專利名稱：復(fù)制細(xì)胞的快速檢測(cè)的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及對(duì)醫(yī)學(xué)、工業(yè)和環(huán)境樣本中存在的復(fù)制細(xì)胞，尤其是微生物細(xì)胞(如細(xì)菌、酵母和霉菌)的檢測(cè)、計(jì)數(shù)與鑒定。微生物培養(yǎng)由于具有很多引人注目的特點(diǎn)，因此是這些市場(chǎng)(markets)的主導(dǎo)方法。本發(fā)明解決了微生物培養(yǎng)的主要缺陷-獲得結(jié)果所需要的時(shí)間長(zhǎng)-同時(shí)保留了該方法的優(yōu)勢(shì)。
用于檢測(cè)和計(jì)數(shù)微生物的微生物培養(yǎng)19世紀(jì)到20世紀(jì)間，出現(xiàn)了一種關(guān)于細(xì)菌、酵母和霉菌在引起傳染性疾病，以及確定食品和飲料品質(zhì)方面所扮演角色的認(rèn)識(shí)。初期，發(fā)展出微生物培養(yǎng)這種有效的方法，以檢測(cè)少量微生物。微生物培養(yǎng)通過(guò)利用微生物迅速且大量增殖的傾向，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)微生物簡(jiǎn)單地目視檢測(cè)。例如，當(dāng)把過(guò)小而令肉眼難以發(fā)現(xiàn)的單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞(約百萬(wàn)分之一米)接種入營(yíng)養(yǎng)肉湯中時(shí)，便可在不超過(guò)24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)令肉湯變得明顯渾濁。
被稱為微生物計(jì)數(shù)或集落計(jì)數(shù)的相關(guān)微生物培養(yǎng)技術(shù)量化了樣本中的微生物細(xì)胞數(shù)量?；谠晃⑸飶?fù)制的微生物計(jì)數(shù)方法通常獲得的是對(duì)應(yīng)于樣本中每個(gè)微生物細(xì)胞的一個(gè)可目測(cè)“集落”。因此，計(jì)數(shù)可見(jiàn)集落便可使微生物學(xué)家準(zhǔn)確測(cè)定樣本中的微生物細(xì)胞數(shù)量。為進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)，需要將細(xì)菌細(xì)胞分散在培養(yǎng)皿中的營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面(“瓊脂平板”)，并于適合原位細(xì)菌復(fù)制的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。無(wú)法目測(cè)的個(gè)體微生物重復(fù)地復(fù)制，在祖代微生物細(xì)胞所附著的物理位點(diǎn)產(chǎn)生大量相同的子代微生物。子細(xì)胞仍然與原始細(xì)胞共同定位(基本相鄰)，從而群體子細(xì)胞(可能生長(zhǎng)為數(shù)千萬(wàn)、數(shù)億的細(xì)胞)最終得以在平板上形成可見(jiàn)集落。
計(jì)數(shù)微生物集落的電子方法已有所發(fā)展。但是與通過(guò)肉眼進(jìn)行的傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法相比，大多數(shù)這種自動(dòng)集落計(jì)數(shù)基本上未提高靈敏度或縮短獲得結(jié)果所需的時(shí)間。集落計(jì)數(shù)器利用了多種光學(xué)方法檢測(cè)集落，包括檢測(cè)微集落固有光學(xué)特性(如U.S.Patent No3,493,772；U.S.Patent No3,811,036；U.S.Patent No5,290,701；Arkin，A.P.，等(1990)；Biotechnology(NY)8746-9)以及環(huán)繞集落的基質(zhì)中pH指示劑分子的顏色變化(U.S.Patent No.5,510,246)。利用染色劑或探針標(biāo)記集落的方法也有所發(fā)展，將于下文論述。
即使是在一個(gè)多世紀(jì)之后，事實(shí)也證明微生物培養(yǎng)是一種非常成功的方法，該方法仍然主導(dǎo)了醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和工業(yè)微生物學(xué)中的質(zhì)量控制檢驗(yàn)(如藥品、食品和飲料生產(chǎn))。該方法經(jīng)濟(jì)、相對(duì)簡(jiǎn)單并且超靈敏。微生物培養(yǎng)的靈敏度可見(jiàn)于針對(duì)絞細(xì)牛肉(ground beef)中食物來(lái)源病原體的常規(guī)檢驗(yàn)中。采用微生物培養(yǎng)可以在25克絞細(xì)牛肉中檢測(cè)到單個(gè)微觀細(xì)菌性病原體細(xì)胞。微生物培養(yǎng)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于其能夠檢測(cè)大范圍的具有醫(yī)學(xué)和工業(yè)意義的微生物。
原位細(xì)菌復(fù)制的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以生成純粹或純系細(xì)胞群體(被稱為純培養(yǎng)物、克隆或集落)。純培養(yǎng)物是相同祖細(xì)胞來(lái)源的相同活細(xì)胞的大量集合。對(duì)鑒定微生物和確定抗生素抗性的方法而言，純培養(yǎng)物是必需的。由于細(xì)菌性病原體通常是伴隨非致病性細(xì)菌從非無(wú)菌的臨床樣本(如糞便或創(chuàng)傷)中分離而得，其中該非致病性細(xì)菌可能比該病原細(xì)胞還要多，因此醫(yī)學(xué)微生物學(xué)嚴(yán)重依賴著純培養(yǎng)。純微生物培養(yǎng)物的分離在工業(yè)微生物學(xué)中也是重要的。例如，藥物和化妝品生產(chǎn)商必須檢驗(yàn)其產(chǎn)品是否存在微生物污染物。污染微生物的純培養(yǎng)物被用于微生物鑒定，可以確定一個(gè)生產(chǎn)批次是否必須被拋棄，并有助于調(diào)查工業(yè)過(guò)程中的污染源。
表1選擇性培養(yǎng)微生物的能力是鑒定微生物和確定對(duì)抗菌劑，如抗生素的抗性及敏感度的一種基本工具。選擇性培養(yǎng)利用了不同微生物需要不同生長(zhǎng)條件的事實(shí)。這些差異起因于微生物菌株在其生化組成方面存在差異的事實(shí)，其中生化組成方面的差異是其固有遺傳差異導(dǎo)致的。例如，一種類型的微生物可能在含有可支持其生長(zhǎng)的單一碳源，糖類山梨糖醇的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而另一種類型的微生物則不能。選擇性生長(zhǎng)在食品工業(yè)中是重要的。例如，通過(guò)將樣本接種至只適合沙門氏菌生長(zhǎng)，而不適合其它食品微生物的培養(yǎng)基中，便可以觀測(cè)到食品樣本中是否含有特定食品病原體-沙門氏菌。
同樣，選擇性培養(yǎng)被用于確定哪一種抗生素在殺傷分離自細(xì)菌性腦膜炎患兒脊髓液的細(xì)菌菌株方面最為有效。以純細(xì)菌培養(yǎng)物(來(lái)源自營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板的純系集落)接種含不同濃度多種抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。最佳抗生素療法是通過(guò)監(jiān)測(cè)微生物在不同抗生素存在條件下生長(zhǎng)的能力而確定的。通過(guò)在固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面的選擇性生長(zhǎng)，從而確定抗生素抗性和靈敏度的方法是另一種常用方法。例如，在Kirby-Bauer法中，將含有不同抗生素的小濾紙圓片置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面上，該平板已包被有臨床樣本來(lái)源的細(xì)菌純培養(yǎng)物。從該濾紙片向外放射狀擴(kuò)散出一個(gè)抗生素梯度。對(duì)高水平抗生素具有抗性的細(xì)菌生長(zhǎng)在濾紙片邊緣。而對(duì)該抗生素非常敏感的細(xì)菌則如果不遠(yuǎn)離濾紙片邊緣便不能生長(zhǎng)。平板培養(yǎng)(通常持續(xù)一或兩天)結(jié)束后，微生物學(xué)家通過(guò)測(cè)定濾紙片周圍的無(wú)生長(zhǎng)圈或區(qū)域的寬度，便可確定該細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性水平。相關(guān)方法，“E”試驗(yàn)(Hardy Diagnostics)利用了含有梯度抗生素的方形條帶。通過(guò)測(cè)定可使條帶附近細(xì)菌持續(xù)復(fù)制的條帶上最高抗生素濃度的點(diǎn)，便可確定細(xì)菌的抗性水平。
微生物培養(yǎng)的最大缺點(diǎn)是慢-需耗時(shí)以產(chǎn)生目測(cè)所需的細(xì)胞數(shù)量。微生物培養(yǎng)所需的長(zhǎng)生長(zhǎng)期在保健和工業(yè)兩方面都是一個(gè)重要難題。例如，因?yàn)樾枰舾商炫囵B(yǎng)并鑒定引起患者血液感染的微生物，因此在抗真菌療法開(kāi)始之前，真菌血液感染患者可能已死亡。某些感染物，如引起結(jié)核病的細(xì)菌，通常需要在培養(yǎng)中生長(zhǎng)數(shù)周。檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌所需的長(zhǎng)時(shí)間可能致使結(jié)核病患者傳染許多人患上這一高度接觸性傳染病，或者令未患結(jié)核病的患者遭受到無(wú)謂的檢疫隔離。
在食品生產(chǎn)中，長(zhǎng)的檢驗(yàn)周期會(huì)加劇食品腐敗，或者導(dǎo)致檢驗(yàn)物料在后繼加工步驟中不恰當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移。緩慢的微生物培養(yǎng)也會(huì)對(duì)生物藥品和疫苗的生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響。在這些應(yīng)用中，生產(chǎn)過(guò)程通常需要將幾個(gè)批次集中。由于長(zhǎng)的微生物培養(yǎng)檢驗(yàn)環(huán)節(jié)，以及貫穿生產(chǎn)過(guò)程的物料轉(zhuǎn)移需要，有時(shí)直到批次集中環(huán)節(jié)才檢出被污染批次。如果隨后發(fā)現(xiàn)被污染批次與未被污染批次混合在一起，則整個(gè)庫(kù)的混合批次都必須被拋棄。
微生物培養(yǎng)的其它缺點(diǎn)，如繁重的人工操作，以及不能培養(yǎng)某些微生物，則被認(rèn)為不如需要的長(zhǎng)時(shí)間所帶來(lái)的難題嚴(yán)重。例如，即使已經(jīng)引入了自動(dòng)接種和分析設(shè)備，人工操作方法仍然主導(dǎo)了微生物計(jì)數(shù)。環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的大部分類型微生物不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)生長(zhǎng)。不過(guò)，這種微生物通常對(duì)人類無(wú)害，或者在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中已被破壞，因此在大多數(shù)應(yīng)用中被忽視了。然而，具有重要醫(yī)學(xué)價(jià)值的若干重要例外包括難以或不可能培養(yǎng)可引起性病或肺炎的細(xì)菌菌株，諸如衣原體。幸運(yùn)的是，有可選的不依賴培養(yǎng)的方法可以應(yīng)用在這些情況中(見(jiàn)下文)。
快速微生物培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法用于更為快速計(jì)數(shù)微生物的若干微生物培養(yǎng)方法已有所發(fā)展。一種快速微生物培養(yǎng)方法是使細(xì)菌細(xì)胞沉積在包被有營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的顯微鏡載玻片上。由于顯微鏡可以檢測(cè)到由少量細(xì)胞分裂而形成的微集落，所以采用顯微鏡檢驗(yàn)會(huì)比肉眼更早檢測(cè)到微生物的生長(zhǎng)。不過(guò)，在檢驗(yàn)含少量微生物細(xì)胞的大樣本方面，該方法并不有效，因?yàn)樵陲@微鏡視野中僅能觀測(cè)非常小體積的樣本。顯微鏡方法的低靈敏度通常限制了其檢測(cè)每毫升含有超過(guò)一萬(wàn)個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的樣本的效果-這些方法的靈敏性遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)。
電子成像系統(tǒng)的出現(xiàn)帶動(dòng)了許多自動(dòng)“集落計(jì)數(shù)器”的發(fā)展。盡管這些計(jì)數(shù)器中的大部分被設(shè)計(jì)為通過(guò)使集落計(jì)數(shù)過(guò)程自動(dòng)化而達(dá)到幫助使用者的目的，而且并未縮短獲得結(jié)果所需的時(shí)間，某些系統(tǒng)仍然證實(shí)了其在集落大到肉眼輕易可見(jiàn)的程度之前檢測(cè)集落的能力。例如，Colifast快速微集落計(jì)數(shù)器(Colifast)可以在大腸型細(xì)菌肉眼可見(jiàn)之前數(shù)小時(shí)便檢測(cè)到熒光標(biāo)記的小集落。Colifast系統(tǒng)通過(guò)利用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中所包含的熒光化合物(一種直到被大腸型細(xì)菌代謝才具有熒光性的物質(zhì))實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)的檢測(cè)。
最近，采用生物熒光標(biāo)記快速計(jì)數(shù)微生物集落的系統(tǒng)已經(jīng)商品化。MicroStar系統(tǒng)(Millipore)利用了微集落中的細(xì)胞ATP通過(guò)系統(tǒng)所應(yīng)用熒光素酶和底物的作用而發(fā)光的特性。該方法基本上縮短了檢測(cè)時(shí)間。MicroStar成像系統(tǒng)也可與標(biāo)記探針結(jié)合應(yīng)用以鑒定特定細(xì)菌(Stender，H.等，J Microbiol Methods 4669-75(2001))。該系統(tǒng)的一個(gè)缺點(diǎn)是該檢測(cè)方法殺死了微生物，妨礙了集落來(lái)源的純培養(yǎng)物的分離。并且該系統(tǒng)也需要昂貴的圖象增強(qiáng)組件。
Boston Probes發(fā)展了一種檢測(cè)含特定細(xì)菌的微集落的即成底片方法(Perry-O-Keefe，H.等Journal of Applied Microbiology 90180-9(2001))。即采用微生物特異PNA探針標(biāo)記膜上的微生物微集落，其中該探針附帶有可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)的酶。繼而使該膜經(jīng)由X射線照射或?qū)⑵渲糜诩闯傻灼弦猿上瘛Ｔ摲椒ㄔ谝淮卧囼?yàn)中僅限于觀測(cè)一種特定微生物。類似方法采用的是熒光標(biāo)記的PNA探針和陣列式掃描儀(Stender，H.等Journal of Microbiological Methods 4531-9(2001))。這些方法比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法事實(shí)上需要更多的專業(yè)技術(shù)。
無(wú)需培養(yǎng)微生物的快速微生物計(jì)數(shù)最快速的微生物計(jì)數(shù)方法摒棄了微生物培養(yǎng)。醫(yī)學(xué)和工業(yè)微生物學(xué)家通常僅感興趣于計(jì)數(shù)有活力的微生物-只有活微生物才在微生物培養(yǎng)期間具有復(fù)制能力。因此，為了實(shí)現(xiàn)最大效果，無(wú)需依賴細(xì)胞復(fù)制而檢測(cè)個(gè)體細(xì)胞的方法必須通過(guò)利用生理學(xué)替代物用于細(xì)胞復(fù)制，以區(qū)分活微生物與死亡微生物(如Nebe-von-Caron，G.等，J MicrobialMethods 4297-114，2000；Mignon-Godefroy，K等，Cytometry 27336-44，1997)。采用染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，以測(cè)定通常與復(fù)制能力相關(guān)的生物化學(xué)特性(如酯酶活性或生物化學(xué)呼吸作用)。已知符合規(guī)章標(biāo)準(zhǔn)并通過(guò)傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法被認(rèn)為無(wú)菌的樣本中常常含有數(shù)千個(gè)細(xì)胞對(duì)替代物的生物化學(xué)活性表現(xiàn)為陽(yáng)性，因此替代物方法的驗(yàn)證與制定存在難題。
直接檢測(cè)活細(xì)胞的系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例是ScanRDI系統(tǒng)(Chemunex)。ScanRDI計(jì)數(shù)的是通過(guò)利用激光掃描技術(shù)由熒光酯酶底物染色的微生物細(xì)胞(U.S.Patent No5,663，057；Mignon Godefroy，K.等，Cytometry27336-44，1997)。激光掃描系統(tǒng)(包括利用光電倍增管(PMTs)的光學(xué)收集系統(tǒng))可以捕捉濾膜的圖象，并檢測(cè)到單個(gè)標(biāo)記細(xì)胞。該系統(tǒng)除了照明并探尋微觀區(qū)域(通常4-14μm)以外，還可以逐光束掃描，以覆蓋宏觀區(qū)域(如25mm直徑圓)。該系統(tǒng)被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)具有完整膜和活性酯酶的細(xì)胞。這種細(xì)胞的數(shù)量與可以在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上形成集落的細(xì)胞數(shù)量是相關(guān)的。不過(guò)，該方法常常導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性的“過(guò)量計(jì)數(shù)”-即超過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)所得的細(xì)胞數(shù)量(Costanzo，S.等(2002)PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology56206-219)。ScanRDI系統(tǒng)的另一個(gè)缺點(diǎn)是在染色過(guò)程中殺死了微生物，從而妨礙了檢測(cè)微生物產(chǎn)生純培養(yǎng)物。最后，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)的激光掃描系統(tǒng)復(fù)雜且昂貴(幾十萬(wàn)美圓)，使得其難以證明其適合常規(guī)微生物學(xué)應(yīng)用。其它激光掃描系統(tǒng)也已商品化(Miraglia，S.等，JBiomol Screen 4193-204，1999；Tibbe，A.G.等，Nat Biotechnol171210-3，1999；Kamentsky，L.，2001，Laser Scanning Cytometry.In Cytometry，Z.Darzynkiewicz，H.Crissman和J.Robinsnon編.Methods in Cell BiologyVol.63，Part A，3rd ed，Series Eds.L.Wilson和P.Matsudaira.(SanDiegoAcademic Press))。
流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法是另一種無(wú)需依賴細(xì)胞復(fù)制而快速計(jì)數(shù)微生物的有效方法(Alvarez-Barrientos，A.等，Clin Microbiol Rev 13167-195，2000)。單個(gè)生物體或顆粒被迫流經(jīng)狹窄通路，一次一個(gè)地經(jīng)過(guò)激光束。除計(jì)數(shù)以外，通過(guò)分析生物體所引發(fā)的熒光放射和光散射，還可以搜集到關(guān)于尺寸/形狀和成分的信息。每分鐘可以分析數(shù)千個(gè)單細(xì)胞或顆粒。通過(guò)將熒光標(biāo)記的種類特異抗體或核酸探針與固定的生物體結(jié)合，便可以利用流式細(xì)胞儀鑒定病原體(Alvarez-Barrientos，2000，同上)。
通過(guò)將熒光標(biāo)記的種類特異抗體或核酸探針與固定的生物體結(jié)合，便可以利用流式細(xì)胞儀鑒定病原體(Alvarez-Barrientos，2000，同上)。一種特定類型的單個(gè)細(xì)胞通常是分析對(duì)象。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法已被廣泛用于定量檢測(cè)特定細(xì)胞類型，并且以細(xì)胞與標(biāo)記探針，通常是抗體或核酸的結(jié)合能力為基礎(chǔ)。例如，利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法定量AIDS患者體內(nèi)幾類淋巴細(xì)胞的群體尺寸。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法是一種比傳統(tǒng)培養(yǎng)更為復(fù)雜且昂貴的方法。盡管比傳統(tǒng)培養(yǎng)快速，但流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法仍然不具有可與傳統(tǒng)方法比較的檢測(cè)范圍。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)可以檢測(cè)0.1升水中的一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，而流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法只有當(dāng)細(xì)胞數(shù)量水平高于上述水平數(shù)千倍時(shí)才最為有效。此外，微生物對(duì)象通常被檢測(cè)所用的染色方法殺死，從而喪失產(chǎn)生純培養(yǎng)物的能力。
采用顯微鏡成像以顯現(xiàn)并直接計(jì)數(shù)微生物是可以快速并相對(duì)簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)的(Amann，R.I.等，Microbiological Reviews 59143-69，1995)。在臨床診斷實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，使熒光標(biāo)記抗體與固定樣本反應(yīng)的直接熒光實(shí)驗(yàn)(DFA)是一種常用方法。例如，采用革蘭氏染色劑對(duì)懷疑含有細(xì)菌的待檢驗(yàn)物進(jìn)行常規(guī)染色。同樣，為檢驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌，需對(duì)樣本進(jìn)行抗酸性染色。該技術(shù)的缺點(diǎn)是其比微生物培養(yǎng)的靈敏性低數(shù)千倍。低靈敏度是由于高放大倍數(shù)所顯現(xiàn)的是小視野。而只有存在高濃度靶細(xì)胞的情況下，小視野中才可能含有靶細(xì)胞。因此，例如采用熒光原位雜交對(duì)唾液中的細(xì)菌性病原體所進(jìn)行的可靠鑒定需要數(shù)滴含有大約4×105個(gè)細(xì)胞/ml或更多細(xì)胞的唾液。在醫(yī)學(xué)上常見(jiàn)的重要感染中所獲的臨床樣本可能含有的細(xì)菌濃度低于100個(gè)細(xì)胞/ml-該濃度并未高到足以期望在高倍數(shù)顯微鏡視野中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的程度。
Hamamatsu公司的研究人員已經(jīng)研制了一種利用大范圍非放大成像，確實(shí)具有足夠靈敏度以檢測(cè)單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的系統(tǒng)(Masuko，M.等，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 67231-8，1991；Masuko，M.等，F(xiàn)EMS MicrobiolLett 65287-90，1991；Yasui，T.等，Appl Environ Microbiol 634528-33，1997)。單個(gè)微觀靶細(xì)胞的大范圍成像是通過(guò)利用與光學(xué)纖維系統(tǒng)、圖象增強(qiáng)器、圖象處理器相連的超靈敏光子計(jì)數(shù)CCD照像機(jī)實(shí)現(xiàn)的。該系統(tǒng)的一個(gè)缺點(diǎn)是由于組合了圖象增強(qiáng)器及相連光學(xué)元件所帶來(lái)的高額費(fèi)用。此外，與微生物培養(yǎng)方法不同，該系統(tǒng)不能檢測(cè)任何微生物、區(qū)分活微生物與死亡微生物，或生成純培養(yǎng)物。
通過(guò)定量確定細(xì)胞的分子組成的快速微生物計(jì)數(shù)在上半個(gè)世紀(jì)，基于微生物分子組成檢測(cè)并鑒定微生物的許多方法都有所發(fā)展。盡管這些方法中的若干基本上比微生物培養(yǎng)快，但均未提供對(duì)微生物學(xué)家而言可謂關(guān)鍵的所有培養(yǎng)特征。例如，盡管適用于微生物的很多免疫測(cè)定方法已經(jīng)商品化，但該技術(shù)本身并不能定量，且靈敏性遠(yuǎn)低于微生物培養(yǎng)，并且在單次檢驗(yàn)中不如可檢測(cè)多種類型微生物的培養(yǎng)有效。或者如另一個(gè)實(shí)例，核酸擴(kuò)增法可以和微生物培養(yǎng)法一樣靈敏，但不能區(qū)分活細(xì)胞與死亡細(xì)胞，并且不能提供適用于檢驗(yàn)抗生素敏感度的純培養(yǎng)物。利用電泳、質(zhì)譜分析和色譜的生物化學(xué)分析方法(如適用于脂肪酸、核酸或蛋白質(zhì))可以有效地鑒定微生物，但這種方法通常不適用于計(jì)數(shù)微生物，并且對(duì)常規(guī)微生物診斷而言通常太昂貴且復(fù)雜。
微生物計(jì)數(shù)尚未滿足的需要總之，微生物培養(yǎng)主導(dǎo)了目前的微生物計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。微生物培養(yǎng)所具有的重要優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)單、超靈敏、經(jīng)濟(jì)且定量，但其顯著的缺點(diǎn)是慢。在保健和生產(chǎn)方面，獲得結(jié)果所需的長(zhǎng)時(shí)間是主要的代價(jià)。更為快速的方法已得到發(fā)展，但在改進(jìn)獲得結(jié)果所需時(shí)間的問(wèn)題同時(shí)，卻犧牲了微生物培養(yǎng)的一種或多種關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。
因此，對(duì)檢驗(yàn)而言，需要一種比傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)快速，還保留了傳統(tǒng)方法的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明通過(guò)利用大范圍成像檢測(cè)來(lái)自原位細(xì)胞分裂的微觀集落，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞有效、快速且靈敏的計(jì)數(shù)?；诒景l(fā)明的微生物計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)解決了臨床和工業(yè)微生物學(xué)中的一個(gè)重要難題-傳統(tǒng)方法檢測(cè)所需的長(zhǎng)時(shí)間-同時(shí)保留了基于微生物培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的實(shí)施方案包括無(wú)需標(biāo)記試劑檢測(cè)細(xì)胞微集落的非破壞性無(wú)菌方法。這些方法可以獲得適用于鑒定微生物和確定抗生素抗性的純培養(yǎng)物。
