5μl人主動(dòng)脈或人平滑肌細(xì)胞QUICK-CloneCdna(1ng/μl，ClontechLaboratory，PaloAlto，CA)進(jìn)行了試驗(yàn)。下列條件被用于PCR-反應(yīng)，20pmol的每種引物XNQZ-15和XNQZ-17，1μldNTP(10mM)，1μlAdvantagecDNA聚合酶混合物(Clontech)，5μl10xcDNAPCR反應(yīng)緩沖液(Clontech)，總體積為50μl。利用Perkin-Elmer2400熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR程序由以下步驟組成94℃維持5分鐘進(jìn)行初始變性，94℃30秒鐘、60℃30秒鐘和72℃3分鐘循環(huán)35次，接著72℃3分鐘進(jìn)行最終的延伸反應(yīng)。然后利用TA-克隆來將PCR-產(chǎn)物插入到載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。按照染色終端循環(huán)測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)程序從兩個(gè)方向?qū)Ρ豢寺〉腜CR-片段進(jìn)行測(cè)序，并利用DNA測(cè)序儀ABI377(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)進(jìn)行分析。用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)SSAO的載體的構(gòu)建通過將源自pCR2.1-TOPO-SSAO載體的EcoRI和SalI片段插入到載體pCI-neo(Promega，Madison，WI)的相同位點(diǎn)上來制備用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)完整的SSAO蛋白質(zhì)的載體，得到載體pMB843。該載體被用作對(duì)應(yīng)于人SSAO的29-763位殘基區(qū)域的PCR-擴(kuò)增模板(Zhang和McIntire，1996)。將5’引物5’-GAGGAAGCTTTGTTCCAAGGTGGAGATGGGGGTGAA-3’(SEQIDNO9)合成為含有部分3C蛋白酶切位點(diǎn)的密碼子(見下文)和位于29位殘基的密碼子的上游的HindIII限制性酶切位點(diǎn)。3’-引物5’-GCATTCTAGTTGTGGTTTGTC-3’(SEQIDNO10)是與被克隆的SSAO片段的下游退火的pCI-neo載體特異性引物。得到的PCR-產(chǎn)物用HindIII和NotI消化，并被克隆到用相同酶酶切的質(zhì)粒pET38b(+)(Novagen，Inc.，Madison，WI)中，從而得到pET38-SSAO。按照上述方法進(jìn)行DNA測(cè)序以便證實(shí)被克隆的SSAO片段具有所期望的序列。通過PCR-介導(dǎo)的突變和按照下述方法進(jìn)行的片段裝配來制備源自日本血吸蟲的、以前被用作重組蛋白質(zhì)的分泌型的酶活性的二聚體化模塊的突變形式(SEQIDNO5)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)(Tudyka和Skerra，1997)。進(jìn)行突變來取代定位在GST蛋白質(zhì)表面附近的第85、138和178位的三個(gè)半胱氨酸殘基，所述GST蛋白質(zhì)表面如日本血吸蟲GST的晶體結(jié)構(gòu)(Lim等，1994；Tudyka和Skerra，1997)所示，具有絲氨酸殘基從而在GST融合蛋白質(zhì)被釋放到氧化環(huán)境后避免不希望的二硫化物的形成(Tudyka和Skerra，1997)。用下列PCR-引物來構(gòu)建突變的GST和引進(jìn)第一部分的3C蛋白酶切位點(diǎn)(見下文)以及用于克隆的合適限制性酶切位點(diǎn)。另外，所述引物引進(jìn)了用于調(diào)控酶切和通過連接可能用于裝配PCR-片段的內(nèi)部限制性位點(diǎn)ROEL-1(5’-GCCGGAATTCGACGCGTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3’；SEQIDNO11)含有用于克隆的EcoRI和MluI，并且與GST的2-8位密碼子(M14654)退火；ROEL-2(5’-CTCTGCGCGCTCTTTTGGAGAACCCAACATGTTGTGC-3’；SEQIDNO12)含有BssHII位點(diǎn)；ROEL-3(5’-GGTTCTCCAAAAGAGCGCGCAGAGATTTCAATGCTTGAAG-3’；SEQIDNO13)含有BssHII位點(diǎn)；ROEL-4(5’-ATGAGATAAACGGTCTTCGAACATTTTCAGCATTTC-3’；SEQIDNO14)含有BbsI位點(diǎn)；ROEL-5(5’-GTTCGAAGACCGTTTATCTCATAAAACATATTTAAATGGTGATC-3’；SEQIDNO15)含有BbsI位點(diǎn)；ROEL-6(5’-AAAAGAAACTAGTTTTGGGAACGCATCCAGGCA-3’；SEQIDNO16)含有SpeI位點(diǎn)；ROEL-7(5’-CCCAAAACTAGTTTCTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATC-3’；SEQIDNO17)含有speI位點(diǎn)；ROEL-8(5’-ACCCAAGCTTCCTGACTTTGTGACTTTGGAGGATGGTCGCCACC-3’；SEQIDNO18)含有用于克隆的HindIII位點(diǎn)并且與GST的212-218位密碼子(M14654)退火。ROEL-8還將在部分3C蛋白酶裂解位點(diǎn)前引進(jìn)間隔-序列SQSQ的密碼子。