專利名稱：短的雙鏈RNAs的體外合成方法
技術領域：
本發(fā)明涉及合成短的雙鏈靶特異性RNAs的領域。披露了利用RNA聚合酶和用靶序列特異性DNA寡核苷酸作模板的體外轉(zhuǎn)錄方法。本發(fā)明特別適用于合成短的干擾RNAs(siRNAs)，業(yè)已證實這種干擾RNAs是在植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默期間引起序列特異性RNA降解，以及無脊椎動物和脊椎動物系統(tǒng)的RNA干擾中的關鍵中間體。
背景技術：
RNA沉默是基于RNA的序列特異性導向和降解的一種重要類型的基因調(diào)控。RNA沉默最早是在轉(zhuǎn)基因植物中發(fā)現(xiàn)的，在這里，它被稱為共抑制或轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。直到最近才在纖毛蟲，真菌和從C.elegans到小鼠和人類細胞的多種動物中發(fā)現(xiàn)了與PTGS相關的序列特異性RNA降解過程，RNA干擾(RNAi)。盡管這些過程在細節(jié)上可能不同，RNAi和PTGS是由相同的高度保守的機制產(chǎn)生的，這表明它們具有古老的起源?；具^程包括將一個雙鏈RNA(dsRNA)裂解成小的雙鏈干擾RNAs(siRNA)，由它們指導同源mRNA的識別和定向裂解。所述小的dsRNAs類似于RNA酶III-樣消化的降解產(chǎn)物。具體地講，siRNAs是靶特異性短的雙鏈RNAs，其中，所述siRNAs的每一條鏈具有5’單磷酸，3′羥基末端，和具有2-3個核苷酸的3′突出部分(Caplen，N.等，2001，PNAS(98)9742-9747)。
RNAi業(yè)已引起了人們的極大關注，因為它是一種剔除特定基因活性的方法，該方法特別適用于以前被認為不適合遺傳學分析的物種。最近的研究證實了合成的siRNAs能夠在C.elegans和來自人和小鼠的細胞系中誘導表達的基因特異性抑制(Caplen N.等，2001，PNAS(98)9742-9747；Elbashir S.等，2001，Nature(411)494-498)。在所述文獻中還證實了，與使用較長的dsRNAs相比，在哺乳動物細胞中，siRNAs提供了一種序列特異性答案，所述較長的dsRNAs能使翻譯因子eIF2α失活，導致蛋白合成的普遍抑制。另外，與使用反義技術的基因表達的抑制相比，siRNAs似乎非常穩(wěn)定，并因此可能不需要大量的化學修飾，這種修飾是單鏈RNA反義寡核苷酸延長體內(nèi)半衰期所需要的。
因此，預計采用siRNAs的RNA沉默，將成為基因表達的工程控制和功能性基因組，以及從分子農(nóng)業(yè)到可能的動物基因治療的多種生物技術應用的重要工具。由于不同的siRNAs能夠以不同的效果作用于它們的靶，對于特定靶測試一種以上siRNAs可能是需要的。另外，基因組規(guī)模的反向遺傳學程序需要大量的siRNAs。
不過，與DNA寡聚體合成相比，通過傳統(tǒng)化學合成方法生產(chǎn)雙鏈靶特異性RNA寡聚體，是相對緩慢并且成本高昂的。另外，RNA寡聚體的化學合成需要專用的合成儀和復雜的純化方法。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)短的雙鏈靶特異性RNAs的替代方法，該方法基于使用噬菌體或其他病毒聚合酶和靶序列特異性寡核苷酸模板的體外轉(zhuǎn)錄。與RNA寡聚體的化學合成相比，本發(fā)明比較快速，并且易于操作。
不過，體外轉(zhuǎn)錄的siRNAs與化學合成的RNA寡聚體存在兩方面的差別。首先，與天然存在的siRNAs相同，化學合成的RNA寡聚體具有5’單磷酸基團。體外轉(zhuǎn)錄的siRNAs保留了5’三磷酸基團。尚不了解是否是因為該三磷酸基團的存在，才使得體外轉(zhuǎn)錄的siRNAs不能誘導RNA干擾。
其次，化學合成的RNA寡聚體是用包括離子交換和反相HPLC在內(nèi)的方法高度純化的，其中，所述合成化合物的純度和質(zhì)量是通過包括NMR和質(zhì)譜分析在內(nèi)的方法評估的。在本發(fā)明中，采用了一種簡單的、粗略純化方法，該方法包括大小排阻層析，苯酚∶氯仿提取和乙醇沉淀。同樣尚不了解的是，省略充分的純化方法，是否會影響“體外”轉(zhuǎn)錄的RNAs在RNA介導的沉默中的用途。
令人吃驚的是，本發(fā)明證實了所述5’三磷酸基團和粗略的純化不會影響“體外”轉(zhuǎn)錄的RNAs的RNA沉默活性，并且提供了siRNA合成的另一種途徑，這使得它有可能成為普通分子生物學實驗室的一種研究工具。
合成具有特定長度和序列的小的單鏈RNAs的現(xiàn)有體外方法(Milligan F.等，1987，Nucleic Acid Res.(15)8783-8798)，不能直接應用于合成小的干擾RNAs。問題在于這樣一種事實RNA聚合酶傾向于將啟動子序列的某些核苷酸轉(zhuǎn)錄到轉(zhuǎn)錄物中。其結果是，可以通過使利用上述方法制備的互補的單鏈RNA分子退火生產(chǎn)的靶特異性dsRNAs，必須在5’末端包括由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，并且在3’末端包括與由所述啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸。很可能在靶序列的mRNA中不存在確定序列長度的片段，其中，5’末端由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸組成，而3’末端由與所述啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸組成。本發(fā)明通過提供截短的RNA聚合酶啟動子序列解決了這一問題，其中，啟動子序列的模板鏈的5’末端的一個或多個核苷酸，被作為靶特異性序列一部分的核苷酸所取代。這種取代不會影響體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)率，但是能提高在靶蛋白的mRNA中存在至少一個具有特定序列長度的靶特異性序列的可能性，其中，5’末端由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸組成，而3’末端由與所述啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸組成。
下面將說明本發(fā)明的這一方面和其他方面。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種用于合成短的雙鏈靶特異性RNAs的體外方法，包括以下步驟a)在一種反應混合物中混合有義靶特異性核苷酸模板和鏈延伸酶，以便形成模板延伸的有義寡核糖核苷酸產(chǎn)物；b)在一種反應混合物中混合反義靶特異性寡核苷酸模板和鏈延伸酶，以便形成模板延伸的反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物；和c)讓在步驟a)中獲得的有義寡核糖核苷酸產(chǎn)物與在步驟b)中獲得的互補性反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物雜交。
在本發(fā)明的另一種實施方案中，所述鏈延伸酶是RNA聚合酶，而步驟a)和b)的寡核苷酸模板包括RNA聚合酶啟動子序列，它優(yōu)選由dsRNAs組成。在一種更優(yōu)選的實施方案中，所述RNA聚合酶是T7聚合酶，而步驟a)和b)的寡核苷酸模板包括在模板鏈的5’末端用靶特異性模板序列延伸的T7RNA聚合酶啟動子序列，任選延伸了2或3個額外的核苷酸。
