專利名稱：生物成分測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在臨床檢查領(lǐng)域生物成分測(cè)定方面，由于非測(cè)定樣品測(cè)定對(duì)象物質(zhì)存在會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，本發(fā)明與可以避免該影響的生物成分測(cè)定試劑有關(guān)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在，在臨床化學(xué)領(lǐng)域，作為血清成分的測(cè)定方法，在目標(biāo)成分為酶的情況下，普遍方法是應(yīng)用含有其基質(zhì)的化合物進(jìn)行酶反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)生成物計(jì)算酶活性。另外，在目標(biāo)成分不是酶的情況下，普遍應(yīng)用的方法也是使用對(duì)目標(biāo)成分具有特殊作用的酶進(jìn)行酶反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定其生成物計(jì)算目標(biāo)成分量，即被稱為“酶法”測(cè)定。
眾所周知，由于體液中的種種成分，例如還原性物質(zhì)抗壞血酸、血紅蛋白、膽紅素等的還原作用會(huì)產(chǎn)生負(fù)誤差；或血紅蛋白、膽紅素等的色素由于測(cè)定波長(zhǎng)造成正、負(fù)誤差產(chǎn)生，在光照條件下，由于測(cè)定藥劑組成成份的影響，這些色素自身的吸收，在測(cè)定過(guò)程中發(fā)生經(jīng)時(shí)性變化，對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，這種影響被稱為“干擾”。
我們對(duì)各種消除體液成分干擾的方法進(jìn)行了研討，例如，僅就消除血紅蛋白、膽紅素產(chǎn)生的干擾對(duì)策就發(fā)表了很多的報(bào)告。關(guān)于消除血紅蛋白的干擾方法，使用硫脲的方法、使用陽(yáng)離子界面活性劑/兩性界面活性劑的方法、使用陽(yáng)離子界面活性劑/兩性界面活性劑/陰離子界面活性劑的方法、使用烷基磺酸鹽類的方法、進(jìn)行雙色光測(cè)定的方法作了許多報(bào)告。另外，關(guān)于消除膽紅素干擾的方法，使用膽紅素氧化酶的方法、膽紅素氧化酶與界面活性劑合用的方法、使用鐵氰化物的方法、使用亞鐵氰化物的方法、使用鐵氰化物/蛋白質(zhì)的方法等也作了許多報(bào)告。
上述方法主要是使氧化酶與過(guò)氧化物酶組合、誘導(dǎo)其消色的干擾消除法，但也包含一部分類似在“白氨酸氨基肽酶測(cè)定法”的基質(zhì)分解消色法中的干擾消除法。但是，迄今為止，仍不能說(shuō)緣于膽紅素以及溶血性血紅蛋白的各干擾問(wèn)題得到了充分解決。

發(fā)明內(nèi)容
在生物成分測(cè)定方面，避免非測(cè)試劑料測(cè)定對(duì)象物質(zhì)、例如膽紅素、溶血性血紅蛋白的存在對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。提供避免這種影響的生物成分測(cè)定試劑及其測(cè)定方法，就是本發(fā)明的課題。
本發(fā)明的發(fā)明者們經(jīng)過(guò)反復(fù)專心的研究，發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行生物成分測(cè)定時(shí)，在試劑中加入2，2-羥基二乙硫酸、β-2，2-羥基二乙硫、甲硫氨酸等中的任意一種或兩種以上藥劑，可以消除溶血性血紅蛋白的干擾；加入含硫化合物，可以消除膽紅素的干擾。在此基礎(chǔ)上，他們完成了本發(fā)明。
即本發(fā)明是由