本發(fā)明以檢測(cè)樣本中活靶細(xì)胞的方法為特征，該方法包括將樣本中存在的活靶細(xì)胞提供在檢測(cè)區(qū)(detection zone)內(nèi)，該檢測(cè)區(qū)包括密度不超過(guò)每平方毫米檢測(cè)面積(detection area)100個(gè)靶細(xì)胞的檢測(cè)面積，使靶細(xì)胞通過(guò)原位復(fù)制形成一個(gè)或多個(gè)微集落；檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)微集落，其中該一個(gè)或多個(gè)微集落是細(xì)胞復(fù)制產(chǎn)生的；其中該檢測(cè)面積的最長(zhǎng)線性維度(dimension)大于1mm；該檢測(cè)面積內(nèi)，細(xì)胞是隨機(jī)分散且固定的；該檢測(cè)法檢測(cè)的一個(gè)或多個(gè)微集落所具有的平均尺寸在至少兩個(gè)正交維度上不超過(guò)50微米；并且該一個(gè)或多個(gè)微集落中的細(xì)胞在檢測(cè)步驟之后仍然保留復(fù)制能力。
本發(fā)明進(jìn)一步以檢測(cè)靶細(xì)胞微集落的方法為特征，該方法包括將靶細(xì)胞提供在檢測(cè)區(qū)內(nèi)，其中該檢測(cè)范圍內(nèi)，細(xì)胞是任意分散且固定的；使靶細(xì)胞通過(guò)原位復(fù)制形成一個(gè)或多個(gè)微集落，其中至少一個(gè)微集落所含靶細(xì)胞不超過(guò)100個(gè)；以及利用不超過(guò)5倍的放大倍數(shù)檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)微集落的一種或多種自然出現(xiàn)的光學(xué)特性。
本發(fā)明也以檢測(cè)靶細(xì)胞微集落所用的設(shè)備為特征，該設(shè)備包括光學(xué)分辨率不超過(guò)20微米、被圍圓(encircled)能量值超過(guò)每個(gè)像素70％的光電陣列探測(cè)器；照明光源，其中該裝置能夠照明并同時(shí)使至少一個(gè)尺寸≥1cm的檢測(cè)范圍成像，并且該裝置光學(xué)放大不超過(guò)5倍。
本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)本發(fā)明多種實(shí)施方案的若干優(yōu)勢(shì)列于表2中。
表2本發(fā)明獲得結(jié)果所需時(shí)間之所以短是因?yàn)楸景l(fā)明具有可檢測(cè)僅含一小部分細(xì)胞的微集落的能力，而這個(gè)能力是傳統(tǒng)方法所必需的。由于細(xì)胞復(fù)制需要時(shí)間，因此與采用傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法檢測(cè)大的可見(jiàn)集落的速度相比，采用本發(fā)明檢測(cè)小的微集落獲得結(jié)果速度快。為檢測(cè)小的微集落，本發(fā)明采用了有效信號(hào)生成與信號(hào)檢測(cè)方法的組合。
超靈敏度-其檢測(cè)大樣本中少量微觀細(xì)胞的能力-部分是因?yàn)榇蠓秶上竦膽?yīng)用。例如，本發(fā)明可以無(wú)需放大地檢測(cè)微觀集落。該特征使得我們可以觀測(cè)大范圍從而檢測(cè)到單幅圖象中的微集落。大范圍成像對(duì)本發(fā)明有效分析大樣本體積的能力而言是關(guān)鍵的。例如，采用膜過(guò)濾可以使大體積樣本中的微生物污染物沉積在膜上。本發(fā)明利用微集落的大范圍非放大成像，可以有效地分析整個(gè)膜。與之相比，采用高放大倍數(shù)顯微鏡估計(jì)相同濾器上的微集落可能需要數(shù)千幅圖象。
有效計(jì)數(shù)大范圍中的少量微集落的能力也源于本發(fā)明具有利用可比較目標(biāo)信號(hào)與局部背景的成像方法的能力。對(duì)含有很少細(xì)胞的樣本而言，這一能力與將大范圍內(nèi)的總信號(hào)與背景集成的方法相比，提高了信號(hào)與背景的比率。
本發(fā)明計(jì)數(shù)生長(zhǎng)微集落的特有能力實(shí)現(xiàn)了對(duì)含有很少細(xì)胞的樣本的分析可靠性。因此，與檢測(cè)單一集成信號(hào)的方法，如量化所存在生物分子(如ATP、抗原或核酸)的方法相比，本發(fā)明可以減少假陽(yáng)性。當(dāng)采用僅依賴于集成信號(hào)的方法時(shí)，任何可引發(fā)信號(hào)的人工產(chǎn)物均可能造成假陽(yáng)性。假設(shè)一個(gè)樣本含有482個(gè)微生物細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞可產(chǎn)生100個(gè)熒光單位。集成方法的結(jié)果是一個(gè)數(shù)量(48,200個(gè)熒光單位)?？僧a(chǎn)生近似數(shù)量熒光單位的人工產(chǎn)物，例如大的熒光塵粒可能是不可區(qū)分的。不過(guò)，本發(fā)明可以容易地區(qū)分單個(gè)大熒光塵粒與482個(gè)獨(dú)立生長(zhǎng)的微集落。
對(duì)區(qū)分來(lái)自無(wú)生命物質(zhì)的假陽(yáng)性信號(hào)與采自不能在實(shí)驗(yàn)條件下生長(zhǎng)細(xì)胞的假陽(yáng)性信號(hào)而言，檢測(cè)生長(zhǎng)中的微集落是一種有效的方法。例如，假設(shè)一個(gè)實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)培養(yǎng)皿中固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上所覆膜上的微生物微集落。本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，是于檢測(cè)范圍內(nèi)的微生物生長(zhǎng)成為微集落之前，使檢測(cè)范圍成像。如果該檢測(cè)區(qū)域內(nèi)存在若干熒光塵?；蜃陨頍晒庑圆溉閯?dòng)物細(xì)胞，若干陽(yáng)性信號(hào)在該“起始時(shí)間”圖象中將是明顯的。在培育培養(yǎng)皿，使微生物開(kāi)始復(fù)制之后，獲取另一圖象。當(dāng)兩幅圖象在寄存器內(nèi)排列時(shí)，便可將相應(yīng)于微集落的陽(yáng)性信號(hào)與假陽(yáng)性信號(hào)區(qū)分開(kāi)來(lái)，因?yàn)椤捌鹗紩r(shí)間”圖象和培養(yǎng)之后的圖象中均存在假陽(yáng)性信號(hào)(通常無(wú)變化)。只有生長(zhǎng)中的微集落會(huì)隨著時(shí)間而出現(xiàn)。為確認(rèn)是微集落信號(hào)，可以在培育期間的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲取圖象并進(jìn)行比較。只有生長(zhǎng)中的微集落會(huì)隨著時(shí)間在信號(hào)強(qiáng)度和尺寸上有所增加。
與采用現(xiàn)有技術(shù)方法構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)相比，采用本發(fā)明所構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)具有大的動(dòng)態(tài)范圍。因此，例如，基于本發(fā)明設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)單幅圖象中的1～106個(gè)微集落。與之相比，當(dāng)濾膜(47mm直徑)上沉積有大約30～150個(gè)集落時(shí)，傳統(tǒng)微生物計(jì)數(shù)方法才最為有效。新計(jì)數(shù)方法(如Chemunex’s ScanRDI和Millipore’s MicroStar)的動(dòng)態(tài)范圍也有限。
為實(shí)現(xiàn)有效信號(hào)的產(chǎn)生，本發(fā)明可以利用微集落的固有光學(xué)特性(如自身熒光性、反射率或者光散射)或多種外部應(yīng)用的標(biāo)記試劑。利用一系列光學(xué)特性和標(biāo)記方法的能力使重要的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)得以建立。例如，對(duì)計(jì)數(shù)樣本中總微生物含量的實(shí)驗(yàn)而言，采用檢測(cè)微集落普遍具備的特性(如自身熒光或紅外線吸收)的方法是有效的。對(duì)食品加工過(guò)程中腐敗可能性的確定，以及藥物生產(chǎn)中的成品出廠檢驗(yàn)而言，這種實(shí)驗(yàn)都是至關(guān)重要的。本發(fā)明的一種重要實(shí)施方案采用了基于檢測(cè)細(xì)胞自身熒光的無(wú)試劑體系，以檢測(cè)小的微生物微集落。該實(shí)施方案提供了一種簡(jiǎn)單、非破壞性、無(wú)菌的微生物計(jì)數(shù)方法。為檢測(cè)特定類型的細(xì)胞，可以采用種類特異標(biāo)記試劑。例如，可采用與單核細(xì)胞增多性李氏菌特異結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體以檢測(cè)該重要食品病原體細(xì)胞來(lái)源的微集落。
與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)類似，本發(fā)明可以利用選擇性條件下測(cè)定微生物生長(zhǎng)的診斷能力。例如，為確定對(duì)抗生素的細(xì)菌抗性，可以在已經(jīng)預(yù)置有抗生素圓片的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)菌。圓片附近非生長(zhǎng)區(qū)的尺寸決定了抗生素抗性?？梢岳帽景l(fā)明更為快速地檢測(cè)該區(qū)域的尺寸。同樣，可以利用本發(fā)明快速地檢測(cè)選擇性培養(yǎng)基上的特定微生物的生長(zhǎng)情況。
本發(fā)明另一項(xiàng)源于非破壞性計(jì)數(shù)的優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)化了必需的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證環(huán)節(jié)，在該環(huán)節(jié)中，新方法顯示與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法等效。本發(fā)明通過(guò)內(nèi)部比較新舊方法，促進(jìn)了其與“金標(biāo)準(zhǔn)”培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的等效性。簡(jiǎn)言之，在早期時(shí)間點(diǎn)，使來(lái)自樣本中微生物的微集落成像之后，可以重新培育樣本持續(xù)一定時(shí)間，該時(shí)間段是采用傳統(tǒng)目測(cè)集落方法時(shí)所必需的。以這種方式便可以內(nèi)部比較本發(fā)明的微集落計(jì)數(shù)與傳統(tǒng)方法對(duì)微集落后期所形成的相同集落的計(jì)數(shù)。
下文的描述和權(quán)利要求將凸顯本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)。
靶細(xì)胞意指可能存在于樣本中，通過(guò)本發(fā)明檢驗(yàn)其是否存在的細(xì)胞。
靶細(xì)胞的種類(category)意指對(duì)采用本發(fā)明所構(gòu)建實(shí)驗(yàn)的目的而言，被認(rèn)為是一致的多個(gè)靶細(xì)胞。
假設(shè)一個(gè)實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)大腸桿菌細(xì)菌的任意菌株。對(duì)該實(shí)驗(yàn)的目的而言，種類“大腸桿菌”將因此包括大腸桿菌種中的任何細(xì)菌。可以設(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)大腸桿菌種中的任何細(xì)菌，而無(wú)需進(jìn)行區(qū)分。非大腸桿菌的細(xì)菌和其它靶細(xì)胞將不能在該實(shí)驗(yàn)中被檢測(cè)出來(lái)，或者可以被檢測(cè)出來(lái)，但被鑒定為非大腸桿菌家族成員。與此相比，假設(shè)一個(gè)實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)大腸桿菌種的亞群，病原體大腸桿菌O157:H7。該情況中，亞群大腸桿菌O157:H7便是靶細(xì)胞的一個(gè)種類。在該亞群，即種類“大腸桿菌O157:H7”中的細(xì)菌可以被不加區(qū)分地檢測(cè)出來(lái)。大腸桿菌O157:H7亞群中不含的大腸桿菌則不能被該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出來(lái)，因而不在大腸桿菌O157:H7種類中。
種類不需要如上述內(nèi)容那樣在分類學(xué)上相關(guān)。例如，可以將實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于檢測(cè)可產(chǎn)生一種特定蛋白質(zhì)的細(xì)菌種類，該蛋白質(zhì)在賦予該細(xì)菌種類抗生素萬(wàn)古霉素抗性方面是必需的。該蛋白質(zhì)可能是由并非密切相關(guān)，即屬于完全不同種類成員的細(xì)菌菌株產(chǎn)生。不過(guò)，一個(gè)種類中的萬(wàn)古霉素抗性菌株可能與相同種類中的萬(wàn)古霉素敏感菌株非常密切相關(guān)。例如，可產(chǎn)生vanA蛋白質(zhì)(對(duì)實(shí)現(xiàn)萬(wàn)古霉素抗性而言是重要的)的細(xì)菌種類包括腸球菌屬和葡萄球菌屬中的萬(wàn)古霉素抗性細(xì)菌，不過(guò)多數(shù)腸球菌和葡萄球菌并不被包括在該種類內(nèi)。因此，從該情況可以看出，對(duì)本實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，該種類包括了由于一個(gè)共同特征而被認(rèn)為一致的靶細(xì)胞，該情況中的共同特征是分子組成(種類特異結(jié)合位點(diǎn))，而不是共同的種系發(fā)生(系統(tǒng))關(guān)系。
靶細(xì)胞的非重疊種類意指并集為空集的幾組靶細(xì)胞。即所有大腸桿菌細(xì)菌的種類，假單胞菌屬中所有細(xì)菌的種類，和所有真菌的種類是非重疊種類。即任何一個(gè)種類中的成員均非其它任一種類中的成員。
實(shí)驗(yàn)的種類復(fù)雜度意指本實(shí)驗(yàn)中所檢測(cè)到的非重疊種類的數(shù)量。
種類特異結(jié)合位點(diǎn)意指靶細(xì)胞上的一個(gè)位點(diǎn)，該位點(diǎn)可在特異結(jié)合條件下與種類結(jié)合分子特異結(jié)合，并且可以區(qū)分作為實(shí)驗(yàn)中待鑒定的特定種類成員的靶細(xì)胞與非該種類成員但也可能存在于該檢驗(yàn)樣本中的靶細(xì)胞。即該位點(diǎn)典型地存在于一個(gè)種類的所有成員中，并且典型地不存在于非重疊種類的任何成員中。種類特異結(jié)合位點(diǎn)與種類特異結(jié)合分子特異結(jié)合。
如果實(shí)驗(yàn)觀測(cè)(scan)一份樣本以確定構(gòu)成分類群的靶細(xì)胞種類，種類特異結(jié)合位點(diǎn)存在于該分類群基本上所有的成員當(dāng)中，而并非存在于檢驗(yàn)樣本可能存在的其它分類群基本上所有的成員當(dāng)中。
可選地，實(shí)驗(yàn)可以觀測(cè)樣本以檢測(cè)不同分類群成員所共有的種類特異結(jié)合位點(diǎn)。該類型種類特異結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)例包括多種大分子(如DNA)和基因、mRNAs、賦予細(xì)菌抗生素抗性、病毒性或者指示活力的蛋白質(zhì)。種類特異結(jié)合位點(diǎn)通常是較大分子或復(fù)合物的一部分。例如，在實(shí)驗(yàn)中可采用種類特異基因組序列作為種類特異結(jié)合位點(diǎn)。該種類特異結(jié)合位點(diǎn)是更大基因組的一部分，其中該基因組含有(1)非種類特異的部分；(2)該實(shí)驗(yàn)不能觀測(cè)到的種類特異結(jié)合位點(diǎn)部分；以及(3)其它部分，即該實(shí)驗(yàn)可觀測(cè)到的獨(dú)特種類特異序列。
具有下列特征的結(jié)合位點(diǎn)被認(rèn)為是種類特異結(jié)合位點(diǎn)，即該結(jié)合位點(diǎn)存在于例如80％、90％、95％或超過(guò)99％的一類靶細(xì)胞當(dāng)中，該類靶細(xì)胞是一個(gè)種類的成員，而在例如80％、90％、95％或超過(guò)99％的另一類靶細(xì)胞當(dāng)中是缺乏的，該類靶細(xì)胞則是相同分類中所有其它種類的成員。應(yīng)當(dāng)指出，種類特異結(jié)合位點(diǎn)可以在作為該種類成員的靶細(xì)胞當(dāng)中一般或特別缺乏。同樣，種類特異結(jié)合位點(diǎn)可以在非該種類成員的靶細(xì)胞當(dāng)中一般或特別存在。例如，假設(shè)一個(gè)蛋白質(zhì)位點(diǎn)存在于基本上所有的大腸桿菌細(xì)菌中，而在其它細(xì)菌種類中未出現(xiàn)。如果，正如可能在數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)菌中不超過(guò)一個(gè)的細(xì)胞上發(fā)生的情況，突變使得該蛋白質(zhì)不再被產(chǎn)生，則該標(biāo)記將不再存在于該菌株的大腸桿菌中。不過(guò)，該蛋白質(zhì)位點(diǎn)仍然被認(rèn)為是種類特異結(jié)合位點(diǎn)?？蛇x地，通過(guò)重組DNA技術(shù)或自然途徑(如通過(guò)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo))將相同蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)移至不同種類細(xì)菌的一個(gè)菌株中。該情況中，非大腸桿菌種類成員的細(xì)菌菌株將表達(dá)仍然被認(rèn)為是大腸桿菌特異結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。
種類結(jié)合分子意指與種類特異結(jié)合位點(diǎn)特異結(jié)合的分子或分子復(fù)合物。種類結(jié)合分子的實(shí)例包括可與基因組DNA雜交的核酸探針；在體外被選擇或“檢出”與蛋白質(zhì)上的位點(diǎn)特異結(jié)合的核酸適體(aptamer)；與細(xì)胞抗原或血清蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體；與激素受體或諸如抗生物素蛋白的結(jié)合分子特異結(jié)合的配體，如表皮生長(zhǎng)因子或生物素。如果兩個(gè)種類結(jié)合分子可分別與獨(dú)特且非重疊種類特異結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，則認(rèn)為這兩個(gè)種類結(jié)合分子是截然不同的。根據(jù)分子組成，可以將種類結(jié)合分子稱為，例如種類結(jié)合寡核苷酸、探針、抗體、配體等。
與一個(gè)種類的靶細(xì)胞特異結(jié)合的種類結(jié)合分子意指在特定結(jié)合條件下，可與基本上所有作為實(shí)驗(yàn)所觀測(cè)到的種類成員的靶細(xì)胞結(jié)合，而基本上不可與非該種類成員但可能存在于樣本中的靶細(xì)胞結(jié)合的種類結(jié)合分子?？杀凰^測(cè)到種類中的靶細(xì)胞結(jié)合的種類結(jié)合分子數(shù)量與被非該種類的靶細(xì)胞結(jié)合的種類結(jié)合分子數(shù)量相比，典型的前者超過(guò)后者的兩倍、五倍、十倍或超過(guò)五十倍。
結(jié)合條件意指實(shí)驗(yàn)所用來(lái)實(shí)現(xiàn)種類結(jié)合分子與種類特異結(jié)合位點(diǎn)特異結(jié)合的條件。例如，當(dāng)種類結(jié)合分子為種類特異DNA探針時(shí)，適用于特定實(shí)驗(yàn)的結(jié)合條件可能是嚴(yán)格DNA雜交條件。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，合適的嚴(yán)格DNA雜交條件取決于該探針的屬性。例如，對(duì)長(zhǎng)度大于500個(gè)堿基的典型DNA探針而言，合適的結(jié)合條件(在雜交術(shù)語(yǔ)中通常被稱為“洗滌條件”)是65℃下、0.2X SSC中。對(duì)抗體與抗原的結(jié)合而言，典型的結(jié)合條件是室溫下、PBS-TB中。
種類結(jié)合分子家族意指與特定種類靶細(xì)胞特異結(jié)合的一組種類結(jié)合分子。
由于多克隆抗體通常包含與相同種類靶細(xì)胞結(jié)合的多個(gè)獨(dú)特種類結(jié)合分子，因此多克隆抗體通常構(gòu)成了種類結(jié)合分子的家族。應(yīng)當(dāng)指出，如果不利用親和純化，多克隆抗體制備物將典型地也含有不與選定種類的靶細(xì)胞結(jié)合的抗體，并且可能含有與其它種類靶細(xì)胞結(jié)合的抗體。其它抗體的存在是因?yàn)閯?dòng)物抗體的所有組成部分是由該動(dòng)物的感染歷史所決定的。因此，多克隆抗體優(yōu)選地通過(guò)親和法進(jìn)行純化。一個(gè)家族中的種類結(jié)合分子可能與該種類中的若干靶細(xì)胞結(jié)合，而不與其它靶細(xì)胞結(jié)合。
種類結(jié)合分子家族的另一個(gè)實(shí)例是出現(xiàn)在所有大腸桿菌O157:H7菌株中，而未出現(xiàn)在其它細(xì)菌群體成員中的一組80個(gè)種類特異基因組DNA序列。該種類結(jié)合分子家族可作為一個(gè)群體與經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理的大腸桿菌O157:H7細(xì)胞雜交，而不可與其它種類細(xì)胞雜交。家族可以包括不同類型的種類結(jié)合分子。例如，上述家族的種類結(jié)合分子也可以包括與O157抗原特異結(jié)合的單克隆抗體，以及與內(nèi)膜毒蛋白質(zhì)(一種毒性因子)結(jié)合的單克隆抗體。種類結(jié)合分子家族可以含有任意數(shù)量的種類結(jié)合分子(即一個(gè)或多個(gè))。
種類結(jié)合分子的非重疊家族意指幾個(gè)種類結(jié)合分子家族，其中的每個(gè)家族均可與一組非重疊種類中的一個(gè)，且僅與一個(gè)種類特異結(jié)合。即種類結(jié)合分子的一組非重疊家族對(duì)應(yīng)到非重疊種類的相同組。例如，在觀測(cè)4USP有害生物大腸桿菌、沙門氏菌、假單胞菌屬某些種和金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)中，這四種生物均為非重疊種類。該實(shí)驗(yàn)可能合并有四種不同的非交叉反應(yīng)的多克隆抗體，每種抗體均特異于該實(shí)驗(yàn)種類中的一種。因此，該實(shí)驗(yàn)包含了四個(gè)非重疊家族的種類結(jié)合分子。實(shí)驗(yàn)中非重疊家族的種類結(jié)合分子被稱為種類結(jié)合分子的集合。
種類結(jié)合分子集合(ensemble)意指被合并在特定實(shí)驗(yàn)所用混合物中的一組種類結(jié)合分子，包含有一個(gè)或多個(gè)非重疊家族。觀測(cè)靶細(xì)胞的多個(gè)非重疊種類的實(shí)驗(yàn)包括了每個(gè)種類的一個(gè)種類結(jié)合分子家族。包含這些家族的整組種類結(jié)合分子被稱為一個(gè)集合。
一個(gè)集合的種類結(jié)合分子復(fù)雜度意指一個(gè)集合中獨(dú)特的種類結(jié)合分子或部分的數(shù)量。例如，如果一個(gè)種類結(jié)合分子集合包括234個(gè)寡核苷酸探針，則該集合的種類結(jié)合分子復(fù)雜度為234。
一個(gè)集合的家族復(fù)雜度意指一個(gè)集合中種類結(jié)合分子的非重疊家族的數(shù)量。該家族復(fù)雜度與結(jié)合一個(gè)集合中每個(gè)家族來(lái)源的種類結(jié)合分子所需的靶細(xì)胞的最少數(shù)量相同。實(shí)驗(yàn)的家族復(fù)雜度與實(shí)驗(yàn)的種類復(fù)雜度一致-即，樣本中所被觀測(cè)到的獨(dú)特種類的數(shù)量。通常，該家族復(fù)雜度也與實(shí)驗(yàn)所采用的獨(dú)特信號(hào)標(biāo)記的數(shù)量一致。
信號(hào)元(element)意指直接產(chǎn)生一個(gè)可檢測(cè)信號(hào)的分子或顆粒。術(shù)語(yǔ)“直接產(chǎn)生”指信號(hào)元是可檢測(cè)信號(hào)的直接來(lái)源或重要調(diào)節(jié)物的事實(shí)。因此，如果該信號(hào)是由熒光團(tuán)所引發(fā)的光子，則該熒光團(tuán)即為該光子的直接來(lái)源，則因而為信號(hào)元。如果該信號(hào)是由RLS顆粒所散射的光子，則RLS微粒為信號(hào)元?？蛇x地，如果該信號(hào)是由辣根過(guò)氧物酶的生色沉淀產(chǎn)物所透射或散射的光，則該生色產(chǎn)物為信號(hào)元。
信號(hào)元的一個(gè)特征是其不能被分割為幾部分，以使每一部分均產(chǎn)生一個(gè)可與總信號(hào)比較(在特征上，無(wú)需在強(qiáng)度上)的信號(hào)。因此，2nM直徑的量子點(diǎn)是一個(gè)信號(hào)元，因?yàn)殡S著對(duì)其的分割，便改變了所獲相應(yīng)納米晶體的特征(放射光譜)。一個(gè)含有熒光染料，諸如熒光素的5μm顆粒不是發(fā)信號(hào)元，因?yàn)槠淇梢员环指顬閹撞糠?，而每一部分均具有可與整個(gè)顆粒相比較的發(fā)信號(hào)特征。與之相比，分子熒光素則是發(fā)信號(hào)元。信號(hào)產(chǎn)生酶(如熒光素酶、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧物酶)的可檢測(cè)產(chǎn)物也被認(rèn)為是信號(hào)元。這種信號(hào)元(或者是當(dāng)存在一個(gè)從前體到信號(hào)元的化學(xué)轉(zhuǎn)化時(shí)的其前體)可以是可擴(kuò)散物質(zhì)、不溶產(chǎn)物和/或不穩(wěn)定中間物質(zhì)。例如，堿性磷酸酶將化學(xué)發(fā)光底物CDP-Star(NEN；編號(hào)NEL-601)轉(zhuǎn)化為一種活性產(chǎn)物，該產(chǎn)物即為光子發(fā)射信號(hào)元。
發(fā)信號(hào)部分意指包含或產(chǎn)生(在酶的情況中)一個(gè)或多個(gè)信號(hào)元，并且被結(jié)合到、或者可以被結(jié)合到種類結(jié)合分子的分子、顆?；蛭镔|(zhì)。該發(fā)信號(hào)部分可以共價(jià)或非共價(jià)地，以及直接或間接地(例如，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)接物或“化學(xué)連接物”部分)附著到種類結(jié)合分子上。發(fā)信號(hào)部分的實(shí)例包括羧化的量子點(diǎn)；熒光團(tuán)，如被改良用于結(jié)合核酸探針或抗體探針的Texas Red；抗生物素蛋白鏈菌素包被的熒光聚苯乙烯顆粒(可以被結(jié)合到生物素化的種類特異結(jié)合蛋白質(zhì))；含有重復(fù)核酸序列的滾環(huán)狀復(fù)制產(chǎn)物，每個(gè)產(chǎn)物均可被雜交到若干連有熒光修飾核苷酸的寡核苷酸，并且在5’末端均含有種類特異結(jié)合寡核苷酸。發(fā)信號(hào)部分可以包含物理上獨(dú)特的成分。例如，在某些情況中，該發(fā)信號(hào)部分是與種類結(jié)合分子(例如抗體)結(jié)合的一種酶(如堿性磷酸酶)。當(dāng)堿性磷酸酶的底物(如CDP-Star或者分別獲自NEN和Roche的BM紫)被轉(zhuǎn)化為本身是信號(hào)元的產(chǎn)物(如發(fā)射光子的不穩(wěn)定中間物質(zhì)，或者可沉淀的生色產(chǎn)物)時(shí)，便產(chǎn)生了信號(hào)。對(duì)種類結(jié)合分子、酶學(xué)發(fā)信號(hào)部分以及底物而言，被應(yīng)用在不同時(shí)間的反應(yīng)當(dāng)中是常見(jiàn)的。
發(fā)信號(hào)部分復(fù)合體意指包含超過(guò)一個(gè)發(fā)信號(hào)部分和超過(guò)一個(gè)種類結(jié)合分子的物理單元。發(fā)信號(hào)部分復(fù)合體中，該發(fā)信號(hào)部分與種類結(jié)合分子的物理相聯(lián)必須是穩(wěn)定的(如4℃下，在PBS中，該發(fā)信號(hào)部分與種類結(jié)合分子連同該復(fù)合體所具有的平均半衰期應(yīng)至少為一天)。發(fā)信號(hào)部分復(fù)合體的一個(gè)實(shí)例是假設(shè)由兩種類型靶細(xì)胞特異抗體和堿性磷酸酶的數(shù)千個(gè)分子包被的聚苯乙烯微粒。該發(fā)信號(hào)部分復(fù)合體是通過(guò)所結(jié)合的抗體種類結(jié)合分子與靶細(xì)胞結(jié)合。當(dāng)采用生色堿性磷酸酶底物(信號(hào)元；如BM紫，Roche)進(jìn)行培育時(shí)，便可以產(chǎn)生肉眼可觀測(cè)到的著色斑點(diǎn)。可選地，當(dāng)采用化學(xué)發(fā)光或熒光堿性磷酸酶底物培育相同的發(fā)信號(hào)部分復(fù)合體時(shí)，可以產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光或熒光信號(hào)。發(fā)信號(hào)部分復(fù)合體的其它實(shí)例包括與熒光素標(biāo)記抗體結(jié)合的納米金顆粒，以及與寡核苷酸種類結(jié)合分子和吖啶酯二者結(jié)合的膠乳微粒，其中吖啶酯是在添加過(guò)氧化氫后才能化學(xué)發(fā)光。