本發(fā)明特別適用于合成小的干擾RNAs。因此，本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于合成靶特異性短的雙鏈RNAs的方法，其中，所述靶特異性短的雙鏈RNAs的長度少于50個核苷酸，優(yōu)選少于30個核苷酸，更優(yōu)選30-12個核苷酸，其特征還在于，在5’末端包括由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，而在3’末端包括與由所述啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸。
因此，本發(fā)明提供了一種用于合成小的干擾RNAs的方法，包括以下步驟a)在一種反應混合物中混合有義siRNA模板和鏈延伸酶，以便形成模板延伸的有義寡核糖核苷酸產(chǎn)物；b)在一種反應混合物中混合反義siRNA模板和鏈延伸酶，以便形成模板延伸的反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物；和c)讓在步驟a)中獲得的有義寡核糖核苷酸產(chǎn)物與在步驟b)中獲得的反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物雜交；其中，步驟a)和b)的siRNA模板包括在所述模板鏈的5’末端用靶特異性模板序列延伸的雙鏈RNA聚合酶啟動子序列，并且具有2或3個額外的核苷酸。在一種優(yōu)選實施方案中，所述鏈延伸酶是T7RNA聚合酶，而所述siRNA模板包括雙鏈T7RNA聚合酶啟動子序列，優(yōu)選

圖1所示出的截短的T7RNA聚合酶啟動子序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于實施本發(fā)明方法的試劑盒以及用于所披露的任何方法中的化合物。
附圖簡述圖1寡核苷酸生產(chǎn)方法。提供了一種用于設計JNK2αl mRNA的編碼序列上的具有19個寡核苷酸的靶序列的siRNA寡核苷酸模板的例子。
圖2A用于熒光素酶報導基因分析中的GL3靶特異性雙鏈siRNAs。利用本發(fā)明的體外方法制備GL3 siRNA1，GL3 siRNA2和GL3 siRNA3。GL3 siRNA寡聚體是通過化學方法合成的(Vargeese，C.等，1988，Nucleic Acid Res.(26)，1046-1050)。
圖2BGL3靶特異性siRNAs和GL3反義單鏈siRNAs對HeLa細胞中熒光素酶表達的影響。將用GL3-對照熒光素酶+報導基因構建體轉(zhuǎn)染的細胞視為100％。
圖2CGL3-siRNA 1對pGL3-對照轉(zhuǎn)染的HeLa細胞中熒光素酶表達的劑量反應曲線。
圖3A用于EGFP-轉(zhuǎn)染的HeLa細胞的FACS分析的EGFP靶特異性雙鏈siRNAs。EGFP ds siRNA 2是用本發(fā)明的體外方法制備的。EGFP ds siRNA寡聚體是通過化學方法合成的(Vargeese，C.等，1988，Nucleic Acid Res.(26)，1046-1050)。
圖3B通過FACScan分析(Beckton-Dickinson)分析EGFP靶特異性siRNAs和EGFP-反義單鏈siRNAs對EGFP-轉(zhuǎn)染的HeLa細胞中GFP熒光的影響。將僅用EGFP DNA轉(zhuǎn)染的細胞視為100％。
圖4A用于JNK2αl轉(zhuǎn)染的HeLa細胞中的JNK2αl靶特異性雙鏈siRNAs。
圖4B用于CDS-1轉(zhuǎn)染的HeLa細胞中的CDS-1靶特異性雙鏈siRNAs。
詳細說明本發(fā)明涉及合成短的雙鏈靶特異性RNAs的領域，并且基于采用鏈延伸酶的寡核苷酸模板的體外轉(zhuǎn)錄。
本文所使用的靶特異性短的雙鏈RNAs，表示與編碼一種特定蛋白，即靶蛋白的部分序列匹配的雙鏈RNA。所述序列的長度優(yōu)選少于50個核苷酸，更優(yōu)選少于30個核苷酸，更優(yōu)選15-25個核苷酸。在一種特定實施方案中，所述靶特異性短的雙鏈RNAs可以作為小的干擾RNAs(siRNAs)用于無脊椎動物和脊椎動物系統(tǒng)的RNA干擾。本發(fā)明所使用的siRNAs是具有12-30個核苷酸的短的dsRNAs分子，具有2-或3-個核苷酸的突出的3’末端。在一種優(yōu)選實施方案中，siRNAs的長度為15-25個核苷酸，具有2個核苷酸的突出的3’末端。更優(yōu)選的是siRNAs的長度為17-22個核苷酸，具有2個核苷酸的突出的3’末端。
為了獲得dsRNA，同時需要有義和反義寡核苷酸模板。本文所使用的術語“寡核苷酸模板”用于表示這樣的結構它在某些直接物理過程中，可以導致第二種結構的模式化，第二種結構通常在某種程度上與其互補。在現(xiàn)代生物學中，幾乎僅用于表示指導通過Watson-Crick堿基配對規(guī)則合成與它互補的序列的核苷酸序列(TheDictionary of Cell and Molecular Biology，3d.Edition，AcademicPress，London，1999(ISBN 0-12-432565-3))。所述模板序列的長度優(yōu)選少于50個核苷酸，并且可以是雙鏈的、單鏈的或部分單鏈的DNA寡聚體模板。
所述寡核苷酸模板可以是合成的DNA模板，或以線性化質(zhì)粒DNA形式產(chǎn)生的模板，它來自克隆在一種載體的限制位點上的靶特異性序列，所述載體如原核克隆載體(pUC13，pUC19)或PCR克隆系統(tǒng)，如Invitrogen的TOPO克隆系統(tǒng)。所述合成DNA模板可以按照本領域眾所周知的技術生產(chǎn)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，所述寡核苷酸模板由部分單鏈的DNA寡聚體模板組成，它包括由dsDNA組成的RNA聚合酶啟動子序列。在本實施方案中，所述靶特異性短的雙鏈RNAs的特征還在于，在它的5’末端包括由RNA聚合酶啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，而在它的3’末端包括與由所述啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸。
本文所定義的“鏈延伸酶”表示能夠由核糖核苷5’三磷酸形成RNA聚合物的酶；所產(chǎn)生的RNA互補于DNA模板。所述酶在RNA鏈的3’-羥基末端添加單核苷酸單位，并因此沿5’→3’方向構建RNA，與用作模板的DNA鏈反向平行。例如，所述鏈延伸酶可以是DNA依賴性聚合酶，如DNA聚合酶I，II和III；RNA-定向的DNA聚合酶，如RSV和AMV-聚合酶；DNA-定向的RNA聚合酶，如大腸桿菌RNA聚合酶；RNA-定向的RNA聚合酶，如噬菌體RNA聚合酶，又被稱為RNA復制酶；或細菌多核苷酸磷酸化酶。
在一種優(yōu)選實施方案中，所述鏈延伸酶是RNA聚合酶。所述RNA聚合酶需要在DNA模板上存在特殊的起始位點。該起始位點在本文中被稱作“RNA聚合酶啟動子序列”，它是RNA聚合酶與DNA模板結合的位點。它還是由RNA聚合酶識別的作為起始信號的位點，以便指示從哪里開始轉(zhuǎn)錄形成RNA。
因此，本發(fā)明提供了由dsDNA組成的包括RNA聚合酶啟動子序列的寡核苷酸模板，其中，所述聚合酶啟動子序列是由RNA聚合酶識別的。本文所使用的術語“識別的”包括在啟動子序列的一側或兩側縮短了一個或多個核苷酸的所有截短的RNA聚合酶啟動子序列，這種截短對RNA聚合酶與起始位點的結合沒有或少有影響，并且對轉(zhuǎn)錄反應沒有或少有影響。例如，Milligan等(Milligan F.等，1987，Nature(15)8783-8798)證實了T7 RNA聚合酶的啟動子似乎不需要非模板鏈上的-17至-14和-3至+6號位置的區(qū)域的DNA，因為除去這些核苷酸對轉(zhuǎn)錄反應少有影響。另外，截短超過模板鏈的+2號位置，即+3至+6號位置的部分，對該反應的產(chǎn)率少有影響(Milligan F.等，1987，Nature(15)8783-8798)。由此獲得的截短的RNA聚合酶啟動子序列被認為屬于“由所述RNA聚合酶識別的RNA聚合酶啟動子序列”。因此，在本發(fā)明的一種具體實施方案中，所述RNA聚合酶啟動子序列由截短的RNA聚合酶啟動子序列組成，其中，缺失了啟動子序列的模板鏈的一側或兩側的一個或多個核苷酸。所述截短的RNA聚合酶啟動子優(yōu)選由圖1所示的在模板鏈的5’末端的+3至+6號位置截短的T7RNA聚合酶啟動子序列組成。