利用引物對(duì)ROEL-/2、ROEL-3/4、ROEL-4/5和ROEL-7/8，以質(zhì)粒pGEX-6P-2(AmershamPharmaciaBiotech)為模板分別進(jìn)行PCR反應(yīng)來擴(kuò)增GST基因的重疊部分。混合四種PCR-片段并且在利用引物ROEL-1和ROEL-8的PCR反應(yīng)中以它們?yōu)槟０鍋硌b配突變的完整GST基因。利用AdvantagecDNAPCR試劑盒(Clontech)進(jìn)行PCR-反應(yīng)。在下一個(gè)步驟中，將GST片段用EcoRI和HindIII進(jìn)行消化并克隆到pUC18(AmershamPharmaciaBiotech)的相同位點(diǎn)上，從而得到pMB809。按照上述方法進(jìn)行DNA測(cè)序來證實(shí)所期望的突變GST片段的序列。pMB809載體采用EcoRI和HindIII進(jìn)行裂解并分離出GST片段，然后將該GST片段克隆到用同種酶酶切的pET38-SSAO載體中的SSAO片段的上游位置。該步驟使得在GST和SSAO(殘基29-763)之間形成了一個(gè)完整的人鼻病毒-14和柯薩奇病毒的3C蛋白酶裂解位點(diǎn)EALFQG(SEQIDNO6)(Miyashita等，1996；Wang等，1997)(參見圖1)。GST-SSAO片段被克隆到載體pMB565的MluI和SalI位點(diǎn)上，其中鼠IgG1重鏈的突變信號(hào)序列(圖1)被克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCI-neo(Promega)的多接頭上。產(chǎn)生的GST-SSAO表達(dá)載體被命名為pMB887(圖3)。穩(wěn)定克隆的轉(zhuǎn)染和選擇將三個(gè)25cm2的T-燒瓶接種上約4×105的人胚胎腎293細(xì)胞(HEK293細(xì)胞，ATCCCRL-1573，Rockville，MD)。在含有Dulbecco的改性Eagle培養(yǎng)基(DMEM)的生長培養(yǎng)基中將細(xì)胞培養(yǎng)到～50％的匯合度，所述培養(yǎng)基補(bǔ)加了10％的胎牛血清(FBS)和2mM的L-谷氨酰胺。在與培養(yǎng)基成分混合之前在56℃下將FBS加熱失活30分鐘。然后利用LipofectAMINE(LifeTechnologies，F(xiàn)rederick，MD)按照廠商提供的說明書通過脂質(zhì)體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將表達(dá)載體pMB887引入到細(xì)胞當(dāng)中。培養(yǎng)48小時(shí)后，將培養(yǎng)基整瓶倒入補(bǔ)加了1mg/ml遺傳霉素(G418)的生長培養(yǎng)基中以篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。約兩個(gè)星期后，出現(xiàn)抗性細(xì)胞并進(jìn)行匯合培養(yǎng)。收集三個(gè)T-燒瓶中的細(xì)胞(克隆混合物)并用補(bǔ)加了1.2mg/ml的G418的生長培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，然后接種到15-cm的培養(yǎng)皿中。兩個(gè)星期后，長出單獨(dú)的菌落并挑出這些菌落進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增以便以后進(jìn)行GST-SSAO生產(chǎn)的分析。利用GST96-孔檢測(cè)試劑盒(DetectionModule)(AmershamPharmaciaBiotech)對(duì)所收集的培養(yǎng)基中的源自擴(kuò)增克隆的GST蛋白進(jìn)行檢測(cè)。選擇出7個(gè)陽性克隆并進(jìn)行冷凍。GST-SSAO在CellFacrorv(細(xì)胞工廠)中的生產(chǎn)10號(hào)克隆在含有補(bǔ)加了5％FBS(熱失活的)、2Mm-谷氨酰胺和1.2mg/mlG418的DMEM的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增和培養(yǎng)后被接種到含有1500ml生長培養(yǎng)基的6320cm2NuncCellFacrory(NalgeNuncInt.，Naperville，IL)中，然后在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后，細(xì)胞匯合并收集培養(yǎng)基。然后向同一CellFacrory中的細(xì)胞中加入FBS含量降低的(2％)新鮮生長培養(yǎng)基(1500ml)，三天后收集條件培養(yǎng)基。將這次過程重復(fù)一次，從一個(gè)CellFacrory中得到總量～4.5升的收集培養(yǎng)基。對(duì)收集到的培養(yǎng)基進(jìn)行離心并在-70℃下進(jìn)行保藏。條件細(xì)胞培養(yǎng)基的濃縮從兩個(gè)CellFacrory中得到的冷凍條件培養(yǎng)基(9.4升)利用30℃的水浴融化。利用Centramate超濾裝置(PallFiltered，Northborough，MA)將所述材料泵過Omega膜(MWCO(截留分子量)10000)，直至達(dá)到600ml的體積。通過裝配了0.65μm預(yù)過濾器的0.45μm的過濾器，SartobranP(Sartorius，Gttingen，德國)，過濾滯留物。用250ml的磷酸鹽緩沖液(PBS)取代管中剩余的濾液結(jié)果得到850ml的過濾樣品。GST-SSAO的純化和裂解GST-SSAO融合蛋白質(zhì)通過HR10/10柱(AmershamPharmaciaBiotech)進(jìn)行谷胱甘肽-親和層析來純化，所述HR10/10柱裝填了8ml的谷胱甘肽-Sepharose4FastFlow(結(jié)合～10mgGST/ml凝膠AmershamPharmaciaBiotech)，并用10個(gè)體積的PBS進(jìn)行平衡。