信號(hào)元或信號(hào)部分的信號(hào)特征意指由信號(hào)元或發(fā)信號(hào)部分所產(chǎn)生信號(hào)的一個(gè)或幾個(gè)方面，這些方面有助于區(qū)分該信號(hào)元或發(fā)信號(hào)部分與其它信號(hào)元或發(fā)信號(hào)部分。例如，由熒光素和若丹明標(biāo)記的發(fā)信號(hào)部分的信號(hào)特征為熒光性。無(wú)線電應(yīng)答器的特征是射頻。光子發(fā)信號(hào)特征的實(shí)例為熒光性、光散射、磷光、反射率、吸光度、化學(xué)發(fā)光性和生物發(fā)光性。除了后兩個(gè)實(shí)例以外，其它的光子發(fā)信號(hào)特征均取決于外部照明(如白光源、激光源或目光)。與之相比，化學(xué)發(fā)光性與生物發(fā)光性則是不依賴外部光源的發(fā)信號(hào)特征。
信號(hào)元或發(fā)信號(hào)部分的類別(class)意指該信號(hào)的獨(dú)特性質(zhì)，該性質(zhì)有助于區(qū)分該信號(hào)元或發(fā)信號(hào)部分與其它信號(hào)元或發(fā)信號(hào)部分。例如，將由紅色染料標(biāo)記的脂質(zhì)體與不同染色的脂質(zhì)體區(qū)分開(kāi)。紅色即其類別。對(duì)傳播特定射頻信號(hào)的微發(fā)射機(jī)而言，可區(qū)分該微發(fā)射機(jī)與其它微發(fā)射機(jī)的射頻信號(hào)的性質(zhì)便構(gòu)成了該信號(hào)元的類別。
信號(hào)標(biāo)記(signature)意指實(shí)驗(yàn)中發(fā)信號(hào)部分與一個(gè)種類的靶細(xì)胞結(jié)合而成的結(jié)合體的獨(dú)特發(fā)信號(hào)性質(zhì)。與四種類型抗體結(jié)合的靶細(xì)胞，即其中一個(gè)與熒光素分子結(jié)合，其它三個(gè)與若丹明分子結(jié)合的靶細(xì)胞所具有的信號(hào)標(biāo)記是通過(guò)熒光素與若丹明的組合加權(quán)吸光度和發(fā)射光譜進(jìn)行描述的。
實(shí)驗(yàn)或標(biāo)記的種類結(jié)合分子集合的信號(hào)復(fù)雜度意指在該實(shí)驗(yàn)中或者通過(guò)與該集合結(jié)合從而可以被獨(dú)特標(biāo)記的靶細(xì)胞種類的數(shù)量?？蛇x地，將該信號(hào)復(fù)雜度定義為如果存在每個(gè)種類靶細(xì)胞的一個(gè)成員便可預(yù)期將出現(xiàn)的獨(dú)特信號(hào)標(biāo)記的數(shù)量。對(duì)某些實(shí)驗(yàn)而言，種類結(jié)合分子集合的信號(hào)復(fù)雜度與實(shí)驗(yàn)所觀測(cè)到的種類數(shù)量相同。其它實(shí)驗(yàn)中，雖然觀測(cè)到許多種類，但可能具有的信號(hào)復(fù)雜度僅為一。
選擇力意指用于捕獲、分離、移動(dòng)或隱蔽靶細(xì)胞的力。選擇力的實(shí)例包括重力、磁力、電勢(shì)、離心力、向心力、浮力密度和壓力。僅通過(guò)作用在靶細(xì)胞上的選擇力便可以移動(dòng)靶細(xì)胞?？蛇x地，選擇力可以特異地作用在與選擇部分相聯(lián)的靶細(xì)胞(見(jiàn)下文定義內(nèi)容)。
移動(dòng)靶細(xì)胞的選擇力的應(yīng)用實(shí)例包括離心靶細(xì)胞；磁選擇結(jié)合有磁性顆粒的靶細(xì)胞；重力沉降標(biāo)記有金屬顆粒的靶細(xì)胞；通過(guò)真空過(guò)濾使靶細(xì)胞在多孔膜上沉積。
選擇部分(selection moiety)意指可以被結(jié)合到種類結(jié)合分子，并且使種類結(jié)合分子可以被選擇力選擇性地捕獲、分離、移動(dòng)或隱蔽的原子、分子、顆?；蚣?xì)胞。當(dāng)種類結(jié)合分子選擇部分復(fù)合體特異地結(jié)合到靶細(xì)胞上時(shí)，通?？梢酝ㄟ^(guò)選擇力將該靶細(xì)胞選擇性地捕獲、分離、移動(dòng)或隱蔽。選擇性指優(yōu)先使選擇部分及相連細(xì)胞對(duì)選擇力的作用敏感，而不是與選擇部分不相連的細(xì)胞。
順磁性顆粒和鐵蛋白是選擇部分的實(shí)例。沉入溶液中的致密石英顆粒是另一種類型的選擇部分。當(dāng)這種顆粒包被有種類結(jié)合分子，并與微生物靶細(xì)胞結(jié)合時(shí)，便可使該靶細(xì)胞沉入水溶液中，從而將該結(jié)合的靶細(xì)胞與樣本中的其它未結(jié)合組分分離開(kāi)。
選擇性特征意指選擇部分的一個(gè)或幾個(gè)方面，這些方面有助于捕獲、選擇或移動(dòng)該選擇部分。例如，順磁性顆粒的選擇性特征為磁性?？焖俪寥胨芤旱氖㈩w粒的選擇性特征為質(zhì)量。
大致平坦的表面或底物意指可以與一個(gè)虛平面平行排列的平面，從而在測(cè)量從該平面上任意一個(gè)1mm×1mm正方形中的點(diǎn)到虛平面上最近點(diǎn)的距離時(shí)，平均距離的絕對(duì)值小于50微米。
檢測(cè)表面意指可沉積靶細(xì)胞的大致平坦的底物表面。在利用光子發(fā)信號(hào)特征的實(shí)施方案中，如果該檢測(cè)表面是光學(xué)透明的，則可以經(jīng)由該檢測(cè)表面的任意一面進(jìn)行檢測(cè)。如果該檢測(cè)表面是不透明的，則經(jīng)由該檢測(cè)表面可沉積靶細(xì)胞的一面進(jìn)行檢測(cè)。
檢測(cè)面積意指由檢測(cè)裝置同時(shí)取樣的檢測(cè)表面的面積。例如，由包括收集透鏡和CCD芯片在內(nèi)的光學(xué)裝置同時(shí)成像的載玻片部分可能測(cè)量為0.8cm×0.5cm。則該檢測(cè)面積為0.4cm2。
檢測(cè)區(qū)意指特定容積，該容積內(nèi)復(fù)制中的靶細(xì)胞可通過(guò)檢測(cè)裝置被檢測(cè)到。該檢測(cè)區(qū)的尺寸與檢測(cè)面積相同，除此之外，還具有一個(gè)深度，與該深度對(duì)應(yīng)的是可檢測(cè)并識(shí)別來(lái)自復(fù)制中的靶細(xì)胞的信號(hào)的深度。因此該檢測(cè)區(qū)的深度取決于計(jì)算正信號(hào)所用的閾值標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)采用光檢測(cè)時(shí)，該檢測(cè)區(qū)的深度取決于視野的光學(xué)深度。
檢測(cè)面積的最長(zhǎng)尺寸意指可以在檢測(cè)區(qū)周邊上的兩點(diǎn)之間所畫出的最長(zhǎng)線。例如，如果該檢測(cè)區(qū)是0.3cm×0.4cm的方形，則該檢測(cè)面積的最長(zhǎng)尺寸是其0.5cm長(zhǎng)的對(duì)角線。如果該檢測(cè)面積是半長(zhǎng)軸為7mm長(zhǎng)，半短軸為2.5mm長(zhǎng)的一個(gè)橢圓，則該檢測(cè)面積的最長(zhǎng)尺寸為14mm。
大范圍檢測(cè)或大范圍成像意指檢測(cè)微觀靶細(xì)胞的方法，其中該檢測(cè)面積(由檢測(cè)裝置同時(shí)分析的面積)遠(yuǎn)大于該靶細(xì)胞或微集落的尺寸。大范圍檢測(cè)的檢測(cè)面積至少有一個(gè)線性尺寸≥1mm。與之相比，微觀集落基本上較小，在至少兩個(gè)正交維度上典型地尺寸不超過(guò)50μm。大范圍檢測(cè)的實(shí)例包括采用CCD像機(jī)成像一個(gè)直徑為9mm的檢測(cè)面積；采用具有1cm長(zhǎng)尺寸的線性陣列檢測(cè)器掃描成像一個(gè)2cm×1cm的方形；采用直接曝光照相底片的方法成像一個(gè)4cm×4cm的濾膜。
若干檢測(cè)樣本中微集落的技術(shù)，并未采用大范圍檢測(cè)。實(shí)例包括固相激光微束掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)，以及在載玻片上具有多個(gè)大功率顯微視野的顯微鏡檢驗(yàn)。
結(jié)合的或穩(wěn)定相聯(lián)的意指兩個(gè)實(shí)體之間的物理相聯(lián)，其中4℃下，該聯(lián)結(jié)在PBS中的平均半衰期最少為一天。假設(shè)，例如蛋白質(zhì)被動(dòng)吸附到聚苯乙烯顆粒的復(fù)雜情況。存在若干不同種類的被吸附蛋白質(zhì)。某些蛋白質(zhì)與表面穩(wěn)定相連，且半衰期為數(shù)月。其它蛋白質(zhì)，如松散結(jié)合在被吸附蛋白質(zhì)外層的蛋白質(zhì)，則不能與顆粒穩(wěn)定相連，在幾小時(shí)內(nèi)便可浸出。
顆粒意指沿任意軸所測(cè)量尺寸均不超過(guò)1mm的剛性基質(zhì)(即至少具有固體的某些特征)。顆?？梢該诫s有信號(hào)元或者與信號(hào)元結(jié)合。顆粒通常被稱為顆粒或者是可反映其尺寸或幾何形狀的術(shù)語(yǔ)。例如，采用的術(shù)語(yǔ)納米球、納米顆?；蚣{米珠指沿任意給定軸所測(cè)量尺寸均小于1微米的顆粒。同樣，采用的術(shù)語(yǔ)微球、微粒或微珠指沿任意給定軸所測(cè)量尺寸均小于1毫米的顆粒。顆粒實(shí)例包括乳膠顆粒、聚丙烯酰胺顆粒、磁性微粒、鐵磁流體(磁性納米顆粒)、量子點(diǎn)等。
圖象增強(qiáng)器或圖象攝像管意指放大光子信號(hào)的裝置，如Inoué，Shinya等，Video microscopythe fundamentals(Plenum Press，New York，1997；p.665)所定義的“一種與攝像管(通過(guò)纖維光學(xué)元件或透鏡)相連，以提高靈敏度的裝置。該增強(qiáng)器為一個(gè)電子管，該電子管具有一個(gè)位于其前端可以根據(jù)聚焦其上的圖象發(fā)射電子的光電陰極，和位于其后端可將電子聚焦在熒光屏上的電子透鏡和/或微通道片，以及一個(gè)可提高電子能的高壓加速器?？梢允菃渭?jí)或多級(jí)”。同一文獻(xiàn)的章節(jié)8中具體描述了若干種這樣的圖象增強(qiáng)器。
在一部分檢測(cè)面積內(nèi)的同時(shí)檢測(cè)意指在同一步驟中對(duì)來(lái)自一部分基本平坦的檢測(cè)表面的信號(hào)所進(jìn)行的檢測(cè)。利用CCD芯片、目視檢測(cè)或者光電二極管基礎(chǔ)的信號(hào)集成對(duì)檢測(cè)面積中的目標(biāo)進(jìn)行大范圍成像便是同時(shí)檢測(cè)的實(shí)例。
鑒定意指確定靶細(xì)胞所屬的一個(gè)或幾個(gè)種類。
樣本意指本發(fā)明所觀測(cè)以確定是否存在靶細(xì)胞的材料。
直接目視檢測(cè)意指除了耐磨校正透鏡以外，不借助儀器所進(jìn)行的目視檢測(cè)。
光電檢測(cè)器意指可以將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的人造裝置或設(shè)備。光電檢測(cè)器的實(shí)例包括CCD檢測(cè)器、光電倍增管檢測(cè)器和光電二極管檢測(cè)器，如雪崩光電二極管。
被圍圓能量或被圍方形(ensquared)能量意指來(lái)自無(wú)窮小光源，并被捕獲在光學(xué)探測(cè)儀陣列的一個(gè)像素上的光子百分比。
熱輻射意指黑體輻射。
細(xì)胞自身熒光性或自身熒光性意指由于天然固有的細(xì)胞組成，如NADH和氧化的黃素蛋白的熒光性，從而使細(xì)胞表現(xiàn)出的熒光性。由于重組熒光蛋白質(zhì)，如綠色熒光蛋白質(zhì)的存在而表達(dá)熒光的細(xì)胞則不被認(rèn)為具有自身熒光性。
原位復(fù)制意指靶細(xì)胞在本來(lái)所處位置上進(jìn)行的復(fù)制，所以其子細(xì)胞基本上仍然與祖代靶細(xì)胞共同定位。例如，細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的體外生物學(xué)培養(yǎng)中，使單個(gè)分散的細(xì)菌沉積在平板上，并在適合細(xì)菌復(fù)制的條件下進(jìn)行培育。某個(gè)位點(diǎn)中的細(xì)菌的復(fù)制便形成也可以進(jìn)行復(fù)制的子細(xì)胞。所有細(xì)胞仍然與原始細(xì)胞共同定位(基本相鄰)，最終在平板上形成可見(jiàn)集落。之前存在單個(gè)細(xì)胞的位置，當(dāng)前出現(xiàn)的便是含有超過(guò)107個(gè)細(xì)胞的集落。
靶細(xì)胞的微集落意指彼此處于物理相鄰位置，位于(或者固定于)一個(gè)表面上的一組靶細(xì)胞，是經(jīng)由單個(gè)祖代靶細(xì)胞以原位體外復(fù)制為基礎(chǔ)的擴(kuò)增所產(chǎn)生的純系后代。微集落通常過(guò)小而不能被肉眼觀察到(如直徑不超過(guò)50微米)。
任何類型的分裂靶細(xì)胞均可以在特定情況中形成微集落，該特定情況可以導(dǎo)致靶細(xì)胞的純系后代在物理上共同定位。例如，微集落可以包含動(dòng)物或植物細(xì)胞、真菌或細(xì)菌。
照明意指具有電磁輻射的照射。不同波長(zhǎng)的電磁輻射均可用于照明。包括，例如波長(zhǎng)在光譜的X射線、UV、可見(jiàn)光或紅外線范圍內(nèi)的輻射。應(yīng)當(dāng)指出，照明輻射未必在可見(jiàn)光范圍內(nèi)。
具有光子發(fā)信號(hào)(photonic signaling)特征的信號(hào)元或發(fā)信號(hào)部分意指通過(guò)光子的發(fā)射、反射、散射、折射、吸收、捕獲、或重定向或光子行為的任何其它調(diào)節(jié)或組合便可以檢測(cè)到的信號(hào)元或發(fā)信號(hào)部分。具有光子發(fā)信號(hào)特征的信號(hào)元或發(fā)信號(hào)部分的若干實(shí)例包括熒光團(tuán)Texas Red(熒光發(fā)信號(hào)特征)；CDP-Star(化學(xué)發(fā)光發(fā)信號(hào)特征)；熒光素酶(生物發(fā)光發(fā)信號(hào)特征)；共振光散射顆粒(光散射發(fā)信號(hào)特征)；BM紫(光吸收或生色發(fā)信號(hào)特征)；和正轉(zhuǎn)化換磷光體(兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)光子的吸收與一個(gè)較短波長(zhǎng)光子的發(fā)射)。
‘?dāng)?shù)字’X‘溶液名稱’意指含有成分為溶液名稱，且濃度為溶液(除水以外)濃度的數(shù)字倍數(shù)的水溶液。例如10X EE含有10mMEDTA/100mM EPPS(EE，或1X EE，含有1mM EDTA/10mM EPPS)。
EE即1mM EDTA/10mM EPPS溶液。將二者混合之前，采用NaOH將兩個(gè)組分的共軛酸調(diào)整為pH8.0。
PB即pH7.4，0.1M磷酸鈉緩沖液。
PBS即磷酸鹽緩沖的鹽水溶液，含有120mM NaCl、2.7mM KCl和pH7.4的10mM磷酸鹽緩沖液(鈉鹽)。
PBS-B即在PBS中含有0.1％BSA(IgG Free；Sigma Cat.No.A-7638)PBS-T即在PBS中含有0.05％Triton X-100(Sigma Cat.No.X-100)PBS-TB即PBS/0.1％BSA/0.05％Triton X-100PBT即PBS/0.1％BSA(IgG Free；Sigma Cat.No.A-7638)/0.05％Tween-20(Sigma Cat.No.X-100)LB即用于培養(yǎng)細(xì)菌的Luria Broth，如前所述制備(Ausubel 1987，同上)。
SSC即150mM NaCl/15mM檸檬酸三鈉，經(jīng)由HCl調(diào)整為pH7.0。
EDAC即(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基))碳化二亞胺TSA即胰酶豆瓊脂(Becton Dickinson/Difco；cat.num.236950)。
TSB即BactoTM胰酶豆肉湯(Becton Dickinson cat.num.211822)。
AP即堿性磷酸酶。
BSA即牛血清白蛋白。
CCD即電荷耦合裝置。
Cfu即集落形成單位(與活細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量對(duì)應(yīng)的細(xì)菌濃度單位)。
FITC即熒光素異硫氰酸鹽。
PNA即肽核酸。
如果沒(méi)有另外指出，該說(shuō)明書中所描述的微生物菌株均獲自American Type Culture Collection(ATCC)，Manassas，VA。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)需要很多世代的細(xì)胞分裂。
傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)獲得結(jié)果所需要的時(shí)間之所以長(zhǎng)，是因?yàn)樾枰獣r(shí)間以生成肉眼可觀察的足量微觀靶細(xì)胞。
圖2.通過(guò)檢測(cè)微集落快速檢測(cè)微生物生長(zhǎng)的概念本發(fā)明通過(guò)使微集落成像的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)生長(zhǎng)細(xì)胞的快速計(jì)數(shù)，其中該微集落所含細(xì)胞比利用傳統(tǒng)方法肉眼檢測(cè)的大集落所含的細(xì)胞少。本發(fā)明之所以快是由于所需要的世代比傳統(tǒng)方法少。
圖3.用于大范圍成像的CCD成像裝置該圖所描繪的以CCD為基礎(chǔ)的成像儀被用于收集實(shí)例中所描述的大量數(shù)據(jù)(也見(jiàn)詳述部分的第5步)。一個(gè)實(shí)例中，是通過(guò)將來(lái)自高強(qiáng)度白光源(1000 Watt Xenon are lamp，Model A-6000，PhotonTechnology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)的光導(dǎo)入流體光導(dǎo)(5mm內(nèi)徑，Model 380，Photon Technology Incorporated，MonmouthJunction，NJ)，從而提供了激發(fā)光。該流體光導(dǎo)將光傳送至一個(gè)激發(fā)濾光輪(BioPoint FW，Ludl Electronics，Hawthorne，NY)，并引導(dǎo)過(guò)濾光束(典型的直徑為9mm)投射在含有標(biāo)記靶細(xì)胞的檢測(cè)表面上。該檢測(cè)表面為微量滴定板孔的光學(xué)透明底部。不過(guò)，相同設(shè)備可以檢測(cè)位于多種檢測(cè)表面(如顯微鏡載玻片、蓋玻片以及具有光學(xué)透明平底的管子)上的標(biāo)記靶細(xì)胞。入射光穿透該檢測(cè)表面，在發(fā)信號(hào)部分中引發(fā)熒光，其中該發(fā)信號(hào)部分是經(jīng)由種類結(jié)合分子與靶細(xì)胞結(jié)合，并沉積于該光學(xué)透明表面上。一部分發(fā)射的熒光被一個(gè)高效收集透鏡系統(tǒng)所收集，并經(jīng)由一個(gè)發(fā)射濾光輪(BioPoint FW，Ludl Electronics)被透射到CCD照像機(jī)(Orca II，Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。
圖4.用于非放大性大范圍成像的CCD成像系統(tǒng)該圖顯示了具有角度照明配置的CCD成像儀，其中光是從收集光學(xué)元件的一側(cè)以一個(gè)角度被導(dǎo)入并投射在檢測(cè)表面(此處顯示為微量滴定板的孔底部)上。該角度是經(jīng)過(guò)選擇的，可最優(yōu)化收集效率，并且避免了收集透鏡對(duì)入射光束的遮擋。該配置的優(yōu)勢(shì)是來(lái)自樣本架底部表面的反射不會(huì)被收集透鏡收集，因而不會(huì)出現(xiàn)熒光背景干擾。
圖5.利用非放大性大范圍成像對(duì)微集落的無(wú)試劑檢測(cè)該圖說(shuō)明了一種不采用標(biāo)記試劑計(jì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)菌的快速方法。微集落中靶細(xì)胞的固有自身熒光是通過(guò)利用基于CCD的非放大性大范圍成像而得以檢測(cè)的。該無(wú)試劑方法的優(yōu)勢(shì)包括其簡(jiǎn)易性、無(wú)破壞性以及廣泛的適用性?？蛇x地，與靶細(xì)胞特異結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的標(biāo)記試劑(如熒光抗體或核酸探針)可以被用于檢測(cè)含有靶細(xì)胞的微集落。
圖6.利用非放大性大范圍成像對(duì)細(xì)菌微集落的檢測(cè)與鑒定(實(shí)施例1)該圖顯示了一種通過(guò)利用基于CCD的非放大性大范圍成像使標(biāo)記的微集落成像，以檢測(cè)微集落的一種快速、簡(jiǎn)易且靈敏的方法。該實(shí)施例中，為形成微集落，需使單細(xì)胞復(fù)制若干代。微集落是由SyberGreen I或FITC標(biāo)記抗體標(biāo)記的。圖7中，上排照片顯示的是0小時(shí)的單細(xì)胞。底排照片顯示的是培育3小時(shí)后形成的微集落。由于位于集落形成細(xì)胞最初所附著位點(diǎn)上的細(xì)胞數(shù)量的增加，使通過(guò)CCD成像檢測(cè)到的目標(biāo)的尺寸及信號(hào)均隨著時(shí)間有實(shí)質(zhì)性的增加。
圖7.利用非放大性大范圍成像對(duì)細(xì)菌微集落基于自身熒光的檢測(cè)(實(shí)施例2)該圖說(shuō)明了一種通過(guò)利用基于CCD的非放大性大范圍成像使細(xì)胞自身熒光信號(hào)成像，以檢測(cè)微集落的一種快速、簡(jiǎn)易且靈敏的方法。單個(gè)分散細(xì)胞沉積在濾膜上，于37℃，生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培育5.25小時(shí)。與另外制備并同樣成像的無(wú)細(xì)菌沉積的濾膜(右幅照片)相比，微集落(由單個(gè)分散細(xì)胞的純系生長(zhǎng)形成)產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)性的自身熒光信號(hào)(左幅照片)。
圖8.一種利用與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的內(nèi)部比較驗(yàn)證快速無(wú)試劑微生物計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)易方法(實(shí)施例3)該圖證明了一種簡(jiǎn)易方法，該方法顯示微集落計(jì)數(shù)等效于傳統(tǒng)方法。利用對(duì)微集落自身熒光的非破壞性檢測(cè)，使得本發(fā)明所檢測(cè)的微集落可以被再次培育，直至其發(fā)育成為可利用傳統(tǒng)可見(jiàn)集落計(jì)數(shù)方法檢測(cè)的大集落。應(yīng)當(dāng)指出，微集落所形成的斑點(diǎn)圖樣(左幅照片)與可見(jiàn)集落所形成的斑點(diǎn)圖樣(右幅照片)相符，便表明兩種方法的等效性。
圖9.利用非放大性大范圍成像檢測(cè)自身熒光微集落的檢測(cè)準(zhǔn)確度及限度(實(shí)施例4)該圖顯示了當(dāng)樣本含極低水平靶細(xì)胞時(shí)，確定本發(fā)明準(zhǔn)確度的方法。對(duì)101個(gè)濾器中的每一個(gè)而言，通過(guò)計(jì)數(shù)自身熒光微集落所獲得的結(jié)果與通過(guò)傳統(tǒng)方法所獲得的結(jié)果相同。
圖10.測(cè)定利用無(wú)試劑非放大性成像快速檢測(cè)的自身熒光細(xì)菌微集落中的微生物細(xì)胞數(shù)量(實(shí)施例5)該圖顯示的是利用大腸桿菌微集落的大范圍成像，由大腸桿菌微集落所產(chǎn)生的信號(hào)(頂部照片)。底部照片中利用高倍數(shù)顯微鏡成像的三個(gè)微集落與上部照片中利用本發(fā)明成像的三個(gè)微集落相符。每幅圖片下方標(biāo)有每個(gè)微集落中的細(xì)菌數(shù)量(45、48和50個(gè)細(xì)胞)。該圖證明利用無(wú)試劑非放大性大范圍成像可以檢測(cè)含少量大腸桿菌細(xì)胞的微集落。
圖11.基于CCD、非放大性、大范圍成像檢測(cè)并鑒定一份環(huán)境水樣本中的細(xì)菌微集落(實(shí)施例6)該圖顯示通過(guò)利用本發(fā)明對(duì)來(lái)自查爾斯河水中的細(xì)菌集落的檢測(cè)，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的分析結(jié)果。細(xì)菌細(xì)胞被收集在混合纖維素酯濾器上。將該濾器置于R2A瓊脂平板上，于32.5℃培育74小時(shí)。利用白光的反射系數(shù)和自身熒光性，在不同時(shí)間點(diǎn)使濾器成像。在反射圖象中鑒定并計(jì)數(shù)直徑大于或等于0.55mm的大集落。也可以確定自身熒光微集落形成可檢測(cè)大集落的時(shí)間點(diǎn)。在不同時(shí)間點(diǎn)，標(biāo)繪出74小時(shí)中可檢測(cè)的大集落與自身熒光微集落的百分?jǐn)?shù)。
圖12.基于CCD、非放大性、大范圍成像檢測(cè)細(xì)菌微集落的方法與計(jì)數(shù)樣本中細(xì)菌的傳統(tǒng)倒平板培養(yǎng)方法之間的相關(guān)性(實(shí)施例7)該圖比較了利用本發(fā)明和傳統(tǒng)倒平板微生物培養(yǎng)方法計(jì)數(shù)自身熒光微集落所獲得的結(jié)果。
圖13.無(wú)試劑計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)范圍及線性(實(shí)施例8)該圖顯示了通過(guò)利用本發(fā)明檢測(cè)自身熒光微集落，對(duì)動(dòng)態(tài)范圍和線性的分析結(jié)果。
圖14.無(wú)需稀釋樣本進(jìn)行的抗菌防腐效果檢驗(yàn)(實(shí)施例9)該圖顯示了分別利用本發(fā)明和傳統(tǒng)方法所獲得的可比較的抗菌防腐效果。該比較顯示本發(fā)明可以通過(guò)避免對(duì)數(shù)百個(gè)樣本稀釋物的分析需要，從而節(jié)省該實(shí)驗(yàn)大部分人力與花費(fèi)。
圖15.利用非放大性大范圍成像對(duì)熱應(yīng)力(heat-stressed)生物制品基于自身熒光的檢測(cè)(實(shí)施例10)該圖顯示了在分別利用本發(fā)明和傳統(tǒng)傾倒平板方法對(duì)熱應(yīng)力生物指示細(xì)胞進(jìn)行的計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性。將該生物指示劑脂肪嗜熱桿菌應(yīng)用在多種熱應(yīng)力情況中。利用CCD基礎(chǔ)大范圍成像測(cè)定微集落自身熒光性，可見(jiàn)大集落則通過(guò)直觀計(jì)數(shù)。彼此相對(duì)地標(biāo)繪出兩種方法的結(jié)果，顯示出好的相關(guān)性。不過(guò)與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明所需要的稀釋物基本上較少。
圖16.對(duì)絞細(xì)牛肉中存在的細(xì)菌微集落基于自身熒光的檢測(cè)(實(shí)施例11)該圖分別顯示了來(lái)源自絞細(xì)牛肉中存在的微生物的自身熒光微集落與大集落的檢測(cè)時(shí)間。隨時(shí)間跟蹤微集落的出現(xiàn)，該微集落于48小時(shí)所形成大集落的100％可以通過(guò)本發(fā)明于16小時(shí)便檢測(cè)到。這表明，與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明可以顯著縮短獲得結(jié)果所需要的時(shí)間。
圖17.磁選擇，繼而進(jìn)行微集落檢測(cè)(實(shí)施例12)該流程圖顯示了對(duì)靶細(xì)胞的磁選擇，繼而使其原位生長(zhǎng)，并利用本發(fā)明對(duì)微集落自身熒光性進(jìn)行的檢測(cè)。
圖18.采用非特異磁選擇，繼而利用非放大性大范圍成像檢測(cè)微集落的方法對(duì)復(fù)雜樣本中的細(xì)菌進(jìn)行的檢測(cè)(實(shí)施例12)該圖顯示了從全血中磁捕獲金黃色葡萄求菌的試驗(yàn)結(jié)果。利用包被有可結(jié)合細(xì)菌的廣泛反應(yīng)試劑混合物的磁性顆粒從血液樣本中選擇出該細(xì)菌。過(guò)濾、平板接種并培育(6小時(shí))后，利用非放大性大范圍成像檢測(cè)自身熒光微集落。培育該濾膜過(guò)夜。之后，再次使該濾膜成像(未顯示圖象)，并核實(shí)6小時(shí)微集落的位置已形成大集落，排除微集落被誤認(rèn)為是塵?；蚱渌⒘５目赡苄浴?br> 圖19.快速抗菌敏感度檢驗(yàn)流程圖(實(shí)施例13)
該圖說(shuō)明了一種通過(guò)利用基于CCD非放大性大范圍成像檢測(cè)微集落的出現(xiàn)，從而檢驗(yàn)細(xì)菌菌株對(duì)抗生素的敏感度的快速方法。對(duì)所示細(xì)菌菌株而言，當(dāng)該細(xì)菌在抗生素存在(右列)條件下生長(zhǎng)時(shí)，不能形成微集落，便說(shuō)明其對(duì)該抗生素敏感。未經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)條件下的培育的細(xì)菌也不能生長(zhǎng)(左列)。如預(yù)期當(dāng)在抗生素存在的生長(zhǎng)條件下培育該菌株時(shí)，檢測(cè)到其生長(zhǎng)(中列)。