因此，本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于合成短的雙鏈靶特異性RNAs的方法。該方法包括以下步驟a)在一種反應混合物中混合靶特異性有義寡核苷酸模板和鏈延伸酶，以便形成模板延伸的有義寡核糖核苷酸產(chǎn)物；b)在一種反應混合物中混合靶特異性反義寡核苷酸模板和鏈延伸酶，以便形成模板延伸的反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物；和c)讓在步驟a)中獲得的有義寡核糖核苷酸產(chǎn)物與在步驟b)中獲得的反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物雜交。
本發(fā)明方法的鏈延伸酶優(yōu)選是選自T7RNA聚合酶，T3RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶的RNA聚合酶。在一種更優(yōu)選的實施方案中，所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
因此，用于本發(fā)明方法的寡核苷酸包括由dsDNA組成的RNA聚合酶啟動子序列，其中，所述RNA聚合酶啟動子序列是由選自T7RNA聚合酶，T3RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶的RNA聚合酶識別的。在一種優(yōu)選實施方案中，所述RNA聚合酶啟動子序列是由T7RNA聚合酶識別的。在一種更優(yōu)選的實施方案中，所述T7RNA聚合酶啟動子序列由圖1所示的截短的T7RNA聚合酶啟動子序列組成。
在另一種實施方案中，用于本發(fā)明方法的寡核苷酸模板的特征在于，它是部分雙鏈的DNA寡聚體模板，包括雙鏈RNA聚合酶啟動子序列，用靶特異性模板序列延伸所述模板鏈的5’末端，任選用2或3個額外的核苷酸延伸。在一種更優(yōu)選的實施方案中，所述靶特異性模板序列在5’末端包括由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，而在3’末端包括與來自所述啟動子序列的核苷酸互補的核苷酸。在所述具體實施方案中，所述寡核苷酸模板包括如圖1所示的截短的T7RNA聚合酶啟動子序列，所述靶特異性模板序列的包括位于5’末端的兩個鳥苷(g)核苷酸和位于3’末端的兩個胞嘧啶(c)核苷酸。
因此，本發(fā)明的第二種實施方案提供了一種用于合成小的干擾RNAs(siRNAs)的方法，包括以下步驟a)在一種反應混合物中混合有義siRNA模板和鏈延伸酶，以便形成模板延伸的有義寡核糖核苷酸產(chǎn)物；b)在一種反應混合物中混合反義siRNA模板和鏈延伸酶，以便形成模板延伸的反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物；和c)讓在步驟a)中獲得的有義寡核糖核苷酸產(chǎn)物與在步驟b)中獲得的反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物雜交；以便步驟a)和b)的siRNA模板包括在模板鏈的5’末端用靶特異性模板序列和2或3個額外核苷酸延伸的雙鏈RNA聚合酶啟動子序列。在一種優(yōu)選實施方案中，用于siRNAs合成的鏈延伸酶由RNA聚合酶組成，優(yōu)選選自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶。因此，用于本發(fā)明方法中的siRNA模板包括一種RNA聚合酶啟動子序列，它是由選自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶的RNA聚合酶識別的。在一種更優(yōu)選的實施方案中，所述鏈延伸酶是T7RNA聚合酶。因此，在一種優(yōu)選實施方案中，所述siRNA模板的RNA聚合酶啟動子序列是由T7 RNA聚合酶識別的。在另一種實施方案中，所述siRNA模板包括如圖1所示的雙鏈截短的T7 RNA聚合酶啟動子序列，其中，所述截短的T 7RNA聚合酶啟動子序列是按照本發(fā)明方法，在模板鏈的5’末端延伸的，并且，其中，所述靶特異性模板序列在它的5’末端包括由所述啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，而在3’末端包括與由所述啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸。在一種具體實施方案中，用于本發(fā)明方法中的siRNA模板包括如圖1所示的雙鏈截短的T7 RNA聚合酶啟動子序列，其中，所述截短的T7 RNA聚合酶啟動子序列是用本發(fā)明方法在所述模板的5’末端延伸的，并且，所述靶特異性模板序列包括位于5’末端的兩個鳥苷(g)核苷酸和位于3’末端的兩個胞嘧啶(c)核苷酸。
在上述用于獲得模板延伸的寡核苷酸產(chǎn)物的任一種方法中使用的反應條件為本領域所公知。實際上，用于酶促轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)RNA的原始材料是DNA模板，RNA聚合酶，和四種需要的核糖核苷酸堿基腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤和尿嘧啶的核苷三磷酸(NTPs)，它們存在于最有利于RNA聚合酶活性的反應緩沖液中。例如，使用T7 RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄的反應混合物，通常包括T7 RNA聚合酶(0.05mg/ml)，寡核苷酸模板(1μM)，每一種NTP(4mM)，和用于提供Mg2+的MgCl2(25mM)，用于所述聚合酶的輔因子。在37℃和pH8.1(例如，在10mM Tris-HCl緩沖液)的條件下，溫育該混合物若干小時(MilliganJ.& Uhlenbeck O.，1989，Methods Enzymol(180)51-62)。包括上述成分的試劑盒可以通過商業(yè)渠道獲得，如MEGA shortscriptTM-T7試劑盒(Ambion)。
由上述任一種方法獲得寡核苷酸產(chǎn)物的純化方法為本領域所普遍公知，并且包括凝膠電泳，大小排阻層析，毛細管電泳和HPLC。凝膠電泳通常被用于純化來自反應混合物的完整長度的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但是，該技術不適用于以較大規(guī)模生產(chǎn)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，用于獲得寡核苷酸產(chǎn)物的純化方法包括大小排阻層析，如SephadexG-25樹脂，任選與苯酚∶氯仿∶異戊醇提取，和乙醇沉淀組合。
本發(fā)明的第三個目的是提供用于實施本發(fā)明方法的試劑盒。在一種實施方案中，所述試劑盒包括一種或多種下列成分a)設計靶特異性有義和反義寡核苷酸模板的說明書；b)鏈延伸酶；c)轉(zhuǎn)錄緩沖液；d)四種需要的核糖核苷酸堿基的核苷三磷酸(NTPs)；e)用于獲得所述有義和反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物的純化工具。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，在所述試劑盒中提供的鏈延伸酶由RNA聚合酶組成，優(yōu)選選自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶的RNA聚合酶。更優(yōu)選的是，在本發(fā)明的試劑盒中提供的鏈延伸酶是T7 RNA聚合酶。