在室溫下以0.9ml/分鐘的流速過夜上樣過濾物(850ml)。收集流出的物質(zhì)用于分析并保藏在-20℃下。用PBS沖洗柱后，用洗脫緩沖液(20mMGSH，0.1MNaCl，0.1MTris-HCl，pH8.2)洗脫結(jié)合的蛋白。將得到的洗脫物上樣在經(jīng)氦-噴射裂解緩沖液(150mMNaCl，1mMEDTA，50mMTris-HCl，pH7.5，25℃)平衡的HiPrepDesalt26/10柱(AmershamPharmaciaBiotech)上并收集蛋白質(zhì)峰。通過加入DTT至5mM和380個(gè)單位的PreScission蛋白酶(AmershamPharmaciaBiotech)(二硫蘇糖醇)來啟動(dòng)裂解反應(yīng)。PreScission蛋白酶是一種遺傳工程融合蛋白質(zhì)，由GST和人鼻病毒3C蛋白酶組成，而且特異性裂解其識(shí)別序列中Gln(G)和Gly(G)殘基之間的鍵。在5℃下溫育裂解混合物。溫育63小時(shí)后，按照上述方法將該物質(zhì)上樣到谷胱甘肽-Sepharose柱上，該柱經(jīng)裂解緩沖液平衡。收集流出液(36ml)，并在5℃下于敞開試管中保存約一個(gè)星期。取樣并進(jìn)行SDS-PAGE分析(非還原的)。用洗脫緩沖液洗脫被捕獲在柱上的蛋白質(zhì)用于分析。將被收集的蛋白樣品上樣到JumboSep裝置(MWCO30000，PallFiltron)上用于緩沖液更換和濃縮。離心并用含有50mMTris-HCl(pH7.5)和150mMNaCl的緩沖液稀釋，該過程循環(huán)5次。取出樣品用于不同分析。然后將緩沖液更換的和濃縮的物質(zhì)(4.2ml)保存在-70℃。蛋白質(zhì)分析通過SDS-PAGE分析SSAO的純度和大小。在有或無2-巰基乙醇存在的條件下利用梯度凝膠4-20％或4-12％(NovexCopenhagen，Denmark)對(duì)樣品進(jìn)行電泳，并通過考馬斯染色對(duì)蛋白進(jìn)行顯影(PhastGelBlueR，AmershamPharmaciaBiotech)。利用考馬斯與蛋白檢測(cè)試劑盒(Pierce，Rockford，IL)按照廠商建議的標(biāo)準(zhǔn)在含有牛血清白蛋白的96-孔板中測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。利用SMART系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech)在Superdex200PC3.2/30柱(AmershamPharmaciaBiotech)上進(jìn)行大小排阻層析。所述柱子在室溫下經(jīng)含有50mMTris-HCl(pH7.5)、150mMNaCl和1mMEDTA的緩沖液平衡。進(jìn)樣體積是10μl，而且樣品以0.1ml/分鐘的流速進(jìn)行洗脫。利用凝膠過濾HMW校準(zhǔn)試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech)中的分子量標(biāo)準(zhǔn)品BlueDextran2000(～2000kDa)、甲狀腺球蛋白(669kDa)、鐵蛋白(440kDa)、過氧化氫酶(232kDa)和醛縮酶(158kDa)來對(duì)柱子進(jìn)行校準(zhǔn)。利用連接了HP1090PTH分析儀的HPG1000A蛋白測(cè)序儀(HewlettPackard，PaloAlto，CA)通過反復(fù)進(jìn)行Edman降解對(duì)純化的GST-SSAO和SSAO進(jìn)行N-端測(cè)序。對(duì)GST-SSAO樣品進(jìn)行脫鹽以便在分析之前除去谷胱甘肽。裂解后從谷胱甘肽-Sepharose柱的流出液中提取SSAO。由Holt及其同事所述的用于一元胺氧化酶的分光光度分析法(Holt等，1997)被用來測(cè)定來自不同純化步驟的樣品中的胺氧化酶活性。該分析法用37℃溫育的96-孔微滴板于SPECTRAmax250微板分光光度計(jì)(MolecularDevice，Sunnyvale，CA)中進(jìn)行。在0.2M磷酸鉀緩沖液(pH7.6)中含有1mM香草酸(Sigma，St.Louis，MO)、500μM4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)(Sigma)和4Uml-1過氧化物酶(源自辣根的型VI，Sigma)的試劑混合物在進(jìn)行檢測(cè)的當(dāng)天配制，并在使用之前一直保存在5℃下。在有或無750μM鹽酸芐胺(Sigma)存在的條件下通過混合50μl的樣品、50μl的試劑混合物和200μl的磷酸鉀緩沖液來開始進(jìn)行反應(yīng)，并且反應(yīng)按照一式三份來進(jìn)行。為了獲得空白對(duì)照值，用緩沖液取代孔中的樣品來進(jìn)行分析。接下來在490nm下的吸光值在10-40分鐘內(nèi)發(fā)生變化。利用磷酸鉀緩沖液將H2O2原液稀釋為10nm/孔至120nm/孔的溶液來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)，于37℃下將樣品在300μM氨基脲中溫育30分鐘，然后加入芐胺溶液。本發(fā)明將通過下列實(shí)施例進(jìn)行描述。這些實(shí)施例只是為了實(shí)例說明本發(fā)明而無論如何都不應(yīng)被理解為是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例實(shí)施例1SSAOcDNA的克隆用PCR方法擴(kuò)增源自人主動(dòng)脈cDNA的人SSAO的基因。PCR引物被設(shè)計(jì)成包含人胎盤胺氧化酶基因的側(cè)翼序列(Zhang和McIntire，1996)以及包含用于克隆到不同表達(dá)載體中的限制性酶切位點(diǎn)。