專利名稱：生產(chǎn)甲硫氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
目前，通過(guò)完善建立的化學(xué)方法以DL-甲硫氨酸外消旋混合物形式生產(chǎn)甲硫氨酸。大多數(shù)DL-甲硫氨酸通過(guò)相同化學(xué)步驟方法的變異方案生產(chǎn)，其中涉及毒性、危險(xiǎn)性、易燃、不穩(wěn)定和高度有氣味的起始材料或中間體。用于化學(xué)合成的起始材料是丙烯醛、甲硫醇和氰化氫?；瘜W(xué)合成包括產(chǎn)生中間體3-甲基巰基丙醛(MMR)的甲硫醇和丙烯醛反應(yīng)。在進(jìn)一步的步驟中，MMR與氰化氫反應(yīng)以形成5-(2-甲硫基乙基)乙內(nèi)酰脲，然后利用2當(dāng)量的苛性堿(caustics)諸如NaOH和二分之一當(dāng)量Na2CO3一起水解它，產(chǎn)生鈉-DL-甲硫氨酸鹽和1當(dāng)量Na2CO3，1當(dāng)量NH3和二分之一當(dāng)量CO2。在隨后的步驟，用1.5當(dāng)量硫酸和1當(dāng)量Na2CO3中和鈉-DL-甲硫氨酸鹽以產(chǎn)生DL-甲硫氨酸Na2SO4和CO2。顯然，與產(chǎn)生的甲硫氨酸量比較，這種化學(xué)方法產(chǎn)生了大量摩爾過(guò)量的無(wú)用鹽。這個(gè)事實(shí)造成了經(jīng)濟(jì)和生態(tài)問(wèn)題。
發(fā)酵方法通?；谠跔I(yíng)養(yǎng)物上培養(yǎng)微生物，所述營(yíng)養(yǎng)物包含碳水化合物源(例如，糖諸如葡萄糖果糖或蔗糖)，氮源(例如，氨)和硫源(例如，硫酸鹽或硫代硫酸鹽)及其它必需培養(yǎng)基成分。這種方法僅產(chǎn)生天然產(chǎn)物L(fēng)-甲硫氨酸和僅有生物質(zhì)做為副產(chǎn)物。因?yàn)榘l(fā)酵方法不使用毒性、危險(xiǎn)、易燃、不穩(wěn)定和高度有氣味的起始材料，并且不產(chǎn)生鹽，所以這種方法優(yōu)于化學(xué)甲硫氨酸合成。可以在生物體諸如大腸桿菌(E.coli)或棒狀桿菌屬(Corynebacter)中生產(chǎn)甲硫氨酸(Kase H.，Nakayama K.(1975)Agric.Biol.Chem.39，153-160頁(yè)；Chatterjee等.(1999)Acta Biotechnol.14，pp199-204頁(yè)；Harma S.Gomes，(2001)J.Eng.Life Sci.1，pp69-73頁(yè)，JP50031092，DE 2105189)。
所有活細(xì)胞都具有帶有許多相互連接途徑的復(fù)雜分解代謝和合成代謝能力。為了維持這種極其復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)各個(gè)部分之間的平衡，細(xì)胞利用了精細(xì)調(diào)諧的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。通過(guò)獨(dú)立地或同時(shí)地調(diào)節(jié)酶合成和酶活性，細(xì)胞能控制根本不同的代謝途徑的活性以反映細(xì)胞的變化需要。在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平，或者在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平可以發(fā)生酶合成的誘導(dǎo)或阻遏。轉(zhuǎn)錄水平的幾種機(jī)理調(diào)節(jié)原核生物中基因表達(dá)(綜述，參見(jiàn)例如Lewin，B(1990)Genes IV，Part 3″Controlling prokaryotic genes by transcription″，Oxford University PressOxford，213-301頁(yè)，和其中的參考文獻(xiàn)，和Michal，G.(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and MolecularBiology，John Wiley & Sons)。由另外的基因介導(dǎo)所有這些已知的調(diào)節(jié)過(guò)程，該另外的基因本身對(duì)各種外部作用產(chǎn)生應(yīng)答(例如，溫度、養(yǎng)分的可獲得性或光照)。參與這種類型調(diào)節(jié)的示例性蛋白質(zhì)因子包括轉(zhuǎn)錄因子。這些因子是結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)，并由增加基因表達(dá)(正調(diào)節(jié))或減少基因表達(dá)(負(fù)調(diào)節(jié))。這些調(diào)節(jié)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子本身可以是調(diào)節(jié)的對(duì)象。例如，通過(guò)低分子量化合物與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合可以調(diào)節(jié)它們的活性，由此刺激或抑制這些蛋白質(zhì)與DNA上適宜結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合(參見(jiàn)，例如Helmann，J.D.和Chamberlin，M.J.(1988)″Structure and function ofbacterial sigma factors.″Ann.Rev.Biochem.57839-872；Adhya，S.(1995)″The lac and gal operons today″和Boos，W.等，″The maltose system.″，兩篇文獻(xiàn)在Regulation of Gene Expression in Escherichia coli(Lin，E.C.C.和Lynch，A.S.，編輯.)Chapman & HallNew York，181-200和201-229頁(yè)；和Moran，C.P.(1993)″RNA polymerase and transcriptionfactors.″inBacillus subtilis and other gram-positive bacteria，Sonenshein，A.L.等編輯.ASMWashington，D.C.，653-667頁(yè))。
在Genbank記錄號(hào)AP005283下公開(kāi)了谷氨酸棒桿狀菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032的整個(gè)基因組。然而，沒(méi)有給出甲硫氨酸生物合成特異性調(diào)節(jié)物的任何提示。
各種因子諸如底物、分解代謝產(chǎn)物和終產(chǎn)物的細(xì)胞和細(xì)胞外水平可以控制基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的正或負(fù)調(diào)節(jié)。典型地，編碼特定途徑的活性所必需的酶的基因的表達(dá)受該途徑的底物分子的高水平誘導(dǎo)。相似地，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在高水平的該途徑的終產(chǎn)物時(shí)，傾向于阻遏這種基因表達(dá)(Snyder，L.和Champness，W.(1997)The Molecular Biology of Bacteria ASMWashington)。其它外部和內(nèi)部因素諸如環(huán)境條件(例如，熱、氧化脅迫或饑餓；參見(jiàn)，例如Lin，E.C.C.和Lynch，A.S.，編輯(1995)Regulation ofGene Expression in Escherichia coli.Chapman & HallNew York)也可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
詳盡地理解微生物中控制細(xì)胞新陳代謝的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)對(duì)于通過(guò)發(fā)酵高產(chǎn)率生產(chǎn)化學(xué)品至關(guān)重要?？梢砸瞥驕p少代謝途徑負(fù)調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)以改進(jìn)期望化學(xué)品的合成，并且相似地，可以組成地激活期望產(chǎn)物的代謝途徑的正調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)，或者在活性上最優(yōu)化該控制系統(tǒng)(如Hirose，Y.和Okada，H.(1979)″Microbial Production of Amino Acids″，inPepper，H.J.和Perlman，D.(編輯)Microbial Technology，第二版.1卷，7章，AcademicPressNew York所述)。
然而，目前為止還沒(méi)有描述過(guò)基于甲硫氨酸生物合成調(diào)節(jié)系統(tǒng)的修飾來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)甲硫氨酸的甲硫氨酸生物合成方法。在所有報(bào)道的發(fā)酵生產(chǎn)甲硫氨酸的方法中，對(duì)于經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)而言，產(chǎn)率看起來(lái)太低。因此，需要改進(jìn)的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)精細(xì)化學(xué)品，優(yōu)選地含硫化合物(象，例如甲硫氨酸)生物合成的新方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的代謝調(diào)節(jié)(metabolicregulatory)(“MR”)分子參與精細(xì)化學(xué)品，優(yōu)選地含硫化合物(象，例如甲硫氨酸)的生物合成。
特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MR分子RXA00655是甲硫氨酸生物合成，半胱氨酸生物合成和/或硫還原途徑的負(fù)調(diào)節(jié)物，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MR分子RXN02910是甲硫氨酸生物合成的正調(diào)節(jié)物，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。這里RXA00655的核苷酸序列記載于SEQ ID NO1，并且這里RXA00655的多肽序列記載于SEQ ID NO2。這里RXN02910的核苷酸序列記載于SEQ ID NO5，并且這里RXN02910的多肽序列記載于SEQ ID NO6。這里RXA00655的同源蛋白質(zhì)記載于SEQ ID NO19，21和23。這里所述RXN02910同源蛋白質(zhì)的核苷酸序列記載于SEQ ID NO18，20和22。
可以通過(guò)調(diào)節(jié)本發(fā)明MR核酸的表達(dá)，例如增加RXN02910核酸分子的表達(dá)或增加RXN02910蛋白質(zhì)的活性，抑制RXA00655核酸分子的表達(dá)或抑制RXA00655蛋白質(zhì)的活性，或者通過(guò)修飾本發(fā)明MR核酸分子的序列以改變MR核酸分子的活性，來(lái)調(diào)節(jié)，例如增加精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物自微生物的生產(chǎn)(例如，提高精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸或甲硫氨酸生物合成途徑的其它化合物自棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)物種的生產(chǎn)或產(chǎn)量)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以將增加RXN02910核酸的表達(dá)或蛋白質(zhì)的活性和抑制RXA00655核酸的表達(dá)或蛋白質(zhì)的活性相聯(lián)合，以調(diào)節(jié)，例如增加自微生物(例如，棒狀桿菌屬或短桿菌屬物種)的精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物的生產(chǎn)。
本發(fā)明特征在于調(diào)節(jié)含硫化合物的微生物生產(chǎn)的方法，該方法包括在可以調(diào)節(jié)含硫化合物的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)微生物，其中該微生物具有表達(dá)或活性受到調(diào)節(jié)的至少一種甲硫氨酸生物合成調(diào)節(jié)物。優(yōu)選地，所述含硫化合物選自甲硫氨酸、半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸和高半胱氨酸。而且優(yōu)選地，增加所述含硫化合物(例如，甲硫氨酸)的生產(chǎn)。
本發(fā)明涉及增加通過(guò)微生物的含硫化合物生產(chǎn)的方法，該方法包括在增加含硫化合物的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)超表達(dá)甲硫氨酸生物合成正調(diào)節(jié)物例如RXN02910的微生物。而且，本發(fā)明還涉及增加微生物的含硫化合物生產(chǎn)的方法，該方法包括在增加含硫化合物的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)下調(diào)表達(dá)(underexpress)甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物，例如RXA00655的微生物。
因此，本發(fā)明涉及生產(chǎn)甲硫氨酸及甲硫氨酸生物合成途徑的其它化合物的方法。這些方法包括在生產(chǎn)甲硫氨酸或甲硫氨酸生物合成途徑的其它化合物的條件下，培養(yǎng)超表達(dá)RXN02910基因產(chǎn)物的微生物。該方法也包括培養(yǎng)RXA00655基因產(chǎn)物表達(dá)受抑的微生物，以生產(chǎn)甲硫氨酸或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物。本發(fā)明也提供了用于生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品的方法，該方法包括聯(lián)合培養(yǎng)超表達(dá)RXN02910基因產(chǎn)物的微生物和RXA00655基因產(chǎn)物表達(dá)受抑的微生物。
MR蛋白質(zhì)能夠例如，參與如下蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后調(diào)節(jié)，其中該蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞正常的代謝功能是重要的。因?yàn)榭梢缘玫接糜诠劝彼岚魻顥U菌(Corynebacterium glutamicum)中的克隆載體(諸如下面的示例)，所以可以在該生物體的基因工程中使用本發(fā)明的核酸分子以使它成為更好或更有效的精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的生產(chǎn)者。
精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸在產(chǎn)率、生產(chǎn)和/或生產(chǎn)效率上的這種提高可以由操作本發(fā)明基因，例如RXA00655或RXN02910的直接作用所致，或者可以由于這種操作的間接作用所致。具體地，正常地調(diào)節(jié)甲硫氨酸代謝途徑的產(chǎn)率、生產(chǎn)和/或生產(chǎn)效率的谷氨酸棒狀桿菌MR蛋白質(zhì)中的改變可能直接影響自該生物體生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品(例如甲硫氨酸，半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物)的總產(chǎn)量或生產(chǎn)速率。參與甲硫氨酸代謝途徑的蛋白質(zhì)中的改變也可能對(duì)期望的精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率具有間接影響。代謝調(diào)節(jié)必然是復(fù)雜的，并且控制不同途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制可以在多個(gè)點(diǎn)交叉，這樣根據(jù)特定細(xì)胞事件可以快速調(diào)整一個(gè)以上的途徑。這使得對(duì)一個(gè)途徑的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的修飾也能夠?qū)υS多其它途徑的調(diào)節(jié)產(chǎn)生影響，而這些其它途徑中的一些途徑可能參與期望的精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的生物合成或降解。以這種間接的方式，對(duì)MR蛋白質(zhì)作用的調(diào)節(jié)將影響產(chǎn)生自不同于該MR蛋白質(zhì)直接調(diào)節(jié)的途徑的代謝途徑的精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)。
本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子可以用于直接改進(jìn)自谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)甲硫氨酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。利用本領(lǐng)域已知的重組基因工程技術(shù)，可以操作本發(fā)明的一種或多種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，以調(diào)整其功能或表達(dá)。例如，對(duì)于編碼氨基酸，例如甲硫氨酸生物合成所需的多肽的基因(例如metY基因)，在參與該基因的轉(zhuǎn)錄阻遏的MR蛋白質(zhì)，例如RXA00655上進(jìn)行突變，使它不再能阻遏轉(zhuǎn)錄，將可以引起該氨基酸生產(chǎn)的增加。相似地，通過(guò)改變MR蛋白質(zhì)活性，引起參與期望的精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的生產(chǎn)的谷氨酸棒狀桿菌蛋白質(zhì)的翻譯增加或激活該蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，也可以增加該化學(xué)品的生產(chǎn)。相反的情況也可能是有益的通過(guò)對(duì)參與調(diào)節(jié)化合物降解途徑的谷氨酸棒狀桿菌蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄或翻譯實(shí)施增加阻遏，或者通過(guò)翻譯后負(fù)修飾該蛋白質(zhì)，可以增加該化學(xué)品的生產(chǎn)。在每種情況下，均可以增加期望的精細(xì)化學(xué)品的總產(chǎn)率或生產(chǎn)速率。
本發(fā)明蛋白質(zhì)和核苷酸分子中這種改變也可能通過(guò)間接機(jī)制改進(jìn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。細(xì)胞中任何一種化合物的代謝必然與其它生物合成和降解途徑交織，并且一個(gè)途徑中必需的輔因子、中間體或底物可能由另一途徑提供或者受該途徑限制。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)本發(fā)明一種或多種調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)的活性，可能影響另一精細(xì)化學(xué)品生物合成或降解途徑的活性或生產(chǎn)效率。而且，對(duì)一種或多種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的操作可能增加培養(yǎng)中(特別是生長(zhǎng)條件可能是次最佳的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)中)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的總體能力。例如，當(dāng)正常地本發(fā)明MR蛋白質(zhì)引起核苷酸生物合成阻遏以應(yīng)答次最佳的細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)(因此，阻止細(xì)胞分裂)時(shí)，通過(guò)突變此MR蛋白質(zhì)，使得阻遏蛋白能力減少，可以增加核苷酸的生物合成和可能地增加細(xì)胞分裂。引起培養(yǎng)物中增加的細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的MR蛋白質(zhì)中的改變，可以至少由于培養(yǎng)物中生產(chǎn)化學(xué)品的細(xì)胞的數(shù)量增多而引起由培養(yǎng)物生產(chǎn)一種或多種期望的精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)量、生率和/或生產(chǎn)效率的增加。
本發(fā)明提供了包含調(diào)節(jié)序列和核酸分子的新轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，該核酸分子編碼代謝途徑蛋白質(zhì)(MR蛋白質(zhì))或其片段，其中所述調(diào)節(jié)序列能優(yōu)選地在微生物中介導(dǎo)所述核酸分子的表達(dá)。優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)序列是與所述核酸分子異源的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)序列是在谷氨酸棒狀桿菌中起作用的啟動(dòng)子序列。
MR蛋白質(zhì)能，例如，執(zhí)行參與谷氨酸棒狀桿菌中代謝途徑的轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后調(diào)節(jié)的酶促步驟。編碼MR蛋白質(zhì)的核酸分子這里稱為MR核酸分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，MR蛋白質(zhì)參與一個(gè)或多個(gè)代謝途徑的轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后調(diào)節(jié)。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，MR核酸分子選自a)包含與SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22核苷酸序列或其互補(bǔ)序列具有至少60％同一性的核苷酸序列的核酸分子；b)包含核酸的至少30個(gè)核苷酸的片段的核酸分子，其中所述核酸包含SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ IDNO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；c)編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含與SEQ ID NO2，SEQ IDNO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23氨基酸序列具有至少約60％同一性的氨基酸序列；和d)編碼多肽的片段的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ IDNO21或SEQ ID NO23的氨基酸序列，其中所述片段包含SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23的氨基酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒可以包含相對(duì)于所述啟動(dòng)子序列在反義或有義方向的編碼MR蛋白質(zhì)(例如RXA00655或RXA02910)的核酸分子。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼MR蛋白質(zhì)(例如RXA00655或RXA02910)的核酸分子編碼多肽，該多肽包含SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中所示的氨基酸序列。尤其優(yōu)選所述核酸分子包含SEQ ID NO1，SEQ IDNO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示核苷酸序列。核酸分子也可以編碼多肽的天然等位變異體，其中所述多肽包含SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ IDNO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一方面涉及包含至少一個(gè)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的載體。優(yōu)選地，該載體是表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一方面涉及用至少一個(gè)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒或至少一個(gè)本發(fā)明載體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使用該宿主細(xì)胞生產(chǎn)MR蛋白質(zhì)。然后，可以從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞分離此MR蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一方面涉及已經(jīng)引入或改變了MR基因的遺傳改變的微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)引入做為轉(zhuǎn)基因的編碼野生型或突變MR序列的本發(fā)明核酸分子，改變了微生物的基因組。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)與改變的MR基因同源重組，改變了，例如功能性破壞了微生物基因組中內(nèi)源MR基因。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變、缺失或倒位改變了微生物中內(nèi)源或引入的MR基因，但是該基因仍舊編碼功能性MR蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，(例如，通過(guò)缺失、截短、倒位或點(diǎn)突變)改變了微生物中MR基因的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)(例如，啟動(dòng)子、阻遏蛋白或誘導(dǎo)物)，以調(diào)節(jié)MR基因的表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物屬于棒狀桿菌屬或短桿菌屬，特別優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物也用于期望的化合物諸如氨基酸，特別優(yōu)選甲硫氨酸的生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一方面涉及生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品的方法。該方法包括培養(yǎng)含有指導(dǎo)本發(fā)明MR核酸分子表達(dá)的載體的細(xì)胞，以生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括獲得含有這種載體的細(xì)胞的步驟，其中用指導(dǎo)MR核酸表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括從培養(yǎng)物回收精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的步驟。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞來(lái)源于棒狀桿菌屬或短桿菌屬，或者選自表1中所示的那些菌株。