圖20.快速抗菌敏感度檢驗(yàn)(實(shí)施例13)該圖顯示了抗菌敏感度檢驗(yàn)結(jié)果，該檢驗(yàn)比較了在含有抗生素的瓊脂平板上微集落形態(tài)的兩種細(xì)菌菌株(一種對(duì)抗生素四環(huán)素具有敏感性，另一種則對(duì)其具有抗性)的生長(zhǎng)情況。將每種菌株來(lái)源的細(xì)菌細(xì)胞過(guò)濾至聚碳酸酯膜上，置于含四環(huán)素的LB瓊脂平板中，并于37□培育三小時(shí)(標(biāo)為“3小時(shí)”的圖片欄)。將同樣方法制備的另一個(gè)濾膜置于含四環(huán)素的LB瓊脂平板中，于室溫下培育時(shí)間不超過(guò)5分鐘(標(biāo)為“0小時(shí)”的圖片欄)。固定這些濾膜并利用核酸染色劑對(duì)其染色。對(duì)含有已培育三小時(shí)的細(xì)菌的膜進(jìn)行CCD成像(標(biāo)為“3小時(shí)CCD”的圖片欄)，在含有抗性菌株的膜上檢測(cè)到微集落生長(zhǎng)，而含有敏感性菌株的膜上則未檢測(cè)到微集落的生長(zhǎng)。通過(guò)高倍數(shù)熒光顯微鏡證實(shí)在含有抗性菌株的濾膜上存在微集落的生長(zhǎng)，而含有敏感菌株的濾膜上則不存在微集落的生長(zhǎng)(標(biāo)為“3小時(shí)顯微鏡”的圖片欄)。如預(yù)期，未于生長(zhǎng)條件下培育的濾膜的CCD圖象中未檢測(cè)到微集落的存在(標(biāo)為“0小時(shí)CCD”的圖片欄)，通過(guò)高倍數(shù)熒光顯微鏡也僅檢測(cè)到幾個(gè)單獨(dú)分散的細(xì)胞。利用計(jì)算機(jī)圖象分析以量化膜的CCD成像結(jié)果(柱狀圖表)。含有由抗性菌株形成的微集落的膜所產(chǎn)生的強(qiáng)度約比含有敏感菌株的膜所產(chǎn)生的強(qiáng)度高25倍。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示利用非放大性大范圍成像檢測(cè)微集落是一種檢驗(yàn)抗菌敏感度的快速且靈敏的方法。
圖21.利用圓片擴(kuò)散(disk diffusion)法和非放大性大范圍成像的快速抗菌敏感度檢驗(yàn)(實(shí)施例14)該圖顯示了抗菌敏感度圓片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)比較了兩種細(xì)菌菌株(一種為敏感菌株，另一種為抗性菌株)的生長(zhǎng)情況。在擴(kuò)散圓片上或鄰近位置的自身熒光微集落生長(zhǎng)5小時(shí)后便可以被檢測(cè)到，與標(biāo)準(zhǔn)過(guò)夜生長(zhǎng)所需時(shí)間相比，該方法大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。左圖顯示的是四環(huán)素抗性菌株的生長(zhǎng)接近擴(kuò)散圓片，而同時(shí)右圖顯示的是缺乏四環(huán)素敏感菌株的生長(zhǎng)。培育該圓片擴(kuò)散平板過(guò)夜。比較24小時(shí)的抑制環(huán)帶與5小時(shí)的環(huán)帶。24小時(shí)的抑制環(huán)帶與5小時(shí)的微集落結(jié)果相同，這表明與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明可以更快地獲得可比較的結(jié)果。
圖22.利用E-testTM和非放大性大范圍成像的快速抗菌敏感度檢驗(yàn)(實(shí)施例15)該圖顯示了抗菌敏感度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)利用含有抗生素四環(huán)素的EtestTM條帶，比較了兩種細(xì)菌菌株(一種為敏感菌株，另一種為抗性菌株)的生長(zhǎng)情況。將細(xì)菌細(xì)胞涂布于TSA平板上。將E-testTM條帶直接加入平板中，并于37℃培育。生長(zhǎng)在E-testTM條帶上或鄰近位置的自身熒光微集落生長(zhǎng)5小時(shí)后便可以被檢測(cè)到。左圖顯示的是第5小時(shí)生長(zhǎng)于條帶256μg/ml處的抗性菌株。右圖顯示的是第5小時(shí)在鄰近條帶2μg/ml處具有一個(gè)抑制區(qū)的敏感菌株。24小時(shí)的抑制區(qū)與5小時(shí)區(qū)域是可比較的，這表明采用本發(fā)明所獲更為快速的結(jié)果與較慢的傳統(tǒng)方法所獲結(jié)果是可比較的。
發(fā)明詳述發(fā)明綜述本發(fā)明快速并經(jīng)濟(jì)地分析經(jīng)過(guò)最低程度處理的生長(zhǎng)細(xì)胞的樣本。本發(fā)明與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法均通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌“集落”的形成測(cè)定了細(xì)胞生長(zhǎng)情況(圖1)，其中“集落”即單個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)連續(xù)細(xì)胞分裂所形成的成簇相連細(xì)胞。不過(guò)，本發(fā)明對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況的檢測(cè)速度遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)，因?yàn)槠錂z測(cè)的微集落所出現(xiàn)的階段早于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)目測(cè)的大集落所出現(xiàn)的階段(圖2，圖8)。通過(guò)利用與微生物培養(yǎng)相同的方法原理，本發(fā)明可以在保留傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢(shì)同時(shí)仍然能夠顯著縮短獲得結(jié)果所需的時(shí)間。
對(duì)特定實(shí)施方案及應(yīng)用的檢驗(yàn)有助于理解本發(fā)明是如何檢測(cè)微集落的。例如，假設(shè)將一個(gè)可以計(jì)數(shù)水中微生物的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用在可注射藥物的生產(chǎn)中。通過(guò)使液體經(jīng)過(guò)一個(gè)多孔膜，從而濃縮并固定水樣(100ml)中的微生物。將含有微生物的膜置于一次性培養(yǎng)皿中的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。于32℃培育微生物，使其復(fù)制并形成微集落。使光投射在膜表面，促使微集落中的細(xì)胞自發(fā)熒光。該自身熒光信號(hào)來(lái)源自細(xì)胞中存在的生物分子(如NADH和氧化的黃素蛋白)。繼而電子成像該自身熒光微集落。來(lái)源自個(gè)體微集落的光照射到位于CCD陣列光電檢測(cè)器上的一個(gè)像素或一小簇相鄰像素。通過(guò)圖象處理軟件立即計(jì)算自發(fā)熒光微集落的數(shù)量，并報(bào)告使用者。應(yīng)當(dāng)指出，除了本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果較快且自動(dòng)化以外，該方法與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)一致。
由于本發(fā)明的實(shí)施方案是非破壞性的(即未殺傷或損害微生物)，因此所檢測(cè)的微集落可以生長(zhǎng)為純培養(yǎng)物。這些純培養(yǎng)物可以被用于鑒定微生物，并且對(duì)臨床樣本而言，可用于確定抗菌抗性和敏感度。非破壞性檢測(cè)也簡(jiǎn)化了對(duì)該方法與傳統(tǒng)微生物計(jì)數(shù)方法等效性的驗(yàn)證。采用本發(fā)明檢測(cè)微集落之后，可以簡(jiǎn)單地再培育培養(yǎng)皿，以使微集落繼續(xù)生長(zhǎng)一段時(shí)間，該時(shí)間段是形成傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)檢測(cè)方法可目測(cè)到的大集落所需要的時(shí)間。對(duì)本發(fā)明檢測(cè)的微集落與微集落進(jìn)一步生長(zhǎng)所形成可見(jiàn)集落的數(shù)量和位點(diǎn)的比較，有利于確定本發(fā)明與傳統(tǒng)方法的等效性。
本發(fā)明也可被用于構(gòu)建采用多種形式、標(biāo)記方法、種類結(jié)合分子及檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)。不過(guò)這些實(shí)驗(yàn)所具有的若干關(guān)鍵特征是共有的。為本發(fā)明諸多實(shí)施方案所共有的步驟及方法在下文有所描述。
本發(fā)明應(yīng)用的一般形式包括如下步驟步驟1闡明實(shí)驗(yàn)問(wèn)題，選擇樣本、待檢測(cè)細(xì)胞種類、生長(zhǎng)條件及發(fā)信號(hào)特征步驟2使細(xì)胞目標(biāo)物(target)沉積在檢測(cè)范圍內(nèi)步驟3使細(xì)胞復(fù)制以形成微集落步驟4任選地標(biāo)記微集落步驟5計(jì)數(shù)微集落在基于本發(fā)明構(gòu)建新應(yīng)用的過(guò)程中，闡明有待該實(shí)驗(yàn)解決的問(wèn)題是第一步。表3列出了工業(yè)及臨床微生物學(xué)家必提的重要問(wèn)題的若干實(shí)例。實(shí)驗(yàn)問(wèn)題的闡明通常定義了必檢驗(yàn)的樣本類型(如絞細(xì)牛肉、臨床尿樣或藥物成品)。選擇使靶細(xì)胞沉積在檢測(cè)范圍內(nèi)方法的過(guò)程中，樣本類型和體積是重要的參數(shù)(見(jiàn)步驟2)。實(shí)驗(yàn)問(wèn)題的闡明也定義了應(yīng)用中必檢測(cè)的細(xì)胞類型或種類(如需氧細(xì)菌、酵母或霉菌、假單胞菌、大腸桿菌O157:H7或無(wú)名脊髓液分離物)。
表3定義了待檢測(cè)或計(jì)數(shù)的細(xì)胞類型之后，選擇條件以促進(jìn)細(xì)胞在檢測(cè)范圍內(nèi)的生長(zhǎng)?？墒辜?xì)胞復(fù)制進(jìn)行的重要參數(shù)包括生長(zhǎng)培養(yǎng)基的成分、選擇性試劑如抗生素的存在、溫度、氧氣及其它氣體水平。如果可能，選擇可以促進(jìn)待檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)，而對(duì)其它類型細(xì)胞無(wú)作用的生長(zhǎng)條件。例如，用于檢測(cè)酵母和霉菌的培養(yǎng)基通常含有可以抑制其它更快速生長(zhǎng)的細(xì)菌微生物生長(zhǎng)情況的成份。
由待檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的方法也必須選定。信號(hào)的選定取決于待檢測(cè)微集落中的細(xì)胞類型、可能形成微集落的其它細(xì)胞類型，以及預(yù)期存在于樣本中的背景類型。假設(shè)一個(gè)測(cè)定藥物生產(chǎn)成品中需氧細(xì)菌總量的實(shí)驗(yàn)；例如用于隱形眼鏡的洗滌溶液。由于該樣本中可能存在廣譜的數(shù)千個(gè)環(huán)境微生物，因此信號(hào)產(chǎn)生方法必須非常全面。某些這種方法依賴于微集落的固有光學(xué)特性，如微集落自身熒光性、反射率或紅外線吸收。該方法實(shí)現(xiàn)了無(wú)需利用試劑的快速微集落檢測(cè)，即本發(fā)明的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)。利用例如微集落自身熒光性產(chǎn)生無(wú)試劑信號(hào)的方法基本上簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)現(xiàn)了無(wú)菌樣本處理，并使得采用“金標(biāo)準(zhǔn)”方法所用的相同培養(yǎng)基和一次性實(shí)驗(yàn)用品所進(jìn)行的快速實(shí)驗(yàn)成為可能。可選地，可以采用染色劑標(biāo)記由靶細(xì)胞形成的微集落。
采用染色劑和特異探針計(jì)數(shù)特定種類的靶細(xì)胞在探詢一系列診斷學(xué)問(wèn)題的應(yīng)用中，可以采用可與靶細(xì)胞分子組成結(jié)合的染色劑或探針?？杀挥糜跈z測(cè)寬范圍靶細(xì)胞(如所有需氧細(xì)菌)的染色劑實(shí)例包括核酸染色劑(如碘化丙啶或Syber Green(Molecular Probes))，和針對(duì)酶活的染色劑(如熒光酯酶染色劑)。為標(biāo)記較窄范圍種類的靶細(xì)胞，可以采用與目標(biāo)特異分子組成結(jié)合的標(biāo)記探針。例如，可以采用與僅存在于食品病原體大腸桿菌O157:H7表面上的分子特異結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體，以檢測(cè)食品樣本中的致病微集落。
因此，為檢測(cè)一種靶細(xì)胞的存在，本發(fā)明可以采用與種類特異分子組成特異結(jié)合的分子。存在于靶細(xì)胞上的種類特異分子組成被稱為種類特異結(jié)合位點(diǎn)，與其特異結(jié)合的分子被稱為種類結(jié)合分子。為檢測(cè)種類結(jié)合分子的結(jié)合情況，通常是使可檢測(cè)標(biāo)記，或發(fā)信號(hào)部分附著于該種類結(jié)合分子。應(yīng)當(dāng)指出，種類特異結(jié)合位點(diǎn)是可能存在于待檢驗(yàn)樣本中的靶細(xì)胞的一個(gè)特性。與之相比，種類結(jié)合分子是在一種診斷試驗(yàn)試劑盒所提供的一種試劑。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以采用廣譜的種類結(jié)合分子。該特征是重要的，因?yàn)椴捎昧瞬煌愋偷姆N類結(jié)合分子以探詢不同類型的診斷學(xué)問(wèn)題(如廣泛界水平的篩選對(duì)狹窄亞種水平的鑒定)。種類結(jié)合分子(也往往被稱為探針)的分類包括核酸(寡核苷酸、適體、克隆序列、基因組DNA、RNA等)；與核酸相關(guān)的化學(xué)變體，如肽核酸(PNA)；抗體；酶(可結(jié)合目標(biāo)底物)；非酶蛋白質(zhì)，如抗生物素蛋白(結(jié)合目標(biāo)分子生物素)；與細(xì)胞組分特異結(jié)合的分子(如與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的毒傘素，或者與抗生物素蛋白結(jié)合的生物素)；染料和染色劑(如亞丙基、金胺-若丹明、或SYTO17)；配體(如與表皮生長(zhǎng)因子受體特異結(jié)合的表皮生長(zhǎng)因子)；以及利用體外發(fā)育技術(shù)(如Zhang等，Nat.Biotech.1871-74，2000)選擇的多肽或核酸結(jié)合試劑。
種類結(jié)合分子可以整合其它功能區(qū)或修飾。例如，種類結(jié)合分子通常共價(jià)地或非共價(jià)地與發(fā)信號(hào)部分(即一個(gè)標(biāo)記區(qū)，如熒光團(tuán)或一個(gè)著色微粒)或選擇部分(如磁性顆?；蚬腆w表面)相連。可選地，種類結(jié)合分子可以被連接到適配物部分，反過(guò)來(lái)該連接有利于其它功能部分的連接。有時(shí)該種類結(jié)合分子具有雙重不可分的功能。例如，可以采用碘化丙啶核酸染色劑作為種類結(jié)合分子(如可能是酵母中的細(xì)胞核酸的種類特異結(jié)合位點(diǎn))，而同時(shí)，采用結(jié)合的染料作為發(fā)信號(hào)部分(即其可以在與種類特異結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光)。基于本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)可以整合多于一類的種類結(jié)合分子(如抗體和核酸染色劑，或者抗體和寡核苷酸)。
最簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)采用了單一類型的種類結(jié)合分子，以觀測(cè)單一種類的靶細(xì)胞。例如，針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)可以采用與位于結(jié)核分枝桿菌表面的種類特異結(jié)合位點(diǎn)特異結(jié)合的單克隆抗體。另一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)篩選尿路感染時(shí)，單一種類為“所有細(xì)胞”-或者，如果人類細(xì)胞被裂解，則為“所有非人類細(xì)胞”-和單一類型的種類結(jié)合分子可以是核酸染色劑(如碘化丙啶)。
種類結(jié)合分子家族是與相同種類靶細(xì)胞成員結(jié)合的一組獨(dú)特的種類結(jié)合分子。例如，針對(duì)丙型肝炎病毒引發(fā)的多克隆抗體便是一個(gè)抗體家族，因?yàn)榫虷CV而言，該多克隆抗體包含了可與相同種類靶細(xì)胞特異結(jié)合的多個(gè)種類結(jié)合分子。種類結(jié)合分子家族的另一個(gè)實(shí)例是一組存在于所有大腸桿菌O157:H7菌株中，而未出現(xiàn)在其它細(xì)菌群體成員中的80個(gè)種類特異基因組DNA序列。該種類結(jié)合分子家族可以作為一個(gè)群體與經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理的大腸桿菌O157:H7細(xì)胞雜交，而不與其它類型細(xì)胞雜交。
為檢測(cè)多個(gè)種類的靶細(xì)胞，一個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該包括若干種類結(jié)合分子家族，并且一個(gè)種類結(jié)合分子家族對(duì)應(yīng)一個(gè)種類的靶細(xì)胞。一組種類結(jié)合分子家族被稱為一個(gè)種類結(jié)合分子集合。例如，針對(duì)肺炎或者濫用藥物的實(shí)驗(yàn)必須將諸多種類的靶細(xì)胞彼此區(qū)分開(kāi)來(lái)。對(duì)應(yīng)每個(gè)種類的靶細(xì)胞，采用一個(gè)種類結(jié)合分子家族。就肺炎檢驗(yàn)而言，可以采用與位于可引起肺炎的微生物表面上的種類特異抗原反應(yīng)的抗體集合。該種類結(jié)合分子集合中的一個(gè)家族可能包含了來(lái)源自兔宿主體內(nèi)所引發(fā)抗血清的免疫球蛋白部分的多克隆抗體，以及直接由肺炎鏈球菌引發(fā)的多克隆抗體。另一個(gè)家族可能包含重組抗體或由腺病毒外殼蛋白直接引發(fā)的單克隆抗體。
通過(guò)一個(gè)集合，即種類復(fù)雜度所檢驗(yàn)的獨(dú)特群體或種類靶細(xì)胞數(shù)量是由該集合中的種類結(jié)合分子家族數(shù)量反映的。反過(guò)來(lái)，一個(gè)集合中的家族數(shù)量可以通過(guò)一個(gè)被稱為集合的“最少種類來(lái)源”的數(shù)量而得以準(zhǔn)確定義。家族復(fù)雜度是必須與來(lái)自該實(shí)驗(yàn)集合中每個(gè)種類結(jié)合分子家族的成員結(jié)合的特定靶細(xì)胞的最小數(shù)量。例如，假設(shè)一個(gè)種類特異抗體集合，用于同時(shí)檢驗(yàn)唾液樣本，以確定結(jié)核分枝桿菌、軍團(tuán)菌屬某些種和厭酷球孢子菌的存在。該集合的家族復(fù)雜度為3，因?yàn)榉謩e來(lái)源自每個(gè)病原體種類，且必須與該集合中每個(gè)種類結(jié)合分子家族的成員結(jié)合的靶細(xì)胞個(gè)數(shù)的最小值為3。本發(fā)明在單次實(shí)驗(yàn)中鑒定廣譜靶細(xì)胞種類的能力，與其利用具有大的家族復(fù)雜度的種類結(jié)合分子集合檢測(cè)樣本的能力存在因果關(guān)系。
結(jié)合本發(fā)明應(yīng)用的種類結(jié)合分子在某一方面應(yīng)具有特異性，即其應(yīng)在實(shí)驗(yàn)條件下與指定靶細(xì)胞結(jié)合，而不與該實(shí)驗(yàn)應(yīng)區(qū)分的其它類型靶細(xì)胞，或該檢驗(yàn)樣本中的其它可能組成結(jié)合。因此，在針對(duì)上呼吸道疾病細(xì)菌感染的檢驗(yàn)中，應(yīng)對(duì)種類結(jié)合分子進(jìn)行篩選，以排除與上呼吸道的普通(共生)微生物組成交叉反應(yīng)的潛在的種類結(jié)合分子。
下述實(shí)例包括了用于獲得并表征種類結(jié)合分子的代表性方法。
本發(fā)明之所以能夠分析樣本以檢測(cè)多種全異種類的靶細(xì)胞，是因?yàn)槠淇梢詤^(qū)分來(lái)源于不同種類靶細(xì)胞的信號(hào)。本發(fā)明通過(guò)采用發(fā)信號(hào)部分標(biāo)記每個(gè)種類特異家族的種類結(jié)合分子，以使其具有獨(dú)特的信號(hào)標(biāo)記，從而區(qū)分了諸多種類。產(chǎn)生并檢測(cè)大量獨(dú)特信號(hào)標(biāo)記(即高信號(hào)復(fù)雜度)的能力實(shí)現(xiàn)了對(duì)可以分析諸多種類靶細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)(即高度多元實(shí)驗(yàn))的構(gòu)建。
本發(fā)明可以利用多種類型的信號(hào)特征，包括熒光、散射光、光偏振、化學(xué)發(fā)光和放射性。發(fā)信號(hào)部分與利用多種信號(hào)特征的檢測(cè)流程的實(shí)例如下文所述。在一個(gè)信號(hào)特征內(nèi)可以有多個(gè)信號(hào)分類。例如，如果該信號(hào)特征為熒光，則該信號(hào)分類包括了多種特征發(fā)射光譜(如紅色熒光、綠色熒光和藍(lán)色熒光)。其它實(shí)例中，假設(shè)紅色熒光微粒是經(jīng)由不同濃度的相同熒光團(tuán)而著色的。該情況中，熒光即信號(hào)特征，但不同強(qiáng)度的顆粒構(gòu)成了多個(gè)種類的信號(hào)特征，即熒光強(qiáng)度是可以將一個(gè)顆粒群體與其它顆粒群體區(qū)分開(kāi)來(lái)的信號(hào)特征的特性。
下述實(shí)例說(shuō)明了可結(jié)合本發(fā)明應(yīng)用的多種發(fā)信號(hào)部分。發(fā)信號(hào)部分可以包括單純的熒光團(tuán)、正調(diào)節(jié)磷光體、天然熒光蛋白質(zhì)(如綠色熒光蛋白及其相關(guān)物)、染料、酶底物體系(產(chǎn)生變色或化學(xué)發(fā)光)、熒光微粒、光散射顆粒、磁性顆?；驘o(wú)線電發(fā)射微裝置。
對(duì)發(fā)展某些可檢測(cè)多種類型靶細(xì)胞的試驗(yàn)(即具有高的種類復(fù)雜度的實(shí)驗(yàn))而言，獲得高的信號(hào)復(fù)雜度是關(guān)鍵的。
獲得高信號(hào)復(fù)雜度混合物中的可區(qū)分標(biāo)記(或發(fā)信號(hào)部分)的數(shù)量被稱為信號(hào)復(fù)雜度。就高度多元試驗(yàn)而言，采用具有高信號(hào)復(fù)雜度的發(fā)信號(hào)部分有時(shí)候是有利的?？蛇B同本發(fā)明應(yīng)用以獲得高信號(hào)復(fù)雜度的的三種普遍方法為(1)獨(dú)特標(biāo)記，(2)組合標(biāo)記，以及(3)比例標(biāo)記。
1.就獨(dú)特標(biāo)記而言，使不同探針家族的探針與單個(gè)發(fā)信號(hào)部分相連，其中該單個(gè)發(fā)信號(hào)部分可以在該實(shí)驗(yàn)所有其它發(fā)信號(hào)部分存在的條件下被輕易地檢測(cè)到。迄今，實(shí)現(xiàn)高信號(hào)復(fù)雜度的獨(dú)特標(biāo)記仍然是困難的。該難點(diǎn)的存在是由于大部分標(biāo)記方法采用了光學(xué)信號(hào)(如生色、熒光、化學(xué)發(fā)光)或放射性標(biāo)記，并且由于光學(xué)信號(hào)的光譜帶寬，以及通過(guò)現(xiàn)有設(shè)備可檢測(cè)信號(hào)的有限范圍，均使得利用光學(xué)信號(hào)可分辨的信號(hào)復(fù)雜度相當(dāng)少。例如，目前，分辨具有獨(dú)特發(fā)射光譜的許多熒光團(tuán)是不可能的，因?yàn)槠渌哂械墓庾V是重疊的。
2.本發(fā)明所采用獲得高信號(hào)復(fù)雜度的另一條途徑是應(yīng)用組合標(biāo)記方法。組合標(biāo)記是一種利用相對(duì)少量的獨(dú)特發(fā)信號(hào)部分實(shí)現(xiàn)高信號(hào)復(fù)雜度的技術(shù)。采用該方法，是使獨(dú)特組合的發(fā)信號(hào)部分與不同目標(biāo)結(jié)合。目前，就分子診斷學(xué)而言，熒光團(tuán)是采用較多的一類信號(hào)部分。不過(guò)，考慮到在對(duì)多重獨(dú)特?zé)晒鈭F(tuán)的分析中所涉及的復(fù)雜因素(存在于激發(fā)光譜與發(fā)射光譜重疊的大部分光譜中)，目前可行的只是組合大約七種或更少的常規(guī)熒光團(tuán)。不過(guò)，組合中采用的七種熒光團(tuán)可以被用于產(chǎn)生127種獨(dú)特信號(hào)(N個(gè)熒光團(tuán)產(chǎn)生2N-1種組合)。通過(guò)利用其它類型的發(fā)信號(hào)部分進(jìn)行組合標(biāo)記也可以實(shí)現(xiàn)高的信號(hào)復(fù)雜度。例如，該方法可以利用含有不同染料的顆粒、屬于不同不連續(xù)尺寸等級(jí)的顆粒，或發(fā)射獨(dú)特?zé)o線電信號(hào)的發(fā)射應(yīng)答器。目前，采用熒光團(tuán)的組合標(biāo)記已被成功地應(yīng)用于人類染色體核型分析(Speicher等，1996，同上；Schrck等，1996，同上)。用于分析組合標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的設(shè)備及軟件是可商業(yè)提供的。
3.采用比例標(biāo)記方法也可以獲得高信號(hào)復(fù)雜度(Fulton等，1997，同上)。同組合標(biāo)記一樣，比例標(biāo)記也是采用相對(duì)少量的獨(dú)特發(fā)信號(hào)元產(chǎn)生多種獨(dú)特類型的發(fā)信號(hào)部分。不過(guò)，與組合標(biāo)記相比，比例標(biāo)記中的發(fā)信號(hào)部分是通過(guò)發(fā)信號(hào)元的比例得以區(qū)分的。例如，可以采用兩種具有不同激發(fā)/發(fā)射特征的熒光團(tuán)，X和Y以使聚苯乙烯顆粒著色。應(yīng)用不同相對(duì)濃度的熒光團(tuán)([X]、[Y])區(qū)分幾組顆粒。例如，可以采用8個(gè)不同濃度的X和8個(gè)不同濃度的Y使所有組合(X1Y1、X1Y2、X8Y7、X8Y8)中的顆粒著色，便產(chǎn)生64種可區(qū)分顆粒。比例標(biāo)記簡(jiǎn)化了使用儀器，因?yàn)槠鋬H需利用少量的信號(hào)類型。采用比例標(biāo)記方法，也可以利用除了熒光團(tuán)以外，而包括非光學(xué)信號(hào)元在內(nèi)的信號(hào)元以產(chǎn)生高信號(hào)復(fù)雜度。
產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)以利于檢測(cè)微集落當(dāng)然，所需的信號(hào)強(qiáng)度水平取決于信號(hào)特征的類型，以及檢測(cè)方法/使用儀器(見(jiàn)下文)。
可以采用標(biāo)記種類結(jié)合分子的多種方法實(shí)現(xiàn)必需的靈敏度。一種最優(yōu)化信號(hào)強(qiáng)度的方法是采用高熒光性的發(fā)信號(hào)部分標(biāo)記目標(biāo)分子。例如，量子點(diǎn)、熒光染色納米球和聚合熒光團(tuán)分子均可以產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào)。將大量信號(hào)元合并可以提高發(fā)信號(hào)部分的熒光強(qiáng)度。例如，熒光納米球(～20nm直徑；Molecular Probes)可以產(chǎn)生相當(dāng)于大約180個(gè)熒光素分子的信號(hào)。熒光染色聚苯乙烯微粒(如1μm直徑)可以整合數(shù)百萬(wàn)個(gè)熒光團(tuán)發(fā)信號(hào)元。將多個(gè)熒光團(tuán)整合進(jìn)與核酸種類結(jié)合分子相聯(lián)的信號(hào)部分的方法是，在克隆的種類特異序列的PCR擴(kuò)增期間，整合進(jìn)熒光團(tuán)-dNTP結(jié)合物。將多個(gè)熒光團(tuán)整合進(jìn)核酸種類結(jié)合分子的可選方法包括采用樹(shù)狀聚合物、分支DNA、或者與多個(gè)信號(hào)部分結(jié)合的滾環(huán)模板、或者連有大量聚合熒光團(tuán)標(biāo)記的核苷酸的方法。使種類結(jié)合分子與多個(gè)發(fā)信號(hào)部分結(jié)合也可以增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度。例如，通過(guò)使大量發(fā)信號(hào)酶(如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶)與納米顆粒結(jié)合，也可以實(shí)現(xiàn)信號(hào)擴(kuò)增。