克隆～2300bp的PCR-產(chǎn)物，隨后的DNA進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果表明克隆的PCR產(chǎn)物的序列與人胎盤胺氧化酶序列(Zhang和McIntire，1996)相同，并且與從肺cDNA克隆的VAP-1序列(Smith等，1998)相同。實(shí)施例2膜-結(jié)合的SSAO的純化(對(duì)照實(shí)施例)為了生產(chǎn)重組SSAO蛋白而進(jìn)行的嘗試表明活性SSAO可以通過利用pMB843載體在人胚胎腎(HEK293)細(xì)胞中來生產(chǎn)，所述pMB843載體中克隆了人SSAO的全長編碼序列。利用溶解試劑進(jìn)行提取后發(fā)現(xiàn)了活性蛋白，但是僅可以部分純化微克量的蛋白質(zhì)。實(shí)施例3用于表達(dá)可溶形式的SSAO的基因構(gòu)建體的原理和設(shè)計(jì)已經(jīng)研究出另一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)非膜結(jié)合的SSAO的方法。通過利用具有內(nèi)在的形成二聚體的傾向的親和融合配偶體取代含有推測(cè)跨膜肽的N-端區(qū)域來進(jìn)行純化和檢測(cè)。所述方法還包括利用可分泌的親和融合配偶體來使融合蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中。選擇日本血吸蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的突變變異體。該突變的GST保留了其活性以及形成二聚體的傾向，并且被優(yōu)化成利于進(jìn)行分泌(Tudyka和Skerra，1997)。蛋白酶裂解位點(diǎn)被設(shè)計(jì)成能夠使SSAO從純化的GST-SSAO融合蛋白質(zhì)中釋放出來。對(duì)預(yù)測(cè)氨基酸序列進(jìn)行的掃描結(jié)果表明第28個(gè)位點(diǎn)上的精氨酸的側(cè)翼具有三個(gè)甘氨酸殘基。若干種人蛋白酶堿性殘基后裂解(Carter，1990；Hooper等，1997)，而且短序列的甘氨酸殘基據(jù)說增強(qiáng)對(duì)蛋白酶的可接近性(Carter，1990)。另外，許多膜-定位蛋白的胞外區(qū)域向血流中進(jìn)行的蛋白水解釋放(脫落)發(fā)生在膜附近(Hooper等，1997)。因此選擇第29位上的甘氨酸殘基與合適的底物進(jìn)行連接，該底物用于GST-SSAO融合蛋白質(zhì)純化后的位點(diǎn)-特異性蛋白水解。因此，能夠裂解在P1位點(diǎn)上具有一個(gè)甘氨酸的底物以及具有高特異性的蛋白酶是理想的?，F(xiàn)有幾種具有這兩種特性的商業(yè)蛋白酶如因子Xa、凝血酶、腸激酶和3C蛋白酶(Nilsson等，1997)。容易捕獲裂解后的蛋白酶的能力是另一個(gè)要考慮的因素，因此選擇了可商購的融合了GST的3C蛋白酶。3C蛋白酶裂解位點(diǎn)EALFQG(SEQIDNO6)(Miyashita等，1996；Wang等，1997)被引進(jìn)GST-SSAO融合構(gòu)建體(圖1)。將GST-SSAO片段克隆到具有信號(hào)序列的讀框中從而實(shí)現(xiàn)GST-SSAO融合蛋白質(zhì)向培養(yǎng)基中的分泌。使用得自鼠抗體的重鏈的信號(hào)序列(參見圖1)。由此得到的最終構(gòu)建體(SEQIDNO19和20)編碼融合蛋白質(zhì)，該融合蛋白質(zhì)含有抗體信號(hào)肽、18個(gè)氨基酸的間隔區(qū)域、突變的GST蛋白質(zhì)、3C蛋白酶的底物序列和由人主動(dòng)脈cDNA克隆的人SSAO蛋白的第29-763位殘基(圖1)。未改構(gòu)的GST-SSAO融合蛋白質(zhì)的計(jì)算分子量是112kDa。實(shí)施例4對(duì)源自被GST-SSAO表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的條件培養(yǎng)基進(jìn)行初步分析源自小規(guī)模的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基中的芐胺氧化酶活性說明GST-SSAO被分泌到了培養(yǎng)基中，其中所述HEK293細(xì)胞被GST-SSAO表達(dá)載體pMB887穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。進(jìn)一步的分析表明谷胱甘肽-Sepharose珠子可被用來純化少量的直接源自條件培養(yǎng)基的GST-SSAO融合蛋白質(zhì)(沒有顯示數(shù)據(jù))，并且表明被純化的物質(zhì)具有芐胺氧化酶活性。有趣地是，發(fā)現(xiàn)GST-SSAO融合蛋白質(zhì)即使被固定在谷胱甘肽-Sepharose珠子上也具有活性。通過估計(jì)珠子上捕獲蛋白質(zhì)的量而計(jì)算的GST-SSAO融合蛋白質(zhì)在條件培養(yǎng)基中的含量為～1mg/l。實(shí)施例5GST-SSAO融合蛋白質(zhì)的制備型純化和位點(diǎn)特異性裂解親和純化過程的概述如圖2所示。純化結(jié)果列于表1中。對(duì)一個(gè)被篩選的克隆進(jìn)行擴(kuò)增并在CellFactory中進(jìn)行培養(yǎng)從而產(chǎn)生大量的用于純化的GST-SSAO。對(duì)收集的條件培養(yǎng)基進(jìn)行濃縮并進(jìn)行過濾，從而縮短了在谷胱甘肽-Sepharose柱上的加樣時(shí)間。然后通過谷胱甘肽-親和層析來從所述被濃縮的且被過濾的條件培養(yǎng)基中純化GST-SSAO融合蛋白質(zhì)。