本發(fā)明的另一方面涉及用于調(diào)節(jié)微生物中的分子生產(chǎn)的方法。這種方法包括用調(diào)節(jié)MR蛋白質(zhì)活性或MR核酸表達(dá)的試劑接觸細(xì)胞，使細(xì)胞相關(guān)活性與不存在該試劑的情況下的相同活性比較發(fā)生改變。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)谷氨酸棒狀桿菌代謝途徑調(diào)節(jié)系統(tǒng)，以改進(jìn)通過(guò)這種微生物生產(chǎn)期望精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的產(chǎn)率或生產(chǎn)速率。調(diào)節(jié)MR蛋白質(zhì)活性的試劑可以是刺激MR蛋白質(zhì)活性或MR核酸表達(dá)的試劑。刺激MR蛋白質(zhì)活性或MR核酸表達(dá)的試劑的例子包括已經(jīng)引入細(xì)胞中的編碼MR蛋白質(zhì)的核酸、小分子、活性MR蛋白質(zhì)。抑制MR活性或表達(dá)的試劑的例子包括小分子和反義MR核酸分子。
本發(fā)明另一方面涉及用于調(diào)節(jié)細(xì)胞生產(chǎn)期望化合物的產(chǎn)率的方法，該方法包括將野生型或突變MR基因引入細(xì)胞中，使該MR基因維持在單獨(dú)的質(zhì)粒上或者整合到宿主細(xì)胞的基因組中。如果整合到基因組中，這種整合可以是隨機(jī)的，或者可以通過(guò)同源重組發(fā)生這種整合，從而由引入的拷貝置換天然基因，使得細(xì)胞中期望化合物的生產(chǎn)受到調(diào)節(jié)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，增加所述產(chǎn)率。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述化學(xué)品是精細(xì)化學(xué)品。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述精細(xì)化學(xué)品是氨基酸。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述氨基酸是甲硫氨酸。


圖1描述了基于同源重組的自身克隆技術(shù)原理，該技術(shù)用于制備甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物(RXA00655，如SEQ ID NO1所示)缺陷的谷氨酸棒狀桿菌株系。
發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明提供了代謝調(diào)節(jié)(metabolicregulatory)(MR)核酸和蛋白質(zhì)分子，例如RXA00655和RXN02910核酸和蛋白質(zhì)分子，它們通過(guò)例如對(duì)參與甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的基因，例如metY基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，而參與微生物，例如谷氨酸棒狀桿菌中的代謝調(diào)節(jié)，包括精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸生物合成的調(diào)節(jié)。
因此，本發(fā)明涉及基于操作微生物中甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑以生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如含硫化合物，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物的方法。
術(shù)語(yǔ)“甲硫氨酸生物合成途徑”包括涉及甲硫氨酸形成或合成中利用的甲硫氨酸生物合成酶(例如，生物合成酶編碼基因編碼的多肽)、化合物(例如，前體、底物、中間體或產(chǎn)物)、輔因子等等的途徑。甲硫氨酸是人類營(yíng)養(yǎng)所需要的氨基酸。細(xì)菌從氨基酸和其生物合成中間體合成它們自己的甲硫氨酸(Escherichia Coli and SalmonellaCellular and MolecularBiology，Neidhardt，F(xiàn)rederick C.Curtiss，Roy III Ingraham，John L.編輯，第二版.1996，ASM Press和Hwang BJ.Yeom HJ.Kim Y.Lee HS.Journalof Bacteriology.184(5)1277-86，2002)。術(shù)語(yǔ)“半胱氨酸生物合成途徑”包括涉及半胱氨酸形成或合成中利用的半胱氨酸生物合成酶(例如，生物合成酶編碼基因編碼的多肽)、化合物(例如，前體、底物、中間體或產(chǎn)物)、輔因子等等的途徑。術(shù)語(yǔ)“硫還原途徑”包括涉及如下酶的途徑，該酶起到代謝無(wú)機(jī)化合物諸如硫和其衍生物的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RXA00655是精細(xì)化學(xué)品生物合成，例如甲硫氨酸生物合成的負(fù)調(diào)節(jié)物，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。因此，RXA00655基因表達(dá)的阻遏或抑制或RXA00655基因的剔除將引起微生物，例如谷氨酸棒狀桿菌中精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物的增加生產(chǎn)。減少或抑制RXA00655基因表達(dá)或RXA00655多肽活性的突變一旦引入也可以引起微生物，例如谷氨酸棒狀桿菌中精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物的增加生產(chǎn)。
也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RXN02910是精細(xì)化學(xué)品生物合成，例如甲硫氨酸生物合成的正調(diào)節(jié)物，例如轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)物。因此，RXN02910基因的超表達(dá)引起微生物，例如谷氨酸棒狀桿菌中甲硫氨酸和甲硫氨酸生物合成途徑的其它化合物的增加生產(chǎn)。增加RXN02910基因表達(dá)或RXN02910多肽活性的突變?cè)谝牒笠惨鹞⑸?，例如谷氨酸棒狀桿菌中甲硫氨酸和甲硫氨酸生物合成途徑的其它化合物的增加生產(chǎn)。
而且，在微生物中RXA00655表達(dá)的阻抑或抑制或RXA00655基因的剔除聯(lián)合RXN02910基因的超表達(dá)也引起微生物中精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物的增加生產(chǎn)。而且，通過(guò)具有阻抑或抑制的RXA00655表達(dá)的微生物或具有RXA00655基因剔除的微生物與超表達(dá)RXN02910基因的微生物的一起培養(yǎng)，也引起自微生物生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物的生產(chǎn)增加。
因此，本發(fā)明一方面的特征在于生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸或甲硫氨酸生物合成途徑的其它化合物的方法，該方法包括在可以生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸或甲硫氨酸生物合成途徑的其它化合物的條件下培養(yǎng)超表達(dá)RXN02910的微生物。超表達(dá)RXN02910的微生物包括經(jīng)操作而超表達(dá)RXN02910的微生物。
術(shù)語(yǔ)“超表達(dá)的”或“超表達(dá)”包括基因產(chǎn)物(例如，RXN02910基因產(chǎn)物)的表達(dá)水平高于微生物操作前的表達(dá)水平或者高于沒(méi)有進(jìn)行操作的相應(yīng)微生物中的表達(dá)水平。例如，特定基因，例如RXN02910的超表達(dá)包括與沒(méi)有進(jìn)行操作以超表達(dá)該特定基因的生物體中的該基因表達(dá)相比，高10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％的表達(dá)。本發(fā)明包括上述百分?jǐn)?shù)中間的范圍和同一性值。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以遺傳操作(例如，基因改造)微生物以超表達(dá)基因產(chǎn)物，使該基因產(chǎn)物的水平高于微生物操作前表達(dá)的水平或者高于沒(méi)有進(jìn)行操作的相應(yīng)微生物中表達(dá)的水平。基因操作可以包括但不限于(例如，通過(guò)添加強(qiáng)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或多個(gè)啟動(dòng)子，或者通過(guò)移除調(diào)節(jié)序列使表達(dá)是組成型的)改變或修飾與特定基因表達(dá)相關(guān)的調(diào)節(jié)序列或位點(diǎn)，改變特定基因的染色體位置，改變特定基因鄰近的核酸序列諸如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，增加特定基因的拷貝數(shù)，修飾參與特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、抑制因子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活物等)，或者本領(lǐng)域常規(guī)的解除特定基因的表達(dá)調(diào)節(jié)的任何其它常規(guī)手段(包括但不限于例如，反義核酸分子的應(yīng)用以阻斷阻抑蛋白的表達(dá))。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物的方法，該方法包括在可以生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物的條件下，培養(yǎng)具有阻抑或抑制的RXA00655表達(dá)的微生物。具有阻抑的RXA00655表達(dá)的微生物包括已經(jīng)被操作以使得RXA00655表達(dá)受阻抑或抑制的微生物。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)的阻抑”，“表達(dá)的抑制”或“下調(diào)表達(dá)”包括基因產(chǎn)物(例如RXA00655基因產(chǎn)物或RXN02910基因產(chǎn)物)的表達(dá)水平低于微生物操作前表達(dá)的水平或者低于沒(méi)有進(jìn)行操作的相應(yīng)微生物中表達(dá)的水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)基因表達(dá)的阻抑或抑制包括操作微生物使得基因不再表達(dá)。例如，特定基因，例如RXA00655的下調(diào)表達(dá)包括與沒(méi)有進(jìn)行操作以下調(diào)表達(dá)該特定基因的生物體中的該基因表達(dá)相比，低10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％的表達(dá)。本發(fā)明包括上述百分?jǐn)?shù)中間的范圍和同一性值。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以遺傳操作(例如，基因改造)微生物以表達(dá)基因產(chǎn)物，使該基因產(chǎn)物的水平低于微生物操作前表達(dá)的水平或者低于沒(méi)有進(jìn)行操作的相應(yīng)微生物中表達(dá)的基因產(chǎn)物水平。遺傳操作可以包括但不限于改變或修飾與特定基因表達(dá)相關(guān)的調(diào)節(jié)序列或位點(diǎn)，改變特定基因的染色體位置，改變特定基因鄰近的核酸序列諸如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，減少特定基因的拷貝數(shù)，修飾參與特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、抑制因子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活物等)，反義核酸分子的應(yīng)用，靶基因的剔除或者本領(lǐng)域常規(guī)的解除對(duì)特定基因的表達(dá)調(diào)節(jié)的任何其它常規(guī)手段。RXA00655基因表達(dá)或RXN02910基因表達(dá)缺陷的微生物包括阻抑或抑制了RXA00655或RXN02910表達(dá)的微生物。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的方法，該方法包括在生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的條件下培養(yǎng)具有增加的RXN02910活性的微生物。“具有增加的RXN02910活性的微生物”包括已經(jīng)被操作以增加RXN02910活性的微生物。
在另一方面，本發(fā)明特征在于生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物的方法，該方法包括在生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物的條件下，培養(yǎng)具有減少的RXA00655活性的微生物?！坝袦p少的RXA00655活性的微生物”包括已經(jīng)被操作以抑制或阻抑RXA00655活性的微生物。
術(shù)語(yǔ)“RXN02910活性”包括引起精細(xì)化學(xué)品生物合成，例如甲硫氨酸生物合成的任何活性。RXN02910活性包括但不限于正調(diào)節(jié)甲硫氨酸生物合成途徑從而引起甲硫氨酸生物合成或甲硫氨酸生物合成途徑的其它化合物的生物合成。可以用任何方法進(jìn)行甲硫氨酸生物合成途徑的正調(diào)節(jié)，所述方法包括但不限于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)及蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)(通過(guò)例如蛋白質(zhì)結(jié)合)。增加的活性包括這樣的活性，該活性水平高于微生物操作前顯示的活性或者高于沒(méi)有進(jìn)行操作的相應(yīng)微生物中顯示的活性。術(shù)語(yǔ)“RXA00655活性”包括引起精細(xì)化學(xué)品生物合成，例如甲硫氨酸生物合成的任何活性。RXA00655活性的例子包括但不限于對(duì)甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑(如Escherichia Coli and SalmonellaCellular and Molecular Biology，Neidhardt，F(xiàn)rederick C.Curtiss，Roy IIIIngraham，John L編輯，第二版.1996，ASM Press中所述)的負(fù)調(diào)節(jié)，該負(fù)調(diào)節(jié)引起甲硫氨酸生物合成減少、甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物的生物合成減少。可以通過(guò)任何方法進(jìn)行甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的負(fù)調(diào)節(jié)，所述方法包括，但不限于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)及蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)(通過(guò)例如蛋白質(zhì)結(jié)合)。減少或阻抑的活性包括這樣的活性，該活性水平低于微生物操作前顯示的活性或者低于沒(méi)有進(jìn)行操作的相應(yīng)微生物中顯示的活性。
本發(fā)明涉及增加通過(guò)微生物的含硫化合物生產(chǎn)的方法，該方法包括在增加含硫化合物的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)超表達(dá)甲硫氨酸生物合成的正調(diào)節(jié)物，例如RXN02910的微生物。本發(fā)明也涉及增加通過(guò)微生物的含硫化合物生產(chǎn)的方法，該方法包括在增加含硫化合物的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)下調(diào)表達(dá)甲硫氨酸生物合成的負(fù)調(diào)節(jié)物，例如RXA00655的微生物。
術(shù)語(yǔ)“含硫化合物”包括含硫或其衍生物的任何化合物。含硫化合物包括氨基酸，該氨基酸包括，但不限于甲硫氨酸、半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸和高半胱氨酸。這里RXA00655核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，并且這里RXA00655多肽序列如SEQ ID NO2所示。這里RXN02910核苷酸序列如SEQ ID NO5所示，并且這里RXN02910多肽序列如SEQ IDNO6所示。RXA00655的同源蛋白質(zhì)如SEQ ID NO19，21和23所示。這里所述RXN02910的同源蛋白質(zhì)的核苷酸序列如SEQ ID NO18，20和22所示。
SEQ ID NOs16和17分別表示突變的RXN02910核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO16中所示RXN02910分子包含在編碼區(qū)核苷酸殘基556位置從鳥(niǎo)嘌呤(G)到腺嘌呤(A)的單核苷酸改變，這引起了編碼蛋白質(zhì)的氨基酸殘基186位置的天冬氨酸(D)到天冬酰胺(N)的改變，如SEQ IDNO17所示。就RXN02910對(duì)精細(xì)化學(xué)品生物合成(例如甲硫氨酸生物合成)的調(diào)節(jié)作用而言，這種多態(tài)性可以引起對(duì)該調(diào)節(jié)作用的調(diào)制，例如引起減少的甲硫氨酸生物合成。
本發(fā)明的分子可以用于直接調(diào)節(jié)自微生物，諸如谷氨酸棒狀桿菌的精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸生產(chǎn)(例如，對(duì)甲硫氨酸生物合成調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性的調(diào)節(jié)直接影響該生物體生產(chǎn)甲硫氨酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率)，或者可以產(chǎn)生引起期望化合物產(chǎn)量、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率增加的間接影響(例如，就對(duì)核苷酸生物合成蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)而言，對(duì)該調(diào)節(jié)作用的調(diào)制將影響細(xì)菌中有機(jī)酸或脂肪酸的產(chǎn)生，這可能的原因是應(yīng)答改變的核苷酸生物合成調(diào)節(jié)而在這些化學(xué)品生物合成或降解途徑中伴隨出現(xiàn)的調(diào)節(jié)改變)。
下面進(jìn)一步詳細(xì)地解釋了本發(fā)明的各個(gè)方面。
術(shù)語(yǔ)‘精細(xì)化學(xué)品’為本領(lǐng)域所認(rèn)知，其包括用于多種工業(yè)的由生物體產(chǎn)生的分子，其中所述工業(yè)例如但不限于制藥、農(nóng)業(yè)和化妝品工業(yè)。此類化合物包括有機(jī)酸如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸、蛋白原性(Proteinogenic)和非蛋白原性氨基酸、嘌呤和嘧啶堿基、核苷和核苷酸(如在Rehm等人編輯的生物技術(shù)(Biotechnology)第6卷中Kuninaka，A.(1996)核苷酸和相關(guān)化合物(Nucleotides and related compounds)，561-612頁(yè)，VCHWeinheim及其中所含參考文獻(xiàn)中所述)、脂類、飽和和不飽和脂肪酸(如花生四烯酸)、二醇(如丙二醇和丁二醇)、碳水化合物(如透明質(zhì)酸和海藻糖)、芳香化合物(如芳族胺、香草醛和靛藍(lán))、維生素和輔因子(見(jiàn)如Ullmann工業(yè)化學(xué)百科全書(shū)(Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry)，A27卷，“維生素”(“Vitamins”)，443-613頁(yè)(1996)VCHWeinheim及其中的參考文獻(xiàn)；以及Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/馬來(lái)西亞科學(xué)和技術(shù)協(xié)會(huì)和亞州自由基研究協(xié)會(huì)聯(lián)盟舉辦的“營(yíng)養(yǎng)、脂類、健康和疾病“論文集(“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”P(pán)roceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and TechnologicalAssociations in Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia)，1994年9月1-3日在馬來(lái)西亞檳榔嶼舉行，AOCS Press，(1995))、酶、聚酮化合物(Cane等人(1998)科學(xué)(Science)28263-68)以及在Gutcho(1983)通過(guò)發(fā)酵的化學(xué)品(Chemieals by Fermentation)，Noyes DataCorporation，ISBN0818805086和其中的參考文獻(xiàn)中所述的所有其它化學(xué)品。這些精細(xì)化學(xué)品中的某些化學(xué)品的代謝和用途進(jìn)一步闡述如下。