1.一種生物成分測(cè)定試劑，其特征在于，在測(cè)定待測(cè)樣品的生物成分時(shí)，為了避免試劑中非待測(cè)對(duì)象物質(zhì)存在對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生的影響，使試劑中含有2，2-羥基二乙硫酸、2，2-羥基二乙硫、甲硫氨酸等中的任意一種或兩種以上物質(zhì)、2.如權(quán)利要求1所述的生物成分測(cè)定試劑，其特征在于，非待測(cè)對(duì)象物質(zhì)的任意項(xiàng)為溶血性血紅蛋白、3.一種生物成分測(cè)定試劑，其特征在于，在測(cè)定待測(cè)樣品的生物成分時(shí)，如果非待測(cè)對(duì)象物質(zhì)的任意項(xiàng)為膽紅素的時(shí)候，使試劑中含有一種或兩種以上含硫化合物、4.如權(quán)利要求3所述的生物成分測(cè)定試劑，其特征在于，含硫化合物為2，2-羥基二乙硫酸、β-2，2-羥基二乙硫、甲硫氨酸、硫脲、亞硫酸鈉、5.如權(quán)利要求3或者4所述的測(cè)定試劑，其特征在于，非待測(cè)對(duì)象物質(zhì)的任意項(xiàng)為膽紅素及血紅蛋白、6.一種通過(guò)吸光度測(cè)定生物成分時(shí)使用的生物成分測(cè)定試劑，含有2，2-羥基二乙硫酸、β-2，2-羥基二乙硫、甲硫氨酸、硫脲、亞硫酸鈉中的任意一種或兩種以上物質(zhì)、7.如權(quán)利要求6所述的測(cè)定試劑，其特征在于，根據(jù)生物成分吸光度進(jìn)行的測(cè)定，是對(duì)生物成分中酶活性的測(cè)定、8.如權(quán)利要求7所述的測(cè)定試劑，酶活性的測(cè)定，通過(guò)堿性磷酸酶(APL)的作用，使用解離發(fā)色化合物測(cè)定APL活性、9.如權(quán)利要求7或者8所述的測(cè)定試劑，含有2，2-羥基二乙硫酸、
10.如權(quán)利要求9所述的測(cè)定試劑，其特征在于，2，2-羥基二乙硫酸最終濃度為0.5～100mM、11.如權(quán)利要求9或者10所述的測(cè)定試劑，其特征在于，除了2，2-羥基二乙硫酸之外，還含有十二烷基硫酸鈉(SDS)、12.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定試劑，其特征在于，SDS的最終濃度為0.005～1.0％、13.一種整套生物成分測(cè)定試劑，包含權(quán)利要求1～12項(xiàng)中任意一項(xiàng)中所述的試劑、14.一種APL活性測(cè)定方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1～12項(xiàng)中任意一項(xiàng)中所述的試劑構(gòu)成的。


圖1在ALP測(cè)定系中，結(jié)合態(tài)膽紅素的干擾作用因是否添加2，2-羥基二乙硫酸，表示出相對(duì)的效果(實(shí)施例1)。
圖2在ALP測(cè)定系中，溶血性血紅蛋白的干擾作用因是否添加2，2-羥基二乙硫酸，表示出相對(duì)的效果(實(shí)施例1)。
圖3在ALP測(cè)定系中，溶血性血紅蛋白的干擾作用因是否添加SDS，表示出相對(duì)的效果(實(shí)施例1)。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，待測(cè)生物成分只要是生物體中含有的成分即可，并沒(méi)有特定限制。可以進(jìn)行含有例如人或動(dòng)物的血液、血清、血漿、尿、糞便、精液、髓液、唾液、汗、眼淚、腹水、羊水等體液、臟器、組織、細(xì)胞等的抽出液成分的測(cè)定。利用吸光光度計(jì)測(cè)定特定波長(zhǎng)的光的吸收度及反射，并以此為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定的物質(zhì)，可以列舉出例如自身含有酶活性的物質(zhì)、或者用酶標(biāo)識(shí)待測(cè)成分、測(cè)定該酶活性的物質(zhì)。更具體地說(shuō)，可以應(yīng)用在以生物的堿性磷化酶(ALP)活性為指標(biāo)的生物成分的測(cè)定，和同樣以ALP的同功酶活性為指標(biāo)的測(cè)定中。