在本發(fā)明的試劑盒中所提供的分離工具，一般是指本領域已知的用于從反應混合物中獲得寡核糖核苷酸產(chǎn)物的純化方法，其中包括凝膠電泳，大小排阻層析，毛細管電泳和HPLC。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，在本發(fā)明的試劑盒中所提供的純化工具由大小排阻層析柱或樹脂組成，如Sephadex G-25樹脂。
設計靶特異性有義和反義寡核苷酸模板的說明書應當考慮在本發(fā)明的圖1中所示出的方法。所述方法基本上包括以下步驟1)尋找位于靶基因的編碼序列內(nèi)的靶特異性序列，該靶特異性序列具有以下序列5′-xx(n12-30)yy-3′，其中，x表示由啟動子轉(zhuǎn)錄的核苷酸，y表示與由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸，而n12-30表示具有12-30個核苷酸的任何寡核苷酸；2)設計一種有義寡核苷酸模板，它包括本發(fā)明的雙鏈RNA聚合酶啟動子序列，在所述模板鏈的5′末端，用在步驟1)中定位的靶特異性序列的互補寡核苷酸序列延伸，任選用兩個額外核苷酸延伸；3)設計一種反義寡核苷酸模板，它包括本發(fā)明的雙鏈RNA聚合酶啟動子序列，在所述模板鏈的5′末端，用在步驟1)中定位的靶特異性序列的反向寡核苷酸序列延伸，任選用兩個額外核苷酸延伸。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，用T7 RNA聚合酶作為鏈延伸酶。在所述實施方案中，設計靶特異性有義和反義寡核苷酸模板的方法包括以下步驟1)尋找位于所述靶基因的編碼序列中的靶特異性序列，它具有以下序列5′-gg(n12-30)cc-3′；2)設計一種具有以下序列的有義寡核苷酸模板5′TAATACGACTCACTATAGG3′ATTATGCTGAGTGATATcc(n互補體)12-30gg-任選用兩個額外的核苷酸延伸，其中，(n互補體)12-30表示在步驟1)中定位的靶特異性序列的互補寡核苷酸序列；和3)設計一種具有以下序列的反義寡核苷酸模板5′TAATACGACTCACTATAGG3′ATTATGCTGAGTGATATcc(n反向)12-30gg-任選用兩個額外的核苷酸延伸，其中，(n反向)12-30表示在步驟1)中定位的靶特異性序列的反向寡核苷酸序列。
在一種具體實施方案中，本發(fā)明的方法被用于合成小的干擾RNAs(siRNAs)。在所述實施方案中，所述設計靶特異性有義和反義siRNA模板的方法包括以下步驟1)尋找位于所述靶基因的編碼序列內(nèi)，并且具有以下序列5′-xx(n15-30)yy-3′的靶特異性序列。其中，x表示由啟動子轉(zhuǎn)錄的核苷酸，y表示與由所述啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸，而n15-30表示具有15-30個核苷酸的任何寡核苷酸；2)設計一種包括本發(fā)明的雙鏈RNA聚合酶啟動子序列的有義寡核苷酸siRNA模板，在所述模板的5′末端，用在步驟1)中定位的靶特異性序列的互補寡核苷酸序列延伸，用兩個額外的核苷酸延伸，優(yōu)選用兩個腺嘌呤殘基延伸；3)設計一種包括本發(fā)明的雙鏈RNA聚合酶啟動子序列的反義寡核苷酸siRNA模板，所述模板的5′末端，用在步驟1)中定位的靶特異性序列的反向寡核苷酸序列延伸，用兩個額外的核苷酸延伸，優(yōu)選用兩個腺嘌呤殘基。
在所述具體實施方案中，所述合成siRNAs的方法用T7 RNA聚合酶作為鏈延伸酶，所述設計靶特異性有義和反義siRNA模板的方法包括以下步驟1)尋找位于所述靶基因編碼序列內(nèi)，并且具有以下序列5′-gg(n15-30)cc-3′的靶特異性序列；2)設計一種具有以下序列的有義寡核苷酸siRNA模板5′TAATACGACTCACTATAGG3′ATTATGCTGAGTGATATcc(n互補體)15-30gg aa其中，(n互補體)15-30表示在步驟1)中定位的靶特異性序列的互補寡核苷酸序列；和3)設計一種具有以下序列的反義寡核苷酸siRNA模板5′TAATACGACTCACTATAGG3′ATTATGCTGAGTGATATcc(n反向)15-30gg aa其中，(n互補體)15-30表示在步驟1)中定位的靶特異性序列的反向寡核苷酸序列。
因此，本發(fā)明提供了一種用于合成短的雙鏈靶特異性RNAs的試劑盒，該試劑盒包括至少一種下列成分a)設計靶特異性有義和反義寡核苷酸模板的說明書；b)鏈延伸酶；c)轉(zhuǎn)錄緩沖液；d)四種需要的核糖核苷酸堿基的核苷三磷酸(NTPs)；e)獲得所述有義和反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物的純化工具。
因此，在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了用于合成小的干擾RNAs的試劑盒，該試劑盒包括至少一種下列成分a)設計靶特異性有義和反義siRNA模板的說明書；b)鏈延伸酶；c)轉(zhuǎn)錄緩沖液；d)四種需要的核糖核苷酸堿基的核苷三磷酸(NTPs)；e)獲得所述有義和反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物的純化工具。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于任何所披露的用來體外合成短的雙鏈RNAs的方法的工具。因此，本發(fā)明提供了i)設計靶特異性有義和反義寡核苷酸模板的方法ii)用于體外合成短的雙鏈RNAs的本發(fā)明的鏈延伸酶
iii)獲得所述有義和反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物的純化工具iv)用于所述反應混合物，以便利用本發(fā)明的鏈延伸酶，由所述靶特異性有義和反義寡核苷酸模板產(chǎn)生有義和反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物的試劑。
本發(fā)明的另一個目的是將通過本發(fā)明方法獲得的siRNAs用于抑制靶基因在細胞中表達的方法中。該方法包括將可通過本發(fā)明方法獲得的siRNAs導入細胞。
所述靶基因可以是來自所述細胞的基因(即細胞基因)，內(nèi)源基因(即存在于基因組中的細胞基因)，轉(zhuǎn)基因(即插入所述細胞基因組的異位位點的基因構建體)，或來自病原體的基因，該病原體能夠感染獲得所述細胞的生物。根據(jù)特定的靶基因和所輸送的雙鏈RNA材料的劑量，該方法可以提供所述靶基因功能的部分或全部喪失。
具有所述靶基因的細胞可以來自任何生物或包含在任何生物內(nèi)。所述生物可以是植物，動物，原生動物，細菌，病毒或真菌。所述植物可以是單子葉植物，雙子葉植物或裸子植物；所述動物可以是脊椎動物或無脊椎動物。所述具有靶基因的細胞可以來自生殖細胞系或體細胞，全能細胞或多能細胞，分裂的或未分裂的細胞，軟組織或上皮細胞，永生化細胞或轉(zhuǎn)化過的細胞等。所述細胞可以是干細胞或分化過的細胞。分化過的細胞種類包括脂肪細胞，成纖維細胞，肌細胞，心肌細胞，內(nèi)皮細胞，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細胞，血細胞，巨核細胞，淋巴細胞，巨嗜細胞，嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞，肥大細胞，白細胞，粒細胞，角質(zhì)形成細胞，軟骨細胞，成骨細胞，破骨細胞，肝細胞，和內(nèi)分泌或外分泌腺體的細胞。