本發(fā)明的元素和方法本發(fā)明至少部分基于對(duì)以前未知功能的分子(這里稱為MR核酸和蛋白質(zhì)分子)，例如RXA00655核酸和蛋白質(zhì)分子和RXN02910核酸和蛋白質(zhì)分子的功能表征，所述分子調(diào)節(jié)或調(diào)制谷氨酸棒狀桿菌中一個(gè)或多個(gè)代謝途徑，例如甲硫氨酸生物合成途徑。RXA00655是甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和半胱氨酸生物合成途徑的負(fù)調(diào)節(jié)物，而RXN02910是甲硫氨酸生物合成途徑的正調(diào)節(jié)物。因此，本發(fā)明特征在于生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物及調(diào)節(jié)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物生產(chǎn)的方法。這些方法包括在生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物的條件下，培養(yǎng)超表達(dá)RXN02910基因產(chǎn)物或具有增加的RXN02910活性的微生物。此類方法也包括培養(yǎng)具有抑制的RXA00655基因產(chǎn)物表達(dá)或抑制的RXA00655活性的微生物，以生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸、半胱氨酸和/或甲硫氨酸生物合成途徑、硫還原途徑和/或半胱氨酸生物合成途徑的其它化合物。本發(fā)明也提供了生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的方法，該方法包括培養(yǎng)超表達(dá)RXN02910基因產(chǎn)物并且同時(shí)顯示抑制的RXA00655基因產(chǎn)物表達(dá)或抑制的RXA00655活性的微生物。而且，本發(fā)明也提供了生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的方法，該方法包括聯(lián)合培養(yǎng)超表達(dá)RXN02910基因產(chǎn)物的微生物和具有抑制的RXA00655基因產(chǎn)物表達(dá)或抑制的RXA00655活性的微生物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的MR分子在轉(zhuǎn)錄，翻譯或翻譯后水平調(diào)節(jié)谷氨酸棒狀桿菌中的代謝途徑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明MR分子對(duì)一個(gè)或多個(gè)谷氨酸棒狀桿菌代謝途徑的調(diào)節(jié)活性，影響該生物體中期望精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的生產(chǎn)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，調(diào)整本發(fā)明MR分子的活性，以調(diào)整本發(fā)明MR蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的谷氨酸棒狀桿菌代謝途徑的效率或產(chǎn)出，而這又直接或間接地調(diào)節(jié)通過(guò)谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)期望精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。
術(shù)語(yǔ)“MR蛋白質(zhì)”或“MR多肽”包括在轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后水平調(diào)節(jié)谷氨酸棒狀桿菌中代謝途徑的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)”MR基因”或”MR核酸序列”包括編碼MR蛋白的核酸序列，其由編碼區(qū)和相應(yīng)的5’和3’非翻譯序列區(qū)組成。術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量”或“生產(chǎn)力”為本領(lǐng)域認(rèn)知，包括在給定時(shí)間和給定發(fā)酵體積下形成的發(fā)酵產(chǎn)物(例如，期望的精細(xì)化學(xué)品)的濃度(例如，kg產(chǎn)物/小時(shí)/升)。術(shù)語(yǔ)”生產(chǎn)效率”包括欲達(dá)到特定生產(chǎn)水平所需的時(shí)間(例如，細(xì)胞通過(guò)多長(zhǎng)時(shí)間達(dá)到精細(xì)化學(xué)品的特定產(chǎn)出速率)。術(shù)語(yǔ)”產(chǎn)率”或”產(chǎn)物/碳產(chǎn)率”或“生產(chǎn)”為本領(lǐng)域認(rèn)知的，包括將碳源轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(即甲硫氨酸)的效率。其通常表示為如kg產(chǎn)物/kg碳源。通過(guò)增加化合物的產(chǎn)率或生產(chǎn)，在給定的時(shí)間期間給定量的培養(yǎng)物中該化合物的回收分子或有用的回收分子的量增加。
術(shù)語(yǔ)”降解”或”降解途徑”為本領(lǐng)域所認(rèn)知，包括在可為多步驟的和受到高度調(diào)節(jié)的過(guò)程中細(xì)胞分解化合物(優(yōu)選地有機(jī)化合物)產(chǎn)生降解產(chǎn)物(一般而言為較小或較不復(fù)雜的分子)。術(shù)語(yǔ)”代謝”為本領(lǐng)域所認(rèn)知，包括生物體中進(jìn)行的所有生物化學(xué)反應(yīng)。特定化合物的代謝(例如，氨基酸諸如甘氨酸的代謝)則包括細(xì)胞內(nèi)涉及該化合物的所有生物合成、修飾和降解途徑。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是本領(lǐng)域公知的，并且包括一種蛋白質(zhì)活性控制或調(diào)節(jié)另一種蛋白質(zhì)的活性。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)”是本領(lǐng)域公知的，并且包括阻止或激活編碼靶蛋白的DNA轉(zhuǎn)化為mRNA的蛋白質(zhì)活性。術(shù)語(yǔ)“翻譯調(diào)節(jié)”是本領(lǐng)域公知的，并且包括阻止或激活編碼靶蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)分子的蛋白質(zhì)活性。術(shù)語(yǔ)“翻譯后調(diào)節(jié)”是本領(lǐng)域公知的，并且包括通過(guò)共價(jià)修飾靶蛋白(例如，通過(guò)甲基化，葡糖基化，磷酸化或者通過(guò)結(jié)合靶蛋白)，阻止或改進(jìn)靶蛋白活性的蛋白質(zhì)活性。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的MR分子可改變微生物如谷氨酸棒狀桿菌中期望分子如精細(xì)化學(xué)品(如甲硫氨酸)的生產(chǎn)。應(yīng)用重組遺傳技術(shù)，可操作本發(fā)明的一種或多種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，從而調(diào)整其功能。例如，可提高生物合成酶的功效，或破壞其別構(gòu)調(diào)節(jié)區(qū)以阻止對(duì)該化合物產(chǎn)生的反饋抑制。類似地，可通過(guò)替換、缺失或添加來(lái)缺失或改變降解酶，從而減弱其對(duì)期望化合物的降解活性并同時(shí)不損害細(xì)胞的存活力。在每種情況下，均可增加這些期望精細(xì)化學(xué)品之一的總產(chǎn)率或生產(chǎn)速率。
本發(fā)明蛋白質(zhì)和核苷酸分子中這種改變也可能以間接的方式改進(jìn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的生產(chǎn)。細(xì)胞中代謝途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制必定是相互牽連的，并且一個(gè)途徑的激活可以以伴隨的方式引起另一個(gè)途徑的阻遏或激活。因此，通過(guò)調(diào)整本發(fā)明一種或多種蛋白質(zhì)的活性，可以影響另一精細(xì)化學(xué)品生物合成或降解途徑的生產(chǎn)或活性效率。例如，就編碼特定氨基酸生物合成蛋白質(zhì)的基因而言，通過(guò)降低MR蛋白質(zhì)阻遏該基因轉(zhuǎn)錄的能力，可以同時(shí)阻抑其它氨基酸生物合成途徑，因?yàn)檫@些途徑是相互關(guān)聯(lián)的。而且，通過(guò)修飾本發(fā)明的MR蛋白質(zhì)，可以在一定程度將細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂與它們的細(xì)胞外環(huán)境解偶聯(lián)；就在細(xì)胞外條件對(duì)于生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂是次最佳時(shí)正常阻遏核苷酸生物合成的MR蛋白質(zhì)而言，通過(guò)損害該MR蛋白質(zhì)從而使它現(xiàn)在缺少該阻遏功能，則即使細(xì)胞外條件很差時(shí)，也可以允許生長(zhǎng)發(fā)生。在大規(guī)模發(fā)酵生長(zhǎng)中，這特別有意義，因?yàn)樵诎l(fā)酵條件下，培養(yǎng)物中溫度、營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)或通風(fēng)常常是次最佳的，但是如果除去針對(duì)這些因素的細(xì)胞調(diào)節(jié)系統(tǒng)，則這些條件仍舊可以支持細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂。
本發(fā)明分離的核酸序列包含在谷氨酸棒狀桿菌株系的基因組中，該株系保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號(hào)是ATCC 13032。在SEQ ID NOs1，18，20，22和2，19，21，23中分別地描述了RXA00655的核苷酸和氨基酸序列，并且在SEQ ID NOs5和6中分別地描述了RXN02910的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NOs16和17分別表示突變的RXN02910核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO16中所示RXN02910分子包含在編碼區(qū)核苷酸殘基556位置從鳥(niǎo)嘌呤(G)到腺嘌呤(A)的單核苷酸改變，這引起了編碼蛋白質(zhì)的氨基酸殘基186位置從天冬氨酸(D)到天冬酰胺(N)的改變，如SEQ ID NO17所示。這種多態(tài)性可以調(diào)整RXN02910對(duì)甲硫氨酸或其它精細(xì)化學(xué)品生物合成的調(diào)節(jié)作用，例如引起減少的甲硫氨酸生物合成。
本發(fā)明也涉及具有實(shí)質(zhì)上與SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ IDNO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23氨基酸序列同源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。如此處所用，其所具有的氨基酸序列與所選氨基酸序列實(shí)質(zhì)上同源的蛋白質(zhì)至少約50％同源于所選氨基酸序列，例如完整的所選氨基酸序列。其所具有的氨基酸序列與所選氨基酸序列實(shí)質(zhì)上同源的蛋白質(zhì)也可至少約50-60％，優(yōu)選地至少約60-70％，且更優(yōu)選地至少約70-80％，80-90％，或90-95％，且最優(yōu)選地至少約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高地同源于所選的氨基酸序列。
本發(fā)明的MR蛋白質(zhì)或其生物活性部分或片段可以轉(zhuǎn)錄地、翻譯地或翻譯后地調(diào)節(jié)谷氨酸棒狀桿菌中代謝途徑，例如甲硫氨酸生物合成途徑，或者具有這里所述的一種或多種活性。
在下面的分段中更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的各個(gè)方面。
A.轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明提供了包含調(diào)節(jié)序列和核酸分子的新轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，該核酸分子編碼代謝途徑蛋白質(zhì)(MR蛋白質(zhì))或其片段，其中所述調(diào)節(jié)序列能介導(dǎo)所述核酸分子的表達(dá)。優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)序列是與所述核酸分子異源的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)序列是在谷氨酸棒狀桿菌中起作用的啟動(dòng)子序列。
MR蛋白質(zhì)能夠例如，執(zhí)行參與谷氨酸棒狀桿菌中代謝途徑的轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后調(diào)節(jié)的酶促步驟。編碼MR蛋白質(zhì)的核酸分子這里稱為MR核酸分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，MR蛋白質(zhì)參與一個(gè)或多個(gè)代謝途徑的轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后調(diào)節(jié)。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，MR核酸分子選自a)包含與SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ IDNO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22核苷酸序列或其互補(bǔ)序列具有至少60％同一性的核苷酸序列的核酸分子；b)包含如下核酸的至少30個(gè)核苷酸的片段的核酸分子，所述核酸包含SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；c)編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含與SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ IDNO23氨基酸序列具有至少約60％同一性的氨基酸序列；和d)編碼多肽的片段的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO2，SEQ IDNO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQID NO23氨基酸序列，其中該片段包含SEQ ID NO2，SEQ IDNO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQID NO23氨基酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒可以包含相對(duì)于所述啟動(dòng)子序列在反義或有義方向的編碼MR蛋白質(zhì)(例如RXA00655或RXA02910)的核酸分子。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼MR蛋白質(zhì)(例如RXA00655或RXA02910)的核酸分子編碼多肽，該多肽包含SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中所示的氨基酸序列。尤其優(yōu)選所述核酸分子包含SEQ ID NO1，SEQ IDNO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示核苷酸序列。核酸分子也可以編碼多肽的天然等位變異體，其中該多肽包含SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中所示的氨基酸序列。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“核酸分子”意在包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和利用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。該術(shù)語(yǔ)也包括位于基因編碼區(qū)3’和5’末端的非翻譯序列編碼區(qū)5’端上游至少約100個(gè)核苷酸的序列和基因編碼區(qū)3’端下游至少約20個(gè)核苷酸的序列。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優(yōu)選地是雙鏈的DNA。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒”意在包括通過(guò)分子生物學(xué)方法獲得的所有類型的核酸構(gòu)建體，其中在所述構(gòu)建體中，a)MR核酸或其部分(例如，包含SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ IDNO22核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的核酸；或者前述核酸的部分)，或者b)與(a)組合的調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子序列)，或者c)(a)和(b)不位于它們的天然遺傳環(huán)境中，或者通過(guò)分子生物學(xué)或基因技術(shù)對(duì)它們進(jìn)行了修飾。這種修飾可以包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的置換、添加、缺失、倒位或插入?！疤烊贿z傳環(huán)境”意在描述具體基因的天然遺傳學(xué)。例如，轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體可以包含MR核酸和其天然啟動(dòng)子序列的組合，前提是這種組合從其天然基因組環(huán)境中分離出來(lái)和/或被放置在不同的基因組環(huán)境中。優(yōu)選地，啟動(dòng)子序列與所述MR核酸是異源的。
“異源的”意在描述MR核酸和啟動(dòng)子序列的組合，其中所述啟動(dòng)子序列天然情況下不調(diào)節(jié)該同一MR核酸的表達(dá)。
與載體或宿主生物體相關(guān)的“轉(zhuǎn)基因的”意在描述包含上述轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的載體或宿主細(xì)胞。
“分離的”核酸分子是與其它核酸分子分離的核酸分子，其中所述其它核酸分子存在于該核酸的天然來(lái)源中。
可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和這里提供的序列信息，分離本發(fā)明的核酸分子，例如具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22核苷酸序列的核酸分子或其部分。例如，利用SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22序列之一的所有或部分做為雜交探針以標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(例如，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中所述)可以從谷氨酸棒狀桿菌文庫(kù)分離谷氨酸棒狀桿菌MRDNA。而且，包含SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ IDNO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22序列之一的所有或部分的核酸分子，可以利用基于該序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行分離(例如，可以利用基于該相同的SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分離包含SEQ ID NO1，SEQ IDNO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22序列之一的所有或部分的核酸分子)。例如，可以從正常細(xì)菌細(xì)胞分離mRNA(例如，通過(guò)Chirgwin等.(1979)Biochemistry 185294-5299的硫氰酸胍提取方法)，并且可以利用逆轉(zhuǎn)錄酶制備DNA(例如，Moloney MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，可從Gibco/BRL，Bethesda，MD獲得；或者AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，可從Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，F(xiàn)L獲得)。根據(jù)SEQ IDNO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示核苷酸序列之一，可以設(shè)計(jì)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的合成寡核苷酸引物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，利用cDNA或可替代地基因組DNA做為模板并利用適宜寡核苷酸引物，可以擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。可以將如此擴(kuò)增的核酸克隆到適宜載體中，并且通過(guò)DNA序列分析表征它。而且，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)，例如利用自動(dòng)DNA合成儀也可以制備對(duì)應(yīng)于MR核苷酸序列的寡核苷酸。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒包含SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示核苷酸序列之一。SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22的序列對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的谷氨酸棒狀桿菌MR DNA。該DNA包含編碼MR蛋白質(zhì)的序列(即，在SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQID NO20或SEQ ID NO22之每個(gè)序列中標(biāo)明的“編碼區(qū)”)及也在SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ IDNO20或SEQ ID NO22中標(biāo)明的5’非翻譯序列和3’非翻譯序列。做為可替代的方案，核酸分子可以只包含SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中任一序列的編碼區(qū)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒包含核酸分子，該核酸分子是SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ IDNO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示核苷酸序列之一或其部分的互補(bǔ)序列。與SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ IDNO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示核苷酸序列之一互補(bǔ)的核酸分子是足以與SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示核苷酸序列之一互補(bǔ)以致可以與SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ IDNO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示核苷酸序列之一雜交并由此形成穩(wěn)定雙螺旋的核酸分子。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒包含核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ IDNO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示核苷酸序列或其部分具有至少約50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或60％，優(yōu)選地至少約61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或70％，更優(yōu)選地至少約71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，或90％，或91％，92％，93％，94％，甚至更優(yōu)選地至少約95％，96％，97％，98％，99％或更高的同源性。本發(fā)明也意欲包括上述范圍中間的同一性范圍值(例如，70-90％同一性或80-95％同一性)。例如，意欲包括利用上述任何值做為上限和/或下限組合而成的同一性范圍值。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施發(fā)方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒包含核苷酸序列，該核苷酸序列可以與SEQ ID NO1，SEQ IDNO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示核苷酸序列之一或其部分雜交，例如在嚴(yán)格條件下雜交。