歷來(lái)使用的ALP測(cè)定試劑，都是不做任何措施的分成2個(gè)試劑系，膽紅素和溶血性血紅蛋白存在所產(chǎn)生的干擾，會(huì)對(duì)APL的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。研討在ALP測(cè)定系中消除這些干擾的對(duì)策時(shí)，發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)添加2，2-羥基二乙硫酸、甲硫氨酸、β-2，2-羥基二乙硫中至少一種物質(zhì)，消除溶血性血紅蛋白的干擾。而且發(fā)現(xiàn)，添加含硫物質(zhì)可以消除膽紅素的干擾。所謂的含硫物，只要分子中含有硫磺原子，就沒(méi)有特定的限制，例如含有硫磺原子的含氧酸、硫代酸以及硫代酸鹽、亞硫酸鈣、亞硫酸鈉、硫代硫酸銨、硫代硫酸鈉、硫代硫酸鉀、2，2-羥基二乙硫酸、甲硫氨酸、硫脲等。比較理想的是在試劑中添加2，2-羥基二乙硫酸、甲硫氨酸、亞硫酸鈉、硫脲中至少一種物質(zhì)之后的消除干擾效果。從這些物質(zhì)中選出任意項(xiàng)，使之與具有消除溶血性血紅蛋白的干擾作用的SDS并存后仍然可以保持消除膽紅素干擾的效果，因此我們采用通過(guò)含硫物與SDS并用的方法，分別消除了膽紅素及溶血性血紅蛋白的干擾，完成了本發(fā)明。
以下以ALP為例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的測(cè)定對(duì)象并不限定于ALP。
人體血清中的ALP是廣泛的分布在人體各器官中，分解大多數(shù)磷酸化合物、部分存在于生物膜外側(cè)與膜結(jié)合的酶，呈亞單位2分子的計(jì)時(shí)器狀構(gòu)造，糖鎖在這上面組成糖蛋白?？梢园l(fā)現(xiàn)例如佝僂病、纖維性骨炎、上皮小體機(jī)能亢進(jìn)癥、白賽氏病、轉(zhuǎn)移性骨癌、軟骨病等疾病和閉塞性黃疽、急性肝炎、肝硬化、轉(zhuǎn)移性肝癌等患者的ALP活性都有所上升。
本發(fā)明的生物成分測(cè)定，可以用于包含在人或動(dòng)物的血液、血清、血漿、尿、糞便、精液、髓液、唾液、汗、眼淚、腹水、羊水等體液、臟器、組織、細(xì)胞等抽出液中的ALP的測(cè)定。另外，本測(cè)定法也可用于ALP同功酶的活性測(cè)定。
在本發(fā)明中，所謂在ALP的作用下解離的消色化合物，是指在ALP的作用下，從ALP測(cè)定用基質(zhì)中解離出來(lái)的物質(zhì)。ALP測(cè)定用基質(zhì)并沒(méi)有特殊的限制，例如甘油磷酸、p-硝基苯磷酸、苯磷酸等，一般使用p-硝基苯磷酸。在各ALP測(cè)定用基質(zhì)中，APL作用解離出來(lái)的消色化合物是p-硝基苯酚。
在本發(fā)明中，使用上述基質(zhì)進(jìn)行APL活性的測(cè)定，可以分時(shí)間測(cè)定基質(zhì)的分解速度，根據(jù)吸光度的增加，算出ALP活性，也可以通過(guò)終點(diǎn)法測(cè)定。另外，在以p-硝基苯磷酸為基質(zhì)的ALP活性測(cè)定中，使用二乙醇胺緩沖液、2-乙基氨基乙醇緩沖液、N-甲基-D-葡糖胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液緩沖的方法也有所報(bào)告(檢查與技術(shù)、Vol.29，No.3，p.225-230(2001))，本發(fā)明的測(cè)定試劑以及測(cè)定方法，在使用AMP的情況下特別有效。
在本發(fā)明中，為了消除膽紅素以及溶血性血紅蛋白的干擾，使ALP測(cè)定試劑中含有的2，2-羥基二乙硫酸最終濃度為0.5～100mM，比較理想的是1.0～50mM，更理想的是2.0～30mM。這里所說(shuō)的最終濃度，是指相對(duì)于測(cè)定系中、用于測(cè)定的樣品和用于測(cè)定的試劑反應(yīng)后最終溶液量的濃度。
并且，為了消除溶血性血紅蛋白的干擾作用，也可以在ALP測(cè)定試劑中除了加入2，2-羥基二乙硫酸以外，還含有SDS。該SDS的最終濃度為0.001～1.0％，比較理想的是0.005～0.5％，更理想的是0.01～0.1％。
本發(fā)明與下列各項(xiàng)相關(guān)加入2，2-羥基二乙硫酸或者進(jìn)而加入SDS的APL測(cè)定試劑以及含有該試劑的整套測(cè)定試劑以及APL測(cè)定方法。
實(shí)施例以下實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)例。
實(shí)施例1對(duì)在結(jié)合態(tài)膽紅素的濃度或者溶血性血紅蛋白的濃度不同的樣品測(cè)定系中，在測(cè)定試劑中添加2，2-羥基二乙硫酸或者SDS時(shí)的效果進(jìn)行了研究。