可通過本發(fā)明的方法獲得的分離的RNA由靶特異性短的雙鏈RNAs組成，其中，所述靶特異性短的雙鏈RNAs的長度少于50個核苷酸，優(yōu)選少于30個核苷酸，更優(yōu)選30-12個核苷酸，其特征在于，在它的5’末端包括由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，而在3’末端包括與由所述啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸，由所述啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸的數(shù)量以及與由所述啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸的數(shù)量優(yōu)選為2，3或4個核苷酸，更優(yōu)選2個核苷酸。
可通過本發(fā)明的方法獲得的短的雙鏈RNAs，任選在3′末端用2或3個額外的核苷酸延伸，并且，在本發(fā)明的其他實施方案中，被表示為具有以下有義序列5′-xx(n12-30)yy-3′，其中，x表示由啟動于序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，y表示與由所述啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸，而n12-30表示具有12-30個核苷酸的任何寡核苷酸。在一種具體實施方案中，所述短的雙鏈RNAs具有有義序列5′-gg(n15-30)cc-3′，其中，g表示由截短的T7 RNA聚合酶啟動子序列(如圖1所示)轉(zhuǎn)錄的核苷酸鳥苷，而n15-30表示具有15-30個核苷酸的任何寡核苷酸。
所述RNA可以直接導入所述細胞(即細胞內(nèi)的)；或?qū)爰毎獾那皇?，間質(zhì)腔，進入生物的循環(huán)系統(tǒng)，口服導入，或通過將一種生物浸泡在含有所述RNA的溶液中導入。用于口服導入的方法，包括直接將所述RNA與所述生物的食物混合，以及工程方法，例如，通過工程改造使被用作食物的物種能表達所述RNA，然后給要影響的生物食用。例如，可以將所述RNA噴灑在植物上，或者通過遺傳工程方法，使植物以足以殺傷某些或全部已知能感染該植物的病原體的量表達所述RNA。
還可以使用導入核酸的物理方法，例如，直接注射到所述生物的細胞中或注射到所述生物的細胞外。我們在本文中披露了，導入HeLa細胞外面的雙鏈RNA能夠抑制基因表達。
血管內(nèi)或血管外循環(huán)，血液或淋巴系統(tǒng)，韌皮部，根，和腦脊液是可以導入RNA的部位。能夠由重組構建體表達RNA的轉(zhuǎn)基因生物，可以通過將所述構建體導入來自合適的生物的合子，胚胎干細胞，或其他多能細胞中生產(chǎn)。
導入核酸的物理方法包括注射含有RNA的溶液，用由所述RNA覆蓋的粒子轟擊，在所述RNA的溶液浸泡細胞或生物，或在存在所述RNA的情況下，對細胞膜進行電穿孔。包裝在病毒顆粒中的病毒構建體能夠同時實現(xiàn)將表達構建體有效導入所述細胞，并且通過轉(zhuǎn)錄由所述表達構建體編碼的RNA?？梢允褂帽绢I域已知的用于導入核酸的其他方法，如脂介導的載體轉(zhuǎn)運，化合物，如磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)運等。因此，所述RNA可以與具有一種或多種下列活性的成分一起導入增強細胞對RNA的攝取，促進雙鏈的退火，穩(wěn)定所述退火鏈，或加強所述靶基因的抑制。
本發(fā)明可用于將RNA導入細胞，以便治療或預防疾病。例如，可以將dsRNA導入癌細胞或腫瘤，以便抑制維持癌發(fā)生/腫瘤發(fā)生表型所需要的基因的基因表達。為了預防疾病或其他病理學，可以選擇啟動或維持所述疾病/病理學所需要的靶基因。因此，在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，它包括可通過本發(fā)明方法獲得的短的雙鏈RNAs，以便抑制靶基因的基因表達，并且包括一種合適的載體。所述組合物能夠以任何合適的方法給藥，例如，注射，口服，眼眶內(nèi)，局部，鼻腔，直腸使用等。所述載體可以是任何合適的藥用載體，優(yōu)選使用能夠增強所述RNA分子進入靶細胞的效率的載體，例如脂質(zhì)體，天然病毒衣殼，或通過化學或酶促方法生產(chǎn)的人工衣殼或由它衍生的結構。
本發(fā)明的其他用途可以是在一種生物中鑒定基因功能的方法，包括利用雙鏈RNA抑制具有以前未知的功能的靶基因的活性。取代傳統(tǒng)遺傳學篩選的耗費時間和勞動力的突變體分離過程的是，通過采用本發(fā)明設想確定功能性基因組的未鑒定過的基因的功能，以便降低靶基因活性的量和/或改變其活性的作用時間?？梢詫⒈景l(fā)明用于確定藥物的潛在靶，了解與發(fā)育相關的正常和病理學事件，確定負責出生后發(fā)育/老化的信號傳導途徑等。日益加快的從基因組和表達的基因來源，包括人類、小鼠、酵母、果蠅和C.elegans基因組獲得核苷酸序列信息的速度，可以與本發(fā)明結合在一起，以便確定生物(例如線蟲)的基因功能。不過，不同生物使用特定密碼子的偏好性，在序列數(shù)據(jù)庫中查找相關的基因產(chǎn)物，將遺傳性狀連鎖圖與獲得核苷酸序列的物理圖譜相關聯(lián)，以及人工智能方法，可用于根據(jù)在所述測序項目中獲得的核苷酸序列，確定推測的開放讀框。
一種簡單的分析方法是按照由已表達序列標志(EST)獲得的部分序列抑制基因表達。生長、發(fā)育、代謝、抗病性或其他生物過程的功能性改變，可能是EST′s基因產(chǎn)物的正常作用的指標。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種抑制靶基因在細胞中表達的方法，包括將RNA導入細胞，其中，所述RNA包括靶特異性短的雙鏈RNA，其中，所述靶特異性短的雙鏈RNA的長度少于50個核苷酸，優(yōu)選少于30個核苷酸，更優(yōu)選30-12個核苷酸，其特征在于，在它的5’末端包括由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，而在它的3’末端包括與由所述啟動子轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸，其中，所述啟動子序列是由一種RNA聚合酶識別的。在另一種實施方案中，所述啟動子序列是由選自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶的RNA聚合酶識別的。
通過參考以下實驗詳述，能更好地理解本發(fā)明，不過，本領域技術人員可以理解的是，這些詳述只是用于說明本發(fā)明的，正如在下面的權利要求書中更詳細地說明的。另外，在本申請中，引用了多份文獻。這些文獻的內(nèi)容被作為參考收入本申請中，以便更全面地說明本發(fā)明所屬技術領域的現(xiàn)狀。
實施例1體外轉(zhuǎn)錄的EGFP和GL3特異性短的dsRNAs，在人類細胞中誘導RNA轉(zhuǎn)染材料和方法質(zhì)粒構建體熒光素酶+是由質(zhì)粒pGL3-對照(Promega)表達的。EGFP是由EGFP/pcDNA5-FRT表達的，它包括來自pEGFP(Clontech)的EGFP基因，該基因定向連接在哺乳動物表達載體pcDNA5/FRT(Invitrogen)的HindIII和NotI位點上。
SiRNAs的體外轉(zhuǎn)錄和雜交在10mM Tris-HCl pH9.0，100mM NaCl，1mM EDTA中，讓寡聚體模板鏈與有義T7啟動子序列(5′TAATACGACTCACTATAGG)雜交，包括煮沸2分鐘，并且用2-3小時緩慢冷卻到室溫。