而且，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒可以只包含SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中序列之一的編碼區(qū)的一部分，例如，可以用作探針或引物的片段，或者編碼MR蛋白質(zhì)生物活性部分的片段。
從來(lái)源于谷氨酸棒狀桿菌的MR基因克隆確定的核苷酸序列使得可以產(chǎn)生探針和引物，以設(shè)計(jì)用于鑒定和/或克隆其它細(xì)胞類型和生物體中的MR同系物(homologue)，及來(lái)其它棒狀桿菌或相關(guān)物種的MR同系物。探針/引物通常包含基本上純化的寡核苷酸。寡核苷酸通常包含嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQID NO20或SEQ ID NO22所示序列之一的有義鏈、SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQID NO22所示序列之一的反義鏈或者其天然突變體中至少約12個(gè)，優(yōu)選地約25個(gè)，更優(yōu)選地約40，50或75個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)?？梢栽赑CR反應(yīng)中使用基于SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22核苷酸序列的引物以克隆MR同系物。基于MR核苷酸序列的探針可以用于檢測(cè)編碼相同或同源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物或基因組序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，探針進(jìn)一步包含附著其上的標(biāo)記基團(tuán)，例如該標(biāo)記基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶、或酶輔因子。這種探針可以用做診斷檢測(cè)試劑盒的一部分，其中該試劑盒通過(guò)諸如檢測(cè)細(xì)胞樣品中MR編碼核酸的水平，例如檢測(cè)MRmRNA水平或檢測(cè)是否基因組MR基因已經(jīng)被突變或缺失，用于鑒定錯(cuò)表達(dá)MR蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒包含編碼蛋白質(zhì)或其部分的核酸分子，其中該蛋白質(zhì)或其部分包含與SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ IDNO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23氨基酸序列具有足夠同源性的氨基酸序列，這樣該蛋白質(zhì)或其部分維持轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后地調(diào)節(jié)谷氨酸棒狀桿菌中代謝途徑的能力。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“足夠的同源性”指具有如下氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分，該氨基酸序列包含最小數(shù)量的相同或等同于SEQ ID NO2，SEQID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ IDNO23氨基酸序列的氨基酸殘基(例如，與SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23的序列之一中氨基酸殘基具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基)，從而使得該蛋白質(zhì)或其部分能轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后調(diào)節(jié)谷氨酸棒狀桿菌中代謝途徑，例如甲硫氨酸生物合成。如這里所述，這種代謝途徑的蛋白質(zhì)成員可以起到調(diào)節(jié)一種或多種精細(xì)化學(xué)品生物合成或降解的作用。這里也描述了這種活性的例子。因此，“MR蛋白質(zhì)的功能”有助于整體調(diào)節(jié)一種或多種精細(xì)化學(xué)品代謝途徑，或者直接或間接地有助于一種或多種精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23的全部氨基酸序列具有至少約50-60％，優(yōu)選地至少約60-70％，更優(yōu)選地至少約70-80％，80-90％，90-95％，最優(yōu)選地至少約96％，97％，98％，99％或更高的同源性。
如上所述，同源MR蛋白質(zhì)，優(yōu)選地同源RXA00655或RXN02910蛋白質(zhì)可以來(lái)源于其它微生物，優(yōu)選地來(lái)源于原核微生物。
術(shù)語(yǔ)“原核微生物”意欲包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌。優(yōu)選地，該術(shù)語(yǔ)包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)或Nocardiaceae的所有屬和種，例如腸桿菌科物種埃希氏菌屬(Escherichia)，沙雷氏菌屬(Serratia)，變形菌屬(Proteus)，腸桿菌屬(Enterobacter)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)，志賀氏菌屬(Shigella)，愛(ài)德華氏菌屬(Edwardsielle)，檸檬酸細(xì)菌屬(Citrobacter)，摩根氏菌屬(Morganella)，普羅威登斯菌屬(Providencia)和耶爾森氏菌屬(Yersinia)。而且優(yōu)選的是所有假單胞菌屬(Pseudomonas)，伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)，諾卡氏菌屬(Nocardia)，醋桿菌屬(Acetobacter)，鏈霉菌屬(Streptomyces)，葡糖桿菌屬(Gluconobacter)，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，短桿菌屬(Brevibacterium)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，梭菌屬(Clostridium)，藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacter)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，，氣桿菌屬(Aerobacter)，產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)，紅球菌屬(Rhodococcus)和青霉屬(Penicillium)物種。最優(yōu)選的是棒狀桿菌屬(Corynebacterium)和鏈霉菌屬(Streptomyces)物種，象例如表1中所示的棒狀桿菌屬物種，白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)，Corynebacterium efficiens和天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)。
同源MR蛋白質(zhì)的例子可以包括a)優(yōu)選地由包含SEQ ID NO19序列的氨基酸序列所描述的、來(lái)源于白喉棒狀桿菌的RXA00655蛋白質(zhì)，b)優(yōu)選地由包含SEQ ID NO21序列的氨基酸序列所描述的、來(lái)源于Corynebacterium efficiens YS-314 GenBank記錄號(hào)Nr.AP005223的RXA00655蛋白質(zhì)，c)優(yōu)選地由包含SEQ ID NO23序列的氨基酸序列所描述的、來(lái)源于天藍(lán)色鏈霉菌Genbank記錄號(hào)NC 003888的RXA00655蛋白質(zhì)。
優(yōu)選地，RXN02910旨在描述核酸分子編碼的多肽，該核酸分子包含選自下面的核酸分子a)包含與SEQ ID NO5或16核苷酸序列具有至少60％同一性的核苷酸序列的核酸分子；b)包含核酸的至少30個(gè)核苷酸的片段的核酸分子，其中所述核酸包含SEQ ID NO5或16的核苷酸序列；c)編碼多肽的核酸分子，該多肽包含與SEQ ID NO6或17氨基酸序列具有至少約60％同一性的氨基酸序列；和d)編碼包含SEQ ID NO6氨基酸序列的多肽的片段的核酸分子，其中該片段包含SEQ ID NO6或17氨基酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
優(yōu)選地，RXA00655旨在描述核酸分子編碼的多肽，該核酸分子包含選自下面的核酸分子
a)包含與SEQ ID NO1，18，20或22核苷酸序列具有至少60％同一性的核苷酸序列的核酸分子；b)包含核酸的至少30個(gè)核苷酸的片段的核酸分子，所述核酸包含SEQ ID NO1，18，20或22的核苷酸序列；c)編碼多肽的核酸分子，該多肽包含與SEQ ID NO2，19，21或23氨基酸序列具有至少約60％同一性的氨基酸序列；d)編碼包含SEQ ID NO2，19，21或23氨基酸序列的多肽的片段的核酸分子，其中該片段包含SEQ ID NO2，19，21或23氨基酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
優(yōu)選地，本發(fā)明MR核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的部分是MR蛋白質(zhì)之一的生物活性部分。這里所用的術(shù)語(yǔ)“MR蛋白質(zhì)的生物活性部分”意欲包括可以轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后地調(diào)節(jié)谷氨酸棒狀桿菌中代謝途徑或者具有這里所述的活性的MR蛋白質(zhì)的部分，例如域/基序。為了檢測(cè)MR蛋白質(zhì)或其生物活性部分是否可以轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后地調(diào)節(jié)谷氨酸棒狀桿菌中代謝途徑，可以進(jìn)行酶活性試驗(yàn)。這種試驗(yàn)方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，在實(shí)施方式的實(shí)施例8中詳述。
可以通過(guò)分離SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中序列之一的部分，表達(dá)MR蛋白質(zhì)或肽的該編碼部分(例如，通過(guò)體外重組表達(dá))，和評(píng)估MR蛋白質(zhì)或肽的該編碼部分的活性，以制備編碼MR蛋白質(zhì)生物活性部分的其它核酸片段。
本發(fā)明進(jìn)一步包括如下核酸分子，所述核酸分子由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO22中所示核苷酸序列(和其部分)之一，因此該核酸分子與SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ IDNO20或SEQ ID NO22，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ IDNO22中所示核苷酸序列編碼相同的MR蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明分離的核酸分子具有編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，該蛋白質(zhì)具有SEQID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中所示的氨基酸序列。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子編碼全長(zhǎng)谷氨酸棒狀桿菌蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)基本上同源于(由SEQ ID NO1，SEQID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ IDNO22，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示開(kāi)放讀框編碼的)SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ IDNO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23，SEQ ID NO19，SEQ IDNO21或SEQ ID NO23的氨基酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括與本發(fā)明核苷酸或氨基酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)高于與現(xiàn)有技術(shù)序列(例如，Genbank序列(或這種序列編碼的蛋白質(zhì)))的同一性百分?jǐn)?shù)的核苷酸和氨基酸序列。通過(guò)檢查給定序列的3個(gè)最高命中之每個(gè)的GAP計(jì)算的同一性百分?jǐn)?shù)得分，并且通過(guò)從100％中減去最高的GAP計(jì)算的同一性百分?jǐn)?shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能計(jì)算針對(duì)本發(fā)明任何給定序列的同一性百分?jǐn)?shù)的下限閾值。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也將理解本發(fā)明也包括同一性百分?jǐn)?shù)大于這樣計(jì)算的下限閾值的核酸和氨基酸序列(例如，至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％，優(yōu)選地至少約61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或70％，更優(yōu)選地至少約71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，或80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，或90％，或91％，92％，93％，94％，且甚至更優(yōu)選地至少約95％，96％，97％，98％，99％或更高的同一性)。
除了SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示谷氨酸棒狀桿菌MR核苷酸序列外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解導(dǎo)致MR蛋白氨基酸序列變化的DNA序列多態(tài)性可在群體(例如，谷氨酸棒狀桿菌群體)中存在。由于自然變異，MR基因中的此遺傳多態(tài)性可在群體中的個(gè)體間存在。如此處所用，術(shù)語(yǔ)”基因”和”重組基因”是指包含編碼MR蛋白，優(yōu)選地編碼谷氨酸棒狀桿菌MR蛋白的開(kāi)放讀碼框的核酸分子。此類天然變異一般可在MR基因核苷酸序列中導(dǎo)致1-5％變異。MR中來(lái)自天然變異且不改變MR蛋白功能活性的任一和所有此類核苷酸變異和所致氨基酸多態(tài)性也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
對(duì)應(yīng)于本發(fā)明谷氨酸棒狀桿菌MR DNA的天然變體和非谷氨酸棒狀桿菌同系物的核酸分子可根據(jù)它們與本文公開(kāi)的谷氨酸棒狀桿菌MR核酸的同源性，使用谷氨酸棒狀桿菌DNA或其部分作為雜交探針按照標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)在嚴(yán)格的雜交條件下分離。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子長(zhǎng)為至少15個(gè)核苷酸，且在嚴(yán)格條件下可以與包含SEQ IDNO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，或SEQ ID NO22，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，或SEQ ID NO22的核苷酸序列的核酸分子雜交。在其它實(shí)施方案中，核酸長(zhǎng)為至少15，20，25，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，225個(gè)或更多個(gè)核苷酸。如此處所用，術(shù)語(yǔ)”在嚴(yán)格條件下雜交”是用來(lái)描述雜交和洗滌條件，在此條件下，相互間至少60％同源的核苷酸序列一般仍可相互雜交。優(yōu)選地，嚴(yán)格條件為這樣的條件，在此條件下相互間具有至少約65％，更優(yōu)選地至少約70％，且甚至更優(yōu)選地至少約75％或更高同源性的序列一般仍保持相互雜交。此嚴(yán)格條件為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知，可在分子生物學(xué)最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)優(yōu)選、非限制性實(shí)例為在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中于約45℃雜交，然后在0.2XSSC，0.1％SDS中于50-65℃洗滌一次或多次。優(yōu)選地，在嚴(yán)格條件與SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ IDNO20，或SEQ ID NO22，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，或SEQ IDNO22的序列雜交的本發(fā)明分離核酸分子對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。如此處所用，”天然存在的”核酸分子是指具有在自然界中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，其編碼天然蛋白)。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸編碼天然的谷氨酸棒狀桿菌MR蛋白。
除了群體中可能存在的MR序列的天然變體外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還將理解可通過(guò)突變向SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQID NO18，SEQ ID NO20，或SEQ ID NO22，SEQ ID NO18，SEQ IDNO20，或SEQ ID NO22的核苷酸序列中導(dǎo)入變化，由此導(dǎo)致所編碼的MR蛋白的氨基酸序列改變，但MR蛋白的功能不變。例如，可在SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，或SEQ IDNO22，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，或SEQ ID NO22的序列中在”非必需”氨基酸殘基處引入導(dǎo)致氨基酸替換的核苷酸替換?！狈潜匦琛卑被釟埢鶠檫@樣的殘基，其可以在本發(fā)明MR蛋白之一的野生型序列(SEQ IDNO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21，或SEQ ID NO23，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21，或SEQ ID NO23)中被改變，但其改變不引起所述MR蛋白的活性改變；而”必需”氨基酸殘基為MR蛋白活性所需。然而，其它氨基酸殘基(例如，在具有MR活性的結(jié)構(gòu)域中不保守或僅為半保守的那些氨基酸殘基)對(duì)活性可為非必需的，并因此可能適于接受改變而同時(shí)又不改變MR活性。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及這樣的核酸分子，其編碼的MR蛋白包含有對(duì)MR活性非必需的氨基酸殘基改變。此類MR蛋白的氨基酸序列與SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQID NO21或SEQ ID NO23，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ IDNO23中含有的序列不同，但保留至少一種本文所述的MR活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中該蛋白質(zhì)包含至少約50％同源于SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23氨基酸序列的氨基酸序列，并且能轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后地調(diào)節(jié)谷氨酸棒狀桿菌中代謝途徑，或者具有這里所述的一種或多種活性。優(yōu)選地，由此核酸分子編碼的蛋白質(zhì)至少約50-60％同源于SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中序列之一，更優(yōu)選地至少約60-70％同源于SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中序列之一，甚至更優(yōu)選地至少約70-80％，80-90％同源于SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中序列之一，且最優(yōu)選地至少約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源于SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ IDNO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中序列之一。
為了確定兩個(gè)氨基酸序列(例如，SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中序列之一和其突變形式)或兩個(gè)核酸的百分同源性，將序列比對(duì)(例如，可以在一個(gè)蛋白質(zhì)或核酸的序列中導(dǎo)入空缺(gap)，以便與另一蛋白質(zhì)或核酸進(jìn)行最佳序列對(duì)齊)以達(dá)到最佳比較的目的。然后比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)一個(gè)序列(例如，SEQ ID NO2，SEQ IDNO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中序列之一)中的某位置與另一個(gè)序列(例如，SEQ ID NO2，SEQ IDNO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23的氨基酸序列的突變形式)中的對(duì)應(yīng)位置處被相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，這些分子在該位置是同源的(即，此處所用的氨基酸或核酸”同源性”等同于氨基酸或核酸”同一性”)。兩條序列間的百分同源性為兩序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，％同源性＝相同的位置數(shù)/總位置數(shù)×100)。