獲得強(qiáng)信號(hào)的另一種方法是使每個(gè)細(xì)胞結(jié)合大量標(biāo)記的種類結(jié)合分子。該結(jié)合可以通過(guò)多種方式實(shí)現(xiàn)，包括采用多個(gè)種類結(jié)合分子(在相同靶細(xì)胞中識(shí)別多個(gè)種類特異結(jié)合位點(diǎn))或通過(guò)選擇與靶細(xì)胞中高度表達(dá)的靶分子結(jié)合的種類結(jié)合分子。例如，通過(guò)使大量獨(dú)特抗原決定部位結(jié)合在微生物靶細(xì)胞上，標(biāo)記的微生物特異多克隆抗體可以獲得高信號(hào)強(qiáng)度。以前，頻繁采用的是選擇大量存在于每個(gè)靶細(xì)胞中的種類特異結(jié)合位點(diǎn)的方法。該方法的實(shí)例包括采用用于核糖體RNA的核酸探針(根據(jù)目標(biāo)生物體和細(xì)胞類型，可以存在于每個(gè)細(xì)胞上千個(gè)拷貝中)。同樣，某些抗原靶分子存在于目標(biāo)生物體每個(gè)細(xì)胞的數(shù)百或數(shù)千個(gè)拷貝中。本發(fā)明可以利用這兩種方法。另一個(gè)實(shí)例是，當(dāng)采用核酸結(jié)合熒光染料Syber Green I作為種類結(jié)合分子/發(fā)信號(hào)部分時(shí)，大量存在于細(xì)菌中的種類特異結(jié)合位點(diǎn)便可以產(chǎn)生高的信號(hào)強(qiáng)度。
使大量信號(hào)部分與靶細(xì)胞結(jié)合不僅可以提高信號(hào)強(qiáng)度，還使本發(fā)明具有可靠性，因?yàn)樵诎屑?xì)胞不存在的情況下下，觀測(cè)到具有預(yù)期復(fù)合信號(hào)標(biāo)記的許多簇大量發(fā)信號(hào)部分的機(jī)會(huì)是很少的。
使發(fā)信號(hào)部分與種類結(jié)合分子結(jié)合本發(fā)明可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法(見(jiàn)例如Hermanson，G.，Bioconjugate Techniques(Academic Press，1996)以及下述特定實(shí)例)將可直接與種類結(jié)合分子結(jié)合的多種類型發(fā)信號(hào)部分整合。例如，抗體或寡核苷酸種類結(jié)合分子可直接與熒光團(tuán)或量子點(diǎn)發(fā)信號(hào)部分結(jié)合。可選地，可以采用抗體或寡核苷酸種類結(jié)合分子包被熒光微粒基底，或光散射納米顆粒基底的發(fā)信號(hào)部分。發(fā)信號(hào)部分可以間接地與種類結(jié)合分子結(jié)合。例如，抗生物素蛋白可直接與多個(gè)信號(hào)元結(jié)合，構(gòu)成一個(gè)發(fā)信號(hào)部分。繼而該標(biāo)記的抗生物素分子可與生物素化的種類特異抗體結(jié)合。在該結(jié)合步驟之前、期間或之后，發(fā)信號(hào)部分均可以被結(jié)合到該種類結(jié)合分子上。例如，本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，可采用異羥基洋地黃毒甙元標(biāo)記的核酸探針作為種類結(jié)合分子。種類結(jié)合分子與樣本靶細(xì)胞中的種類特異結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合之后，將未結(jié)合的探針洗滌除去。繼而使抗異羥基洋地黃毒甙元抗體堿性磷酸酶結(jié)合物(發(fā)信號(hào)部分)與已結(jié)合的異羥基洋地黃毒甙元標(biāo)記的探針結(jié)合。繼而將堿性磷酸酶底物(如化學(xué)發(fā)光底物CDP-Star；NEN)添加到已結(jié)合的堿性磷酸酶中以產(chǎn)生信號(hào)。
步驟2使細(xì)胞目標(biāo)物沉積在檢測(cè)范圍內(nèi)在基于本發(fā)明的應(yīng)用中，第二步通常是使樣本中的靶細(xì)胞沉積在檢測(cè)范圍內(nèi)。通常采用基本上平的檢測(cè)區(qū)，因?yàn)樵谀撤N程度上，光學(xué)成像系統(tǒng)可以有效地收集來(lái)自薄檢測(cè)區(qū)的光(即具有小深度視野的光學(xué)系統(tǒng))，例如當(dāng)微集落生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，或者生長(zhǎng)在覆于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面的膜上時(shí)。這些情況中，與檢測(cè)區(qū)的側(cè)向尺寸相比，檢測(cè)區(qū)的深度可以被忽略不計(jì)。該步驟也可被用于選擇性地沉積某種靶細(xì)胞，除去可能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，或者使靶細(xì)胞與標(biāo)記試劑接觸。
利用膜過(guò)濾使細(xì)胞沉積在基本上平的膜檢測(cè)表面具有若干優(yōu)勢(shì)。利用膜過(guò)濾的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是其可以從大樣本體積收集少量靶細(xì)胞的能力。例如，1升水中的單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞可以迅速且有效地沉積在標(biāo)準(zhǔn)過(guò)濾膜的表面上。水可以自由通過(guò)膜，而細(xì)胞則因?yàn)槟た壮叽绮荒芡ㄟ^(guò)。將水樣倒入一種底部已形成膜的容器內(nèi)，繼而使膜底部表面真空。水流經(jīng)膜的同時(shí)，細(xì)胞仍停留在膜表面上。采用液體任選地洗滌該膜，以有效地除去諸如生長(zhǎng)抑制物的物質(zhì)，或者使細(xì)胞暴露于標(biāo)記試劑。繼而可以將該膜置于生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。
使靶細(xì)胞沉積于表面的其它方法包括離心、重力沉降、磁選擇或者與表面已結(jié)合的種類結(jié)合分子結(jié)合(如捕獲抗體)。某些情況(如磁分離)中，采用的是獨(dú)特部分，即選擇部分。包被有種類特異抗體的磁性微粒是該選擇部分的一個(gè)實(shí)例。靶細(xì)胞與抗體包被的磁性顆粒結(jié)合之后，利用磁場(chǎng)使磁標(biāo)記細(xì)胞沉積在檢測(cè)表面上。同樣，可以采用包被有目標(biāo)特異抗體的致密微粒作為選擇部分。該情況中，是通過(guò)重力對(duì)該致密顆粒的作用使標(biāo)記細(xì)胞沉積在檢測(cè)表面上。
步驟3使細(xì)胞復(fù)制以形成微集落該步驟中，通過(guò)在檢測(cè)區(qū)適當(dāng)位置上進(jìn)行分裂，靶細(xì)胞形成了微集落。微集落的生長(zhǎng)是通過(guò)將細(xì)胞暴露于含營(yíng)養(yǎng)物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并在可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的條件下進(jìn)行培養(yǎng)而得以實(shí)現(xiàn)的(上文步驟1中選定了這些參數(shù))。一種典型實(shí)施方案中，細(xì)胞沉積在多孔膜濾器上。將該濾膜置于培養(yǎng)皿內(nèi)凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基表面上，繼而蓋上培養(yǎng)皿，并將其放在處于適當(dāng)溫度的培養(yǎng)箱中。目前，該方法被廣泛地用于支持利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法進(jìn)行的集落生長(zhǎng)，因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以通過(guò)膜自由擴(kuò)散，而不會(huì)使祖細(xì)胞來(lái)源的子細(xì)胞移動(dòng)?？蛇x地，微集落可以直接生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或等效物的表面上。
也可以在微集落生長(zhǎng)步驟中對(duì)靶細(xì)胞特異生長(zhǎng)進(jìn)行選擇。例如，可能將一個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于檢測(cè)樣本中的厭氧細(xì)菌(例如，對(duì)可注射藥物成品的檢驗(yàn)而言，這種實(shí)驗(yàn)通常是必需的)。該情況中，生長(zhǎng)步驟可以在鐘形罐內(nèi)的厭氧環(huán)境下進(jìn)行。該步驟中也可采用選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基以實(shí)現(xiàn)選擇性微生物生長(zhǎng)。為檢測(cè)細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性，例如，通常在不同濃度的多種抗生素存在條件下培育細(xì)胞。如果在某一濃度的抗生素存在和缺乏條件下，細(xì)菌菌株的生長(zhǎng)是可比較的，便可推斷該細(xì)菌菌株對(duì)這一濃度抗生素的抗性。
本發(fā)明可以檢測(cè)多種集落形態(tài)。多種類型的生長(zhǎng)細(xì)胞在相同底物(營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和膜)上形成單個(gè)分散的丘狀集落。其它類型的細(xì)胞則形成不規(guī)則形狀集落或絲狀集落。此外，集落形態(tài)依賴于生長(zhǎng)條件(如營(yíng)養(yǎng)、溫度和底物)。某些類型細(xì)胞是游離的，根本不能形成分散集落。如果檢測(cè)這種生物的生長(zhǎng)是重要的，可以在培養(yǎng)基中添加運(yùn)動(dòng)抑制物。因此，應(yīng)選定生長(zhǎng)條件，并進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)以確保靶細(xì)胞形成可檢測(cè)的微集落。如果需要，可以改變生長(zhǎng)條件，或者可以在平行實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用多種條件。
步驟4微集落的任選標(biāo)記該任選步驟是在有利于特異結(jié)合的條件下使種類結(jié)合分子及相聯(lián)的發(fā)信號(hào)部分(也稱為探針、標(biāo)記或染色劑)與靶細(xì)胞接觸。例如，該步驟中使一個(gè)種類特異核酸序列集合雜交到樣本中的互補(bǔ)目標(biāo)序列。同樣，使樣本中的種類特異抗原與相應(yīng)的種類特異抗體結(jié)合。
就結(jié)合步驟，以及可于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行的結(jié)合而言，存在若干可能的物理配置方法。例如，在使靶細(xì)胞沉積在檢測(cè)區(qū)之前，可以在液體樣本中標(biāo)記靶細(xì)胞。繼而在沉積步驟期間或者通過(guò)洗滌，可以有效地除去未結(jié)合的探針。該方法的一個(gè)缺點(diǎn)是信號(hào)通常不隨著微生物生長(zhǎng)而增加。較強(qiáng)的信號(hào)通常是通過(guò)在微生物生長(zhǎng)期間或之后標(biāo)記微集落而獲得的?？梢栽跔I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中添加標(biāo)記試劑，以使微生物可以在生長(zhǎng)期間連續(xù)地暴露于該試劑。可選地，可以在生長(zhǎng)之后使微集落暴露于探針。例如，通?？梢酝ㄟ^(guò)干燥、加熱和/或暴露于化學(xué)試劑(如NaOH或氯仿蒸氣)，固定膜上的微集落，并且暴露相應(yīng)的種類特異結(jié)合位點(diǎn)。繼而可以通過(guò)采用標(biāo)記試劑覆蓋微集落，或者通過(guò)將膜置于含有該標(biāo)記試劑的墊上，從而實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。通常，需采用洗滌步驟以除去未結(jié)合的試劑。為實(shí)現(xiàn)快速結(jié)合動(dòng)力學(xué)，需要最優(yōu)化種類結(jié)合分子的濃度。針對(duì)特異結(jié)合所選擇的選定條件取決于種類結(jié)合分子的特征，以及其與目標(biāo)分子的相互作用。下述實(shí)例描述了特定條件和操作。
步驟5計(jì)數(shù)微集落檢驗(yàn)基于本發(fā)明的應(yīng)用的最后一步是計(jì)數(shù)樣本中的靶細(xì)胞。該計(jì)數(shù)步驟本身包括成像、圖象分析和產(chǎn)生報(bào)告的步驟。
本發(fā)明可以無(wú)需放大地檢測(cè)微觀集落。低放大倍數(shù)成像有利于大范圍成像，反過(guò)來(lái)也有利于觀測(cè)大樣本。本發(fā)明的某些實(shí)施方案在某種程度上是通過(guò)利用高效光學(xué)元件，引導(dǎo)微集落發(fā)射的光子投射進(jìn)光電檢測(cè)器陣列的少量像素中，從而無(wú)需放大地檢測(cè)微觀集落。
采用的成像方法取決于步驟1所選定的信號(hào)產(chǎn)生類型。例如，根據(jù)光學(xué)特性或者用于產(chǎn)生信號(hào)的發(fā)信號(hào)特征，成像方法是不同的。對(duì)某些信號(hào)特征(如反射率、熒光性、光散射、吸光度)而言，必須通過(guò)光源照亮檢測(cè)區(qū)中的復(fù)合物。就其它信號(hào)特征(如化學(xué)發(fā)光、熱輻射)而言，則無(wú)需照明?？梢岳枚喾N檢測(cè)器，包括電子光電檢測(cè)器、底片及直接目測(cè)。
個(gè)體微集落的檢測(cè)本身是定量且超靈敏的。通過(guò)在照相或數(shù)碼圖象中計(jì)數(shù)個(gè)體細(xì)胞，或者利用自動(dòng)圖象分析數(shù)字化圖象，可以人工實(shí)現(xiàn)定量化。累計(jì)整個(gè)樣本的信號(hào)強(qiáng)度也可以量化靶細(xì)胞。對(duì)含有高濃度靶細(xì)胞的樣本而言，信號(hào)集成尤其有用。這些情況中，分辨重合信號(hào)往往是不可能的。
對(duì)標(biāo)記探針家族信號(hào)的解碼實(shí)現(xiàn)了對(duì)諸多種類靶細(xì)胞的鑒定。該步驟的一個(gè)重要目標(biāo)是通過(guò)確定附著樣本的標(biāo)記種類結(jié)合分子的信號(hào)，從而鑒定樣本中靶細(xì)胞的種類。
當(dāng)以熒光為信號(hào)特征時(shí)，大范圍成像所采用的可用裝置是圖3所示以CCD照像機(jī)為基礎(chǔ)的成像儀。該裝置被用于收集下述若干實(shí)例中的數(shù)據(jù)。通過(guò)將來(lái)自高強(qiáng)度白光源(1000W氙弧燈，Model A-6000，Photon Technology Incorporated，Monmouth J unction，NJ)的光導(dǎo)入液體光導(dǎo)(5mm內(nèi)徑，Model 380，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)，便可提供激發(fā)光。該液體光導(dǎo)將光傳導(dǎo)進(jìn)激發(fā)濾光輪(BioPoint FW，Ludl Electronics，Hawthorne，NY)，并引導(dǎo)過(guò)濾的光束(如9mm或更大直徑)投射在含有微集落的檢測(cè)表面上。該設(shè)備可以檢測(cè)位于多種配置條件中的微集落(如在營(yíng)養(yǎng)瓊脂、顯微鏡載玻片、蓋玻片、或具有光學(xué)透明平底的管或孔的表面上；或者固定在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或其它物質(zhì)中)。入射光投射在檢測(cè)表面，引發(fā)靶細(xì)胞中的熒光。通過(guò)高效收集透鏡系統(tǒng)收集一部分發(fā)射的熒光，并經(jīng)過(guò)發(fā)射濾光輪(BioPoint FW，Ludl Electronics)將其引導(dǎo)至CCD照像機(jī)(Orca II，Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。該光學(xué)聯(lián)動(dòng)裝置的設(shè)計(jì)及構(gòu)造是基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的原理和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。
本發(fā)明也可以整合其它類型的光電檢測(cè)器和其它配置?？梢酝ㄟ^(guò)選擇更為靈敏的照像機(jī)(如被冷卻至低溫的照像機(jī)，或者采用薄型背照式芯片的照像機(jī))提高成像系統(tǒng)的靈敏度。可選地，可以通過(guò)利用行掃描系統(tǒng)(如BT Image Array；Hamamatsu)提高檢測(cè)靈敏度和分辨率。對(duì)行掃描而言，采用了線性CCD或光電二極管陣列(如1×500或1×1000個(gè)像素)以捕捉圖象。一維中的分辨率對(duì)應(yīng)的是陣列元素?cái)?shù)量，而二維圖象的捕捉通常是通過(guò)垂直移動(dòng)線性陣列下的樣本載玻片而實(shí)現(xiàn)的。由于元件較少，類似靈敏度的線性陣列典型地沒(méi)有區(qū)域形式的CCD照像機(jī)昂貴。
圖3圖解的設(shè)備通過(guò)利用X-Y定位鏡臺(tái)(BioPoint XY，LudlElectronics)，在激發(fā)和收集光學(xué)元件上移動(dòng)樣本容器(如微量滴定板)，方便了對(duì)多個(gè)樣本的信號(hào)檢測(cè)。Image-Pro和Image-Pro add-ins控制了所有設(shè)備組成及圖象獲得。濾光輪由ScopePro add-in(MediaCybernetics，Baltimore MD)控制，StagePro add-in(Media Cybernetics，Baltimore MD)操縱了鏡臺(tái)定位，而照像機(jī)控制是通過(guò)Hamamatsu OrcaII driver(Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。也采用了Image-Pro Pluse加工圖象并如下述進(jìn)行分析。
本發(fā)明采用白光照明的實(shí)施方案利用了濾譜器以提供針對(duì)每個(gè)熒光團(tuán)的最佳激發(fā)峰。白光的光譜寬，使得可以選擇多種熒光團(tuán)以消除發(fā)射光譜重疊現(xiàn)象。采用白光照明器可獲得的典型斑點(diǎn)尺寸，如2mm～5mm，對(duì)大范圍成像而言均是合適的。由于濾波改變相對(duì)簡(jiǎn)單，可以自動(dòng)化，并且白光系統(tǒng)非常適用，因此可以采用相同設(shè)備檢驗(yàn)采用特定組熒光團(tuán)的情況。
圖3所示系統(tǒng)的收集效率的最大化是通過(guò)采用一個(gè)定制設(shè)計(jì)的由兩個(gè)部分收集物鏡和調(diào)焦元件組成的收集光學(xué)裝置而得以實(shí)現(xiàn)。該收集物鏡具有高的收集效率(≥f#/1.2)并且可以輸出相對(duì)準(zhǔn)直射的光束。調(diào)焦透鏡捕捉由該收集物鏡輸出的光，并將其聚焦在CCD的檢測(cè)表面上。該光學(xué)裝置被設(shè)計(jì)為兩部分，以便在收集透鏡的光程內(nèi)插入一個(gè)濾光輪。就本發(fā)明某些實(shí)施方案而言，例如某些無(wú)需濾波變化的實(shí)施方案，包括一個(gè)錐形光導(dǎo)纖維束以獲得高收集效率可能是理想的。光導(dǎo)纖維束所包含的光纖可以收集最接近樣本的光，并將光直接引導(dǎo)至CCD芯片?？蛇x地，本發(fā)明可以利用直接接近檢測(cè)法非常靈敏地檢測(cè)信號(hào)，其中樣本被直接疊置在CCD芯片或鄰近位置上(以實(shí)現(xiàn)對(duì)薄型背照式CCD芯片的最高靈敏度)。
除了上述的白光、多重光譜系統(tǒng)以外，我們也發(fā)展了簡(jiǎn)易的單色熒光成像系統(tǒng)用于非放大性大范圍成像。圖4所示系統(tǒng)中，激發(fā)光是由532nm雙頻二極管激光器(50mW，Model#BWT-50E，B&W Tek，Newark，DE)提供的。由于該檢測(cè)采用單色，因此濾光輪并非必需。單個(gè)激發(fā)濾光器(Model HQ532/10x，Chroma Technology，Brattleboro，VT)除去來(lái)自激光輸出的諧波，單個(gè)發(fā)射濾光器(Model HQ620/60m，Chroma Technology，Brattleboro，VT)則使只有特定熒光信號(hào)才可以通過(guò)并到達(dá)CCD照像機(jī)。該系統(tǒng)也采用了沒(méi)有前述CCD照像機(jī)昂貴的一種CCD照像機(jī)(Model KX-2E，Apogee CCD，Auburn，CA)以捕捉圖象。通過(guò)合并多重激光發(fā)射器和濾光器裝置，可以容易地使該設(shè)備適于進(jìn)行多色分析。
本發(fā)明所合并的CCD照像機(jī)通常被冷卻至-5℃～-50℃，該溫度對(duì)10秒到大約2分鐘(取決于照像機(jī)靈敏度)的集成時(shí)間而言已經(jīng)足夠，并具有最小的內(nèi)成像雜波。通過(guò)持續(xù)收集熒光團(tuán)所發(fā)射的光子一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間段，使得集成時(shí)間越長(zhǎng)，通常所獲的靈敏度越高。長(zhǎng)的集成時(shí)間對(duì)行掃描而言是不合適的；不過(guò)，可以利用具有非常高量子效率的薄型背照式線性陣列，以提高靈敏度。
本發(fā)明也可以采用基于干涉儀的光譜成像，以檢測(cè)并解碼信號(hào)(Schrock，E.，1997，同上)。利用該技術(shù)，由發(fā)信號(hào)部分發(fā)射或散射的光被分為兩路，通過(guò)棱鏡(以使不同波長(zhǎng)傳播不同距離)，并使其重組以創(chuàng)建一個(gè)干擾圖形。經(jīng)過(guò)對(duì)該干擾圖形的傅里葉分析，便產(chǎn)生一個(gè)對(duì)應(yīng)該圖象中每一點(diǎn)的光譜。
可選地，可以采用照相底片經(jīng)濟(jì)地記錄樣本中的靶細(xì)胞圖象。當(dāng)發(fā)信號(hào)特征為化學(xué)發(fā)光時(shí)，該方法最容易實(shí)施。可以在商用掃描儀中使底片上收集的圖象數(shù)字化，以存儲(chǔ)數(shù)據(jù)和分析數(shù)字圖象。
對(duì)本發(fā)明產(chǎn)生數(shù)字圖象的實(shí)施方案而言，是采用計(jì)算機(jī)軟件鑒定并量化目標(biāo)微集落。對(duì)采用不同種類熒光發(fā)信號(hào)部分的典型實(shí)驗(yàn)而言，軟件將合適的熒光團(tuán)特異圖象疊加，通過(guò)確定每個(gè)目標(biāo)微集落發(fā)射的信號(hào)或組合信號(hào)以鑒定靶細(xì)胞，并計(jì)數(shù)樣本中存在的每種目標(biāo)微集落。該軟件也可以(1)糾正照明不均勻；(2)通過(guò)反卷積矩陣糾正熒光交叉；(3)用印在底片上的記錄標(biāo)記排列圖像)(4)比較不同時(shí)間點(diǎn)的圖象；(5)應(yīng)用算法以辨別生長(zhǎng)中的微集落與非生長(zhǎng)中的微集落；(6)基于與查詢表的比較，為樣本中每個(gè)成像微集落分配ID編碼；(7)記錄成像樣本條形碼用于鑒定樣本；以及(8)自動(dòng)將輸出數(shù)據(jù)、圖象及條形碼保存在可以借助，例如網(wǎng)絡(luò)瀏覽器接口查詢的數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)。商業(yè)可提供的圖象分析包可以提供這些功能。也可以采用多色圖象分析所用的軟件包(如Image-Pro，Media Cybernetics；MetaMorph，Universal Imaging；MatLab；The Math Works)。
在此處略述該軟件包以及分析下述多個(gè)實(shí)例中所收集的熒光數(shù)據(jù)的方法是有用的。使檢測(cè)表面成像，以確定熒光目標(biāo)的數(shù)量和/或總熒光信號(hào)。通過(guò)CCD照像機(jī)從膜上捕捉熒光，并將其保存為TIFF(Tagged Image File Format)圖象文件，該文件包含像素位點(diǎn)及強(qiáng)度的記錄。采用三種方法量化分析結(jié)果。通過(guò)合計(jì)所有像素的熒光信號(hào)可以確定成像檢測(cè)區(qū)的總集成信號(hào)。比較樣本來(lái)源的集成信號(hào)和陰性對(duì)照來(lái)源的集成信號(hào)。對(duì)含有大量靶細(xì)胞的樣本而言，測(cè)定其總集成信號(hào)是尤其有用的。第二種方法是計(jì)數(shù)檢測(cè)區(qū)內(nèi)的熒光目標(biāo)。第三種方法是累計(jì)熒光目標(biāo)所包含所有像素的強(qiáng)度(與總計(jì)圖象中所有像素強(qiáng)度相反)。所有圖象分析均是采用Image-Pro v4.0(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)進(jìn)行的。
通過(guò)最初定義膜上的區(qū)域(感興趣的區(qū)域)可以實(shí)現(xiàn)總集成信號(hào)的獲得。Image-Pro可以將感興趣的區(qū)域轉(zhuǎn)換為單個(gè)目標(biāo)，其它Image-Pro工具則可以總計(jì)該目標(biāo)中所顯示的像素總信號(hào)。繼而以相同方式分析來(lái)源自未添加靶細(xì)胞的膜的類似圖象，以其作為陰性對(duì)照。從含有樣本的目標(biāo)的值減去將該陰性對(duì)照的值。該扣除同時(shí)除去了分析和電子儀器帶來(lái)的雜波。
第二種和第三種定量方法采用了Image-Pro的目標(biāo)搜尋程序。該程序匯集了值(信號(hào))大于自動(dòng)或用戶定義的閾值的相鄰像素。建立了目標(biāo)的周邊輪廓線。周邊像素及其內(nèi)部的像素被定義為目標(biāo)，總計(jì)這些像素值，便獲得目標(biāo)的集成值。繼而利用該分析軟件計(jì)數(shù)感興趣范圍內(nèi)的所有目標(biāo)，其中該感興趣范圍表現(xiàn)為樣本容器的底部，另外，該分析軟件也可用于推算已發(fā)現(xiàn)的所有目標(biāo)的集成信號(hào)強(qiáng)度。
利用IPP Image-Pro宏語(yǔ)言，上述程序可以自動(dòng)地同時(shí)對(duì)若干圖象進(jìn)行批處理。另外，采用用戶定義的其它IPP scripts也可以處理數(shù)據(jù)。例如，將某一尺寸(面積)或強(qiáng)度之下或之上的目標(biāo)包括在內(nèi)或排除在外，對(duì)排除灰塵而言，將是一種有效的工具，對(duì)用于確定目標(biāo)定義的圖象分析而言，其它重要參數(shù)是根據(jù)應(yīng)用的不同而變化的，并且應(yīng)該進(jìn)行相應(yīng)的最優(yōu)化。
本發(fā)明的多個(gè)方面均可以自動(dòng)化，包括將上文略述的步驟串聯(lián)。假設(shè)一個(gè)應(yīng)用是分析液體樣本，如注射用藥水或臨床尿樣。該自動(dòng)系統(tǒng)，是從收集燒杯內(nèi)的樣本開(kāi)始，可以通過(guò)過(guò)濾使靶細(xì)胞沉積于膜上，并將其置于生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，于生長(zhǎng)條件下培育靶細(xì)胞，有規(guī)律地定期使膜成像，并報(bào)告結(jié)果?？蛇x地，本發(fā)明的單項(xiàng)功能也可自動(dòng)化。例如，用于將培養(yǎng)皿(或其它用于微生物生長(zhǎng)的一次性耗材)自動(dòng)加載進(jìn)或卸載出成像設(shè)備的模塊，以及用于自動(dòng)調(diào)焦的模塊均可以被合并入體系內(nèi)。
實(shí)施例.下述實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制，它們提供了實(shí)施與一系列應(yīng)用相關(guān)的本發(fā)明不同實(shí)施方案的技術(shù)細(xì)節(jié)。
實(shí)施例1.利用非放大性大范圍成像進(jìn)行細(xì)菌微集落的檢測(cè)與鑒定背景與目標(biāo)臨床微生物學(xué)(如細(xì)菌鑒定與抗菌敏感度檢驗(yàn))和工業(yè)微生物學(xué)(如要求的無(wú)菌度檢驗(yàn))的核心均是微生物生長(zhǎng)的檢測(cè)，但常用方法慢。在分析上必然存在延遲，在臨床情況中會(huì)引起無(wú)謂的死亡和痛苦，在工業(yè)中則需要大筆費(fèi)用。
利用非放大性大范圍成像檢測(cè)個(gè)體微集落，在利用微生物培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，避免了傳統(tǒng)及新出現(xiàn)方法的重大缺陷。利用本發(fā)明原位復(fù)制分析的優(yōu)勢(shì)是速度；易多元化(觀測(cè)超過(guò)一個(gè)的微生物)；無(wú)需犧牲微集落活力檢測(cè)和鑒定的能力(對(duì)有效抗菌敏感度檢驗(yàn)而言是必需的)。
實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)該實(shí)施例證明了本發(fā)明檢測(cè)細(xì)菌微集落原位復(fù)制的能力。該方法的原理見(jiàn)圖7所示。使細(xì)菌沉積在濾膜上，并使其進(jìn)行原位復(fù)制。以兩種方式標(biāo)記所獲的微集落采用核酸染色劑SyberGreen I，和通過(guò)結(jié)合由FITC標(biāo)記的群體特異抗體。繼而采用以基于CCD的非放大性大范圍成像檢測(cè)標(biāo)記微集落。