測(cè)定用試劑按照以下方法調(diào)制(第一試劑)
2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP) 350mM硫酸亞鉛 1.36mM醋酸鎂 2.71mMN-羥基乙基乙二胺三乙酸 2.71mM(HEDTA)pH 10.4(30℃)(第二試劑)2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP) 350mM4-硝基苯磷酸 65.1mMpH 10.4(30℃)調(diào)制在第一試劑中添加2，2-羥基二乙硫酸30mM的藥劑和添加SDS0.5％的藥劑。
測(cè)定用樣品按照以下方式調(diào)制。
(a)結(jié)合態(tài)膽紅素濃度不同的血清樣品管理血清QAP-trawl·1X(國(guó)際試劑制造)的血清9容和不含結(jié)合態(tài)膽紅素的水溶液或者和含有調(diào)制好了的結(jié)合態(tài)膽紅素(干擾審核國(guó)際試劑制造)的水溶液1容混合，對(duì)結(jié)合態(tài)膽紅素的最大濃度為22mg/dL的血清稀釋系列進(jìn)行調(diào)制，作為各測(cè)定樣品。
(b)血紅蛋白濃度不同的血清樣品管理血清QAP-trawl·1X(國(guó)際試劑制造)的血清9容和不含血紅蛋白的水溶液或者和含有調(diào)制好了的溶血性血紅蛋白(干擾審核國(guó)際試劑制造)的水溶液1容混合，將溶血性血紅蛋白的最大濃度為480mg/dL的稀釋系列血清進(jìn)行調(diào)制，作為各測(cè)定樣品。
測(cè)定在以下條件下進(jìn)行。
在5μL測(cè)定用樣品中加入第一試劑210μL，在37℃條件下預(yù)熱5分鐘后，添加第二試劑70μL，攪拌后，比較其在405nm(主波長(zhǎng))及505nm(副波長(zhǎng))中單位時(shí)間內(nèi)吸光度的增加速度。以已知APL活性值的酶溶液吸光度增加速度為基礎(chǔ)，計(jì)算出各測(cè)定樣品的酶活性。
測(cè)定裝置使用日立7170型自動(dòng)分析裝置。
結(jié)果如第1圖～第3圖所示。第1圖說(shuō)明源于各濃度的結(jié)合態(tài)膽紅素的干擾，通過(guò)添加2，2-羥基二乙硫酸而消除。
從第2圖可以看出源于各濃度的溶血性血紅蛋白的干擾，通過(guò)添加2，2-羥基二乙硫酸而減輕。
從第3圖可以確認(rèn)源于各濃度的溶血性血紅蛋白的干擾，通過(guò)添加SDS而消除。
實(shí)施例2在含有結(jié)合態(tài)膽紅素以及溶血性血紅蛋白(Hb)的測(cè)定用樣品中，在其中添加2，2-羥基二乙硫酸和SDS，對(duì)其效果進(jìn)行研討。測(cè)定用樣品以及試劑的調(diào)制方法如下，測(cè)定以與實(shí)施例1同樣的方式進(jìn)行。
(測(cè)定用樣品的調(diào)制)測(cè)定用樣品，以與實(shí)施例1同樣的方式，分別調(diào)制成結(jié)合態(tài)膽紅素濃度為21.6mg/dL和溶血性血紅蛋白濃度為480mg/dL的。
第一試劑以及第二試劑以與實(shí)施例1所示同樣的方式調(diào)制。并且，調(diào)制出在第一試劑中同時(shí)添加2，2-羥基二乙硫酸30mM和SDS 0.5％的藥劑。
關(guān)于添加2，2-羥基二乙硫酸30mM的和SDS0.5％效果，把不含結(jié)合態(tài)膽紅素以及溶血性血紅蛋白的測(cè)定系的測(cè)定值定為100％，以之作為相對(duì)值進(jìn)行評(píng)析。
其結(jié)果如表1所示。表1明顯地表示出由于添加2，2-羥基二乙硫酸和SDS，源于結(jié)合態(tài)膽紅素以及溶血性血紅蛋白的干擾消除了。
表1

(無(wú)添加沒(méi)有添加2，2-羥基二乙硫酸和SDS的試劑測(cè)定系)(添加添加2，2-羥基二乙硫酸和SDS的試劑測(cè)定系)產(chǎn)業(yè)上的利用可能性如以上說(shuō)明所示使用本發(fā)明的生物成分測(cè)定試劑，可以消除溶血性血紅蛋白產(chǎn)生的干擾以及由膽紅素產(chǎn)生的干擾，得到正確的生物成分測(cè)定值。
權(quán)利要求