編碼與SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21，或SEQ ID NO23蛋白質(zhì)序列同源的MR蛋白的分離核酸分子可通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)核苷酸替換、添加或缺失導(dǎo)入SEQ ID NO1，SEQID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，或SEQ IDNO22的核苷酸序列，從而由此將一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、添加或缺失導(dǎo)入所編碼的蛋白質(zhì)中而產(chǎn)生?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變將突變導(dǎo)入SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ IDNO18，SEQ ID NO20，或SEQ ID NO22的序列之一中。優(yōu)選地，在一處或多處預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基處進(jìn)行保守氨基酸替換?！北Ｊ匕被崽鎿Q”為將氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基類已在本領(lǐng)域定義過(guò)。這些類包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在MR蛋白中預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基優(yōu)選用來(lái)自同一側(cè)鏈類的另一氨基酸殘基替換?；蛘?，在另一實(shí)施方案中，可通過(guò)例如飽和誘變沿著全部或部分MR編碼序列隨機(jī)導(dǎo)入突變，并對(duì)所得突變體篩選文中所述的MR活性，以鑒定保留MR活性的突變體。對(duì)SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，或SEQ ID NO22之一個(gè)序列進(jìn)行誘變后，可重組表達(dá)編碼蛋白，并用例如文中所述的試驗(yàn)(參見(jiàn)實(shí)施例部分的實(shí)施例6)確定蛋白質(zhì)的活性。
本發(fā)明也提供了MR的嵌合或融合蛋白。如此處所用，MR“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括與非MR多肽可操作地連接的MR多肽?！癕R多肽”指具有與MR蛋白相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的多肽?！胺荕R多肽”指具有如下氨基酸序列的多肽，該序列對(duì)應(yīng)于實(shí)質(zhì)上不同源于MR蛋白的蛋白質(zhì)，例如，所述蛋白質(zhì)可以是與MR蛋白質(zhì)不同且來(lái)源于相同或不同的生物體的蛋白質(zhì)。在融合蛋白內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意指MR多肽和非MR多肽相互以符合閱讀框的形式融合。非MR多肽可與MR多肽的N-末端或C-末端融合。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白為GST-MR融合蛋白，其中MR序列融合至GST序列的C-末端。此類融合蛋白可利于重組MR蛋白的純化。在另一實(shí)施方案中，融合蛋白為在其N(xiāo)-末端含有異源信號(hào)序列的MR蛋白。在某些宿主細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞)中，通過(guò)應(yīng)用異源信號(hào)序列可增加MR蛋白的表達(dá)和/或分泌。
優(yōu)選地，本發(fā)明的MR嵌合或融合蛋白通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)制備。例如，編碼不同多肽序列的DNA片段可根據(jù)常規(guī)技術(shù)以符合閱讀框的方式連結(jié)在一起，所述技術(shù)為例如，應(yīng)用鈍末端或粘末端(用于連接)、限制性酶消化產(chǎn)生合適的末端、適當(dāng)時(shí)填平粘端、堿性磷酸酶處理以避免不需要的接合以及酶促連接。在另一實(shí)施方案中，融合基因可由常規(guī)技術(shù)合成，包括DNA自動(dòng)合成儀。備選地，可應(yīng)用錨定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，導(dǎo)致在兩連續(xù)的基因片段間產(chǎn)生互補(bǔ)突出端，隨后可以進(jìn)行退火及重新擴(kuò)增以產(chǎn)生嵌合基因序列(參見(jiàn)例如，最新分子生物學(xué)方法(Current Protocolsin Molecular Biology)，Ausubel等人編輯，John Wiley & Sons1992)。此外，許多商售的表達(dá)載體已編碼有融合部份(如GST多肽)。可將編碼MR的核酸克隆到此類表達(dá)載體中，以使融合部分與MR蛋白以符合閱讀框的形式連為一體。
MR蛋白的同系物可通過(guò)誘變產(chǎn)生，例如MR蛋白質(zhì)的不同點(diǎn)突變或截短。如此處所用，術(shù)語(yǔ)”同系物”是指MR蛋白的變體形式，其可以用作MR蛋白活性的激動(dòng)劑或拮抗劑。MR蛋白的激動(dòng)劑可持有與MR蛋白基本相同的生物活性或其部份生物活性。MR蛋白的拮抗劑可以，例如通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合包括MR蛋白在內(nèi)的MR調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)的下游或上游成員，抑制天然形式的MR蛋白的一種或多種活性。因此，本發(fā)明的谷氨酸棒狀桿菌MR蛋白及其同系物可調(diào)整該微生物中MR蛋白所調(diào)節(jié)的一個(gè)或多個(gè)代謝途徑的活性。
在一個(gè)備選實(shí)施方案中，MR蛋白的同系物可以通過(guò)針對(duì)MR激動(dòng)劑或拮抗劑活性篩選MR蛋白的突變體組合文庫(kù)進(jìn)行鑒定，例如，所述文庫(kù)可以為截短突變體文庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在核酸水平上進(jìn)行組合誘變，產(chǎn)生由多樣化基因文庫(kù)編碼的多樣化MR變體文庫(kù)。例如，多樣化MR變體文庫(kù)可通過(guò)如下方式制備將合成的寡核苷酸混合物酶促連接為基因序列以使一組簡(jiǎn)并的潛在MR序列可表達(dá)為單獨(dú)的多肽，或備選地，表達(dá)為其中含有該組MR序列的一組較大融合蛋白(例如，用于噬菌體展示)。有多種方法可用于從簡(jiǎn)并的寡核苷酸序列產(chǎn)生潛在MR同系物文庫(kù)?？稍贒NA自動(dòng)合成儀上進(jìn)行簡(jiǎn)并基因序列的化學(xué)合成，然后將合成基因連入合適的表達(dá)載體。一組簡(jiǎn)并基因的應(yīng)用使得可以在一個(gè)混合物中提供編碼一組所需的潛在MR序列的所有序列。用于合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(參見(jiàn)例如，Narang，S.A(1983)Tetrahedron 393；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等人(1984)科學(xué)(Science)1981056；Ike等人(1983)核酸研究(Nucleic Acid Res)11477)。
此外，MR蛋白編碼序列片段的文庫(kù)可用于產(chǎn)生多樣化的MR片段群，以篩選及隨后挑選出MR蛋白的同系物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)用核酸酶處理MR編碼序列的雙鏈PCR片段(在所述處理進(jìn)行的條件下，在每個(gè)分子中僅發(fā)生大約一次切割)、將雙鏈DNA變性、使DNA復(fù)性形成雙鏈DNA(此雙鏈DNA中可以包括來(lái)自不同切割產(chǎn)物的有義/反義對(duì))、用S1核酸酶處理以從新形成的雙鏈體中除去單鏈部分，然后將產(chǎn)生的片段文庫(kù)連入表達(dá)載體，由此產(chǎn)生編碼序列片段的文庫(kù)。用該方法可形成表達(dá)文庫(kù)，所述文庫(kù)編碼MR蛋白不同大小的N-末端、C-末端及內(nèi)部片段。
用于篩選通過(guò)點(diǎn)突變或截短產(chǎn)生的組合文庫(kù)的基因產(chǎn)物以及用于篩選cDNA文庫(kù)以獲得具有所選性質(zhì)的基因產(chǎn)物的一些技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。這些技術(shù)可經(jīng)修改而適于快速篩選由MR同系物的組合誘變產(chǎn)生的基因文庫(kù)。最為廣泛應(yīng)用的適于高通量分析以篩選大型基因文庫(kù)的技術(shù)一般包括將基因文庫(kù)克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中，用所獲載體文庫(kù)轉(zhuǎn)化適宜細(xì)胞并表達(dá)組合基因，在該表達(dá)條件下對(duì)所需活性的測(cè)試將利于分離檢測(cè)到的基因產(chǎn)物的編碼載體。遞歸總體誘變(Recursive ensemblemutagenesis，REM)為增加文庫(kù)中功能性突變體頻率的一種新技術(shù)，可與篩選試驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用以鑒定MR同系物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS897811-7815；Delgrave等人(1993)蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)6(3)327-331)。
在另一實(shí)施方案中，可以利用基于細(xì)胞的試驗(yàn)來(lái)分析多樣化的MR文庫(kù)，所用方法為本領(lǐng)域熟知。
除了編碼上述MR蛋白的核酸分子外，本發(fā)明的另一方面涉及與這些分子反義的分離核酸分子?！胺戳x”核酸包含這樣的核苷酸序列，其互補(bǔ)于編碼蛋白質(zhì)的“有義”核酸，例如互補(bǔ)于雙鏈DNA分子的編碼鏈或互補(bǔ)于mRNA序列。因此，反義核酸可通過(guò)氫鍵與有義核酸鍵合。反義核酸可互補(bǔ)于全長(zhǎng)的MR編碼鏈或僅互補(bǔ)于其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義核酸分子反義于編碼MR蛋白的核苷酸序列的編碼鏈的“編碼區(qū)”。術(shù)語(yǔ)“編碼區(qū)”是指包含可翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū)域。在另一實(shí)施方案中，反義核酸分子反義于編碼MR的核苷酸序列的編碼鏈的“非編碼區(qū)”。術(shù)語(yǔ)“非編碼區(qū)”是指不被翻譯為氨基酸的位于編碼區(qū)側(cè)翼的5’和3’序列(即，也稱為5’和3’非翻譯區(qū))。
基于這里公開(kāi)的編碼MR分子的編碼鏈序列(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQID NO22中所示序列)，可根據(jù)Watson和Crick堿基配對(duì)原理設(shè)計(jì)本發(fā)明的反義核酸。反義核酸分子可互補(bǔ)于MR mRNA的全長(zhǎng)編碼區(qū)，但更優(yōu)選為僅反義于部分MR mRNA編碼區(qū)或非編碼區(qū)的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可互補(bǔ)于MR mRNA翻譯起始位點(diǎn)周?chē)膮^(qū)域。反義寡核苷酸可例如長(zhǎng)約5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)或50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的反義核酸可使用本領(lǐng)域公知的方法應(yīng)用化學(xué)合成和酶連反應(yīng)構(gòu)建。例如，反義核酸(如反義寡核苷酸)可用天然存在的核苷酸或各種修飾的核苷酸化學(xué)合成，其中所述修飾的核苷酸被設(shè)計(jì)用于增加分子的生物穩(wěn)定性或用于增加反義和有義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性。備選地且優(yōu)選地，反義核酸可應(yīng)用表達(dá)載體進(jìn)行生物制備，所述載體中已反義向亞克隆了一段核酸(即，轉(zhuǎn)錄自此插入核酸的RNA對(duì)于目的靶核酸將是反義方向的，這將在下面的子部分中進(jìn)一步描述)。
本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的載體，優(yōu)選地表達(dá)載體，該轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒包含編碼MR蛋白質(zhì)(或其部分)的核酸。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)”載體”是指這樣的核酸分子，其可轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一核酸。一種類型的載體為”質(zhì)?！保侵钙渲锌蛇B接額外DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體為病毒載體，其中可將額外DNA片段連接入病毒基因組中。某些載體可在它們所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體)。其它載體在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合入宿主細(xì)胞的基因組中，并因此隨著宿主基因組一起復(fù)制。而且，某些載體可指導(dǎo)與它們操作性連接的基因的表達(dá)。此類載體此處稱為”表達(dá)載體”。一般，用于重組DNA技術(shù)中的表達(dá)載體通常為質(zhì)粒形式。在本說(shuō)明書(shū)中，”質(zhì)?！焙汀陛d體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最經(jīng)常使用的載體形式。但是，本發(fā)明旨在包括其它形式的表達(dá)載體，如噬菌體載體，它們起到等同的作用。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體以適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)MR核酸的形式包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子)，調(diào)節(jié)序列的選擇是基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞進(jìn)行的，它們可操作地與待表達(dá)的核酸序列連接。在轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒中，”可操作地連接”是指目的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞后在宿主細(xì)胞中表達(dá))的方式連接。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”意在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如，聚腺苷酸化信號(hào))。例如，在Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods in En-zymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)和在Vasicova P.Patek M.Nesvera J.Sahm H.Eikmanns B.Journal ofBacteriology(1999)181(19)6188-91，在Patek M.等(1996)Microbiology1421297-309，和在Mateos等.(1994)Journal of Bacteriology 1767362-71中描述了這種調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列包括在許多類型宿主細(xì)胞中引導(dǎo)核苷酸序列組成型表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，和只在一些宿主細(xì)胞中引導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列是例如啟動(dòng)子，諸如Cos-，tac-，trp-，tet-，trp-tet-，lpp-，lac-，lpp-lac-，lacIq-，T7-，T5-，T3-，gal-，trc-，ara-，SP6-，arny，SP02，λ-PR-或λ-PL，優(yōu)選地在細(xì)菌中使用它們。也可以使用人工啟動(dòng)子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以取決于諸如待要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。可以將本發(fā)明的表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞中，以產(chǎn)生這里所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽，包括融合蛋白或肽(例如，MR蛋白質(zhì)，MR蛋白質(zhì)的突變體形式，融合蛋白等)。
可以設(shè)計(jì)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒或表達(dá)載體以在原核生物或真核生物細(xì)胞中表達(dá)MR蛋白質(zhì)。例如，可以在細(xì)菌細(xì)胞諸如谷氨酸棒狀桿菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞(利用桿狀病毒表達(dá)載體)，酵母和其它真菌細(xì)胞，藻類和多細(xì)胞植物細(xì)胞，或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)MR基因。在Goeddel，GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中進(jìn)一步討論了適合的宿主細(xì)胞。做為可替代的方案，例如，利用T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶，可以體外轉(zhuǎn)錄和翻譯轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒或表達(dá)載體。
在原核生物中表達(dá)蛋白質(zhì)最常常用包含組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體進(jìn)行，所述啟動(dòng)子引導(dǎo)融合或非融合蛋白質(zhì)表達(dá)。
融合載體向其中編碼的蛋白質(zhì)，通常向重組蛋白質(zhì)的氨基末端添加多個(gè)氨基酸。通常的融合表達(dá)載體可以融合谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，麥芽糖E結(jié)合蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)A和靶重組蛋白質(zhì)。
適宜的誘導(dǎo)型大腸桿菌(E.coli)表達(dá)載體的例子包括pTrc(Amann等，(1988)Gene 69301-315)pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19，pKC30，pRep4，pHS1，pHS2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III113-B1，λgt11，pBdCl和pET 11d(Studier等，Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89；和Pouwels等編輯，(1985)Cloning Vectors.ElsevierNew York ISBN 0 444 904018)。
在Eikmanns B.J.，等.(1991)Gene 10293-8中可以發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌穿梭表達(dá)載體的其它例子。谷氨酸棒狀桿菌中使用的適宜克隆載體是例如Sinskey等，美國(guó)專利號(hào)4,649,119中所公開(kāi)的克隆載體，并且公開(kāi)了用于谷氨酸棒狀桿菌和相關(guān)的短桿菌屬物種(例如，乳糖發(fā)酵短桿菌(B.lactofermentum))的遺傳操作技術(shù)(Yoshihama等，J.Bacteriol.162591-597(1985)；Katsumata等，J.Bacteriol.159306-311(1984)；和Santamaria等，J.Gen.Microbiol.1302237-2246(1984))。
自pTrc載體的靶基因表達(dá)依賴于宿主RNA聚合酶從雜種trp-lac融合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。對(duì)于其它種類的細(xì)菌轉(zhuǎn)化，可以選擇適宜的載體。例如，已知質(zhì)粒pIJ101，pIJ364，pIJ702和pIJ361可用于轉(zhuǎn)化鏈霉菌，而質(zhì)粒pUB110，pC194或pBD214適于芽孢桿菌屬物種的轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)移遺傳信息到棒狀桿菌中的幾種質(zhì)粒包括pHM1519，pBL1，pSA77或pAJ667(Pouwels等，編輯.(1985)Cloning Vectors.ElsevierNew YorkIBSN 0 444 904018)。最大化重組蛋白質(zhì)表達(dá)的一個(gè)策略是在酶解切割重組蛋白質(zhì)的能力受損的宿主細(xì)菌中表達(dá)蛋白質(zhì)(Gottesman，S.，GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，California(1990)119-128)。另一策略是改變將要插入到表達(dá)載體中的核酸的核酸序列，使編碼每個(gè)氨基酸的每個(gè)密碼子都是選定用于表達(dá)的細(xì)菌，諸如谷氨酸棒狀桿菌中偏愛(ài)使用的密碼子(Wada等.(1992)Nucleic Acids Res.202111-2118)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)可以進(jìn)行本發(fā)明核酸序列的這種改變。
本發(fā)明的另一方面涉及其中已經(jīng)引入本發(fā)明轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。這里，可以相互交換地使用術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”和“轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞”。應(yīng)理解，這種術(shù)語(yǔ)不僅指特定的細(xì)胞，也指這種細(xì)胞的后代或潛在的后代。由于突變或環(huán)境影響，在隨后世代中可能出現(xiàn)一些改變，因此實(shí)際上這種后代與親代細(xì)胞可能不相同，但是仍舊包括在本發(fā)明范圍中。
宿主細(xì)胞可以是任何原核生物或真核生物細(xì)胞。例如，可以在細(xì)菌細(xì)胞，諸如谷氨酸棒狀桿菌，昆蟲(chóng)細(xì)胞，酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)MR蛋白質(zhì)。其它適合的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。表1中示出了與谷氨酸棒狀桿菌相關(guān)的微生物，其可以方便地用做本發(fā)明核酸和蛋白質(zhì)分子的宿主細(xì)胞。
通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)，可以將載體DNA引入到原核生物或真核生物細(xì)胞中。這里所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意指各種本領(lǐng)域公知的用于向宿主細(xì)胞中引入外源核酸(例如，線型DNA或RNA(例如，只是線型化的載體或基因構(gòu)建體，而無(wú)載體))或者載體形式的核酸(例如，質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、噬粒、轉(zhuǎn)座子或其它DNA)的技術(shù)，所述技術(shù)包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀，DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂轉(zhuǎn)染或電穿孔。在Sambrook，等.(Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)和其它實(shí)驗(yàn)室指南中可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適宜方法。