實(shí)驗(yàn)方法在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌MG1655細(xì)胞過(guò)夜，使其密度達(dá)到大約109個(gè)細(xì)胞/ml。通過(guò)對(duì)血球計(jì)數(shù)器中的過(guò)夜培養(yǎng)物的稀釋液進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確定細(xì)胞的大概數(shù)量。繼而稀釋該過(guò)夜培養(yǎng)物，獲得大約103個(gè)細(xì)胞/ml密度。利用真空過(guò)濾裝置和塑料漏斗杯(Millipore Microfil V User Guide，PF07114，Rev A 3/00)，使1毫升稀釋液沉積在黑色聚碳酸酯濾膜(Osmonics；cat.num.K02BP04700)上。以該方式制備16個(gè)單獨(dú)的濾膜，每個(gè)濾膜含有～1000個(gè)細(xì)胞，其中四個(gè)濾膜用于四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、1.5、3和24小時(shí))。過(guò)濾后，將每個(gè)濾膜置于含有LB生長(zhǎng)培養(yǎng)基、獨(dú)立的并已預(yù)熱至37℃的瓊脂平板上，將其置于37℃培養(yǎng)箱中。定時(shí)(0、1.5、3、24小時(shí))將四個(gè)濾膜取出培養(yǎng)箱。通過(guò)在一條已布點(diǎn)有甲醛的ParafilmTM的500μl點(diǎn)上放入濾器，沉積有細(xì)菌的一側(cè)朝上，將其中兩個(gè)濾器固定在3.0％甲醛中，保持10分鐘。固定后，將濾膜置于吸水墊上，以吸收多余的甲醛。繼而將Syber Green I(200μl，Molecular Probes)的10X溶液添加在濾膜頂部。染色細(xì)胞10分鐘。采用PBS-B將另外兩個(gè)未用于核酸染色的濾膜封閉15分鐘后，向該濾膜上添加FITC標(biāo)記的抗大腸桿菌抗體(Fitzgerald)。培育30分鐘后，將濾膜置于吸水墊上，以吸收殘余液體。繼而通過(guò)將濾膜置于以CCD為基礎(chǔ)的成像儀(詳述部分的步驟5中有所描述，并如圖3所示)上，并使細(xì)菌面對(duì)光源和CCD芯片，以使所有膜成像。
結(jié)果該實(shí)施例中，為形成微集落，需使細(xì)胞經(jīng)過(guò)復(fù)制若干代。采用Syber Green I或FITC標(biāo)記抗體標(biāo)記微集落。圖6中的上排圖片顯示的是0小時(shí)的單細(xì)胞。下排圖片顯示的是培育3小時(shí)后的微集落。由于在集落形成細(xì)胞最初所附著位點(diǎn)上的細(xì)胞數(shù)量的增加，從而通過(guò)CCD成像隨時(shí)間檢測(cè)到的目標(biāo)尺寸和信號(hào)存在實(shí)質(zhì)性的增加。對(duì)醫(yī)學(xué)和工業(yè)微生物實(shí)踐而言，生長(zhǎng)檢測(cè)是重要的。該實(shí)施例顯示本發(fā)明可以顯著縮短檢測(cè)微生物生長(zhǎng)所需的時(shí)間。
實(shí)施例2.利用非放大性大范圍成像對(duì)細(xì)菌微集落進(jìn)行的基于自身熒光的檢測(cè)背景與目標(biāo)在背景部分論述了檢測(cè)微生物生長(zhǎng)的方法的重要性，以及現(xiàn)有方法的局限性。該實(shí)施例證實(shí)基于本發(fā)明快速檢測(cè)細(xì)菌微集落生長(zhǎng)的方法是非常簡(jiǎn)單且有效的方法。該方法依賴于靶細(xì)胞的固有熒光性(自身熒光性)以產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。因此，該方法不利用種類結(jié)合分子或外源發(fā)信號(hào)部分，便可以實(shí)現(xiàn)微觀靶細(xì)胞的非放大性大范圍成像。無(wú)試劑非破壞性計(jì)數(shù)的優(yōu)勢(shì)包括可獲得純培養(yǎng)物(對(duì)微生物鑒定和抗生素敏感度檢驗(yàn)而言)、提高方法有效性、以及隨時(shí)間跟蹤微生物生長(zhǎng)的能力(目標(biāo)分辨力和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)而言))。
實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例1培育大腸桿菌MG1655細(xì)胞。采用無(wú)菌PBS系列稀釋(10倍稀釋)細(xì)菌細(xì)胞。利用真空過(guò)濾裝置和塑料漏斗杯(Millipore Microfil V User Guide，PF07114，Rev A 3/00)，使細(xì)菌細(xì)胞(50ml體積，10-7稀釋液)沉積在黑色聚碳酸酯濾器(Osmonics；cat.num.K02BP04700)上。以過(guò)濾無(wú)菌PBS的濾器作為陰性對(duì)照。過(guò)濾后，將每個(gè)濾器置于含有LB生長(zhǎng)培養(yǎng)基、獨(dú)立的并已預(yù)熱至37℃的瓊脂平板上，將其置于37℃培養(yǎng)箱中。通過(guò)過(guò)濾重復(fù)樣本，并在LB瓊脂上培育濾器，以確定10-7稀釋液中的活細(xì)胞數(shù)量。該過(guò)程顯示10-7稀釋液中每50ml約含1000個(gè)細(xì)胞。5.25小時(shí)，通過(guò)將保持在玻璃顯微鏡載玻片上的濾器置于以CCD為基礎(chǔ)的成像儀(詳述部分的步驟5中有所描述，并如圖3所示)中，并使細(xì)菌面對(duì)光源和CCD照像機(jī)，以使膜成像。采用FITC光學(xué)濾光器裝置(Chroma；激發(fā)470/40nm，發(fā)射522/40nm)并利用軟件控制(Image Pro Plus，version4:1；Media cybernetics)捕獲1秒曝光。
結(jié)果圖7顯示了5.25小時(shí)生長(zhǎng)后對(duì)細(xì)菌微集落進(jìn)行的以自身熒光為基礎(chǔ)的檢測(cè)結(jié)果。1秒曝光后，含有微集落的濾器產(chǎn)生了強(qiáng)信號(hào)(圖7，左圖)，而不含微集落的濾器，雖然經(jīng)過(guò)相同處理并成像，仍未顯示這種信號(hào)(圖7，右圖)。
該實(shí)施例證明對(duì)微生物生長(zhǎng)的檢測(cè)而言，本發(fā)明這一非常簡(jiǎn)單的實(shí)施方案是有效的方法?？梢岳迷摷夹g(shù)更為有效地制定多種重要微生物的診斷應(yīng)用，包括無(wú)菌度檢驗(yàn)、環(huán)境和水檢驗(yàn)、微生物鑒定及微生物敏感度。
實(shí)施例3.一種利用與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的內(nèi)部比較驗(yàn)證快速無(wú)試劑微生物計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)單方法背景與目標(biāo)對(duì)新方法的開(kāi)發(fā)者及其用戶而言，驗(yàn)證新的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法等效是基本任務(wù)。定型的驗(yàn)證要求條件通常被編纂在政府規(guī)定中，以指導(dǎo)新的微生物學(xué)方法在工業(yè)和保健行業(yè)中的推廣。在制藥工業(yè)中，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所用的新方法有時(shí)實(shí)施困難，是由于證明其與已接受方法等效存在難度。該實(shí)施例的目標(biāo)是驗(yàn)證一種可證明基于本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)等效的簡(jiǎn)單方法。
實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2培育并分析大腸桿菌MG1655細(xì)胞。微集落成像后，于37℃再次培育濾器大約15小時(shí)。采用由斜角照射平板的顯微鏡白熾燈所提供的反射白光對(duì)所獲大集落成像。另外，與檢測(cè)微集落自身熒光性所用系統(tǒng)相同，也采用相同成像系統(tǒng)收集該反射光。
結(jié)果通過(guò)比較圖8中的左圖和右圖，證實(shí)本發(fā)明的該實(shí)施方案明顯地未傷害微生物。通過(guò)內(nèi)部比較“祖代”微集落(左圖)與其“子代”大集落(右圖)之間的準(zhǔn)確相符程度，有利地證實(shí)該方法與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)等效。
實(shí)施例4.利用非放大性大范圍成像檢測(cè)自身熒光微集落的檢測(cè)準(zhǔn)確度及限度背景與目標(biāo)在保健和工業(yè)微生物學(xué)兩方面，少量微生物的準(zhǔn)確檢測(cè)都是重要的。例如，攜帶潛在致命血液感染物的患者的10ml血液樣本中可能僅存在1個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。同樣，在藥物生產(chǎn)中，可注射藥物的無(wú)菌度測(cè)試必須檢測(cè)到樣本中可能含有的單個(gè)活的微生物細(xì)胞。兩種情況中，假陰性結(jié)果與假陽(yáng)性結(jié)果均會(huì)造成嚴(yán)重后果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為假陽(yáng)性和假陰性的部分便定義了實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度。
該實(shí)施例的目標(biāo)是顯示本發(fā)明檢測(cè)最低水平靶細(xì)胞時(shí)的準(zhǔn)確度。
實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例3培育并分析大腸桿菌MG1655細(xì)胞。不過(guò)，對(duì)該實(shí)施例而言，是采用多級(jí)濾器(n＝101)過(guò)濾細(xì)胞的稀釋液，從而預(yù)期平均五個(gè)濾器中大約有一個(gè)濾器上的檢測(cè)區(qū)內(nèi)含有一個(gè)單個(gè)靶細(xì)胞。5小時(shí)培育完成后，使每個(gè)濾器成像，并記錄微集落的存在。繼而再次培育濾器過(guò)夜，再記錄大集落的存在。繼而比較利用本發(fā)明所獲的結(jié)果與利用傳統(tǒng)目測(cè)法所獲的結(jié)果。
結(jié)果圖9圖示了當(dāng)樣本含有極低水平靶細(xì)胞時(shí)，該實(shí)施例所采用的測(cè)定本發(fā)明準(zhǔn)確度的方法。對(duì)101個(gè)濾器中的每一個(gè)而言，通過(guò)計(jì)數(shù)微集落所獲的結(jié)果與通過(guò)傳統(tǒng)方法所獲的結(jié)果相同。如通過(guò)微集落或大集落存在所判斷的那樣，大多數(shù)濾器(n＝80)無(wú)沉積的靶細(xì)胞。此外，含有沉積的靶細(xì)胞(n＝21)的濾器，微集落出現(xiàn)的數(shù)量(若干濾器含多個(gè)靶細(xì)胞，如統(tǒng)計(jì)學(xué)所預(yù)期一樣)以及在濾器上的位置均與觀察大集落的結(jié)果相同，都為結(jié)果增加了進(jìn)一步的可信度。本發(fā)明與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法有100％的一致性，并且無(wú)假陽(yáng)性或假陰性檢測(cè)結(jié)果。因此，結(jié)果表明本發(fā)明在檢測(cè)非常低水平靶細(xì)胞時(shí)是準(zhǔn)確的。
實(shí)施例5.確定在利用無(wú)試劑非放大成像快速檢測(cè)的自身熒光細(xì)菌微集落中微生物細(xì)胞的數(shù)量背景與目標(biāo)該實(shí)施例的目標(biāo)是證實(shí)利用大范圍成像無(wú)試劑檢測(cè)微集落自身熒光性的靈敏度及速度。之所以可以快速檢測(cè)微生物生長(zhǎng)，是由于本發(fā)明具有在細(xì)胞量少時(shí)也可檢測(cè)早期微集落的能力。該實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)通過(guò)非放大CCD成像確定了所檢測(cè)微集落中的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量。
實(shí)驗(yàn)方法將新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌(ATCC，Cat.No8739)單集落接種至含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基(TSB；10ml)的錐底管(50ml)內(nèi)，并進(jìn)行培育(16小時(shí)，37℃，150rpm)。含有穩(wěn)定期細(xì)胞的培養(yǎng)物(2.4×109/ml)用于接種含預(yù)熱TSB(37℃，100ml)的錐形燒瓶(500ml)，以產(chǎn)生對(duì)檢測(cè)而言時(shí)間最佳的對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物。將穩(wěn)定期培養(yǎng)物(100μl)接種至含有預(yù)熱TSB的燒瓶中，并進(jìn)行培育(2小時(shí)、37℃、150rpm)。通過(guò)倒平板滴定法發(fā)現(xiàn)，以該方式獲得的培養(yǎng)物含有～5×107個(gè)細(xì)菌/ml。將對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物稀釋在PBS中(10-6)。利用過(guò)濾裝置(Millipore Inc.，1225 Sampling Manifold，Cat.No.XX27025 50)，通過(guò)架在一個(gè)吸水墊(Whatman Inc.，Cat.No.1441325)上的膜(Chemunex Inc.，Chemfilter CB0.4，Black，PET-23，25mm)過(guò)濾一體積(10ml)的稀釋液。將細(xì)菌收集在膜上后，將該膜置于預(yù)熱(32.5℃)過(guò)的TSA平板上。通過(guò)采用FITC光學(xué)濾光器裝置(Chroma；激發(fā)470/40nm，發(fā)射522/40nm)以及軟件控制(Image Pro Plus，MediaCybernetics)的非放大性大范圍成像捕捉(30秒曝光)平板圖象。捕捉到初始圖象后，將該平板置于培養(yǎng)箱(32.5℃)內(nèi)進(jìn)行培育。2.5小時(shí)的生長(zhǎng)后，從培養(yǎng)箱取出平板，并利用之前應(yīng)用的圖象捕捉裝置使相同區(qū)域再次成像。捕捉圖象之后，立即固定膜(于含有1.5％甲醛經(jīng)過(guò)過(guò)濾的1型水中5分鐘)，之后將膜洗滌兩次(PBS，每次5分鐘)，再將膜置于含有上述固定或洗滌溶液的3M Whatman紙上。將膜放在取樣支管上，該支管只有一個(gè)位置未用塞子密封。進(jìn)行真空過(guò)濾15秒。為計(jì)數(shù)單個(gè)微集落中的細(xì)菌，需將膜染色，將碘化丙啶(1ml，5μg/ml)添加至杯壁內(nèi)，同時(shí)加以真空壓力，繼而添加1型水(1ml)。繼續(xù)保持真空壓力15秒后，將膜移開(kāi)并置于玻璃載玻片上，采用Pro Long Antifade Reagent(Molecular Probes，Eugene，OR，Cat.No.P-4781)干燥，并蓋上蓋玻片。利用配備有SPOT RT照像機(jī)(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI，Model No.2.3.1，2秒，僅選擇紅色光譜)的熒光顯微鏡(Axioplan II熒光顯微鏡，Carl，ZeissInc.，Thornwood，NY；Cy3.5 filter set，Chroma Id.No.SP-103，激發(fā)581/10nm，發(fā)射617/40nm，400x)使著色微集落成像，空間配準(zhǔn)之后，利用大范圍成像鑒定相應(yīng)的未著色微集落。
結(jié)果圖10顯示了該實(shí)施例所獲的結(jié)果。對(duì)采用本發(fā)明32.5℃下生長(zhǎng)2.5小時(shí)后所檢測(cè)到的三個(gè)微集落進(jìn)行染色，并利用高倍數(shù)顯微鏡分析。三個(gè)微集落分別含有45、48和50個(gè)細(xì)胞。在微集落附近未觀測(cè)到單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，證明經(jīng)過(guò)染色操作的微集落仍然完整。應(yīng)當(dāng)指出，大腸桿菌的可見(jiàn)集落(～1mm直徑)所含細(xì)胞數(shù)量約為上述數(shù)量的1百萬(wàn)倍。因此，利用非放大無(wú)試劑檢測(cè)，本發(fā)明可以在細(xì)胞分裂僅幾代后便檢測(cè)到微集落。
實(shí)施例6.對(duì)環(huán)境水樣中的細(xì)菌微集落進(jìn)行的基于CCD、非放大性、大范圍成像檢測(cè)與鑒定背景與目標(biāo)該實(shí)施例旨在顯示當(dāng)將本發(fā)明應(yīng)用于檢測(cè)多種可能被營(yíng)養(yǎng)抑制的環(huán)境微生物時(shí)，本發(fā)明快速檢測(cè)微生物生長(zhǎng)的能力。
水是許多藥物的生產(chǎn)、加工和配方中的常用配料。在生產(chǎn)過(guò)程中，檢測(cè)藥用水中的細(xì)菌是基本步驟，因?yàn)榧?xì)菌本身或其代謝產(chǎn)物如果存在于最終產(chǎn)品中的話，都將引起不利后果。細(xì)菌的增殖可能出現(xiàn)在產(chǎn)品的生產(chǎn)、保存和分裝過(guò)程中。飲用水是提供藥用水的來(lái)源，也是微生物污染的主要外源。糞便大腸桿菌和廣泛多種微生物、大量革蘭氏陰性細(xì)菌均可能存在于飲用水中。檢測(cè)水中細(xì)菌的常用方法慢，不利于及時(shí)的系統(tǒng)控制。
采用非放大性大范圍成像檢測(cè)個(gè)體細(xì)菌微集落顯示出體外復(fù)制分析的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)避免了傳統(tǒng)方法與新出現(xiàn)方法的重要缺點(diǎn)。采用本發(fā)明的原位復(fù)制分析的優(yōu)勢(shì)是速度以及無(wú)需犧牲微集落活力進(jìn)行檢測(cè)并鑒定的能力(有利于鑒定產(chǎn)品和加工過(guò)程中的微生物污染源，或確定特定微生物是否對(duì)應(yīng)用水的產(chǎn)品或加工過(guò)程有害)。
實(shí)驗(yàn)概述本實(shí)施例證實(shí)了本發(fā)明在集落生長(zhǎng)成為大集落之前檢測(cè)細(xì)菌微集落原位復(fù)制的能力。使細(xì)菌沉積在濾器上，并使其進(jìn)行原位復(fù)制。采用基于CCD、非放大、大范圍成像方法，利用自身熒光性(FITC激發(fā)和放射濾光器)和白光反射性檢測(cè)所獲的微集落和大集落。
實(shí)驗(yàn)方法無(wú)菌條件下從查爾斯河中采集水樣，并在采集后的1小時(shí)之內(nèi)應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)中。在設(shè)置14,000rpm的Eppendorf Centrifuge5415C中離心查爾斯河水樣1～2秒。采用無(wú)菌I型水以1∶10的比例稀釋離心后的查爾斯河水樣，并利用真空過(guò)濾裝置和無(wú)菌塑料漏斗(Millipore Microfil100ml Funnel，cat.num.MIHABG072)將1.0ml稀釋液沉積在黑色、混合纖維素酯濾器(Millipore；cat.num.HABP04700)上。將每個(gè)過(guò)濾后的濾器置于含有R2A生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Becton Dickinson/Difco；cat.num.218263)的單個(gè)瓊脂平板上。制備10個(gè)單獨(dú)的濾器，并于32.5℃培育該瓊脂平板74小時(shí)。定時(shí)(17、24、42、50、68和74小時(shí))將瓊脂平板從培養(yǎng)箱中取出，并通過(guò)把平板置于以CCD為基礎(chǔ)的成像儀上，使細(xì)菌集落面對(duì)發(fā)光源和CCD芯片，從而使濾器成像。用于反射的照明光源是由Fiber-LiteModel190 Convection Cooled 30 Watt Quartz Halogen Illuminator(Dolan-Jenner Industries，Inc.，Lawrence，MA)提供的，照明是以斜角照射在濾器上。肉眼可觀測(cè)到0.5mm或更大直徑的細(xì)菌集落，因此可以利用該尺寸標(biāo)準(zhǔn)作為細(xì)菌集落的辨別特征。鑒別0.55mm或更大直徑的集落，并于反射圖象中進(jìn)行計(jì)數(shù)。也可以確定將發(fā)育成為大集落的自身熒光微集落何時(shí)可以被檢測(cè)到。分析自身熒光圖象以確定74小時(shí)的大集落的祖代細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間。于不同時(shí)間點(diǎn)標(biāo)繪出74小時(shí)的大集落在還是自身熒光微集落時(shí)便被檢測(cè)到的百分比。
結(jié)果該實(shí)施例中，為形成微集落和大集落，需使來(lái)自水樣的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制。通過(guò)利用本發(fā)明檢測(cè)兩種類型的集落，并通過(guò)自身熒光性和反射率進(jìn)行鑒定。圖11所示數(shù)據(jù)表明可目測(cè)的集落數(shù)量從17小時(shí)的11％(6個(gè)集落)增加至74小時(shí)的100％(53個(gè)集落)。74小時(shí)大集落中的94％(50個(gè)集落)在24小時(shí)還是自身熒光微集落時(shí)便可被檢測(cè)到。該實(shí)施例顯示本發(fā)明可以顯著縮短檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)所需的時(shí)間，進(jìn)而縮短檢驗(yàn)水樣中的細(xì)菌所需的時(shí)間。
實(shí)施例7.細(xì)菌微集落的基于CCD、非放大、大范圍成像檢測(cè)與計(jì)數(shù)細(xì)菌的傳統(tǒng)方法之間的相關(guān)性背景與目標(biāo)本實(shí)施例的目標(biāo)是確定采用本發(fā)明快速檢測(cè)微集落所獲的結(jié)果與采用較慢的傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)所獲的結(jié)果之間數(shù)字的相關(guān)性。
實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)本實(shí)施例比較了分別通過(guò)本發(fā)明和傳統(tǒng)“倒平板”培養(yǎng)方法的微集落計(jì)數(shù)。使細(xì)菌沉積在濾器上，并使其進(jìn)行原位復(fù)制。采用基于CCD、非放大、大范圍成像并利用自身熒光性(FITC激發(fā)和發(fā)射濾光器)檢測(cè)所獲的微集落。繼而比較采用本發(fā)明所獲的微集落數(shù)量與采用倒平板方法所獲的大集落數(shù)量。
實(shí)驗(yàn)方法在TSB中培育大腸桿菌8739細(xì)胞過(guò)夜，使其密度約為109個(gè)細(xì)胞/ml。在PBS中對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)物進(jìn)行稀釋，獲得從大約107個(gè)細(xì)胞/ml到大約102個(gè)細(xì)胞/ml的10倍系列稀釋液。采用PBS進(jìn)一步稀釋從每個(gè)系列稀釋液取出的等份試樣，使1.0ml含有大約50個(gè)細(xì)菌。將1毫升稀釋液連同35ml融化的(47℃)胰酶豆瓊脂(TSA)(Becton Dickinson/Difco；cat.num.236950)置于培養(yǎng)皿中。于室溫冷卻該瓊脂平板，繼而于32.5℃培育平板過(guò)夜。制備10個(gè)瓊脂平板用于每個(gè)系列稀釋液。通過(guò)目測(cè)平板計(jì)數(shù)瓊脂平板中的大集落。利用真空過(guò)濾裝置和無(wú)菌塑料漏斗(Millipore Microfil100ml Funnel，cat.num.MIHABG072)將細(xì)菌稀釋液(11.3ml)沉積在黑色混合纖維素酯濾器(Millipore；cat.num.HABP04700)上。將每個(gè)濾器置于含有TSA的單個(gè)瓊脂平板上。制備10個(gè)濾器對(duì)應(yīng)每個(gè)系列稀釋液，并于32.5□培育該瓊脂平板7小時(shí)。繼而從培養(yǎng)箱中取出平板，并通過(guò)將平板置于以CCD為基礎(chǔ)的成像儀上，使細(xì)菌集落面對(duì)照明光源和CCD芯片，以使濾器成像。利用FITC激發(fā)和發(fā)射濾光器檢測(cè)來(lái)自每個(gè)微集落的自身熒光。過(guò)濾時(shí)采用多于11倍的體積是因?yàn)槊總€(gè)圖象構(gòu)成整個(gè)濾器表面的大約1/11th。因此，每個(gè)圖象應(yīng)含有的細(xì)菌數(shù)量與進(jìn)入每個(gè)倒平板中的細(xì)菌數(shù)量相同。通過(guò)目測(cè)檢查圖象以確定每個(gè)圖象中的微集落數(shù)量。通過(guò)使微集落或大集落的數(shù)量乘以一個(gè)稀釋系數(shù)，計(jì)算每個(gè)系列稀釋液中的細(xì)菌數(shù)量。
結(jié)果該實(shí)施例中，使細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，并于濾器上形成微集落或者在瓊脂平板中形成大集落。微集落是利用本發(fā)明檢測(cè)，大集落是利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和目測(cè)檢查瓊脂平板而得以檢測(cè)。相對(duì)于每個(gè)系列稀釋液，標(biāo)繪出通過(guò)每種方法所測(cè)定的細(xì)菌濃度，結(jié)果如圖12所示。每個(gè)點(diǎn)代表10次單獨(dú)測(cè)定結(jié)果的平均值。在采用本發(fā)明所獲的結(jié)果與采用傳統(tǒng)倒平板方法所獲的結(jié)果之間獲得一個(gè)正相關(guān)性。0.9996的相關(guān)系數(shù)表明在采用本發(fā)明的微集落計(jì)數(shù)和采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的大集落計(jì)數(shù)之間存在很好的線性關(guān)系。
實(shí)施例8.無(wú)試劑計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)范圍及線性背景與目標(biāo)新微生物學(xué)檢驗(yàn)方法的兩個(gè)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)為該方法的范圍及線性。該范圍是已被證實(shí)可采用新檢驗(yàn)方法精確、準(zhǔn)確、線性測(cè)定的微生物的最高和最低水平之間的區(qū)間。微生物學(xué)檢驗(yàn)方法的線性是其獲得特定結(jié)果的能力，其中該結(jié)果在給定范圍內(nèi)與存在于樣本中的微生物濃度成比例。
該實(shí)施例證明本發(fā)明在一定細(xì)菌水平范圍上的線性。本發(fā)明檢測(cè)了濾器表面上的微集落的存在，并通過(guò)利用基于CCD、非放大、大范圍成像量化微集落的自身熒光信號(hào)。
實(shí)驗(yàn)方法在TSB中培育大腸桿菌8739細(xì)胞過(guò)夜，使其密度約為109個(gè)細(xì)胞/ml。在PBS中對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)物進(jìn)行稀釋，獲得10-4～10-9的10倍系列稀釋液。利用真空過(guò)濾裝置和無(wú)菌塑料漏斗(MilliporeMicrofil100ml Funnel，cat.num.MIHABG072)將5ml的每個(gè)系列稀釋液沉積在黑色混合纖維素酯濾器(Pall Gelman Laboratory；cat.num.66585)上。將完成過(guò)濾的每個(gè)濾器置于含有胰酶解酪蛋白豆瓊脂、卵磷脂和聚山梨醇酯80(Becton Dickinson BBL，cat.num.211764)的單個(gè)瓊脂平板上。對(duì)應(yīng)每個(gè)系列的稀釋液制備1個(gè)濾器，并于32.5℃培育該瓊脂平板6.5小時(shí)，繼而于32.5℃培育過(guò)夜。于6.5小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，從培養(yǎng)箱中取出瓊脂平板，并通過(guò)將平板置于基于CCD的成像儀上，使細(xì)菌集落面對(duì)照明光源和CCD芯片，以使濾器成像。利用GFP激發(fā)和GFP-LP發(fā)射濾光器檢測(cè)來(lái)自每個(gè)微集落的自身熒光。利用ImagePro軟件(Media Cybernetics，Inc.，Version 4.5.0.19)量化每個(gè)圖象中來(lái)自微集落的自身熒光信號(hào)。繼而過(guò)夜培育，目測(cè)檢查瓊脂平板，對(duì)采用10-8和10-9稀釋液制備的濾器上所存在的大集落數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。利用這兩個(gè)濾器上的大集落數(shù)量以推算被添加至每個(gè)膜上的細(xì)菌數(shù)量，以及最初過(guò)夜培養(yǎng)物中的細(xì)菌濃度。