1.一種生物成分測(cè)定試劑，其特征在于，在測(cè)定待測(cè)樣品的生物成分時(shí)，為了避免試劑中非待測(cè)對(duì)象物質(zhì)存在對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生的影響，使試劑中含有2，2-羥基二乙硫酸、2，2-羥基二乙硫、甲硫氨酸等中的任意一種或兩種以上物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的生物成分測(cè)定試劑，其特征在于，非待測(cè)對(duì)象物質(zhì)的任意項(xiàng)為溶血性血紅蛋白。
3.一種生物成分測(cè)定試劑，其特征在于，在測(cè)定待測(cè)樣品的生物成分時(shí)，如果非待測(cè)對(duì)象物質(zhì)的任意項(xiàng)為膽紅素的時(shí)候，使試劑中含有一種或兩種以上含硫化合物。
4.如權(quán)利要求3所述的生物成分測(cè)定試劑，其特征在于，含硫化合物為2，2-羥基二乙硫酸、β-2，2-羥基二乙硫、甲硫氨酸、硫脲、亞硫酸鈉。
5.如權(quán)利要求3或者4所述的測(cè)定試劑，其特征在于，非待測(cè)對(duì)象物質(zhì)的任意項(xiàng)為膽紅素及血紅蛋白。
6.一種通過(guò)吸光度測(cè)定生物成分時(shí)使用的生物成分測(cè)定試劑，含有2，2-羥基二乙硫酸、β-2，2-羥基二乙硫、甲硫氨酸、硫脲、亞硫酸鈉中的任意一種或兩種以上物質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的測(cè)定試劑，其特征在于，根據(jù)生物成分吸光度進(jìn)行的測(cè)定，是對(duì)生物成分中酶活性的測(cè)定。
8.如權(quán)利要求7所述的測(cè)定試劑，酶活性的測(cè)定，通過(guò)堿性磷酸酶(APL)的作用，使用解離發(fā)色化合物測(cè)定APL活性。
9.如權(quán)利要求7或者8所述的測(cè)定試劑，含有2，2-羥基二乙硫酸。
10.如權(quán)利要求9所述的測(cè)定試劑，其特征在于，2，2-羥基二乙硫酸最終濃度為0.5～100mM。
11.如權(quán)利要求9或者10所述的測(cè)定試劑，其特征在于，除了2，2-羥基二乙硫酸之外，還含有十二烷基硫酸鈉(SDS)。
12.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定試劑，其特征在于，SDS的最終濃度為0.005～1.0％。
13.一種整套生物成分測(cè)定試劑，包含權(quán)利要求1～12項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的試劑。
14.一種APL活性測(cè)定方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1～12項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生物成分活性的測(cè)定試劑及其測(cè)定方法，在測(cè)定生物成分的方法中，避免膽紅素、溶血性血紅蛋白等非測(cè)試劑料測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的存在對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。一種生物成分測(cè)定試劑，在生物成分測(cè)定試劑中含有2，2－羥基二乙硫酸、β－2，2－羥基二乙硫、甲硫氨酸等中的任意一種或兩種以上藥劑。為了避免溶血性血紅蛋白的影響，添加2，2－羥基二乙硫酸、β－2，2－羥基二乙硫、甲硫氨酸中的至少一種，特別是為了避免膽紅素的影響，向試劑中添加2，2－羥基二乙硫酸、甲硫氨酸、硫脲、亞硫酸鈉的至少一種，而且，除了上面選擇的任意一項(xiàng)物質(zhì)，進(jìn)而與十二烷基硫酸鈉一種并用。
文檔編號(hào)C12Q1/42GK1492936SQ02805170
公開(kāi)日2004年4月28日 申請(qǐng)日期2002年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月17日
發(fā)明者上田陽(yáng)子, 山下和昭, 昭 申請(qǐng)人:國(guó)際試藥株式會(huì)社