對(duì)于微生物轉(zhuǎn)化，已知取決于使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化技術(shù)，只有一小部分細(xì)胞可以摻入附加型定位的外源DNA，或者通過(guò)涉及重組的過(guò)程將外源DNA摻入到它們的基因組中。為了鑒定和篩選這些轉(zhuǎn)化體，通常將編碼選擇性標(biāo)記(例如，對(duì)抗生素的抗性)的基因和目的基因一起引入到宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記包括賦予對(duì)藥物，諸如卡那霉素、四環(huán)素、博來(lái)霉素、氯霉素、林可霉素的抗性的選擇性標(biāo)記。編碼選擇性標(biāo)記的核酸可以被引入到宿主細(xì)胞中位于與編碼MR蛋白質(zhì)的載體相同的載體上，或者可以在單獨(dú)的載體上被引入。由引入的核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以例如，通過(guò)藥物篩選鑒定(例如，已經(jīng)摻入了選擇性標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它的細(xì)胞將死亡)。
可以在Tauch A.Puhler A.Kalinowski J.Thierbach G.Plasmid.44(3)285-91，2000，Kim HJ.Kim Y.Lee MS.Lee HS.Molecules & Cells.12(1)112-6，2001 Guerrero C.Mateos LM.Malumbres M.Martin JF.AppliedMicrobiology & Biotechnology.36(6)759-62，1992，Eikmanns BJ.Kleinertz E.Liebl W.Sabm H.Gene.102(1)93-8，1991，Yoshihama M.Higashiro K.Rao EA.Akedo M.Shanabruch WG.Follettie MT.WalkerGC.Sinskey AJ.Journal of Bacteriology.162(2)591-7，1985.Tauch A.Zheng Z.Puhler A.Kalinowski J.Plasmid.40(2)126-39，1998.CadenasRF.Martin JF.Gil JA.Gene.98(1)117-21，1991中發(fā)現(xiàn)可以在谷氨酸棒狀桿菌中使用的抗生素抗性基因的例子。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以產(chǎn)生含有選定系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因宿主生物(優(yōu)選地微生物)，該系統(tǒng)允許調(diào)節(jié)引入的基因的表達(dá)。例如，在載體上于lac操縱子控制下包含MR基因可以允許只有在IPTG存在的情況下才表達(dá)MR基因。這種調(diào)節(jié)系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的，并且在例如Eikmanns B.J.等.(1991)Gene 10293-8中描述了該調(diào)節(jié)系統(tǒng)。
可以利用培養(yǎng)的本發(fā)明的宿主細(xì)胞，諸如原核生物或真核生物的宿主細(xì)胞產(chǎn)生(即，表達(dá))MR蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用本發(fā)明的宿主細(xì)胞產(chǎn)生MR蛋白質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(在細(xì)胞中，已經(jīng)引入了編碼MR蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒或表達(dá)載體，或者細(xì)胞基因組中已經(jīng)引入了編碼野生型或改變的MR蛋白質(zhì)的基因)，直到產(chǎn)生MR蛋白質(zhì)為止。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞分離MR蛋白質(zhì)。
B.阻抑MR蛋白質(zhì)表達(dá)的方法有大量本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法教導(dǎo)了如何在生物體中誘導(dǎo)特定基因缺陷或者如何阻抑或減少所述基因或相應(yīng)基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，將所述方法應(yīng)用于甲硫氨酸生物合成的負(fù)調(diào)節(jié)物(例如，RXA00655)，由此增加了甲硫氨酸的生物合成。
所述方法可以包括選自下列方法的一種或多種方法。
a)編碼所述MR蛋白質(zhì)(例如，負(fù)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì))的基因的剔除；b)編碼所述MR蛋白質(zhì)(例如，負(fù)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì))的基因的誘變，其中可以在所述基因的編碼、非編碼或調(diào)節(jié)區(qū)中誘導(dǎo)所述突變；c)反義RNA的表達(dá)，其中所述反義RNA與編碼所述MR蛋白質(zhì)(例如，負(fù)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì))的RNA的至少一部分互補(bǔ)；d)DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的表達(dá)，其阻斷或減少編碼所述MR蛋白質(zhì)(例如，負(fù)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì))的基因表達(dá)；e)蛋白質(zhì)結(jié)合因子的表達(dá)，其阻斷或減少編碼所述MR蛋白質(zhì)(例如，負(fù)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì))的基因表達(dá)；f)所述MR蛋白質(zhì)(例如，負(fù)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì))的顯性失活變體的表達(dá)；和g)編碼所述MR蛋白質(zhì)(例如，負(fù)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì))的mRNA的去穩(wěn)定化。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，(例如，通過(guò)本領(lǐng)域已知的同源重組或其它遺傳方法)破壞宿主細(xì)胞中內(nèi)源MR基因，使其蛋白質(zhì)產(chǎn)物不再表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，用一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，缺失或倒位改變了宿主細(xì)胞中內(nèi)源或引入的MR基因。所述MR基因仍舊可能編碼功能性MR蛋白質(zhì)，但也可能編碼非功能性MR蛋白質(zhì)或具有修飾(例如，增加或降低)活性的MR蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，(例如，通過(guò)缺失、截短、倒位或點(diǎn)突變)改變了微生物中MR基因的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)(例如，啟動(dòng)子、阻遏物或誘導(dǎo)物)，以調(diào)節(jié)MR基因的表達(dá)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解利用本發(fā)明的方法可以容易地產(chǎn)生含有一種以上所述MR基因和蛋白質(zhì)修飾的宿主細(xì)胞，并且本發(fā)明中包括這種宿主細(xì)胞。
為了產(chǎn)生同源重組微生物，制備含有至少一部分MR基因的載體，其中已經(jīng)向該MR基因部分中引入了缺失、添加或置換，以便改變例如，功能性破壞MR基因。優(yōu)選地，該MR基因是谷氨酸棒狀桿菌MR基因，但是它也可以是來(lái)源于相關(guān)細(xì)菌，或者甚至來(lái)源于哺乳動(dòng)物、酵母或昆蟲(chóng)來(lái)源的同系物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)載體，這樣一旦發(fā)生同源重組，就功能性破壞內(nèi)源MR基因(即，不再編碼功能性蛋白質(zhì)；也稱做“剔除”載體)。做為可替代的方案，可以設(shè)計(jì)載體，以便一旦發(fā)生同源重組，就突變或改變內(nèi)源MR基因(例如，可以改變上游調(diào)節(jié)區(qū)以改變內(nèi)源MR蛋白質(zhì)的表達(dá))。在同源重組載體中，改變的MR基因部分在其5’和3’側(cè)翼具有MR基因的其它核酸，以允許在載體帶有的內(nèi)源MR基因和微生物的內(nèi)源MR基因之間發(fā)生同源重組。該額外的側(cè)翼MR核酸具有對(duì)于與內(nèi)源基因進(jìn)行成功同源重組而言足夠的長(zhǎng)度。通常地，(在5’和3’末端)側(cè)翼DNA應(yīng)該具有100堿基對(duì)至幾千個(gè)堿基對(duì)之間的長(zhǎng)度，并且包含在載體中(參見(jiàn)，例如Thomas，K.R.，和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51503，關(guān)于同源重組載體的描述)。此外，可以利用其它篩選方式來(lái)構(gòu)建染色體重組的方法也是已知的，其中通過(guò)陽(yáng)性篩選的方法來(lái)尋回選擇性標(biāo)記，Schafer A.Tauch A.Jager W.Kalinowski J.Thierbach G.Puhler A.Gene.145(1)69-73，1994。(例如，通過(guò)電穿孔)將載體引入到微生物中并利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)篩選其中引入的MR基因已經(jīng)與內(nèi)源MR基因同源重組的細(xì)胞。
通過(guò)表達(dá)定向抗編碼MR的mRNA的反義RNA可以獲得減少的MR蛋白質(zhì)表達(dá)。上面描述了所述的反義RNA。利用反義基因調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)，例如Weintraub，H.等，AntisenseRNA as a molecular tool for genetic analysis，Reviews Trends in Genetics，1(1)卷1986)。通常向細(xì)胞施用或者在原位產(chǎn)生本發(fā)明的反義核酸分子，使它們雜交或結(jié)合編碼MR蛋白質(zhì)的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA，以例如通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)。雜交可以是通過(guò)常規(guī)核苷酸互補(bǔ)性以形成穩(wěn)定的雙螺旋，或者例如在結(jié)合DNA雙螺旋的反義核酸分子的情況下，雜交是在雙螺旋大溝中的特異性相互作用?？梢孕揎椃戳x分子，例如通過(guò)將反義核酸分子與結(jié)合細(xì)胞表面受體或抗原的肽或抗體連接，使它特異性結(jié)合選定的細(xì)胞表面上表達(dá)的受體或抗原。也可以利用這里所述的載體，向細(xì)胞遞送反義核酸分子。為了獲得足夠的細(xì)胞內(nèi)反義分子濃度，優(yōu)選其中反義核酸分子置于強(qiáng)原核生物、病毒或真核生物啟動(dòng)子控制下的載體構(gòu)建體。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的反義核酸分子是α-端基異構(gòu)核酸分子(α-anomeric nucleic acid molecule)。α-端基異構(gòu)核酸分子與互補(bǔ)RNA形成特殊雙鏈雜合體，在該雜合體中與通常β-單元相反，該雙鏈走向互相平行(Gaultier等.(1987)Nucleic Acids.Res.156625-6641)。反義核酸分子也可以包含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等.(1987)Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等.(1987)FEBS Lett.215327-330)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明反義核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能切割與其具有互補(bǔ)區(qū)的單鏈核酸，諸如mRNA。因此，核酶(例如，錘頭狀核酶(Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334585-591中所述))可以用于催化切割MR mRNA轉(zhuǎn)錄物，以抑制MR mRNA的翻譯?？梢愿鶕?jù)這里公開(kāi)的MR DNA的核苷酸序列(即，SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ IDNO20或SEQ ID NO22)設(shè)計(jì)對(duì)編碼MR的核酸具有特異性的核酶。例如，可以構(gòu)建四膜蟲(chóng)(Tetrahymena)L-19IVS RNA衍生物，其中活性位點(diǎn)的核苷酸序列與編碼MR的mRNA中待要切割的核苷酸序列互補(bǔ)。參見(jiàn)，例如Cech等美國(guó)專利號(hào).4,987,071和Cech等.美國(guó)專利號(hào).5,116,742。做為可替代的方案，可以利用MR mRNA從RNA分子庫(kù)篩選具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA。參見(jiàn)，例如Bartel，D.和Szostak，J.W.(1993)Science 2611411-1418。
做為可替代的方案，可以利用與MR核苷酸序列的調(diào)節(jié)區(qū)(例如，MR啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的核苷酸序列，通過(guò)使該核苷酸序列靶向目標(biāo)以形成阻止靶細(xì)胞中MR基因轉(zhuǎn)錄的三股螺旋結(jié)構(gòu)，從而抑制MR基因表達(dá)。一般地參見(jiàn)Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)569-84；Helene，C.等(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)807-15。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的另外或可替代的方法可以用于調(diào)節(jié)，例如阻抑或增加基因(例如，編碼甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物的基因)的表達(dá)，或者用于調(diào)節(jié)例如增加或阻抑或抑制相應(yīng)基因產(chǎn)物的活性。
可以使用的一種方法是表達(dá)基因產(chǎn)物(例如，編碼甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物的基因)的顯性失活變體以阻抑例如甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物的活性。
優(yōu)選地，甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物(例如，如SEQ ID NO1，18，20或22所示例的RXA00655)是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。已知轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物作為二聚體存在，其結(jié)合可能以所謂的二重對(duì)稱含有重復(fù)序列的DNA結(jié)構(gòu)的相對(duì)部分?？梢栽谵D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的氨基酸序列中確定DNA結(jié)合活性。在Schumacher M.A.和Brennan R.G.(2002)Molecular Microbiology.45885-93中可以發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物二聚體結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的例子。例如，通過(guò)在一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)相同蛋白質(zhì)的不同等位基因以產(chǎn)生由調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的未突變和突變等位形式組成的異源二聚體蛋白質(zhì)，可以賦予這種生物體顯性失活表型。在Journal of Molecular Biology(2002)322(2)311-24，和在Journal ofBiological Chemistry(1994).269(11)8246-54中可以發(fā)現(xiàn)用于在生物體中構(gòu)建突變體顯性失活阻遏蛋白的方法，其中該生物體也表達(dá)相同基因的未突變的等位基因。例如，可以失活所述甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方式中，mRNA穩(wěn)定和去穩(wěn)定作用可以用做增加或減少給定mRNA分子的壽命的方法。在Smolke C.D.和Keasling J.D.(2002)Biotechnology & Bioengineering.78(4)412-24，在Smolke C.D.等.(2001)Metabolic Engineering 3(4)313-21，和在Carrier T.A.and KeaslingJ.D.(1999)Biotechnology Progress 15(1)58-64中可以發(fā)現(xiàn)影響給定mRNA壽命的方法?？梢杂糜谡{(diào)節(jié)基因表達(dá)的另一種方法涉及DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的表達(dá)，該DNA結(jié)合蛋白質(zhì)增加或阻斷或減少?gòu)幕?，例如編碼甲硫氨酸生物合成調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)。
通過(guò)利用特異性DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，例如鋅指蛋白質(zhì)類轉(zhuǎn)錄因子，可以阻斷或減少基因，例如編碼甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)。所述因子可以定向于例如待要阻抑的基因的調(diào)節(jié)區(qū)。所述因子的應(yīng)用允許阻抑表達(dá)，而不改變相應(yīng)的基因序列。構(gòu)建能結(jié)合特異性靶序列的人工DNA結(jié)合因子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。通過(guò)利用上述人工DNA結(jié)合因子，將它們與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合，由此產(chǎn)生人工轉(zhuǎn)錄起始因子，從而可以增加基因表達(dá)，例如編碼甲硫氨酸生物合成正調(diào)節(jié)物的基因表達(dá)。(Dreier B等.(2001)J Biol Chem 276(31)29466-78；Dreier B等.(2000)JMol Biol 303(4)489-502；Beerli RR等.(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(4)1495-1500；Beerli RR等.(2000)J Biol Chem 275(42)32617-32627；Segal DJ和Barbas CF 3rd.(2000)Curr Opin Chem Biol 4(1)34-39；KangJS和Kim JS(2000)J Biol Chem 275(12)8742-8748；Beerli RR等.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(25)14628-14633；Kim JS等.(1997)Proc NatlAcad Sci USA 94(8)3616-3620；Klug A(1999)J Mol Biol 293(2)215-218；Tsai SY等.(1998)Adv Drug Deliv Rev 30(1-3)23-31；Mapp AK等.(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(8)3930-3935；Sharrocks AD等.(1997)Int JBiochem Cell Biol 29(12)1371-1387；Zhang L等.(2000)J Biol Chem 275(43)33850-33860)。通過(guò)利用，例如聚酰胺類型的定制的低分子量合成化合物也可以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的阻抑(Dervan PB和Bürli RW(1999)CurrentOpinion in Chemical Biology 3688-693；Gottesfeld JM等.(2000)GeneExpr 9(1-2)77-91)。對(duì)于任何特異性DNA靶序列，可以在合理基礎(chǔ)上采用這些化合物以允許阻抑基因表達(dá)，或者如果該化合物與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合使用，則允許起始基因表達(dá)。構(gòu)建能結(jié)合特異性靶序列的人工DNA結(jié)合因子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(Bremer RE等.(2001)Bioorg MedChem.9(8)2093-103；Ansari A.Z等.(2001)Chem Biol.8(6)583-92；Gottesfeld J.M.等.(2001)JMol Biol.309(3)615-29；Wurtz N.R.等.(2001)Org Lett 3(8)1201-3；Wang C.C.等.(2001)Bioorg Med Chem 9(3)653-7；Urbach A.R.和Dervan P.B.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98(8)4343-8；Chiang S.Y.等.(2000)J Biol Chem.275(32)24246-54)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以利用蛋白質(zhì)結(jié)合因子的表達(dá)，該蛋白質(zhì)結(jié)合因子激活或阻斷或減少編碼甲硫氨酸生物合成調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)或活性。
適于結(jié)合甲硫氨酸生物合成調(diào)節(jié)物，并且因此阻抑活性的蛋白質(zhì)結(jié)合因子可以基于RNA諸如，aptamer(Famulok M和Mayer G(1999)CurrTop Microbiol Immunol 243123-36)，抗體、抗體片段或單鏈抗體。這些蛋白質(zhì)結(jié)合因子的構(gòu)建和利用的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
C.本發(fā)明的用途和方法文中所述的核酸分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)同系物、融合蛋白、引物、轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞可用于一種或多種下述方法中調(diào)節(jié)期望的化合物如精細(xì)化學(xué)品如甲硫氨酸的細(xì)胞產(chǎn)量；鑒定谷氨酸棒狀桿菌及相關(guān)生物體；繪制與谷氨酸棒狀桿菌相關(guān)的生物體的基因組圖譜；鑒定并定位目標(biāo)谷氨酸棒狀桿菌序列；進(jìn)化研究；確定MR蛋白中為功能所需的區(qū)域；調(diào)節(jié)MR蛋白活性；以及調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)代謝途徑的活性。
本發(fā)明的MR核酸分子具有各種用途。對(duì)本發(fā)明MR核酸分子的操作，例如阻抑或增加核酸表達(dá)或蛋白質(zhì)分子的活性，可以引起對(duì)甲硫氨酸生物合成的調(diào)節(jié)。例如，在甲硫氨酸或甲硫氨酸生物合成途徑的其它化合物的生產(chǎn)方面，超表達(dá)RXN02910或具有增加的RXN02910表達(dá)的谷氨酸棒狀桿菌株系顯示了顯著增加的生產(chǎn)，其中該RXN02910是甲硫氨酸生物合成的正調(diào)節(jié)物。而且，在甲硫氨酸或甲硫氨酸生物合成途徑的其它化合物的生產(chǎn)方面，RXN00655缺陷或具有阻抑的RXN00655表達(dá)的谷氨酸棒狀桿菌株系也顯示了顯著增加的生產(chǎn)，其中該RXN00655是甲硫氨酸生物合成的負(fù)調(diào)節(jié)物。
此外，對(duì)本發(fā)明MR核酸分子進(jìn)行操作可導(dǎo)致產(chǎn)生與野生型MR蛋白功能不同的MR蛋白。這些蛋白質(zhì)可以在功效或活性上提高，可以在細(xì)胞內(nèi)以較通常多的量存在，或可以在功效或活性上降低。