結(jié)果該實(shí)施例中，使細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制并在瓊脂平板中的濾器上形成微集落。微集落是通過(guò)利用本發(fā)明檢測(cè)，并通過(guò)GFP-LP自身熒光性得以鑒定。利用ImagePro軟件量化每個(gè)圖象中來(lái)自微集落的自身熒光信號(hào)。與添加至每個(gè)濾器中的細(xì)菌數(shù)量相對(duì)應(yīng)，標(biāo)繪出每個(gè)圖象中的自身熒光信號(hào)，結(jié)果如圖13所示。數(shù)據(jù)在細(xì)菌水平的5個(gè)對(duì)數(shù)范圍上是線性的。該范圍是非常顯著的，因?yàn)槟承﹤鹘y(tǒng)培養(yǎng)方法，即倒平板的范圍僅為2個(gè)對(duì)數(shù)。結(jié)果也顯示出非常好的線性，其R2值為0.9929。對(duì)新的微生物學(xué)檢驗(yàn)方法(Evaluation，Validation，andImplementation of New Microbiological Testing Methods.2000；PDAJournal of Pharmaceutical Science&Technology 54(Supplement TR33)，1-41)而言，該值在可接受的R2值范圍(0.8～1.2)內(nèi)。
實(shí)施例9.無(wú)需稀釋樣本的快速抗微生物防腐劑效果檢驗(yàn)背景與目標(biāo)將抗菌防腐劑添加至被包裝在多劑量容器內(nèi)的物品中，以避免可能由生產(chǎn)環(huán)節(jié)或者在消費(fèi)者取出單劑量時(shí)引入的微生物的生長(zhǎng)。對(duì)含有固有抗菌活性的藥品或含有抗菌防腐劑的產(chǎn)品而言，均必須證實(shí)其的抗菌效果。該實(shí)驗(yàn)非常昂貴且難以進(jìn)行，因?yàn)楸仨毞治龃罅繕颖鞠♂屢骸５湫偷目咕栏瘎┬Ч麢z驗(yàn)需要分析數(shù)百個(gè)微生物培養(yǎng)平板。該實(shí)施例的一個(gè)重要目標(biāo)是證實(shí)本發(fā)明可以通過(guò)避免稀釋樣本的需要而節(jié)省大部分實(shí)驗(yàn)人力。
實(shí)驗(yàn)方法在TSB中培養(yǎng)大腸桿菌8739細(xì)胞過(guò)夜，使其密度達(dá)到大約109個(gè)細(xì)胞/ml。將細(xì)菌(共計(jì)8.48×106或2.12×105個(gè)細(xì)胞/ml)添加至40ml無(wú)菌PBS或40ml的Osco Brand無(wú)菌保存鹽溶液(由American Procurement and Logistics Company分裝，Lot num.1T016，Exp.Jun 03)。室溫培育這兩種溶液168小時(shí)。分別于0、24、96和168小時(shí)后，取出5ml含細(xì)菌PBS和5ml含細(xì)菌Osco Saline，并將其添加至含有45ml無(wú)菌 D/E Neutralizing Broth(BectonDickinson/Difco，cat num.281910)的單獨(dú)試管中。利用真空過(guò)濾裝置和無(wú)菌塑料漏斗(Millipore Microfil100ml Funnel，cat.num.MIHABG072)將稀釋的樣本沉積在黑色混合纖維素酯濾器(PallGelman Laboratory；cat.num.66585)上。將每個(gè)濾器置于含有胰酶解酪蛋白豆瓊脂、卵磷脂和聚山梨醇酯80(Becton Dickinson BBL，cat.num.211764)的單個(gè)瓊脂平板上。于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)每個(gè)稀釋液制備1個(gè)濾器。于32.5℃培育瓊脂平板6.5小時(shí)。從培養(yǎng)箱中取出瓊脂平板，并通過(guò)將平板置于以CCD為基礎(chǔ)的成像儀上，使細(xì)菌集落面對(duì)照明光源和CCD芯片，以使濾器成像。利用GFP激發(fā)和GFP-LP發(fā)射濾光器檢測(cè)自身熒光。利用ImagePro軟件(Media Cybernetics，Inc.，Version 4.5.0.19)量化每個(gè)圖象中的微集落來(lái)源的自身熒光信號(hào)。采用實(shí)施例8中所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將通過(guò)ImagePro分析所獲的自身熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成每個(gè)膜所加入的細(xì)菌數(shù)量，并繼而轉(zhuǎn)換成針對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的每ml溶液(PBS或Osco Saline)的細(xì)菌濃度。給定0小時(shí)培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌的起始濃度，計(jì)算24、96和168小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌濃度減量的對(duì)數(shù)值。0、24、96和168小時(shí)后，從含細(xì)菌的PBS和Osco鹽溶液中取出100μl，將其添加至900μl的D/E Neutralizing Broth(1∶10稀釋)中。繼而在1.0ml無(wú)菌PBS中以1∶10稀釋率制備10-1～10-6的系列10倍稀釋液。將總體積的10-1～10-6稀釋液分別添加至含有卵磷脂和聚山梨醇酯80的30ml融化(45℃)的胰酶解酪蛋白豆瓊脂中。室溫冷卻這些瓊脂平板，并于32.5℃培育過(guò)夜。目測(cè)計(jì)數(shù)兩個(gè)最低稀釋度的平板，每個(gè)平板所含集落不超過(guò)300個(gè)。利用這些數(shù)字(乘以合適的稀釋系數(shù))計(jì)算PBS和Osco鹽溶液中的細(xì)菌濃度。給定0小時(shí)培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌的起始濃度，計(jì)算24、96和168小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌濃度減量的對(duì)數(shù)值。標(biāo)繪出通過(guò)本發(fā)明所測(cè)定細(xì)菌濃度減量的對(duì)數(shù)值，并與通過(guò)倒平板方法(一種傳統(tǒng)的、以生長(zhǎng)為基礎(chǔ)的微生物學(xué)計(jì)數(shù)方法)所測(cè)定細(xì)菌濃度減量的對(duì)數(shù)值進(jìn)行比較。結(jié)果如圖14的圖表所示。
結(jié)果圖14中的結(jié)果顯示在Osco鹽溶液(0.1％山梨酸)中的抗菌防腐劑在減少細(xì)菌濃度方面是有效的。在PBS中則未觀察到細(xì)菌濃度的降低。數(shù)據(jù)表明即使本發(fā)明不需要稀釋，兩種計(jì)數(shù)方法仍然線性相關(guān)(R2＝0.9633)。結(jié)果顯示本發(fā)明可以通過(guò)避免傳統(tǒng)方法麻煩的樣本稀釋步驟，從而節(jié)省了大部分勞力和物料。
實(shí)施例10.利用非放大性大范圍成像對(duì)熱應(yīng)力生物學(xué)指示劑進(jìn)行的基于自身熒光的檢測(cè)背景與目標(biāo)該實(shí)施例的目標(biāo)是顯示本發(fā)明在采用耐熱孢子作為生物學(xué)指示劑方面的潛在應(yīng)用。在藥物和醫(yī)學(xué)器械生產(chǎn)，以及臨床實(shí)驗(yàn)室中，為確保無(wú)菌操作的效果，一個(gè)重要的應(yīng)用就是滅菌器定量方法。
進(jìn)一步的目標(biāo)是顯示本發(fā)明可以通過(guò)減少所需樣本的數(shù)量從而簡(jiǎn)化生物學(xué)指示劑的計(jì)數(shù)。在傳統(tǒng)倒平板方法中，覆蓋整個(gè)可能范圍的系列10倍稀釋液對(duì)準(zhǔn)確定量樣本而言是必要的。該實(shí)施例中，利用生物學(xué)指示劑脂肪嗜熱桿菌自身熒光的非放大性大范圍成像，以定量有活力的孢子濃度。該定量化是線性的，具有大約3個(gè)數(shù)量級(jí)，并減少了準(zhǔn)確測(cè)定熱應(yīng)力處理之后殘留活力孢子數(shù)量所必需的稀釋液數(shù)量。在短期生長(zhǎng)之后捕捉自身熒光圖象，繼而分析圖象以估計(jì)獲得有活力的熱應(yīng)力脂肪嗜熱桿菌孢子的起始濃度。
實(shí)驗(yàn)方法在無(wú)菌水中稀釋脂肪嗜熱桿菌ATCC7953(RavenBiological Laboratories，Inc.)的孢子，獲得～2×105個(gè)孢子/ml的濃度，并進(jìn)行多種熱應(yīng)力實(shí)驗(yàn)，范圍從110℃持續(xù)5分鐘到121℃持續(xù)15分鐘。在水中以10倍稀釋度系列稀釋該熱處理后的孢子和未處理的對(duì)照，直到1/1000稀釋度。為了做比較，除了非放大性大范圍成像自身熒光以外，每個(gè)樣本是通過(guò)傳統(tǒng)倒平板方法分析的。通過(guò)將每個(gè)樣本的每個(gè)稀釋液1ml置于培養(yǎng)皿中，并添加20ml融化的胰酶解酪蛋白豆瓊脂(TSA，BD catalogue no.236950)，制備倒平板。凝固后，于55℃培育平板48小時(shí)，并人工計(jì)數(shù)。選擇含30～300個(gè)集落的平板計(jì)算孢子滴度，如果沒(méi)有一個(gè)平板所含集落超過(guò)30個(gè)，該情況中，便采用含有未稀釋的樣本1ml的平板。
為制備用于大范圍成像的微集落，采用15ml無(wú)菌水分別混合1ml未稀釋樣本和1ml的1/100稀釋液，并利用真空過(guò)濾和塑料漏斗杯(Millipore Microfil V User Guide，PF07114，Rev A 3/00)使其濾過(guò)黑色HABP濾器(Millipore catalogue no.HABP04700)。過(guò)濾后，將每個(gè)濾器置于TSA的單個(gè)平板上。利用非放大性基于CCD的成像儀(于詳述部分的步驟5中所描述，如圖3所示)捕捉t＝0小時(shí)的圖象。利用FITC光學(xué)濾光器裝置(Chroma；激發(fā)470/40nm，發(fā)射522/40nm)通過(guò)5秒曝光捕捉自身熒光。于55℃培育平板，并于8和20小時(shí)捕捉圖象。利用Image Pro Pluse軟件(version 4.1；Media cybernetics)分析圖象。采用t＝0曝光可以發(fā)現(xiàn)可能在細(xì)菌生長(zhǎng)前便存在于平板上的灰塵和其它熒光雜質(zhì)。對(duì)每個(gè)圖象而言，除去t＝0時(shí)的雜質(zhì)來(lái)源的信號(hào)，將所有目標(biāo)(在特定實(shí)施例中該研究對(duì)象被定義為具有3200～65301個(gè)強(qiáng)度單位的像素強(qiáng)度)的像素強(qiáng)度總和與采用未經(jīng)熱應(yīng)力處理的孢子所獲的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，并由該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算孢子滴度。對(duì)由未稀釋樣本所獲的值與由1/100稀釋液所獲的值而言，根據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)哪一個(gè)值下降，便選用該值。將通過(guò)非放大性成像所獲自身熒光計(jì)算的孢子/ml值與通過(guò)倒平板方法計(jì)算的值相比較。
結(jié)果通過(guò)倒平板方法計(jì)算的熱應(yīng)力孢子滴度與通過(guò)自身熒光大范圍成像計(jì)算的孢子滴度對(duì)比圖可見(jiàn)于圖15。兩種方法所獲的值之間存在好的相關(guān)性，不過(guò)每?jī)蓚€(gè)自身熒光圖象需要四個(gè)平板。另外，倒平板需要48～72小時(shí)才可以讀數(shù)，而自身熒光圖象則在生長(zhǎng)8～20小時(shí)便可以被捕捉到并分析。
變動(dòng)也可以利用自身熒光的非放大性大范圍成像以定量其它生物學(xué)指示劑生物，如枯草芽孢桿菌和產(chǎn)芽胞梭狀芽胞桿菌的活細(xì)胞濃度。
可以采用自身熒光圖象的多種分析方法定量細(xì)胞濃度。例如，可以采用微集落的目標(biāo)數(shù)量代替目標(biāo)像素強(qiáng)度總和。由于目標(biāo)(微集落)遠(yuǎn)比充分生長(zhǎng)后的大集落小(可肉眼計(jì)數(shù))，相同面積中適合更多微集落進(jìn)入，同時(shí)不犧牲由于研究對(duì)象重疊而損失的準(zhǔn)確度。另外，可以將更復(fù)雜的目標(biāo)搜尋算法應(yīng)用到圖象中，以處理局部熒光背景，鄰接目標(biāo)，和雜質(zhì)熒光顆粒的存在。
實(shí)施例11.對(duì)絞細(xì)牛肉中細(xì)菌微集落進(jìn)行的基于自身熒光的檢測(cè)背景與目標(biāo)該實(shí)施例說(shuō)明與藥典方法相比，本發(fā)明能夠縮短檢測(cè)絞細(xì)牛肉中細(xì)菌微集落所需的時(shí)間。對(duì)預(yù)防早期食品腐敗而言，測(cè)定生肉中的活細(xì)菌總量是重要的?，F(xiàn)有方法需花費(fèi)兩天，并且通常需要生產(chǎn)者在獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果之前就開(kāi)始運(yùn)輸檢驗(yàn)用肉。縮短檢測(cè)微生物所需的時(shí)間可以預(yù)防食品引起的疾病事故、無(wú)效生產(chǎn)和昂貴的召回成本。
實(shí)驗(yàn)方法于225ml 0.1％蛋白胨水中稀釋瘦絞細(xì)牛肉(25g)，并于細(xì)菌分離器中加工以使樣本勻質(zhì)化。繼而在0.1％蛋白胨水中系列稀釋該樣本。將合適體積的10-2、10-3、10-4和10-5稀釋液添加至PBS中，并利用真空過(guò)濾裝置將其傾倒在兩種類型的濾器膜上(MilliporeHABP Cat.No.HABP04700 0.45μm和Chemunex CB0.40.4μm Ref.no.200-C20010-01)。對(duì)應(yīng)每個(gè)稀釋液和濾器類型制備復(fù)制樣本，于35℃培育TSA平板48小時(shí)。利用基于CCD的成像儀捕捉0、6、16、24和48小時(shí)的圖象。利用FITC光學(xué)濾光器裝置(Chroma；激發(fā)470/40nm，發(fā)射522/40nm)，并利用軟件控制(Image Pro Plus.)于HDyn分辨率下捕捉曝光10秒的圖象。也可采用白光反射曝光10秒捕捉圖象。
結(jié)果數(shù)據(jù)收集自兩種類型膜濾器上的10-4和10-5稀釋液。通過(guò)在反射圖象中計(jì)數(shù)48小時(shí)0.5mm或更大直徑的大集落，以分析該數(shù)據(jù)。繼而在反射和自身熒光圖象中將這些大集落回溯至24、16和6小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)。圖16分別顯示了自身熒光微集落和大集落的檢測(cè)時(shí)間。跟蹤可于48小時(shí)形成大集落的微集落隨著時(shí)間的出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)100％的大集落可以通過(guò)本發(fā)明于16小時(shí)便檢測(cè)到。這些結(jié)果顯示與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明可以顯著縮短獲得結(jié)果所需的時(shí)間。
變動(dòng)可以將該實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)延伸至檢驗(yàn)多種食品，包括其它肉類、蔬菜、飲料和奶制品。
實(shí)施例12.采用非特異磁選擇繼而通過(guò)利用非放大性大范圍成像的微集落檢測(cè)對(duì)復(fù)雜樣本中的細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)目標(biāo)本實(shí)施例說(shuō)明了一種非特異性地從復(fù)雜樣本中選擇個(gè)體細(xì)菌細(xì)胞，繼而通過(guò)利用非放大性大面積成像快速檢測(cè)微集落生長(zhǎng)的免疫測(cè)定方法。更具體而言，本實(shí)施例證實(shí)了從血液中有效選擇一定范圍的細(xì)菌，并繼而利用直接生長(zhǎng)方法檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)的能力。本實(shí)施例顯示借助包被有結(jié)合試劑混合物的磁珠，可以從復(fù)雜樣本中選擇不同種類的細(xì)菌。
實(shí)驗(yàn)方法圖17顯示了本實(shí)施例檢測(cè)復(fù)雜樣本中細(xì)菌的過(guò)程。首先，將細(xì)菌細(xì)胞和磁珠添加至樣本中，并進(jìn)行培養(yǎng)。使磁珠與細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合；繼而利用磁力沉淀復(fù)合物。重新懸浮(PBS)磁珠，過(guò)濾，并平板接種于生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。也將所獲的磁選擇上清液制成平板。培養(yǎng)結(jié)束后，利用非放大性大范圍成像于不同時(shí)間點(diǎn)使濾器成像，以檢測(cè)微集落。
通過(guò)使具有活性甲苯磺酰基團(tuán)的磁性顆粒(Dynal，Oslo，Norway，cat.no.140.03)與若干非特異和特異的接合劑偶聯(lián)，獲得一個(gè)磁性顆粒陣列。該接合劑包括多粘菌素B硫酸鹽(Sigma；cat.no.P1004)、多粘菌素B納米蛋白(Sigma；cat.no.P2076)、內(nèi)毒素中和蛋白(Seikagaku America自然來(lái)源和重組型，cat.no.910140-1，910130-1和910120-1)、內(nèi)毒素抑制蛋白(Bachem；cat.no.H-1382)、內(nèi)毒素底物(Bachem；cat.no.L-1195)、抗脂磷壁酸質(zhì)抗體(QED；cat.no.15711)、抗內(nèi)毒素抗體(QED cat.no.15306和15301)。超聲處理(1分鐘；設(shè)置8；Fisher Scientific 550 Sonic Dismembrator)包被的磁性顆粒(每10μl含1×108個(gè))。繼而將混合的包被磁珠添加至內(nèi)含血液(1ml，Biochemed；黃種人血液，以檸檬酸鈉為抗凝血?jiǎng)?，cat.no.10762WB)的1.5ml試管中，其中該血液混有大約1、10或100個(gè)金黃色葡萄球菌(ATCC#27694)。培育(室溫下1小時(shí))血液、細(xì)菌和磁體。培育結(jié)束后，利用磁分離裝置(Polysciences，Inc.，Warrington，PA，Cat.No.8MB4111S)以捕獲并保護(hù)磁性顆粒，從而磁選擇出珠體。繼而澄清血液后，置于TSA(Difco，cat.no.236950)平板上，同樣制成初始金黃葡萄球菌接種量為1、10和100個(gè)細(xì)胞的平板(作為對(duì)照)。重新懸浮(1ml PBS)磁性顆粒，并將所獲的含有磁性顆粒-細(xì)菌復(fù)合體的液體過(guò)濾通過(guò)膜(Osmonics，poretics 47mm，0.22μm孔，聚碳酸酯黑色濾器，cat.no.1213889)，將膜置于TSA平板上。利用非放大性大范圍成像于0時(shí)間點(diǎn)和短暫培養(yǎng)期之后使濾器成像，以檢測(cè)自身熒光微集落?；厥瞻俜致适峭ㄟ^(guò)比較采用磁性的捕獲量和采用公式(平均磁捕獲/平均接種量)×100所獲數(shù)值而確定的。
結(jié)果圖18顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了磁分離之后的微集落檢測(cè)。該圖顯示的兩個(gè)圖象，取自0點(diǎn)和生長(zhǎng)6小時(shí)。6小時(shí)圖象含有認(rèn)定的微集落-為亮點(diǎn)，而0點(diǎn)圖象中則無(wú)法看見(jiàn)。為證實(shí)這些微集落確實(shí)是生長(zhǎng)中的微生物微集落，將濾器培育過(guò)夜并再次成像。于認(rèn)定的微集落位點(diǎn)檢測(cè)到大集落，證實(shí)了快速檢測(cè)結(jié)果。1個(gè)細(xì)胞樣本便實(shí)現(xiàn)了超過(guò)90％的金黃色葡萄球菌回收率。10和100個(gè)細(xì)胞樣本則獲得超過(guò)50％的回收率。
變動(dòng)(廣泛接合劑)可以采用多種廣泛反應(yīng)性接合劑，包括細(xì)菌凝集素、抗腸細(xì)菌常用抗原、抗蛋白質(zhì)A、抗蛋白質(zhì)G、LPS結(jié)合蛋白、粘蛋白(細(xì)菌接合劑)、CD14(結(jié)合LPS和LPS細(xì)菌復(fù)合體)、膠凝素(于噬菌作用或補(bǔ)體串聯(lián)期間結(jié)合細(xì)菌)、其補(bǔ)體的亞單位，如C3b和C4b、人類清除細(xì)胞受體(與細(xì)菌組成結(jié)合的細(xì)胞受體)和tectonics(結(jié)合蛋白質(zhì)的碳水化合物)。
變動(dòng)(特異接合劑)可以采用多種類型的種類結(jié)合分子，包括抗體、適體和配體以從復(fù)雜樣本中特異地選擇一定范圍的細(xì)菌類型。該變動(dòng)實(shí)施例中，大腸桿菌O157:H7的選擇是通過(guò)利用大腸桿菌O157:H7特異抗體實(shí)現(xiàn)的。
實(shí)驗(yàn)方法的變動(dòng)該變動(dòng)中，復(fù)雜樣本中的細(xì)菌檢測(cè)是采用分析物特異性磁選擇實(shí)現(xiàn)的。該選擇之后，利用非放大性大范圍成像檢測(cè)微集落。圖17顯示了該實(shí)施例所用的方法。將含有大腸桿菌O157:H7的樣本與磁性顆?；旌?。繼而對(duì)樣本進(jìn)行磁選擇，過(guò)濾并利用非放大性大范圍成像于一系列時(shí)間點(diǎn)成像。通過(guò)使甲苯磺?；揎椀拇判灶w粒(Dynal，Oslo，Norway，cat.No.140.03；根據(jù)生產(chǎn)商推薦方法進(jìn)行偶聯(lián))與由大腸桿菌O15:H7引發(fā)的多克隆抗體(BioTrace親和純化的；Kirkegaard&Perry Laboratories，Gaithersburg，MD，Cat.No.01-95-90)偶聯(lián)，獲得抗大腸桿菌O157:H7磁性顆粒。超聲處理(1分鐘；設(shè)置8；Fisher Scientific 550 Sonic Dimembrator)抗大腸桿菌O157:H7磁性顆粒(1×108/10μl)。繼而將該磁珠添加至混有大腸桿菌O157:H7(Strain DEC 3B，Dr.Tom Whittam，Pennsyl-vania StateUniversity)的血液中(1ml；Biochemed；黃種人血液，以檸檬酸鈉為抗凝血?jiǎng)?，cat.no.10762WB)。大腸桿菌O157:H7微集落的生長(zhǎng)和檢測(cè)是遵循本實(shí)施例中上述的相同步驟實(shí)現(xiàn)的。
實(shí)施例13利用原位復(fù)制和非放大性大范圍成像的抗微生物敏感度檢驗(yàn)背景與目標(biāo)背景部分論述了抗微生物敏感度檢驗(yàn)對(duì)確定合適療法的意義。監(jiān)測(cè)固體培養(yǎng)基上的微生物生長(zhǎng)是常用的方法，并且與液體培養(yǎng)中的生長(zhǎng)相比具有若干顯著優(yōu)勢(shì)。不利用設(shè)備(如采用平板擴(kuò)散實(shí)驗(yàn))、經(jīng)濟(jì)、并同時(shí)定量地確定細(xì)菌菌株對(duì)若干抗生素的敏感度是可能的，但是目前的方法需要純化的集落，因此在處理患者樣本后的1～2天通常不能進(jìn)行。這種延遲可能給患者帶來(lái)生命危險(xiǎn)。此外，通常還需要另外的1～2天以檢測(cè)并分析抗菌敏感度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
目標(biāo)本實(shí)施例證實(shí)了本發(fā)明快速確定細(xì)菌菌株抗菌敏感度的用途。該方法的原理如圖19所示。下述實(shí)驗(yàn)中，抗性和敏感性菌株生長(zhǎng)在含有和不含有抗生素的培養(yǎng)基上，并且微集落的檢測(cè)方法與上述實(shí)施例相同。該方法顯示了顯著縮短被拖延的生長(zhǎng)步驟(在抗生素中的集落純化與生長(zhǎng))的能力，而該被拖延的生長(zhǎng)步驟在目前可能會(huì)拖延合適的抗菌療法的實(shí)施。
方法與上述實(shí)施例(實(shí)施例1)相同，使細(xì)菌的敏感性(大腸桿菌MG1655)和抗性(大腸桿菌MG1655/pLafr I)菌株沉積在濾器上。將含有大約1 000個(gè)抗性細(xì)菌的濾器置于含抗生素(四環(huán)素；64μg/ml)或不含抗生素的LB平板(LB瓊脂；Difco)上。于37℃培育(3小時(shí))后，如上述實(shí)施例(實(shí)施例1)對(duì)濾器進(jìn)行染色并成像。
結(jié)果圖21顯示了利用基于CCD的非放大性大范圍成像對(duì)抗菌敏感度的檢驗(yàn)結(jié)果。CCD成像在含有抗性細(xì)菌的膜上檢測(cè)到微集落，而在含有敏感性細(xì)菌的膜上則未檢測(cè)到(于最左端標(biāo)記3小時(shí)+tet，CCD的圖象部分中比較標(biāo)有“resistant strain(抗性菌株)”和“sensitivestrain(敏感菌株)”的圖象)。從圖象分析獲得的強(qiáng)度數(shù)據(jù)量化了該觀測(cè)結(jié)果(條形圖)。高倍數(shù)熒光顯微鏡證實(shí)培養(yǎng)3小時(shí)后抗性菌株形成微集落，而敏感菌株則未形成微集落。(顯微鏡分析表明在抗生素存在條件下，敏感細(xì)菌的培育將導(dǎo)致異常的細(xì)菌形態(tài)[比較下排標(biāo)有“sensitive strain(敏感菌株)”的兩幅顯微鏡圖象])。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)抗菌敏感度檢驗(yàn)而言，利用非放大性大范圍成像檢測(cè)微集落是一種快速且靈敏的方法。
變動(dòng)抗菌敏感度檢驗(yàn)中的某些變動(dòng)包括采用不同信號(hào)部分。該實(shí)驗(yàn)中，活性染色劑，如Syto 9和其它Syto家族成員(MolecularProbes)，酯酶底物如熒光素二乙酸酯或ChemChrome V6(Chemunex)，標(biāo)記抗體，或產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的代謝物均可以作為核酸染色劑的替代品。也可以利用靶細(xì)胞的天然自身熒光性檢測(cè)微集落。也可以利用微集落生長(zhǎng)，與采用抗菌敏感度檢驗(yàn)的平板擴(kuò)散或E檢驗(yàn)方法(AB biodisk NA Inc.；E-test條帶)相同，監(jiān)測(cè)幾何生長(zhǎng)抑制。該抗菌敏感度檢驗(yàn)也可以被延伸為包括采用不同熒光標(biāo)記的抗體同時(shí)鑒定多種微生物。
實(shí)施例14利用圓片擴(kuò)散方法和非放大性大范圍成像的快速抗菌敏感度檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)本實(shí)施例證實(shí)了本發(fā)明利用圓片擴(kuò)散方法快速確定細(xì)菌菌株抗菌敏感度的用途。將含有已知濃度抗生素的圓片置于含有大量來(lái)自微生物純培養(yǎng)物的細(xì)胞的平板上?？股赜蓤A片擴(kuò)散而出，以圓片為中心形成抗生素濃度的一個(gè)放射狀梯度(即越接近圓片，抗生素濃度越高)。高抗性菌株可以在圓片存在下生長(zhǎng)，即使是在抗生素濃度最高的圓片邊緣也不例外。較小抗性的菌株則生長(zhǎng)在環(huán)繞圓片的一個(gè)抑制區(qū)之外。抑制區(qū)的寬度與對(duì)菌株的抗生素抗性水平相關(guān)。
抑制區(qū)傳統(tǒng)地是通過(guò)培養(yǎng)過(guò)夜后利用肉眼進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)施例證實(shí)了通過(guò)利用非放大性大范圍成像檢測(cè)微集落生長(zhǎng)，可以在幾小時(shí)內(nèi)便確定所形成的抑制區(qū)的能力。
實(shí)驗(yàn)方法將實(shí)施例13中采用并描述的菌株稀釋至106CFU/ml后，平板接種于TSA培養(yǎng)基上。繼而將一個(gè)四環(huán)素?cái)U(kuò)散圓片(HardyDiagnostics；30μg四環(huán)素，cat.no.Z9121)置于該平板上。于37℃培育平板5小時(shí)。與上述實(shí)施例相同，利用微集落自身熒光性和非放大性大范圍成像使微集落成像。
結(jié)果圖21顯示了利用非放大性大范圍成像快速檢驗(yàn)抗菌敏感度的結(jié)果。以CCD為基礎(chǔ)的成像僅于5小時(shí)后便可在抗生素?cái)U(kuò)散圓片附近檢測(cè)到生長(zhǎng)的自身熒光抗性集落。該抑制區(qū)與通過(guò)培養(yǎng)過(guò)夜目測(cè)檢查所獲的結(jié)果是可以比較的。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示基于微集落生長(zhǎng)檢測(cè)抑制區(qū)比傳統(tǒng)圓片擴(kuò)散方法更為快速，并且可以獲得可比較的結(jié)果。
變化本技術(shù)可以采用大部分抗生素?cái)U(kuò)散圓片和大部分微生物。
實(shí)施例15利用E-testTM和非放大性大范圍成像的快速抗微生物敏感度檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)本實(shí)施例證實(shí)本發(fā)明利用E-testTM抗生素實(shí)驗(yàn)條帶快速確定細(xì)菌菌株的抗生素敏感度的用途。該E-testTM條帶含有一定范圍濃度的四環(huán)素，使用戶可以利用一個(gè)條帶便確定抑制實(shí)驗(yàn)細(xì)菌生長(zhǎng)所需的最低抗生素濃度。該最小抑制濃度是基于對(duì)無(wú)生長(zhǎng)發(fā)生區(qū)域的目測(cè)，該區(qū)域被稱為抑制區(qū)。抑制區(qū)傳統(tǒng)地是通過(guò)培養(yǎng)過(guò)夜后利用肉眼測(cè)定。該實(shí)施例證實(shí)了通過(guò)利用非放大性大范圍成像檢測(cè)微集落生長(zhǎng)，可以在幾小時(shí)內(nèi)便確定抑制區(qū)的能力。