被柱捕獲的蛋白質(zhì)用20mM的GSH洗脫并在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE分析。這表明GST-SSAO融合蛋白質(zhì)具有很高的純度，并且表明可以通過單步法將其從培養(yǎng)基中的大量其它蛋白中分離出來。GST-SSAO融合蛋白質(zhì)遷移至分子量標(biāo)準(zhǔn)品中的116kDa蛋白質(zhì)的水平。從谷胱甘肽-Sepharose柱上回收到總量為8.8mg的蛋白質(zhì)。GST-SSAO融合蛋白的比活性被測(cè)定為243nmol分鐘-1·mg-1。有趣地是，通過緩沖液更換步驟去除了還原劑GST后的比活性幾乎翻了一倍。谷胱甘肽-親和純化的GST-SSAO用GST-3C蛋白酶融合蛋白，質(zhì)(46kDa)裂解從而去除了SSAO上的GST融合配偶體。分析實(shí)驗(yàn)表明裂解反應(yīng)的速度非常慢，但很精確，沒有觀察到副產(chǎn)物的產(chǎn)生。而且，完全的裂解可以通過～48小時(shí)的溫育來實(shí)現(xiàn)。裂解混合物過谷胱甘肽-Sepharose柱以便捕獲被除去的GST融合配偶體和GST-3C蛋白酶。收集流出的物質(zhì)并在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明只含有～97kDa分子量的預(yù)期SSAO產(chǎn)物。也對(duì)捕獲的物質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明只含有GST融合配偶體(～28kDa)和GST-3C蛋白酶。這表明發(fā)生了完全的裂解反應(yīng)，而且所有含有蛋白質(zhì)的GST被捕獲在谷胱甘肽-Sepharose柱上。還表明全部的SSAO蛋白質(zhì)流出了柱子，這是因?yàn)樵谙疵摮龅奈镔|(zhì)中沒有發(fā)現(xiàn)SSAO蛋白質(zhì)的存在。純化的SSAO蛋白質(zhì)的比活性被測(cè)定為522nmol分鐘-1·mg-1，比裂解前測(cè)定的比活性低。由于用DTT來確保3C蛋白酶在裂解GST-SSAO融合蛋白質(zhì)過程中的活性，所以我們通過SDS-PAGE分析(非還原的)來分析所述裂解緩沖劑是否影響SSAO均二聚體內(nèi)可能的二硫鍵(Kurkijrvi等，1998；Smith等，1998；Salminen等，1998)。只發(fā)現(xiàn)了推定的SSAO單體(～97kDa)(沒有顯示數(shù)據(jù))。然而，在5℃貯存過程中SSAO蛋白被轉(zhuǎn)化成～170kDa的大小(由SDS-PAGE分析得到)，這表明形成了一個(gè)或多個(gè)二硫鍵。通過滲濾除去裂解緩沖液并且SDS-PAGE分析結(jié)果表明SSAO蛋白仍然主要是分子量為～170kDa的二聚體形式。從9.4升的條件培養(yǎng)基中獲得總量為3.6mg的重組SSAO，該SSAO的比活性為809nmol分鐘-1·mg-1。基于所測(cè)定的芐胺氧化酶活性，該過程的總產(chǎn)率是22％。有趣地是，GST融合配偶體對(duì)SSAO蛋白質(zhì)的芐胺氧化酶活性的影響不明顯。緩沖液更換步驟后的純化的GST-SSAO融合蛋白質(zhì)的比活性被測(cè)定為634nmol分鐘-1·mg-1。去除了GST融合配偶體后，SSAO的比活性被測(cè)定為809nmol分鐘-1·mg-1。然而，GST融合配偶體的分子量是GST-SSAO融合蛋白質(zhì)的～25％，并且去除了GST后的比活性的增加幅度相同。這為利用融合蛋白質(zhì)進(jìn)行酶的性質(zhì)鑒定提供了可能。而且，親和融合配偶體如GST可被用來以定向的方式將重組蛋白結(jié)合或固定在固體載體上以便研究例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用和酶特性(Nilsson等，1997)。當(dāng)與谷胱甘肽-Sepharose珠子結(jié)合時(shí)，GST-SSAO融合蛋白質(zhì)確實(shí)具有活性。實(shí)施例6純化的SSAO蛋白質(zhì)的初步定性通過在非變性條件下進(jìn)行凝膠過濾實(shí)驗(yàn)來分析SSAO蛋白的大小。將源自SSAO蛋白質(zhì)物質(zhì)的樣品上樣到標(biāo)準(zhǔn)的Superdex200分析柱上，其中所述SSAO蛋白質(zhì)物質(zhì)在非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE分析時(shí)是以二聚體蛋白的形式進(jìn)行遷移。所述SSAO蛋白質(zhì)的洗脫體積為1.29ml，比過氧化氫酶(232kDa)略快一些，過氧化氫酶的洗脫體積是1.35ml。對(duì)被純化的SSAO蛋白質(zhì)進(jìn)行N-端氨基酸測(cè)序的結(jié)果表明GST-3C蛋白酶能夠特異性裂解GST-SSAO融合蛋白質(zhì)內(nèi)的3C蛋白酶底物序列EALFQG(SEQIDNO6)(圖1)。測(cè)定了29個(gè)氨基酸，而且這29個(gè)氨基酸精確地對(duì)應(yīng)于預(yù)測(cè)的SSAO氨基酸序列(SEQIDNO2)的第29-58位殘基。而且還對(duì)GST-SSAO融合蛋白質(zhì)進(jìn)行N-端測(cè)序，結(jié)果表明信號(hào)肽正如所期望的被進(jìn)行了加工。最后，發(fā)現(xiàn)被純化的SSAO蛋白正如所料對(duì)氨基脲的抑制作用敏感。在有0.1mM氨基脲存在的條件下，大于95％的芐胺氧化酶活性受到抑制。表1重組人SSAO的純化a將活性測(cè)定為以0.5mM芐胺為底物每分鐘產(chǎn)生H2O2的nmol數(shù)。SSAO活性是以0.1mM氨基脲作為抑制劑來測(cè)定的。b是在加入5mMDTT和GST-3C蛋白酶之前測(cè)定的。c該步驟是在GST-SSAO融合蛋白質(zhì)位點(diǎn)特異性裂解后進(jìn)行，目的是截留被除掉的GST融合配偶體和GST-3C蛋白酶。