轉(zhuǎn)錄是使用MEGAshortscriptTMT7試劑盒(Ambion)，按照生產(chǎn)商的說明進行的。在G-25自旋柱上純化siRNA。苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取，使用Heavy Phase-Lock Gels(Eppendorf)，并且在-80℃下用乙醇沉淀過夜。讓互補的siRNA鏈在1mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA pH8.0中雜交，包括煮沸2分鐘，并且用2-3小時緩慢冷卻到室溫。通過在非變性20％聚丙烯酰胺TBE凝膠上電泳ds-和ss-siRNAs，評估雜交。
細胞系和轉(zhuǎn)染在補充了1.8mM l-谷氨酰胺，9％FBS，和45U/l青霉素/鏈霉素的具有高濃度葡萄糖和l-谷氨酰胺(Invitrogen)的DMEM中生長HeLa細胞。以類似于Elbashir等(2001)披露的方法轉(zhuǎn)染細胞。在轉(zhuǎn)染之前24小時，對細胞進行胰蛋白酶化，并且用缺乏抗生素的生長培養(yǎng)基稀釋到3×105細胞/ml。將0.5ml細胞接種到24孔平板的每一個孔中。用1微克GL3-對照或EGFP/pcDNA5-FRT報導基因構建體和50pmol單鏈或25pmol雙鏈siRNAs轉(zhuǎn)染所述細胞，除非另有說明，按照生產(chǎn)商的說明使用LipofectamineTM2000(LF2000；Invitrogen)。具體地講，我們在每個孔中將LF2000用于48微升缺少抗生素的無血清培養(yǎng)基中。在與用相同的培養(yǎng)基稀釋到50微升總體積的報導基因和/或siRNAs混合之前，在室溫下將稀釋過的LF2000預培養(yǎng)1分鐘。然后在室溫下溫育復合物20分鐘，然后添加到所述細胞中。EGFP和GL3報導基因分析是在24小時后進行的。對于JNK2αl siRNA實驗和GL3 siRNA劑量反應實驗來說，使用6孔平板。細胞數(shù)量增加了4倍，而試劑用量增加了5倍。對于JNK2αl siRNA實驗來說，大約在轉(zhuǎn)染之后48小時收獲細胞，用于RNA分離和蛋白提取。
報導基因分析使用FACScan(Beckton-Dickinson)對EGFP-轉(zhuǎn)染的細胞進行FACS分析。將細胞胰蛋白酶化，并且用PBS洗滌，然后重新懸浮在FACS固定溶液中(PBS+1％甲醛)中。通過比較用水轉(zhuǎn)染的樣品和用EGFP/pcDNA5-FRT轉(zhuǎn)染的樣品，估算轉(zhuǎn)染效率，該效率通常為75-90％。根據(jù)在有或沒有共轉(zhuǎn)染的siRNAs的樣品中平均GFP熒光的改變，估算由轉(zhuǎn)錄的或合成的siRNAs誘導的RNAs的程度。
對于熒光素酶分析來說，將細胞胰蛋白酶化，并且將100微升的等分樣品轉(zhuǎn)移到白色96孔組織培養(yǎng)平板的3個孔中。使用Luc-ScreenTM系統(tǒng)(Applied Biosystems)和TopCount-NXTTM微量平板閃爍和發(fā)光計數(shù)器(Packard)，按照生產(chǎn)商的說明進行分析。
Northern和Western印跡分析使用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen)，按照生產(chǎn)商的說明，用大約106HeLa細胞的樣品制備總RNA。在預制MOPS Latitude RNA瓊脂糖凝膠(BioWhittaker Molecular Applications)上對樣品進行電泳，并且按照生產(chǎn)商的說明轉(zhuǎn)移到Hybond-XL尼龍膜(AP Biotech)上。使用Rediprime II系統(tǒng)(AP Biotech)，按照生產(chǎn)商的說明制備DNA探針。雜交是在Rapid-Hyb溶液(AP Biotech)中按照生產(chǎn)商的說明進行的。
細胞核和細胞質(zhì)蛋白提取物是按照Gordon(1991)披露的方法進行的，用完整的蛋白酶抑制劑混合物(Roche)代替亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、和抑胃酶肽，并且省略了脫氧膽酸鈉。
在4-20％SDS聚丙烯酰胺小凝膠(Invitrogen)上對提取物進行電泳，使用彩虹蛋白標記物(AP Biotech)，并且電印跡到0.2微米的Tansblot吸印硝酸纖維素膜(BioRad)上。用PBS+0.05％Tween-20漂洗所述印跡，并且在4℃下，在含有5％奶粉的PBS/Tween-20中，與以1∶150的比例稀釋的JNK2 D2小鼠單克隆抗體(Santa Cruz Biotech)一起溫育過夜。然后用PBS/Tween-20洗滌所述印跡3次，然后與1∶3000的HRP-偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體(BioRad)一起溫育45分鐘。再洗滌3次，并且在PBS/Tween-20中溫育30分鐘，然后通過ECL系統(tǒng)(APBiotech)檢測。
結果以前業(yè)已用siRNAs證實了RNAi，除了兩個3’突出核苷酸之外，它是雙鏈的(Elbashir等2001；Caplen等2001)。為了較快并且較廉價地生產(chǎn)多種用于多種細胞靶的siRNAs，我們設計了一種用于采用體外轉(zhuǎn)錄技術制備所述分子的方法。
Milligan等(1987)披露了使用部分單鏈的DNA寡聚體模板，通過T7 DNA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄的方法。標準的T7小型啟動子包括位于3’末端的3個鳥苷核苷酸，它是作為轉(zhuǎn)錄物的前3個堿基摻入的。不過，第三個鳥苷通?？梢杂闷渌塑账崛〈?，而又不會顯著降低體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)率(Milligan等1987)。因此，通過這種方法生產(chǎn)的siRNAs應當包括兩個5’鳥苷核苷酸?？拷恳粭lsiRNA鏈的3’末端的兩個互補的胞嘧啶核苷酸是必要的，以便與另一條鏈上的5’鳥苷堿基配對。以這種方式生產(chǎn)的特定長度的siRNAs，應當能夠靶定平均以大約250個核苷酸一次的頻率出現(xiàn)在mRNA中的序列。
我們設計的DNA寡聚體模板兼顧到了上述限制因素(圖1)。將每一種模板用于轉(zhuǎn)錄siRNA的一條鏈。通過經(jīng)過Sephadex G-25大小排阻柱，苯酚∶氯仿提取，和醇沉淀，對所述鏈進行粗略純化。然后將所述鏈重新懸浮在退火緩沖液中，并且通過煮沸和緩慢冷卻雜交。
我們的體外轉(zhuǎn)錄的siRNAs與以前使用的化學合成的產(chǎn)物有兩方面的差別。首先，所有其他報導過的siRNAs都是經(jīng)過高度純化的。其次，體外轉(zhuǎn)錄的siRNAs保留了5’三磷酸基團。與作為天然RNAi機制的一部分在體內(nèi)生產(chǎn)的siRNA類似，化學合成的RNA寡核苷酸通常使siRNAs具有攜帶的5’單磷酸。為了確定上述差別是否使得我們的siRNAs不能誘導RNAi，我們首先檢驗了針對兩個報導基因-EGFP和GL3設計的雙鏈siRNAs(圖2和3)。示出了來自至少三個獨立實驗的結果和標準誤(圖2B，圖3B)。
轉(zhuǎn)錄的GL3 ds siRNA 1將共轉(zhuǎn)染的pGL3-對照報導質(zhì)粒的熒光素酶活性降低了大約5倍，而僅用雙倍摩爾濃度的反義鏈沒有作用。用化學合成的GL3 ds siRNA(ds 1 RNA寡聚體)獲得了類似結果。第二種轉(zhuǎn)錄的siRNA具有更適中的作用。而第三種轉(zhuǎn)錄的siRNA具有很強的作用。單用反義鏈也觀察到了顯著活性。來自雙鏈類型的作用的強度是劑量依賴性的(圖2C)，并且改變了穩(wěn)態(tài)RNA水平。EGFP dssiRNA 2對熒光素酶活性同樣具有適中的作用(圖2B)。不過，這種作用似乎是非特異性的，并且在較大劑量下表現(xiàn)出有限的反應。