實(shí)驗(yàn)方法將實(shí)施例13中采用并描述的菌株稀釋至106CFU/ml后，平板接種于TSA培養(yǎng)基上。繼而將E-testTM條帶(Hardy Diagnostics0.016～256μg四環(huán)素，cat.no.51002258)置于該平板上，并于37℃培育平板5小時(shí)。與上述實(shí)施例相同，利用微集落自身熒光性和非放大性大范圍成像使生長(zhǎng)在實(shí)驗(yàn)條帶上或相鄰位置的微集落成像。
結(jié)果圖22顯示了利用非放大性大范圍成像快速檢驗(yàn)抗菌敏感度E-testTM的結(jié)果。非放大、大范圍成像檢測(cè)到在E-testTM抗生素實(shí)驗(yàn)條帶附近生長(zhǎng)的自身熒光抗性微集落。生長(zhǎng)5小時(shí)后便可以測(cè)定抑制區(qū)，且該抑制區(qū)與培養(yǎng)過(guò)夜后所觀測(cè)到的抑制區(qū)是可比較的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示利用非放大性大范圍成像檢測(cè)微集落是一種快速、靈敏的方法，并且大大縮短了E-testTM實(shí)驗(yàn)獲得結(jié)果所需的時(shí)間。
變動(dòng)含有多種抗生素的E-testTM條帶均可應(yīng)用本技術(shù)。
其它實(shí)施方案本申請(qǐng)中參考的所有專利、專利應(yīng)用和出版物均引入在此，作為參考。從于此公開(kāi)的本發(fā)明的說(shuō)明書和實(shí)踐的考慮出發(fā)，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明的其它實(shí)施方案將是顯而易懂的。說(shuō)明書與實(shí)施例應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為僅是示范性的，下述權(quán)利要求指明了本發(fā)明的實(shí)際范疇與精神?？梢员槐疚乃枋龇椒ú捎玫钠渌鼘?shí)施方案的實(shí)施例見(jiàn)提交于2002年9月6日，標(biāo)題為“RAPID AND SENSITIVE DETECTION OFCELLS AND VIRUSES”的美國(guó)申請(qǐng)No.＿＿＿＿，和提交于2002年9月6日，標(biāo)題為“RAPID AND SENSITIVE DETECTION OFMOLECULES”的美國(guó)申請(qǐng)No.＿＿＿＿，兩篇專利均被引入在此作為參考。
其它實(shí)施方案在權(quán)利要求中。
權(quán)利要求為
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣本中活的靶細(xì)胞的方法，該方法包括如下步驟(a)將該樣本中存在的活的靶細(xì)胞以每平方毫米檢測(cè)面積不超過(guò)100個(gè)靶細(xì)胞的密度提供在包括檢測(cè)面積在內(nèi)的檢測(cè)區(qū)中，其中在該檢測(cè)區(qū)內(nèi)，所述細(xì)胞是隨機(jī)分散且固定的；(b)所述靶細(xì)胞通過(guò)原位復(fù)制形成一個(gè)或多個(gè)微集落；和(c)檢測(cè)所述一個(gè)或多個(gè)微集落；其中所述檢測(cè)面積的最長(zhǎng)線性維度大于1mm；所述一個(gè)或多個(gè)微集落在至少兩個(gè)正交維度上具有不超過(guò)50微米的平均量度；所述一個(gè)或多個(gè)微集落中的細(xì)胞在檢測(cè)之后保留了復(fù)制能力。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶細(xì)胞是以每平方毫米檢測(cè)面積不超過(guò)10個(gè)靶細(xì)胞的密度隨機(jī)分散在檢測(cè)區(qū)內(nèi)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶細(xì)胞是以每平方毫米檢測(cè)面積不超過(guò)1個(gè)靶細(xì)胞的密度隨機(jī)分散在檢測(cè)區(qū)內(nèi)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)方法檢測(cè)了檢測(cè)面積中的單個(gè)微集落。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)方法檢測(cè)了重疊或相鄰的微集落。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)不要求超過(guò)5x的放大倍數(shù)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)不要求超過(guò)2x的放大倍數(shù)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)不要求超過(guò)1x的放大倍數(shù)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)不要求超過(guò)0.2x的放大倍數(shù)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)微集落中的平均細(xì)胞數(shù)量不超過(guò)50,000。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)微集落所含細(xì)胞不超過(guò)10,000。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)微集落中的平均細(xì)胞數(shù)量不超過(guò)1000。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)微集落中的平均細(xì)胞數(shù)量不超過(guò)100。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)微集落中的平均細(xì)胞數(shù)量不超過(guò)10。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)微集落具有最長(zhǎng)線性尺寸不超過(guò)25微米的平均量度。
16.權(quán)利要求10的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)微集落具有最長(zhǎng)線性尺寸不超過(guò)10微米的平均量度。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶細(xì)胞為細(xì)菌。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶細(xì)胞為真核細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18方法，其中所述靶細(xì)胞為霉菌或真菌細(xì)胞。
20.權(quán)利要求18方法，其中所述靶細(xì)胞為人類、動(dòng)物或植物細(xì)胞。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶細(xì)胞為人類、動(dòng)物或植物的寄生物。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)方法檢測(cè)并鑒定了來(lái)源自超過(guò)一種非重疊種類細(xì)胞的微集落。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本含有由多細(xì)胞生物體獲得的流體或組織。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本含有動(dòng)物的體液或組織。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本來(lái)源自人類。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本來(lái)源自非人類的脊椎動(dòng)物。
27.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本選自呼吸道、泌尿生殖道、生殖道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、尿、血液、皮膚、血漿、血清、唾液、創(chuàng)傷組織、創(chuàng)傷滲出物、活組織檢查物、糞便、生殖道和致密組織樣本，及它們的衍生物。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本為血液或尿樣本。
29.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本來(lái)源自植物。
30.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本是通過(guò)取樣環(huán)境空氣或水，或暴露于環(huán)境的表面、物體或生物體而獲得的。
31.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣本是從選自在人類或動(dòng)物局部或內(nèi)部使用的藥物、化妝品、血液或其它產(chǎn)品生產(chǎn)中的原料、已完成或加工中的物料；在食品或飲料生產(chǎn)中的原料、加工中或已完成的物料；在醫(yī)學(xué)或體外診斷裝置、化學(xué)產(chǎn)品的生產(chǎn)中的原料、加工中或已完成的物料；工業(yè)表面；設(shè)備；和機(jī)械裝置的材料中獲得。
32.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)區(qū)是與含有一種或多種有利于靶細(xì)胞復(fù)制的物質(zhì)的液體培養(yǎng)基相接觸的。
33.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞直接沉積于固體或半固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。
34.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(a)之前，利用選擇方法將一個(gè)或多個(gè)所述靶細(xì)胞與選擇部分的復(fù)合體沉積在所述檢測(cè)區(qū)中，其中所述選擇方法選自磁選擇、離心、沉淀和過(guò)濾。
35.權(quán)利要求34的方法，其中在步驟(a)之前，使所述靶細(xì)胞與靶細(xì)胞特異的磁性選擇部分接觸，繼而利用磁力將一個(gè)或多個(gè)所述靶細(xì)胞與所述選擇部分的復(fù)合體沉積在所述檢測(cè)表面上。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述靶細(xì)胞特異的磁性選擇部分含有可與種類結(jié)合分子結(jié)合的磁性顆粒。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所述靶細(xì)胞是在液體中與平均密度大于所述液體平均密度的靶細(xì)胞特異的選擇部分接觸，其中一個(gè)或多個(gè)所述靶細(xì)胞與所述選擇部分的復(fù)合體隨后通過(guò)重力、離心或向心力被沉積在所述檢測(cè)表面上。
38.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶細(xì)胞是利用選自磁選擇、離心、沉淀和過(guò)濾的選擇方法被沉積在所述檢測(cè)區(qū)中，其中未應(yīng)用選擇部分。
39.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(a)之前，所述樣本經(jīng)過(guò)處理，以使所述樣本液化和/或均質(zhì)化。
40.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(a)之前，所述樣本經(jīng)過(guò)處理，以除去除了所述靶細(xì)胞以外的物質(zhì)或物體。
41.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括確定一種或多種物質(zhì)或處理對(duì)所述靶細(xì)胞的一種或多種屬性的影響。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述屬性為進(jìn)行細(xì)胞復(fù)制的能力。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述一種或多種物質(zhì)存在于用于支持所述靶細(xì)胞復(fù)制的培養(yǎng)基中。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述屬性為所述靶細(xì)胞在無(wú)菌處理后進(jìn)行復(fù)制的能力。
45.權(quán)利要求41的方法，其中所述屬性為所述靶細(xì)胞在一種或多種潛在的復(fù)制抑制物的存在下復(fù)制的能力。
46.權(quán)利要求41的方法，其中所述靶細(xì)胞為細(xì)菌、真菌、寄生物或培養(yǎng)的細(xì)胞，所述物質(zhì)為抗菌劑、抗真菌劑或抗寄生物劑。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述一種或多種抑制物為抗微生物化合物。
48.權(quán)利要求45的方法，其中所述一種或多種抑制物為抗腫瘤化合物。
49.權(quán)利要求41的方法，其中所述屬性為所述靶細(xì)胞的生活力、光學(xué)特性變化、代謝或酶活力，或生物化學(xué)組成。
50.權(quán)利要求35的方法，進(jìn)一步包括如下步驟(d)使所述靶細(xì)胞與一種或多種物質(zhì)接觸，或者利用一種或多種處理方法處理所述細(xì)胞；以及(e)確定所述一種或多種物質(zhì)或所述一種或多種處理方法對(duì)所述靶細(xì)胞的一種或多種屬性的影響。
51.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)區(qū)包括選自玻璃、塑料、微量滴定板孔表面、吸水膜、塑料條帶、毛細(xì)管表面、顯微射流室表面和顯微射流通道表面的材料。
52.權(quán)利要求1的方法，其中所述微集落中所述細(xì)胞的復(fù)制在所述檢測(cè)之后是持續(xù)的。
53.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)包括至少兩個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括一個(gè)時(shí)間段，所述時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行了復(fù)制，并繼而進(jìn)行檢測(cè)步驟。
54.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括采用一種或多種其它樣本重復(fù)步驟(a)～(c)的步驟，其中所述重復(fù)是自動(dòng)進(jìn)行的。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述樣本是被自動(dòng)加載進(jìn)包括檢測(cè)器在內(nèi)的設(shè)備中。
56.權(quán)利要求54的方法，其中所述樣本被自動(dòng)沉積在一系列檢測(cè)區(qū)內(nèi)，所述一系列檢測(cè)區(qū)是物理相連的，并且被自動(dòng)且相繼地加載進(jìn)包括檢測(cè)器在內(nèi)的設(shè)備中。
57.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)包括照射一個(gè)或多個(gè)微集落以產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述檢測(cè)方法檢測(cè)了因所述一個(gè)或多個(gè)微集落的照射所引起的光發(fā)射、散射、反射或吸收。
59.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)方法檢測(cè)了熒光。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述熒光是由所述微集落所發(fā)射的自身熒光。
61.權(quán)利要求57的方法，其中所述照射應(yīng)用了一個(gè)或多個(gè)激光器。
62.權(quán)利要求57的方法，其中所述照射應(yīng)用了一個(gè)或多個(gè)發(fā)光二極管。
63.權(quán)利要求57的方法，其中所述照射應(yīng)用了白光源。
64.權(quán)利要求57的方法，其中所述照明是經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)僅可透過(guò)選定波長(zhǎng)的光的光學(xué)濾光器。
65.一種檢測(cè)靶細(xì)胞微集落的方法，所述方法包括如下步驟(a)在檢測(cè)區(qū)內(nèi)提供靶細(xì)胞，其中在檢測(cè)面積內(nèi)，所述細(xì)胞是隨機(jī)分散且固定的；(b)通過(guò)原位復(fù)制形成所述靶細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)微集落，其中至少一個(gè)微集落所包含的靶細(xì)胞不超過(guò)100個(gè)；和(c)利用不超過(guò)5倍的放大倍數(shù)檢測(cè)所述一個(gè)或多個(gè)微集落的一種或多種天然存在的光學(xué)特性。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述一種或多種光學(xué)特性包括自身熒光性。
67.權(quán)利要求65的方法，其中所述一種或多種光學(xué)特性包括熱輻射。
68.權(quán)利要求65的方法，其中所述一種或多種光學(xué)特性包括光學(xué)吸收。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述光學(xué)吸收在紅外線范圍內(nèi)。
70.權(quán)利要求65的方法，其中所述一種或多種光學(xué)特性包括熒光偏振。
71.權(quán)利要求65的方法，其中所述一種或多種光學(xué)特性包括光學(xué)反射性。
72.權(quán)利要求65的方法，其中所述一種或多種光學(xué)特性包括光散射。
73.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)方法檢測(cè)了所述一個(gè)或多個(gè)微集落不依賴于添加發(fā)信號(hào)部分或種類結(jié)合分子的特性。
74.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在步驟(c)之前或期間，采用發(fā)信號(hào)部分標(biāo)記所述一個(gè)或多個(gè)微集落的步驟，其中步驟(c)中的檢測(cè)方法檢測(cè)了由發(fā)信號(hào)部分產(chǎn)生的信號(hào)。
75.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在步驟(c)之前或期間，使所述樣本與發(fā)信號(hào)部分接觸的步驟，所述發(fā)信號(hào)部分與所述靶細(xì)胞直接或間接相連。
76.權(quán)利要求75的方法，其中所述發(fā)信號(hào)部分是與種類結(jié)合分子相連的。
77.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在步驟(c)之前或期間，在允許所述種類結(jié)合分子與位于一個(gè)或多個(gè)所述靶細(xì)胞之上的一個(gè)或多個(gè)種類特異結(jié)合位點(diǎn)之間形成一個(gè)或多個(gè)復(fù)合體的條件下，使所述樣本與種類結(jié)合分子接觸的步驟。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述種類結(jié)合分子包括抗體、適體或配體。
79.權(quán)利要求77的方法，其中所述檢測(cè)應(yīng)用到可以區(qū)分不同家族的標(biāo)記種類結(jié)合分子的信號(hào)標(biāo)記的光學(xué)濾光器。
80.權(quán)利要求77的方法，其中所述種類結(jié)合分子直接或間接標(biāo)記有一個(gè)或多個(gè)發(fā)信號(hào)部分。
81.權(quán)利要求80的方法，進(jìn)一步包括在步驟(c)之前，將任何未結(jié)合的種類結(jié)合分子從所述一個(gè)或多個(gè)復(fù)合體移除的步驟。
82.權(quán)利要求77的方法，其中所述種類結(jié)合分子是種類結(jié)合分子集合的一個(gè)成員，其中所述集合包括一個(gè)特異于每個(gè)非重疊種類待檢測(cè)靶細(xì)胞的種類結(jié)合分子家族。
83.權(quán)利要求82的方法，其中所述種類結(jié)合分子家族中的每一個(gè)均標(biāo)記有可以發(fā)射具有獨(dú)特信號(hào)種類或信號(hào)標(biāo)記的信號(hào)的發(fā)信號(hào)部分。
84.權(quán)利要求83的方法，其中步驟(c)中，所述檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)所述發(fā)信號(hào)部分的獨(dú)特信號(hào)標(biāo)記之間的差異，從而檢測(cè)所述非重疊種類的靶細(xì)胞。
85.權(quán)利要求76的方法，其中所述發(fā)信號(hào)部分為顆?；蛘呤桥c顆粒物理相連。
86.權(quán)利要求75的方法，其中所述發(fā)信號(hào)部分具有熒光信號(hào)特征。
87.權(quán)利要求86的方法，其中所述發(fā)信號(hào)部分選自有機(jī)熒光團(tuán)、正調(diào)節(jié)磷光體、鑭系元素、量子點(diǎn)、從非熒光底物生成熒光產(chǎn)物的酶和熒光染色的顆粒。
88.權(quán)利要求86的方法，其中所述發(fā)信號(hào)部分為用于細(xì)胞的熒光染色劑。
89.權(quán)利要求75的方法，其中所述發(fā)信號(hào)部分具有生色發(fā)信號(hào)特征。
90.權(quán)利要求86的方法，其中所述發(fā)信號(hào)部分具有化學(xué)熒光發(fā)信號(hào)特征。
91.權(quán)利要求75的方法，其中所述發(fā)信號(hào)部分具有光散射發(fā)信號(hào)特征。
92.權(quán)利要求91的方法，其中所述發(fā)信號(hào)部分為共振光散射顆?；虻入x子共振顆粒。
93.權(quán)利要求75的方法，其中所述發(fā)信號(hào)部分為用于染色活細(xì)胞的活性染色劑。
94.權(quán)利要求82的方法，其中所述種類結(jié)合分子集合具有的家族復(fù)雜度為1。
95.權(quán)利要求82的方法，其中所述種類結(jié)合分子集合具有的家族復(fù)雜度大于1。
96.權(quán)利要求95的方法，其中所述集合具有的家族復(fù)雜度≥5。
97.權(quán)利要求75的方法，其中所述發(fā)信號(hào)部分包含一種或多種化合物，所述化合物只有與所述靶細(xì)胞相連才是可檢測(cè)的，所述靶細(xì)胞組成或所述靶細(xì)胞生理學(xué)、物理學(xué)或微環(huán)境狀態(tài)對(duì)所述發(fā)信號(hào)部分起作用。
98.權(quán)利要求1的方法，其中所述復(fù)制與所述檢測(cè)發(fā)生在特定器皿內(nèi)，所述器皿被構(gòu)建為可以避免其它細(xì)胞進(jìn)入或者樣本中的細(xì)胞逸出。
99.權(quán)利要求1的方法，其中所述復(fù)制與所述檢測(cè)發(fā)生在特定器皿內(nèi)，所述器皿具有用于自動(dòng)跟蹤樣本的條形碼或等效標(biāo)記。
100.權(quán)利要求1的方法，其中所述復(fù)制與所述檢測(cè)發(fā)生在具有記錄標(biāo)記的表面上，所述記錄標(biāo)記有利于相同表面的多個(gè)圖象的排列定位。
101.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)方法檢測(cè)了檢測(cè)區(qū)特定范圍內(nèi)的對(duì)照標(biāo)記或?qū)φ占?xì)胞。
102.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)應(yīng)用了適于檢測(cè)照射所述靶細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)的光學(xué)濾光器。
103.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)應(yīng)用了光電檢測(cè)器。
104.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)應(yīng)用了光電陣列檢測(cè)器。
105.權(quán)利要求104的方法，其中所述光電檢測(cè)器包括CCD檢測(cè)器。
106.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)未應(yīng)用圖象增強(qiáng)器。
107.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)應(yīng)用了光電倍增管檢測(cè)器。
108.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)應(yīng)用了光電二極管檢測(cè)器。
109.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)應(yīng)用了感光底片。
110.一種用于檢測(cè)靶細(xì)胞微集落的設(shè)備，所述設(shè)備包括(a)光學(xué)分辨率不超過(guò)50微米，被圍圓能量值或被圍方形能量值大于每個(gè)像素50％的光電陣列檢測(cè)器；以及(b)照明光源。其中所述設(shè)備能夠照明并同時(shí)使至少一個(gè)維度≥1cm的檢測(cè)面積成像，其中所述設(shè)備不能光學(xué)放大超過(guò)5倍。
111.權(quán)利要求110的設(shè)備，其中所述設(shè)備不包括圖象增強(qiáng)器。
112.權(quán)利要求110的設(shè)備，進(jìn)一步包括用于聚焦所述檢測(cè)區(qū)的自動(dòng)聚焦裝置。
113.權(quán)利要求110的設(shè)備，進(jìn)一步包括計(jì)算機(jī)，由所述光電檢測(cè)器收集的數(shù)據(jù)被傳輸至所述計(jì)算機(jī)以進(jìn)行圖象分析。
114.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在步驟(c)期間或之后，確定微集落數(shù)量的步驟。
115.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在步驟(c)期間或之后，通過(guò)利用圖象分析軟件分析所述檢測(cè)面積的圖象，確定所述靶細(xì)胞種類的步驟。
116.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在步驟(c)期間或之后，通過(guò)利用圖象分析軟件分析所述檢測(cè)面積的圖象，確定所述一個(gè)或多個(gè)微集落在檢測(cè)區(qū)中的定位。
117.權(quán)利要求116的方法，進(jìn)一步包括在步驟(c)期間或之后，比較單個(gè)微集落在檢測(cè)區(qū)中的定位與之前確定的相同微集落的定位的步驟。
118.權(quán)利要求117的方法，其中所述圖象分析軟件包括從不隨時(shí)間改變尺寸的目標(biāo)中辨別出可以隨時(shí)間改變尺寸的目標(biāo)所用的算法。
119.權(quán)利要求114的方法，其中所述測(cè)定包括分析所述檢測(cè)面積的圖象。
120.權(quán)利要求44的方法，其中所述無(wú)菌處理選自熱滅菌、輻射、暴露于毒氣、消毒劑處理。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過(guò)利用大范圍成像檢測(cè)原位細(xì)胞分裂形成的微觀集落，從而有效、快速且靈敏地計(jì)數(shù)活細(xì)胞的方法?；诒景l(fā)明的微生物計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)解決了臨床和工業(yè)微生物學(xué)中的一個(gè)重要難題－采用傳統(tǒng)方法檢測(cè)所需的長(zhǎng)時(shí)間－同時(shí)保留了以微生物培養(yǎng)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的實(shí)施方案包括不利用標(biāo)記試劑檢測(cè)細(xì)胞微集落的非破壞性無(wú)菌方法。這些方法可以產(chǎn)生用于微生物鑒定和確定抗微生物抗性的純培養(yǎng)物。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1582327SQ02822097
公開(kāi)日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2002年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月6日
發(fā)明者D·斯特勞斯 申請(qǐng)人:基因描繪系統(tǒng)有限公司