d緩沖液更換和通過超濾進(jìn)行樣品濃縮。參考文獻(xiàn)Blom，N.，Hansen，J.，Blaas，D.andBrunak，S.(1996)CleavagesiteanalysisinpicomaviralpolyproteinsDiscoveringcellulartargetsbyneuralnetworks.ProteinScience5，2203-2216.Boomsma，F(xiàn).，vanVeldhuisen，D.J.，deKam，P.J.，Manin′tVeld，A.J.，Mosterd，A.，Lie，K.I.，andSchalekamp，M.A.(1997)Plasmasemicarbazide-sensitiveamineoxidaseiselevatedinpatientswithcongestiveheartfailure.Cardiovasc.Res.33(2)，387-391.Boomsma，F(xiàn).，vandenMeiracker，A.H.，Winkel，S.，Aanstoot，H.J.，Batstra，M.R.，Manin′tVeld，A.J.，andBruining，G.J.(1999)Circulatingsemicarbazide-sensitiveamineoxidaseisraisedbothintypeI(insulin-dependent)，intypeII(non-insulin-dependent)diabetesmellitusandeveninchildhoodtypeIdiabetesatfirstclinicaldiagnosis.Diabetologia42(2)，233-237.Boor，P.J.，andHysmith，R.M.(1987)Allylaminecardiovasculartoxicity.Toxicology44(2)，129-145.Buffoni，F(xiàn).(1993)Properties，distributionandphysiologicalroleofsemicarbazide-sensitiveamineoxidases.Curr.Top.Pharmacol.2，33-49.Callingham，B.A.，Crosbie，A.E.，andRous，B.A.(1995)Someaspectsofthepathophysiologyofsemicarbazide-sensitiveamineoxidaseenzymes.Prog.BrainRes.106，305-321.Carter，P.(1990)Site-specificproteolysisoffusionproteins.InProteinpurificationFrommolecularmechanismtolarge-scaleprocesses(Am.Chem.Soc.Symp.Ser.No.427)(Ladish，M.R.，Willson，R.C.，Painton，C.C.，andBuilder，S.E.，eds)，pp.181-193，AmericanChemicalSocietyPress.Castillo，V.，Lizcano，J.M.，VisaJ.，andUnzeta，M.(1998)Semicarbazide-sensitiveamineoxidase(SSAO)fromhumanandbovinecerebrovasculartissuesbiochemicalandimmunohistologicalcharacterization.Neurochem.Int.33(5)，415-423.Conklin，D.J.，Langford，S.D.，andBoor，P.J.(1998)Contributionofserumandcellularsemicarbazide-sensitiveamineoxidasetoaminemetabolismandcardiovasculartoxicity.Toxicol.Sci.46(2)，386-392.Dwyer，M.A.，Huang，A.J.，Pan，C.Q.，andLazarus，R.A.ExpressionandcharacterizationofaDNaseI-Fcfusionenzyme.(1999)J.Biol.Chem.274(14)，9738-9743.Ekblom，J.(1998)Potentialtherapeuticvalueofdrugsinhibiti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155160LysLeuProGluMetLeuLysMetPheGluAspArgLeuSerHisLys165170175ThrTyrLeuAsnGlyAspHisValThrHisProAspPheMetLeuTyr180185190AspAlaLeuAspValValLeuTyrMetAspProMetCysLeuAspAla195200205PheProLysLeuValSerPheLysLysArgIleGluAlaIleProGln210215220IleAspLysTyrLeuLysSerSerLysTyrIleAlaTrpProLeuGln225230235240GlyTrpGlnAlaThrPheGlyGlyGlyAspHisProProLysSerGln245250255SerGlnGluAlaLeuPheGlnGlyGlyAspGlyGlyGluProSerGln260265270LeuProHisCysProSerValSerProSerAlaGlnProTrpThrHis275280285ProGlyGlnSerGlnLeuPheAlaAspLeuSerArgGluGluLeuThr290295300AlaValMetArgPheLeuThrGlnArgLeuGlyProGlyLeuValAsp305310315320AlaAlaGlnAlaArgProSerAspAsnCysValPheSerValGluLeu325330335GlnLeuProProLysAlaAlaAlaLeuAlaHisLeuAspArgGlySer340345350ProProProAlaArgGluAlaLeuAlaIleValPhePheGlyArgGln355360365ProGlnProAsnValSerGluLeuValValGlyProLeuProHisPro370375380SerTyrMetArgAspValThrValGluArgHisGlyGlyProLeuPro385390395400TyrHisArgArgProValLeuPheGlnGluTyrLeuAspIleAspGln405410415MetIlePheAsnArgGluLeuProGlnAlaSerGlyLeuLeuHisHis420425430CysCysPheTyrLysHisArgGlyArgAsnLeuValThrMetThrThr435440445AlaProArgGlyLeuGlnSerGlyAspArgAlaThrTrpPheGlyLeu450455460TyrTyrAsnIleSerGlyAlaGlyPhePheLeuHisHisValGlyLeu465470475480GluLeuLeuValAsnHisLysAlaLeuAspProAlaArgTrpThrIle485490495GlnLysValPheTyrGlnGlyArgTyrTyrAspSerLeuAlaGlnLeu500505510GluAlaGlnPheGluAlaGlyLeuValAsnValValLeuIleProAsp515520525AsnGlyThrGlyGlySerTrpSerLeuLysSerProValProProGly530535540ProAlaProProLeuGlnPheTyrProGlnGlyProArgPheSerVal545550555560GlnGlySerArgValAlaSerSerLeuTrpThrPheSerPheGlyLeu565570575GlyAlaPheSerGlyProArgIlePheAspValArgPheGlnGlyGlu580585590ArgLeuValTyrGluIleSerLeuGlnGluAlaLeuAlaIleTyrGly595600605GlyAsnSerProAlaAlaMetThrThrArgTyrValAspGlyGlyPhe610615620GlyMetGlyLysTyrThrThrProLeuThrArgGlyValAspCysPro625630635640TyrLeuAlaThrTyrValAspTrpHisPheLeuLeuGluSerGlnAla645650655ProLysThrIleArgAspAlaPheCysValPheGluGlnAsnGlnGly660665670LeuProLeuArgArgHisHisSerAspLeuTyrSerHisTyrPheGly675680685GlyLeuAlaGluThrValLeuValValArgSerMetSerThrLeuLeu690695700AsnTyrAspTyrValTrpAspThrValPheHisProSerGlyAlaIle705710715720GluIleArgPheTyrAlaThrGlyTyrIleSerSerAlaPheLeuPhe725730735GlyAlaThrGlyLysTyrGlyAsnGlnValSerGluHisThrLeuGly740745750ThrValHisThrHisSerAlaHisPheLysValAspLeuAspValAla755760765GlyLeuGluAsnTrpValTrpAlaGluAspMetValPheValProMet770775780AlaValProTrpSerProGluHisGlnLeuGlnArgLeuGlnValThr785790795800ArgLysLeuLeuGluMetGluGluGlnAlaAlaPheLeuValGlySer805810815AlaThrProArgTyrLeuTyrLeuAlaSerAsnHisSerAsnLysTrp820825830GlyHisProArgGlyTyrArgIleGlnMetLeuSerPheAlaGlyGlu835840845ProLeuProGlnAsnSerSerMetAlaArgGlyPheSerTrpGluArg850855860TyrGlnLeuAlaValThrGlnArgLysGluGluGluProSerSerSer865870875880SerValPheAsnGlnAsnAspProTrpAlaProThrValAspPheSer885890895AspPheIleAsnAsnGluThrIleAlaGlyLysAspLeuValAlaTrp900905910ValThrAlaGlyPheLeuHisIleProHisAlaGluAspIleProAsn915920925ThrValThrValGlyAsnGlyValGlyPhePheLeuArgProTyrAsn930935940PhePheAspGluAspProSerPheTyrSerAlaAspSerIleTyrPhe945950955960ArgGlyAspGlnAspAlaGlyAlaCysGluValAsnProLeuAlaCys965970975LeuProGlnAlaAlaAlaCysAlaProAspLeuProAlaPheSerHis980985990GlyGlyPheSerHisAsn99權(quán)利要求1.含有編碼可分泌的融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸，所述融合蛋白，質(zhì)包含(i)指導(dǎo)所述融合蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞中分泌出來的信號(hào)肽；(ii)可溶形式的人氨基脲-敏感性胺氧化酶(SSAO)；(iii)能夠使可溶形式的人SSAO二聚體化的融合配偶體；(iv)位于可溶形式的人SSAO和融合配偶體之間的蛋白酶裂解位點(diǎn)。2.