在用EGFP/pcDNA5-FRT報導基因共轉(zhuǎn)染的細胞中，相同的轉(zhuǎn)錄的EGFP ds siRNA 2明顯減弱GFP熒光(圖3B)。用有義或反義鏈本身或用化學合成的siRNA(EGFP dsl RNA寡聚體)或它的組成部分，獲得了更適中的作用。EFP熒光不受GL3 ds siRNA 3的影響。
上面所提到的體外轉(zhuǎn)錄的(IVT)熒光素酶ds siRNAs以不同的程度對熒光素酶活性產(chǎn)生了抑制作用。作為RNAi活性的陽性對照，我們使用了化學合成的熒光素酶ds siRNA。在我們看來，所述合成的dssiRNA將來自共轉(zhuǎn)染的pGL3-對照報導質(zhì)粒的熒光素酶活性降低了大約5倍。所有實驗的轉(zhuǎn)染效率在91-95％之間波動。一種IVT-熒光素酶ds siRNA(GL3 ds siRNA 1)將熒光素酶活性降低了78％，而2倍摩爾濃度的ds siRNA的反義RNA鏈本身沒有作用。我們試驗的第二種IVT-siRNA(GL3 ds siRNA 2)具有更適中的作用(36％抑制作用)。而第三種IVT-siRNA具有很強的作用(82％的抑制作用)，僅用反義RNA鏈同樣觀察到了顯著活性(55％的抑制作用)，使得所述結果令人費解。各自具有單獨使用它們時的1/3摩爾濃度的三種IVT-siRNAs混合物具有中等作用(70％的抑制作用)，而不是協(xié)同作用，這表明使用多種siRNAs靶定相同的基因可能是沒有優(yōu)勢的。我們可以證實來自ds類型的抑制作用是劑量依賴性的。盡管非特異性GFP siRNA(GFP ds siRNA2)對熒光素酶活性同樣具有適中的作用(46％的抑制作用)，這種作用似乎是非特異性的，并且在較大劑量下表現(xiàn)出有限的反應(數(shù)據(jù)未示出)。
相同的IVT-GFP ds siRNA(GFP ds siRNA 2)在用GFP/pcDNA5-FRT報導基因共轉(zhuǎn)染的細胞中能強效減弱GFP熒光(87％的抑制作用)。單獨使用有義(41％)或反義(19％)鏈或使用化學合成的siRNA(GFP dsl RNA寡聚體)或它的組成部分獲得了更為適中的作用。正如所預料的，GFP熒光不受非特異性熒光素酶ds siRNA 3的影響。
為了證實內(nèi)源基因表達也受轉(zhuǎn)錄的siRNAs的影響，我們靶定了JNK2αl(圖4A)和CDS-1(圖4B)基因的產(chǎn)物。與用作為轉(zhuǎn)染對照的水(模擬物)，EGFP/pcDNA5-FRT質(zhì)粒(僅有EGFP DNA)，單鏈siRNAs，或非特異性siRNA(EGFP ds siRNA 2)轉(zhuǎn)染的細胞相比，Western和Nothern印跡分析，發(fā)現(xiàn)了在用轉(zhuǎn)錄的siRNA(JNK2αl dssiRNA1-估計降低了87％)或化學合成的siRNA(JNK2αl ds 1 RNA寡聚體-估計降低了76％)轉(zhuǎn)染的HeLa細胞的細胞核提取物樣品中的JNK2αl蛋白和RNA水平的特異性降低。
與模擬物轉(zhuǎn)染的細胞相比，Western印跡分析在用CDS 1-特異性IVT-siRNAs轉(zhuǎn)染的HeLa細胞的細胞質(zhì)提取物中發(fā)現(xiàn)了CDS1蛋白含量的適當?shù)?高達67％)降低，但是在用非特異性siRNA轉(zhuǎn)錄的細胞中沒有發(fā)現(xiàn)。
實施例2體外轉(zhuǎn)錄的小鼠Insr特異性短的dsRNAs，剔除Balb/C小鼠肝臟中的Insr雄性Balb/C小鼠(大約25克)(標準圈養(yǎng)，自由接觸食物/水)接受尾部靜脈注射，注射使用鹽水2.3毫升，或含有40微克針對鼠胰島素受體(NCBI保藏號NM-010568；2536-2556號堿基)的siRNA的鹽水，它是通過體外轉(zhuǎn)錄的截短的T7啟動子方法制備的，同時使用800 U RNA酶抑制劑。
所述注射是盡可能快地進行的(8-10秒)，在24，48和72小時處死2只對照和2只siRNA處理的小鼠。迅速取出肝臟，稱重，在干冰/異丙醇中冷凍。用粉碎的冷凍組織和RNEasy Maxi試劑盒(Qiagen)提取總RNA。
在第一條鏈cDNA合成之后，通過Q-PCR，使用Smart循環(huán)儀(引物F 3526-3548，R 3744-3768)分析胰島素受體的mRNA，同樣通過Q-PCR將結果對親環(huán)蛋白A表達標準化(NCBI保藏號NM017101的157-182和496-521號堿基)。
權利要求
1.一種用于合成靶特異性短的雙鏈RNAs的方法，包括以下步驟a)在一種反應混合物中混合靶特異性有義核苷酸模板和鏈延伸酶，以便形成模板延伸的有義寡核糖核苷酸產(chǎn)物；b)在一種反應混合物中混合靶特異性反義寡核苷酸模板和鏈延伸酶，以便形成模板延伸的反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物；和c)讓在步驟a)中獲得的有義寡核糖核苷酸產(chǎn)物與在步驟b)中獲得的互補性反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物雜交。
2.如權利要求1的方法，其中，所述鏈延伸酶是RNA聚合酶。
3.如權利要求2的方法，其中，所述RNA聚合酶選自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶或SP6聚合酶。
4.如權利要求1的方法，其中，步驟a)和b)的寡核苷酸模板包括由dsDNA組成的RNA聚合酶啟動子序列。
5.如權利要求4的方法，其中，所述RNA聚合酶啟動子序列是由選自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶或SP6聚合酶的RNA聚合酶識別的。
6.如權利要求4-5中任意一項的方法，其中，所述RNA聚合酶啟動子序列是由T7 RNA聚合酶識別的。
7.如權利要求4-6中任意一項的方法，其中，步驟a)和b)的寡核苷酸模板的特征還在于，它是部分雙鏈的DNA寡聚體模板，該模板包括雙鏈RNA聚合酶啟動子序列，該序列在模板鏈的5’末端用靶特異性模板序列延伸。
8.如權利要求4-7中任意一項的方法，其中，所述RNA聚合酶啟動子序列由圖1所示的截短的T7 RNA聚合酶啟動子序列組成。
9.如權利要求1-8中任意一項的方法，其中，所述靶特異性短的雙鏈RNA的長度少于30個核苷酸。
10.如權利要求1-8中任意一項的方法，其中，所述靶特異性短的雙鏈RNA的特征在于，在它的5’末端包括由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，而在3’末端包括與由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸。
11.一種用于合成小的干擾RNAs(siRNA)的方法，包括以下步驟a)在一種反應混合物中混合有義siRNA模板和鏈延伸酶，以便形成模板延伸的有義寡核糖核苷酸產(chǎn)物；b)在一種反應混合物中混合有義siRNA模板和鏈延伸酶，以便形成模板延伸的反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物；和c)讓在步驟a)中獲得的有義寡核糖核苷酸產(chǎn)物與在步驟b)中獲得的反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物雜交；其中，步驟a)和b)中的siRNA模板包括在模板鏈的5’-末端用靶特異性模板序列延伸的雙鏈RNA聚合酶啟動子序列，以及2或3個額外的核苷酸。
12.如權利要求11的方法，其中，所述鏈延伸酶是RNA聚合酶。
13.如權利要求12的方法，其中，所述RNA聚合酶選自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶或SP6聚合酶。