本發(fā)明也提供了篩選調(diào)節(jié)MR蛋白活性的分子的方法，所述分子可以與MR蛋白本身相互作用或與MR蛋白的底物或結(jié)合部分相互作用，或者調(diào)節(jié)本發(fā)明MR核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯。在此類方法中，將表達(dá)本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)MR蛋白的微生物與一種或多種受試化合物接觸，并評(píng)估每一受試化合物對(duì)MR蛋白的活性或表達(dá)水平的影響。
這種活性的改變可以直接地調(diào)節(jié)由谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)一種或多種精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。例如，對(duì)于編碼期望精細(xì)化學(xué)品的生物合成蛋白質(zhì)的基因，通過(guò)優(yōu)化激活該基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的MR蛋白質(zhì)，例如甲硫氨酸生物合成正調(diào)節(jié)物，例如RXN02910的活性，或者通過(guò)損害或廢除阻遏這種基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的MR蛋白質(zhì)，例如甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物，例如RXA00655的活性，也可以增加該生物合成途徑的活性或活性率。相似地，通過(guò)改變MR蛋白質(zhì)活性使它組成性地翻譯后失活期望的精細(xì)化學(xué)品降解途徑中所涉及的蛋白質(zhì)，或者通過(guò)改變MR蛋白質(zhì)活性使它組成性地阻遏這種基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，由于該精細(xì)化學(xué)品化合物減少的降解，從而可以增加細(xì)胞生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)速率。
而且，由于不同代謝途徑的相互關(guān)聯(lián)性，通過(guò)調(diào)節(jié)一種或多種MR蛋白質(zhì)的活性，可以間接地刺激或改進(jìn)細(xì)胞的一種或多種精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)或生產(chǎn)率。例如，對(duì)于通過(guò)激活一種或多種賴氨酸生物合成酶的表達(dá)而增加產(chǎn)量、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率，可以同時(shí)增加其它化合物，諸如其它氨基酸的表達(dá)，其中這些其它化合物在細(xì)胞對(duì)賴氨酸的需求量增加大時(shí)也自然會(huì)被細(xì)胞以更大的需求量所需求。而且，可以改變細(xì)胞整體的代謝調(diào)節(jié)使細(xì)胞在發(fā)酵培養(yǎng)的環(huán)境條件(其中可能營(yíng)養(yǎng)物和氧氣的供應(yīng)不好，可能環(huán)境中有高水平的有毒廢物)下能更好地生長(zhǎng)或復(fù)制。例如，對(duì)應(yīng)答細(xì)胞外培養(yǎng)基中高水平廢物而阻遏分子——細(xì)胞膜產(chǎn)生所需的分子——合成(為了阻斷次最佳生長(zhǎng)條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂)的MR蛋白質(zhì)，進(jìn)行誘變使它不再能阻遏這種合成，可以甚至在次最佳生長(zhǎng)條件下增加培養(yǎng)物中細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。由于培養(yǎng)物中存在相對(duì)更多數(shù)量的產(chǎn)生期望精細(xì)化學(xué)品的細(xì)胞，這種增加的生長(zhǎng)或生存力也應(yīng)該增加發(fā)酵培養(yǎng)物生產(chǎn)這種期望精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)率。
前述用于誘變MR蛋白質(zhì)以導(dǎo)致由谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品(例如甲硫氨酸)的產(chǎn)率增加的誘變策略不意在限制性的；可以對(duì)這些策略進(jìn)行的改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。利用這些策略，并且結(jié)合這里公開(kāi)的機(jī)制，本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子可以用于產(chǎn)生表達(dá)突變的MR核酸和蛋白質(zhì)分子的谷氨酸棒狀桿菌或相關(guān)的細(xì)菌株系，以改進(jìn)期望化合物的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。這種期望化合物可以是谷氨酸棒狀桿菌的任何天然產(chǎn)物，包括生物合成途徑的終產(chǎn)物和天然代謝途徑的中間體，及谷氨酸棒狀桿菌代謝中不天然出現(xiàn)，但是由本發(fā)明的谷氨酸棒狀桿菌株系產(chǎn)生的分子。
本發(fā)明的MR分子也可以用于鑒定谷氨酸棒狀桿菌生物體或其近親。而且，它們可以用于鑒定微生物混合群體中谷氨酸棒狀桿菌或其近親的存在。本發(fā)明提供了大量谷氨酸棒狀桿菌基因的核酸序列；利用跨越谷氨酸棒狀桿菌基因中該生物體獨(dú)特的區(qū)域的探針，通過(guò)在嚴(yán)格條件下探測(cè)自微生物的單一或混合群體培養(yǎng)物中提取的基因組DNA，可以確定該生物體是否存在。
本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子也可以做為基因組特異性區(qū)域的標(biāo)記。這不僅在基因組作圖中有用，并且也可以用于谷氨酸棒狀桿菌蛋白質(zhì)的功能性研究。例如，為了鑒定特定的谷氨酸棒狀桿菌DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的基因組區(qū)，可以消化谷氨酸棒狀桿菌基因組，并且溫育所得到的片段和DNA結(jié)合蛋白質(zhì)。用本發(fā)明的核酸分子，優(yōu)選地具有容易檢測(cè)標(biāo)記的核酸分子可以另外地探測(cè)結(jié)合蛋白質(zhì)的片段；這種核酸分子與基因組片段的結(jié)合能將片段定位于谷氨酸棒狀桿菌的基因組圖譜中，并且當(dāng)用不同的酶進(jìn)行多次時(shí)，有利于快速確定蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸序列。而且，本發(fā)明的核酸分子與相關(guān)物種的序列可能具有足夠的同源性，這樣這些核酸分子可以做為相關(guān)細(xì)菌，諸如乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)中基因組圖譜構(gòu)建的標(biāo)記。
通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)一步示例了本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)該解釋為限制性的。這里將本申請(qǐng)中所引用的所有參考文獻(xiàn)，附圖，專利申請(qǐng)，專利，公開(kāi)的專利申請(qǐng)，表和序列表特此并入為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032的總基因組DNA的制備谷氨酸棒狀桿菌(ATCC 13032)的培養(yǎng)物在30℃于BHI培養(yǎng)基(Difco)中劇烈振搖過(guò)夜。離心收獲細(xì)胞，棄上清并將細(xì)胞重懸于5ml緩沖液-I(培養(yǎng)物原初體積的5％-所有顯示的體積為按100ml培養(yǎng)物體積計(jì)算所得)。緩沖液-I的組成140.34g/l蔗糖，2.46g/l MgSO4×7H2O，10ml/l KH2PO4溶液(100g/l，用KOH調(diào)節(jié)至pH 6.7)，50ml/l M12濃縮物(10g/l(NH4)2SO4，1g/l NaCl，2g/l MgSO4×7H2O，0.2g/l CaCl2，0.5g/l酵母提取物(Difco)，10ml/l痕量元素混合物(200mg/l FeSO4×H2O，10mg/l ZnSO4×7H2O，3mg/lMnCl2×4H2O，30mg/l H3BO3，20mg/l CoCl2×6H2O，1mg/lNiCl2×6H2O，3mg/l Na2MoO4×2H2O，500mg/l絡(luò)合劑(EDTA或檸檬酸)，100ml/l維生素-混合物(0.2mg/l生物素，0.2mg/l葉酸，20mg/l對(duì)氨基苯甲酸，20mg/l核黃素，40mg/l泛酸鈣，140mg/l煙酸，40mg/l維生素B6鹽酸鹽，200mg/l肌醇)。向懸液中加入溶菌酶至終濃度2.5mg/ml。在37℃孵育約4小時(shí)后，細(xì)胞壁降解，離心收獲所得的原生質(zhì)體。沉淀用5ml緩沖液-I洗一次并用5ml TE-緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8)洗一次。將沉淀重懸于4ml TE-緩沖液，并加入0.5ml SDS溶液(10％)和0.5ml NaCl溶液(5M)。加入蛋白酶K至終濃度200μg/ml后，將懸液在37℃孵育約18小時(shí)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法用酚、酚-氯仿-異戊醇和氯仿-異戊醇提取而純化DNA。然后，加入1/50體積的3M醋酸鈉和2體積的乙醇，于-20℃孵育30分鐘，并在高速離心機(jī)上使用SS34轉(zhuǎn)子(Sorvall)于12,000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，沉淀DNA。將該DNA溶于含20μg/ml RNaseA的1ml TE-緩沖液中，并用1000ml TE-緩沖液于4℃透析至少3小時(shí)。在此期間，更換緩沖液3次。向分裝的0.4ml透析過(guò)的DNA溶液中加入0.4ml 2M LiCl和0.8ml乙醇。于-20℃孵育30分鐘后，離心(13,000轉(zhuǎn)/分，Biofuge Fresco，Heraeus，Hanau，德國(guó))收集DNA。將該DNA沉淀溶于TE-緩沖液。用此方法制備的DNA可用于所有目的，包括southern印跡或構(gòu)建基因組文庫(kù)。
實(shí)施例2在大腸桿菌中構(gòu)建谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的基因組文庫(kù)使用如實(shí)施例1所述制備的DNA，按照公知的且已建立的方法(參見(jiàn)例如，Sambrook，J.等人(1989)“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，Cold Spring HarborLaboratory Press，或Ausubel，F(xiàn).M.等人(1994)“分子生物學(xué)最新方法”，John Wiley & Sons.)構(gòu)建粘粒和質(zhì)粒文庫(kù)。
可以使用任何質(zhì)?；蛘沉?。特別可以使用的是質(zhì)粒pBR322(Sutcliffe，J.G.(1979)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)753737-3741)；pACYC177(Change & Cohen(1978)細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol)1341141-1156)、pBS系列的質(zhì)粒(pBSSK+，pBSSK-及其它；Stratagene，LaJolla，USA)、或粘粒如SuperCos1(Stratagene，LaJolla，USA)或Lorist6(Gibson，T.J.，Rosenthal A.和Waterson，R.H.(1987)基因(Gene)53283-286。特異性用于谷氨酸棒狀桿菌的基因文庫(kù)可用質(zhì)粒pSL109(Lee，H.-S.和A.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4256-263)構(gòu)建。
實(shí)施例3DNA序列測(cè)定和計(jì)算機(jī)功能分析如實(shí)施例2所述的基因組文庫(kù)按照標(biāo)準(zhǔn)方法用于DNA序列測(cè)定，尤其是使用ABI377序列測(cè)定儀通過(guò)鏈終止法測(cè)定(參見(jiàn)例如，F(xiàn)leischman，R.D.等人(1995)“流感嗜血菌(Haemophilus Influenzae)Rd的全基因組隨機(jī)序列測(cè)定和組裝”，科學(xué)(Science)，269496-512)。使用具有以下核苷酸序列的測(cè)序引物5’-GGAAACAGTATGACCATG-3’(SEQ ID NO18)或5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO19)。
實(shí)施例4體內(nèi)誘變谷氨酸棒狀桿菌的體內(nèi)誘變可通過(guò)將質(zhì)粒(或其它載體)DNA在不能維持其遺傳信息完整性的大腸桿菌或其它微生物(例如芽孢桿菌屬種或酵母如釀酒酵母)中傳代而實(shí)施。典型的增變菌株在用于DNA修復(fù)系統(tǒng)的基因中有突變(例如mutHLS，mutD，mutT等；參考文獻(xiàn)見(jiàn)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌(Escherichia coli and Salmonella)，ASMWashington一書(shū)中的Rupp，W.D.(1996)DNA修復(fù)機(jī)制，2277-2294頁(yè))。此類菌株為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。此類菌株的用途在例如Greener，A.和Callahan，M.(1994)Strategies732-34中進(jìn)行了闡述。
實(shí)施例5谷氨酸棒狀桿菌的生長(zhǎng)——培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件棒狀桿菌培養(yǎng)在合成或天然的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。用于棒狀桿菌的許多種不同生長(zhǎng)培養(yǎng)基為人們熟知并易于獲得(Lieb等人(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.，32205-210；von der Osten等人(1998)Biotechnology Letters，1111-16；DE專利4,120,867；在原核生物(The Procaryotes)，Volume II，Balows，A.等人編輯.Springer-Verlag一書(shū)中的Liebl(1992)“棒狀桿菌屬”(“The Genus Corynebacterium”))。這些培養(yǎng)基由一種或多種碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素和痕量元素組成。優(yōu)選的碳源是糖類，如單糖、二糖或多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素可以用作很好的碳源。也可通過(guò)復(fù)合化合物如糖蜜或其它來(lái)自糖提煉的副產(chǎn)品，向培養(yǎng)基提供糖。提供不同碳源的混合物也可以是有利的。其它可能的碳源為醇類和有機(jī)酸，如甲醇、乙醇、醋酸或乳酸。氮源通常為有機(jī)或無(wú)機(jī)氮化合物，或?yàn)榘@些化合物的物質(zhì)。示例性氮源包括氨氣或胺鹽如NH4Cl或(NH4)2SO4、NH4OH、硝酸鹽、尿素、氨基酸或復(fù)合氮源如玉米漿、大豆粉、大豆蛋白質(zhì)、酵母提取物、肉膏等。
可包括在培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽化合物包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯化物、磷鹽或硫酸鹽。可向培養(yǎng)基中加入螯合物以維持溶液中的金屬離子。尤其有用的螯合物包括二羥基酚，如兒茶酚或原兒茶酸鹽，或有機(jī)酸如檸檬酸。培養(yǎng)基一般還包含其它生長(zhǎng)因子如維生素或生長(zhǎng)促進(jìn)劑，其實(shí)例包括生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸鹽和維生素B6。生長(zhǎng)因子和鹽常常來(lái)自復(fù)合培養(yǎng)基成分，如酵母提取物、糖蜜、玉米漿等。培養(yǎng)基化合物的確切組成強(qiáng)烈取決于直接實(shí)驗(yàn)并在每一具體情況下單獨(dú)確定。有關(guān)培養(yǎng)基優(yōu)化的信息在課本”Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach(P.M.Rhodes，P.F.Stanbury編輯，IRLPress(1997)53-73頁(yè)，ISBN 0 19 963577 3)中可找到。也可從供應(yīng)商處選擇生長(zhǎng)培養(yǎng)基，如standard 1(Merck)或BHI(grain heart infusion，DIFCO)或其它。
通過(guò)加熱(1.5巴，121℃加熱20分鐘)或過(guò)濾除菌對(duì)所有的培養(yǎng)基組成成分進(jìn)行滅菌。組成成份可一起滅菌，或需要的話分開(kāi)滅菌。所有的培養(yǎng)基組成成份可在生長(zhǎng)開(kāi)始時(shí)存在，或它們可任選地連續(xù)加入或分批加入。
對(duì)每一實(shí)驗(yàn)單獨(dú)規(guī)義培養(yǎng)條件。溫度應(yīng)在15℃和45℃的范圍之間。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度可保持恒定或可改變。培養(yǎng)基的pH應(yīng)在5至8.5的范圍之間，優(yōu)選地在7.0附近，可通過(guò)向培養(yǎng)基中添加緩沖液來(lái)維持。用于此目的的示例性緩沖液為磷酸鉀緩沖液?？蓚溥x地或同時(shí)使用合成緩沖液如MOPS、HEPES、ACES和其它。也可以在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)加入NaOH或NH4OH維持恒定的培養(yǎng)pH。如果使用復(fù)合培養(yǎng)基成分如酵母提取物，可減少對(duì)額外的緩沖液的需要，因?yàn)樵S多復(fù)合化合物具有高緩沖能力。如果使用發(fā)酵罐培養(yǎng)微生物，也可用氣態(tài)氨控制pH。
培養(yǎng)時(shí)間通常在幾小時(shí)到幾天之間。選擇培養(yǎng)時(shí)間以允許肉湯中累積最大量的產(chǎn)物?？稍诙喾N容器如不同規(guī)格的微滴定板、玻璃管、玻璃燒瓶或玻璃或金屬發(fā)酵罐中實(shí)施公開(kāi)的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于篩選大量的克隆，應(yīng)在微滴定板、玻璃管或在有或沒(méi)有擋板的搖瓶中培養(yǎng)微生物。優(yōu)選地使用100ml搖瓶，其中裝有10％(體積)的所需生長(zhǎng)培養(yǎng)基。該燒瓶應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩器(振幅25mm)上以100-300轉(zhuǎn)/分速度搖動(dòng)?？赏ㄟ^(guò)維持潮濕環(huán)境減少蒸發(fā)損失；備選地，對(duì)蒸發(fā)損失應(yīng)進(jìn)行數(shù)學(xué)上的校正。
如果測(cè)試遺傳修飾的克隆，也應(yīng)測(cè)試未修飾的對(duì)照克隆或含基本質(zhì)粒的無(wú)任何插入的對(duì)照克隆。使用已于30℃孵育的在瓊脂板上生長(zhǎng)的細(xì)胞接種培養(yǎng)基至OD6000.5-1.5，其中所述瓊脂板如CM板(10g/l葡萄糖，2.5g/lNaCl，2g/l尿素，10g/l聚胨，5g/l酵母抽取物，5g/l肉膏，22g/l NaCl，2g/l尿素，10g/l聚胨，5g/l酵母抽取物，5g/l肉膏，22g/l瓊脂，用2M NaOH調(diào)節(jié)至pH 6.8)。培養(yǎng)基的接種可以通過(guò)引入從CM板得到的谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞的鹽水懸液或通過(guò)添加該細(xì)菌的液體預(yù)培養(yǎng)物來(lái)完成。
實(shí)施例6突變蛋白質(zhì)功能的體外分析可通過(guò)幾種已建立的方法測(cè)定結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)的活性，如DNA帶移動(dòng)試驗(yàn)(也稱為凝膠阻滯試驗(yàn))。此類蛋白質(zhì)對(duì)其它分子表達(dá)的影響可使用報(bào)告基因試驗(yàn)測(cè)定(如在Kolmar，H.等人(1995)EMBO J.143895-3904及其中所引用的參考文獻(xiàn)中所述)。報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)為人們所熟知，并被建立以應(yīng)用于原核和真核細(xì)胞，使用的酶如β-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白和幾種其它的酶。
實(shí)施例7分析突變蛋白質(zhì)對(duì)期望產(chǎn)物產(chǎn)生的影響谷氨酸棒狀桿菌中的遺傳修飾對(duì)期望化合物(如氨基酸)產(chǎn)生的影響可通過(guò)如下方式評(píng)估將經(jīng)修飾的微生物在合適的條件(如上文中所描述的那些條件)下生長(zhǎng)，并針對(duì)期望產(chǎn)物(即氨基酸)產(chǎn)生的增加來(lái)分析培養(yǎng)基和/或細(xì)胞成分。此類分析技術(shù)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知，包括光譜學(xué)、薄層色譜法、多種染色法、酶學(xué)和微生物學(xué)方法、以及分析色譜法如高效液相色譜法(參見(jiàn)例如，Ullman工業(yè)化學(xué)百科全書(shū)(Ullman，Encyclopediaof Industrial Chemistry)，A2卷，89-90和443-613頁(yè)，VCHWeinheim(1985)；Fallon，A.等人(1987)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology)中的“HPLC在生物化學(xué)中的應(yīng)用”，17卷；Rehm等人(1993)生物技術(shù)(Biotechnology)，3卷，III章“產(chǎn)物回收和純化”，469-714頁(yè)，VCHWeinheim；Belter，P.A.等人(1988)生物分離生物技術(shù)中的下游加工，John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)生物物質(zhì)的回收方法John Wileyand Sons；在《Ulmann工業(yè)化學(xué)百科全書(shū)》一書(shū)中的Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)生物化學(xué)分離，B3卷，11章，1-27頁(yè)，VCHWeinheim；以及Dechow，F(xiàn).J.(1989)生物技術(shù)中的分離和純化技術(shù)(Separation andpurification techniques in biotechnology)，Noyes Publications.)。
除了測(cè)定發(fā)酵終產(chǎn)物外，還可分析用于產(chǎn)生期望化合物的代謝途徑的其它成分如中間體和副產(chǎn)物來(lái)確定化合物的總體產(chǎn)率、產(chǎn)量和或生產(chǎn)效率。分析方法包括測(cè)定培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)素水平(例如，糖類、碳水化合物、氮源、磷酸鹽和其它離子)、測(cè)定生物量組成和生長(zhǎng)、分析生物合成途徑中共同代謝物的產(chǎn)生及測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的氣體。這些測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法在《應(yīng)用微生物生理學(xué)，實(shí)用方法》(Applied MiCrobial Physiology，A PracticalApproach)，P.M.Rhodes和P.F.Stanbury編輯，IRL Press，103-129；131-163和165-192頁(yè)(ISBN0199635773)及其引用的參考文獻(xiàn)中列出。
實(shí)施例8從谷氨酸棒狀桿菌培養(yǎng)物中純化期望產(chǎn)物可通過(guò)多種本領(lǐng)域熟知的方法從谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞或上述培養(yǎng)物上清回收期望產(chǎn)物。如果期望產(chǎn)物不從細(xì)胞向外分泌，可低速離心從培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞、用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如機(jī)械力或超聲裂解細(xì)胞。離心去除細(xì)胞碎片，保留含有可溶蛋白質(zhì)的上清級(jí)分用于進(jìn)一步純化期望化合物。如果產(chǎn)物從谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞分泌，則低速離心從培養(yǎng)物中去除細(xì)胞，并保留上清級(jí)分用于進(jìn)一步純化。