如權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述可溶形式的人SSAO含有SEQIANO2的第29至763位的氨基酸或其片段。3.如權(quán)利要求2所述的核酸，其中所述融合蛋白質(zhì)具有芐胺氧化酶活性。4.如權(quán)利要求2所述的核酸，其中所述可溶形式的人SSAO含有SEQIDNO2的29至763位氨基酸。5.如權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述融合蛋白質(zhì)缺乏人SSAO的跨膜區(qū)域。6.如權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述融合蛋白質(zhì)缺乏SEQIDNO2的第6至26位氨基酸。7.如權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述融合配偶體被融合到可溶形式的人SSAO的N-端部分。8.如權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述融合配偶體是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶或其功能上等同的變異體。9.如權(quán)利要求8所述的核酸，其中所述融合配偶體是日本血吸蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的變異體，所述變異體至少一個(gè)位于85、138和178位點(diǎn)上的半胱氨酸被另一個(gè)氨基酸殘基所取代。10.如權(quán)利要求8所述的核酸，其中所述融合配偶體合有SEQIDNO4或SEQIDNO5的氨基酸序列。11.如權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述信號(hào)肽是小鼠IgG1重鏈信號(hào)肽。12.如權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述蛋白酶裂解位點(diǎn)是3C蛋白酶裂解位點(diǎn)。13.如權(quán)利要求12所述的核酸，其中所述3C蛋白酶裂解位點(diǎn)含有氨基酸序列EALFQG(SEQIDNO6)。14.如權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述融合蛋白質(zhì)含有SEQIDNO20的氨基酸序列。15.含有權(quán)利要求1所述核酸的表達(dá)載體。16.含有權(quán)利要求14所述核酸的表達(dá)載體。17.用于純化重組人SSAO的方法，該方法包括(i)用權(quán)利要求15所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(ii)在培養(yǎng)基中以及能夠使由所述表達(dá)載體編碼的融合蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；(iii)使分泌出的融合蛋白質(zhì)與對(duì)所述融合配偶體具有親和性的配體結(jié)合；(iv)分離所述的融合配偶體和可溶形式的人SSAO；和(v)回收可溶形式的人SSAO。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述對(duì)所述融合配偶體具有親和性的配體是谷胱甘肽或其衍生物。19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中通過蛋白酶裂解將所述融合配偶體與可溶形式的人SSAO分離開來。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述蛋白酶是細(xì)小核糖核酸病毒3C蛋白酶。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述蛋白酶是鼻病毒3C蛋白酶。22如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述蛋白酶被融合到融合配偶體上從而產(chǎn)生融合蛋白酶。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中通過包括將所述融合蛋白酶與對(duì)所述融合蛋白酶具有親和性的配體相結(jié)合的方法來從可溶形式的人SSAO中分離出所述的融合蛋白酶。24.用于分離固定化重組人SSAO的方法，該方法包括(i)用權(quán)利要求15所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(ii)在培養(yǎng)基中以及能夠使由所述表達(dá)載體編碼的融合蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；(iii)使分泌出的融合蛋白質(zhì)與對(duì)所述融合配偶體具有親和性的配體結(jié)合由此固定融合蛋白質(zhì)。25.由權(quán)利要求1的核酸編碼的融合蛋白質(zhì)。26.權(quán)利要求25所述的融合蛋白質(zhì)，其中所述融合蛋白質(zhì)被固定在對(duì)所述融合配偶體具有親和性的配體上。全文摘要本申請(qǐng)涉及一種含有編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的重組構(gòu)建體，所述融合蛋白質(zhì)含有一種可溶形式的人SSAO(氨基脲－敏感性胺氧化酶)、一種可分泌的融合配偶體、一個(gè)信號(hào)肽和一個(gè)蛋白質(zhì)酶裂解位點(diǎn)。所述構(gòu)建體用于純化可溶形式的人SSAO的方法中。文檔編號(hào)C12N9/06GK1488000SQ0280400公開日2004年4月7日申請(qǐng)日期2002年2月18日優(yōu)先權(quán)日2001年2月23日發(fā)明者L·阿布拉姆森,J·尼爾森,L阿布拉姆森申請(qǐng)人:比奧維特羅姆股份公司