14.如權利要求12的方法，其中，所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
15.如權利要求11的方法，其中，所述RNA聚合酶啟動子序列是由選自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶或SP6聚合酶的RNA聚合酶識別的。
16.如權利要求15的方法，其中，所述RNA聚合酶啟動子序列是由T7 RNA聚合酶識別的。
17.如權利要求16的方法，其中，所述RNA聚合酶啟動子序列由圖1所示的截短的T7 RNA聚合酶啟動子序列組成。
18.如權利要求11的方法，其中，所述靶特異性模板序列的特征還在于包括5’末端的兩個鳥苷(g)核苷酸，和位于3’末端的兩個胞嘧啶(c)核苷酸。
19.一種抑制靶基因在細胞中的表達的方法，包括將RNA導入細胞，其中，所述RNA包括少于50個核苷酸的靶特異性短的雙鏈RNA，其特征在于，在它的5’末端包括由RNA聚合酶啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，而在它的3’末端包括與由所述RNA聚合酶啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸。
20.如權利要求19的方法，其中，由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸的數(shù)量以及與由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸的數(shù)量為2，3或4個核苷酸。
21.如權利要求19或20的方法，其中，所述靶特異性短的雙鏈RNA的3’末端用2或3個額外的核苷酸延伸。
22.如權利要求19-21中任意一項的方法，其中，所述RNA聚合酶啟動子序列是由選自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶或SP6聚合酶的RNA聚合酶識別的。
23.如權利要求19-22中任意一項的方法，其中，所述RNA聚合酶啟動子序列由圖1所示的截短的T7 RNA聚合酶啟動子序列組成。
24.如權利要求19-23中任意一項的方法，其中，所述靶基因是細胞基因，內(nèi)源基因，轉(zhuǎn)基因，或來自病原體的基因。
25.可通過權利要求1-18中任意一項的方法獲得的分離的RNA。
26.如權利要求25的分離的RNA，其中，所述RNA由少于50個核苷酸的靶特異性短的雙鏈RNA組成，在它的5’末端包括由RNA聚合酶啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，而在它的3’末端包括與由所述RNA聚合酶啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸。
27.如權利要求25或26的分離的RNA，其中，由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸的數(shù)量以及與由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸的數(shù)量為2，3或4個核苷酸。
28.如權利要求25-27中任意一項的分離的RNA，其中，所述RNA分子的有義序列可以表示為5′-xx(n12-30)yy-3′，其中，x表示由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，y表示與由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸，而n表示具有12-30個核苷酸的任何寡核苷酸。
29.如權利要求25-28中任意一項的分離的RNA，其中，所述RNA分子的有義序列可以表示為5′-gg(n15-30)cc-3′，其中，g表示由截短的T7RNA聚合酶啟動子(如圖1所示)序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸鳥苷，c表示與由截短的T7RNA聚合酶啟動子(如圖1所示)序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸胞嘧啶，而n15-30表示具有15-30個核苷酸的任何寡核苷酸。
30.如權利要求25-29中任意一項的分離的RNA，其中，所述靶特異性短的雙鏈RNA的3’末端用2或3個額外的核苷酸延伸。
31.用于權利要求1-18中任意一項的方法中的靶特異性有義寡核苷酸模板。
32.用于權利要求1-18中任意一項的方法中的靶特異性反義寡核苷酸模板。
33.如權利要求31和32的靶特異性寡核苷酸模板，其中，所述寡核苷酸模板包括由dsRNA組成的RNA聚合酶啟動子序列，所述dsRNA的5’末端是用靶特異性模板序列延伸的。
34.如權利要求31-33的靶特異性寡核苷酸模板，其中，所述RNA聚合酶啟動子序列由圖1所示的截短的T7 RNA聚合酶啟動子序列組成。
35.如權利要求31-34的靶特異性寡核苷酸模板，其中，所述靶特異性短的雙鏈RNA的長度少于30個核苷酸。
36.如權利要求31-35的靶特異性寡核苷酸模板，其中，所述靶特異性短的雙鏈RNA的特征在于，在它的5’末端包括由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸，而在它的3’末端包括與由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸。
37.一種用于合成短的雙鏈靶特異性RNAs的試劑盒，該試劑盒包括至少一種下列成分a)設計靶特異性有義和反義寡核苷酸模板的說明書；b)鏈延伸酶；c)轉(zhuǎn)錄緩沖液；d)四種需要的核糖核苷酸堿基的核苷三磷酸(NTPs)；e)用于獲得所述有義和反義寡核糖核苷酸產(chǎn)物的純化工具。
38.如權利要求37的試劑盒，其中，用于設計所述靶特異性有義和反義寡核苷酸模板的說明書中描述了具有以下步驟的方法1)尋找位于靶基因的編碼序列內(nèi)的靶特異性序列，該靶特異性序列具有以下序列5′-xx(n12-30)yy-3′，其中，x表示由啟動子轉(zhuǎn)錄的核苷酸，y表示與由啟動子序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸互補的核苷酸，而n12-30表示具有12-30個核苷酸的任何寡核苷酸；2)設計一種有義寡核苷酸模板，它包括本發(fā)明的雙鏈RNA聚合酶啟動子序列，在所述模板鏈的5′末端，用在步驟1)中定位的靶特異性序列的互補寡核苷酸序列延伸，任選用兩個額外核苷酸延伸；3)設計一種反義寡核苷酸模板，它包括本發(fā)明的雙鏈RNA聚合酶啟動子序列，在所述模板鏈的5′末端，用在步驟1)中定位的靶特異性序列的反向寡核苷酸序列延伸，任選用兩個額外核苷酸延伸。
39.如權利要求37的試劑盒，其中，所述鏈延伸酶為RNA聚合酶，優(yōu)選為選自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶的RNA聚合酶。
40.如權利要求37-39中任意一項的試劑盒，其中，所述純化工具為大小排阻層析柱。
全文摘要
本發(fā)明涉及合成短的雙鏈RNAs的領域。披露了利用噬菌體聚合酶和用靶序列特異性單鏈DNA寡核苷酸作模板的體外轉(zhuǎn)錄方法。本發(fā)明特別適用于合成短的干擾RNAs (siRNAs)，業(yè)已證實這種干擾RNAs是在植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默期間引起序列特異性RNA降解，以及無脊椎動物和脊椎動物系統(tǒng)的RNA干擾中的關鍵中間體。
文檔編號C12N15/10GK1604963SQ02822098
公開日2005年4月6日 申請日期2002年10月30日 優(yōu)先權日2001年11月5日
發(fā)明者M·D·德貝克, A·N·哈里斯 申請人:詹森藥業(yè)有限公司