將來(lái)自任一種純化方法的上清級(jí)分用合適的樹(shù)脂進(jìn)行層析，其中期望分子保留在層析樹(shù)脂上而樣本中的許多雜質(zhì)不保留在層析樹(shù)脂上，或者雜質(zhì)保留在層析樹(shù)脂上而樣本不保留。此層析步驟必需時(shí)可使用相同或不同的層析樹(shù)脂重復(fù)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在選擇合適的層析樹(shù)脂以及將它們最有效地用于特定的待純化分子方面是很精通的。可通過(guò)過(guò)濾或超濾濃縮純化產(chǎn)物，并貯存在使產(chǎn)物穩(wěn)定性最大的溫度下。
有大量的純化方法為本領(lǐng)域公知，上述純化方法為非限制性的。此類純化技術(shù)例如在Bailey，J.E.和Ollis，D.F.生物化學(xué)工程基礎(chǔ)(BiochemicalEngineering Fundamentals)，McGraw-Hill紐約(1986)中描述。
分離化合物的身份和純度可通過(guò)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評(píng)定。這些技術(shù)包括高效液相色譜(HPLC)、光譜法、染色法、薄層色譜法、NIRS、酶學(xué)試驗(yàn)或微生物學(xué)方法。此類分析方法的綜述見(jiàn)Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等人(1996)生物技術(shù)(Biotekhnologiya)1127-32；和Schmidt等人(1998)生物加工工程(Bioprocess Engineer)1967-70；Ulmann工業(yè)化學(xué)百科全書(shū)(Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)(1996)A27卷，VCHWeinheim，89-90頁(yè)，521-540頁(yè)，540-547頁(yè)，559-566頁(yè)，575-581頁(yè)和581-587頁(yè)；Michal，G.(1999)生物化學(xué)途徑生物化學(xué)和分子生物學(xué)圖集(BiochemicalPathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology)，John Wileyand Sons；《生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》17卷中的Fallon，A.等人(1987)HPLC在生物化學(xué)中的應(yīng)用。
實(shí)施例9本發(fā)明基因序列的分析在兩個(gè)序列間比較序列并確定百分同源性為本領(lǐng)域公知的技術(shù)，可使用數(shù)學(xué)算法完成，如Karlin和Altschul(1990)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)872264-68的算法，該算法的改進(jìn)見(jiàn)Karlin和Altschul(1993)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905873-77。此算法被摻入了Altschul等人(1990)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.215403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)中?？捎肗BLAST程序進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，設(shè)置的分值＝100、字長(zhǎng)＝12，以獲得與本發(fā)明MR核酸分子同源的核苷酸序列?？捎肵BLAST程序進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)檢索，設(shè)置的分值＝50、字長(zhǎng)＝3，以獲得與本發(fā)明MR蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的缺口比對(duì)，可使用Altschul等人(1997)核酸研究(Nucleic Acids Res.)25(17)3389-3402中所述的Gapped BLAST。當(dāng)使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將知道對(duì)所分析的具體序列如何優(yōu)化程序(例如XBLAST和NBLAST)參數(shù)。
用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一實(shí)例為Meyers和Miller((1988)Comput.Appl.Biosci.411-17)的算法。此算法被摻入ALIGN程序(2.0版本)，其中所述ALIGN程序?yàn)镚CG序列比對(duì)軟件包的一部分。當(dāng)應(yīng)用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可使用PAM120權(quán)重殘基表、設(shè)置缺口長(zhǎng)度罰分為12和缺口罰分為4。其它的序列分析算法為本領(lǐng)域公知，包括Torelli和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.103-5描述的ADVANCE和ADAM；以及Pearson和Lipman(1988)P.N.A.S.852444-8描述的FASTA。
使用GCG軟件包(可在http//www.gcg.com獲得)中的GAP程序也可獲得兩個(gè)氨基酸序列間的百分同源性，其中使用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣，缺口權(quán)重為12、10、8、6或4，且長(zhǎng)度權(quán)重為2、3或4。使用GCG軟件包中的GAP程序可獲得兩個(gè)核酸序列間的百分同源性，其中使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，如缺口權(quán)重為50且長(zhǎng)度權(quán)重為3。
實(shí)施例10構(gòu)建和操作DNA微陣列本發(fā)明的序列另外可用于DNA微陣列的構(gòu)建和應(yīng)用(DNA陣列的設(shè)計(jì)、方法學(xué)和用途為本領(lǐng)域熟知，在如Schena，M.等人(1995)科學(xué)(Science)270467-470；Wodicka，L.等人(1997)自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)151359-1367；DeSaizieu，A.等人(1998)自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)1645-48；和DeRisi，J.L.等人(1997)科學(xué)(Science)278680-686中描述)。
DNA微陣列為由硝化纖維素、尼龍、玻璃、硅氧烷或其它材料組成的固體或柔軟的支持物。核酸分子可以以有序的方式附著在其表面。經(jīng)過(guò)合適的標(biāo)記后，其它核酸或核酸混合物可與固定的核酸分子雜交，且標(biāo)記物可用于監(jiān)測(cè)和測(cè)定在規(guī)定區(qū)域處雜交分子的各自信號(hào)強(qiáng)度。該方法允許同時(shí)定量在所應(yīng)用的核酸樣本或混合物中所有核酸或所選核酸的相對(duì)量或絕對(duì)量。因此DNA微陣列允許平行分析多個(gè)核酸(多至6800個(gè)或更多個(gè)核酸)的表達(dá)(參見(jiàn)例如，Schena，M.(1996)BioEssays 18(5)427-431)。
本發(fā)明的序列可用于設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，其中所述寡核苷酸引物可通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)如聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增一種或多種谷氨酸棒狀桿菌基因的限定區(qū)域。對(duì)5’或3’寡核苷酸引物的選擇和設(shè)計(jì)或?qū)线m接頭的選擇和設(shè)計(jì)允許所得的PCR產(chǎn)物能共價(jià)連接在上述支持介質(zhì)表面上(也參見(jiàn)例如Schena，M.等人(1995)科學(xué)(Science)270467-470中描述)。
核酸微陣列也可如Wodicka，L.等人(1997)自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)151359-1367所述通過(guò)原位寡核苷酸合成來(lái)構(gòu)建。通過(guò)照相平版印刷法，將基質(zhì)的精確限定的區(qū)域曝光。由此活化光不穩(wěn)定的保護(hù)基，然后進(jìn)行核苷酸添加，而避光區(qū)域不發(fā)生任何修飾。接下來(lái)的保護(hù)和光活化循環(huán)允許在規(guī)定的位置處合成不同的寡核苷酸。本發(fā)明基因的小的限定區(qū)域可通過(guò)固相寡核苷酸合成在微陣列上合成。
存在于樣本或核苷酸混合物中的本發(fā)明核酸分子可與此微陣列雜交。這些核酸分子可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)記。簡(jiǎn)而言之，核酸分子(例如mRNA分子或DNA分子)在如反轉(zhuǎn)錄或DNA合成期間通過(guò)摻入同位素或熒光標(biāo)記的核苷酸而標(biāo)記。標(biāo)記的核酸與微陣列的雜交已有描述(例如，Schena，M.等人(1995)見(jiàn)上文；Wodicka，L.等人(1997)，見(jiàn)上文；和DeSaizieu A.等人(1998)，見(jiàn)上文)。雜交分子的檢測(cè)和定量根據(jù)具體摻入的標(biāo)記而進(jìn)行。放射性標(biāo)記可如Schena，M.等人((1995)見(jiàn)上文)所述檢測(cè)，熒光標(biāo)記可以例如通過(guò)Shalon等人(1996)基因組研究(Genome Research)6639-645的方法檢測(cè)。
如上所述，將本發(fā)明序列應(yīng)用于DNA微陣列使得可以比較分析不同的谷氨酸棒狀桿菌菌株或其它棒狀桿菌菌株。例如，核酸陣列方法有利于基于個(gè)體轉(zhuǎn)錄譜研究菌株間變異及鑒定對(duì)特定和/或目標(biāo)菌株特性如致病性、生產(chǎn)力和應(yīng)激耐受力重要的基因。并且，可使用核酸陣列技術(shù)比較本發(fā)明基因在發(fā)酵反應(yīng)期間的表達(dá)譜。
實(shí)施例11細(xì)胞蛋白質(zhì)群(蛋白質(zhì)組)的動(dòng)力學(xué)分析本發(fā)明的基因、組合物和方法可用于研究蛋白質(zhì)群的相互作用和動(dòng)力學(xué)，稱為‘蛋白質(zhì)組學(xué)’。目標(biāo)蛋白質(zhì)群包括但不限于谷氨酸棒狀桿菌的總蛋白質(zhì)群(例如，與其它生物體的蛋白質(zhì)群比較)、那些在特定環(huán)境或代謝條件下(例如，在發(fā)酵過(guò)程中、在高溫或低溫下、或在高或低pH時(shí))具活性的蛋白質(zhì)、或那些在生長(zhǎng)和發(fā)育的特定時(shí)期具活性的蛋白質(zhì)。
可通過(guò)多種熟知的技術(shù)如凝膠電泳分析蛋白質(zhì)群。細(xì)胞蛋白質(zhì)可例如通過(guò)裂解或提取獲得，并且可使用多種電泳技術(shù)相互分離。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)很大程度上基于它們的分子量。等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳(IEF-PAGE)基于等電點(diǎn)分離蛋白質(zhì)(等電點(diǎn)不僅反映蛋白質(zhì)的氨基酸序列，也反映蛋白質(zhì)的翻譯后修飾)。另一更優(yōu)選的蛋白質(zhì)分析方法為連續(xù)組合IEF-PAGE和SDS-PAGE，稱為2-D-凝膠電泳(例如，在Hermann等人(1998)電泳(Electrophoresis)193217-3221；Fountoulakis等人(1998)電泳(Electrophoresis)191193-1202；Langen等人(1997)電泳(Electrophoresis)181184-1192；Antelmann等人(1997)電泳(Electrophoresis)181451-1463中的描述)。其它分離技術(shù)也可用于蛋白質(zhì)分離，如毛細(xì)管凝膠電泳；此類技術(shù)在本領(lǐng)域中熟知。
通過(guò)這些方法分離的蛋白質(zhì)可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)顯示，如通過(guò)染色或標(biāo)記顯示。合適的染色劑為本領(lǐng)域公知，包括考馬斯亮藍(lán)、銀染或熒光染料如Sypro Ruby(Molcular Probos)。在谷氨酸棒狀桿菌的培養(yǎng)基中包含放射性標(biāo)記的氨基酸或其它蛋白質(zhì)前體(例如，35S-甲硫氨酸、35S-半胱氨酸、14C-標(biāo)記的氨基酸、15N-氨基酸、15NO3或15NH4+或13C-標(biāo)記的氨基酸)將允許這些細(xì)胞的蛋白質(zhì)在它們分離前被標(biāo)記上。類似地，可采用熒光標(biāo)記?？筛鶕?jù)前述的技術(shù)提取、分離和分開(kāi)這些標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
通過(guò)這些技術(shù)顯示的蛋白質(zhì)可進(jìn)一步通過(guò)測(cè)定所用染料或標(biāo)記的量來(lái)分析?？墒褂萌绻鈱W(xué)方法定量確定給定蛋白質(zhì)的量，并且可與同一凝膠或其它凝膠中的其它蛋白質(zhì)的量比較。凝膠上蛋白質(zhì)的比較可例如通過(guò)光學(xué)比較、光譜學(xué)、圖像掃描并分析凝膠、或通過(guò)使用照相膠片和屏來(lái)進(jìn)行。此類技術(shù)在本領(lǐng)域中熟知。
為確定任一給定蛋白質(zhì)的身份，可采用直接序列測(cè)定或其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。例如，可使用N-和/或C-端氨基酸序列測(cè)定(諸如Edman降解)，也可使用質(zhì)譜(特別是MALDI或ESI技術(shù)(參見(jiàn)例如，Langen等人(1997)電泳(Electrophoresis)181184-1192))。此處提供的蛋白質(zhì)序列可用于通過(guò)這些技術(shù)鑒定谷氨酸棒狀桿菌蛋白質(zhì)。
通過(guò)這些方法獲得的信息可用于比較來(lái)自各種生物條件(例如，尤其是，不同生物體、發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)、培養(yǎng)基條件、或不同的小生境等)的不同樣本間的蛋白質(zhì)存在、活性或修飾模式。從單獨(dú)這些實(shí)驗(yàn)或與其它技術(shù)組合獲得的數(shù)據(jù)可用于多種用途，如比較在給定情形下(例如，代謝情形下)多種生物體的行為、增加產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的菌株的生產(chǎn)力或提高精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)效率。
實(shí)施例12制備甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物(RXA00655)缺陷的谷氨酸棒狀桿菌株系通過(guò)利用基于同源重組的自身克隆技術(shù)進(jìn)行甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物(RXA00655)缺陷的谷氨酸棒狀桿菌株系的制備。所述技術(shù)原理如圖1中所示。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等.(1989)，Molecular Cloning.A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor；Innis等.(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press)，通過(guò)將RXA00655(SEQ IDNO1)5’-和3’-區(qū)的PCR擴(kuò)增片段連接到載體pCLiK5MCS_integrative_sacB(SEQ ID NO4)中，構(gòu)建名稱為pS_Δ655(SEQ ID NO3)的質(zhì)粒，該質(zhì)粒用于制備甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物(RXA00655)缺陷的谷氨酸棒狀桿菌株系。PCR擴(kuò)增的5’片段的5’末端側(cè)翼是引物引入的XhoI位點(diǎn)，而3’末端側(cè)翼是內(nèi)源NheI位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增的3’片段的5’末端側(cè)翼是由引物引入的NheI位點(diǎn)和隨后的TAA終止密碼子，并且其3’末端側(cè)翼是引物引入的MluI位點(diǎn)。
如所述(Liebl等.(1989)FEMS Microbiol Let 53299-303)，將pS_Δ655(SEQ ID NO3)電穿孔到谷氨酸棒狀桿菌株系A(chǔ)TCC13032中。在補(bǔ)加有50mg/l卡那霉素的CM瓊脂平板上篩選通過(guò)分子間同源重組整合有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。
CM瓊脂10.0g/L D-葡萄糖2.5g/L NaCl2.0g/L尿素10.0g/L細(xì)菌用胨(Difco)
5.0g/L酵母提取物(Difco)5.0g/L牛肉膏(Difco)22.0g/L瓊脂(Difco)高壓滅菌(20分鐘，121℃)。
非選擇性地(沒(méi)有卡那霉素)在CM培養(yǎng)基中過(guò)夜溫育卡那霉素抗性的克隆以獲得質(zhì)粒與RXA00655染色體拷貝的一起切除。在含有10％蔗糖的CM瓊脂上將培養(yǎng)物涂平板。只有切除了整合的pS_Δ655質(zhì)粒的那些克隆才能生長(zhǎng)在含有蔗糖的CM瓊脂上，因?yàn)閜S_Δ655中sacB基因?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化為對(duì)谷氨酸棒狀桿菌有毒的果聚糖蔗糖酶。在切除時(shí)，或者RXA00655的缺失構(gòu)建體或者RXA00655的染色體拷貝與質(zhì)粒一起被去除。
為了鑒定已經(jīng)排除了RXA00655染色體拷貝的克隆，制備所有可能克隆的染色體DNA(Tauch等.(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns等.(1994)Microbiology 1401817-1828)，并且根據(jù)Sambrook等.(1989)，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，用Southern印跡分析進(jìn)行對(duì)照。剔除的株系稱為ATCC13032_Δ_rxa00655。
實(shí)施例15用ATCC13032_Δ_rxa00655制備甲硫氨酸在30℃，在CM瓊脂平板上溫育ATCC13032和ATCC13032_Δ_rxa00655菌株。從平板上刮下細(xì)胞，并且懸浮在鹽水中。對(duì)于主培養(yǎng)，用細(xì)胞懸浮液接種100ml錐形燒瓶中的10ml培養(yǎng)基II和0.5g高壓滅菌的CaCO3(Riedel de Haen)，達(dá)到最終OD600nm為1.5。在30℃，進(jìn)行培養(yǎng)72小時(shí)。
培養(yǎng)基II40g/l蔗糖60g/l糖蜜(基于100％糖含量計(jì)算的)25g/l(NH4)2SO4
0.4g/l MgSO4*7H2O0.6g/l KH2PO40.3mg/l硫胺素*HCl1mg/l生物素(來(lái)源于1mg/ml無(wú)菌過(guò)濾的母液，用NH4OH將pH調(diào)整到8.0)2mg/l FeSO42mg/l MnSO4用NH4OH將pH調(diào)整到7.8。以后，高壓滅菌培養(yǎng)基(121℃，20分鐘)。添加來(lái)源于母液(200μg/ml，無(wú)菌過(guò)濾)的另外維生素B12，使終濃度是200μg/l。
根據(jù)來(lái)自于Agilent的方法，利用Agilent 1100系列LC系HPLC檢測(cè)形成的甲硫氨酸的量。在Hypersil AA-柱(Agilent)上分離以鄰苯二醛(ortho-pthalaldehyde)柱前衍生的氨基酸。株系A(chǔ)TCC13032_Δ_rxa00655比ATCC13032產(chǎn)生了顯著更多的甲硫氨酸。
實(shí)施例16制備超表達(dá)甲硫氨酸生物合成正調(diào)節(jié)物(RXN02910)的谷氨酸棒狀桿菌株系利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等.(1989)，Molecular Cloning.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor；Innis等.(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press)，通過(guò)將RXN02910的PCR擴(kuò)增片段(SEQ ID NO9)連接到載體pG(SEQ IDNO12)中構(gòu)建超表達(dá)甲硫氨酸生物合成正調(diào)節(jié)物(RXN02910；SEQ IDNO5或6)、名稱為pGrxn02910(SEQ ID NO13)的質(zhì)粒。使用下面的寡核苷酸引物對(duì)用于擴(kuò)增有義引物(SEQ ID NO7)5′-GAGAGACTCGAGTGGTTTAGGGGATGAGAAACCG-3′反義引物(SEQ ID NO8)
5′-CTCTCACTAGTCTACCGCGCCAACAACAGCG-3′PCR擴(kuò)增片段的5’末端側(cè)翼是引物引入的XhoI位點(diǎn)，3’末端側(cè)翼是引物引入的BcuI位點(diǎn)。擴(kuò)增的片段含有RXN02910的開(kāi)放讀框(ORF)以及包含啟動(dòng)子的相應(yīng)基因的另外5’區(qū)。
如所述(Liebl，等.(1989)FEMS Microbiology Letters 53299-303)，將所得到的質(zhì)粒pGrxn02910(SEQ ID NO13)電穿孔到谷氨酸棒狀桿菌株系A(chǔ)TCC13032中。在補(bǔ)加有50mg/l卡那霉素的CM瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化體(參見(jiàn)上述)。所得到的株系命名為ATCC13032/pGrxn02910。
實(shí)施例17用ATCC13032/pGrxn02910制備甲硫氨酸在30℃，在CM瓊脂平板上溫育ATCC13032和ATCC13032/pGrxn02910菌株。從平板上刮下細(xì)胞，并且懸浮在鹽水中。對(duì)于主培養(yǎng)，用細(xì)胞懸浮液接種100ml圓錐形燒瓶中的10ml培養(yǎng)基II(參見(jiàn)上述)和0.5g高壓滅菌的CaCO3(Riedel de Haen)，達(dá)到最終OD600nm為1.5。在30℃，進(jìn)行培養(yǎng)72小時(shí)。在ATCC13032/pGrxn02910情況下，所有的平板和培養(yǎng)物都含有另外的50μg/l卡那霉素。根據(jù)來(lái)自于Agilent的方法，利用Agilent 1100系列LC系HPLC檢測(cè)形成的甲硫氨酸的量。在HypersilAA-柱(Agilent)上分離用鄰苯二醛柱前衍生的氨基酸。株系A(chǔ)TCC13032/pGrxn02910比ATCC13032產(chǎn)生了顯著更多的甲硫氨酸。
實(shí)施例18制備甲硫氨酸生物合成正調(diào)節(jié)物(RXN02910)缺陷的谷氨酸棒狀桿菌株系通過(guò)卡那霉素選擇性載體的插入進(jìn)行甲硫氨酸生物合成正調(diào)節(jié)物(RXN02910)缺陷的谷氨酸棒狀桿菌株系的制備。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等.(1989)，Molecular Cloning.A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor；Innis等.(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press)，通過(guò)將rxn02910的PCR擴(kuò)增片段連接到載體pIntegrativ(SEQ ID NO14)中構(gòu)建名稱為pIntegrativ_Δ2910(SEQ ID NO15)的質(zhì)粒，該質(zhì)粒用于制備甲硫氨酸生物合成正調(diào)節(jié)物(rxn02910)缺陷的谷氨酸棒狀桿菌株系。PCR擴(kuò)增片段(SEQ ID NO11)的5’末端側(cè)翼是引物引入的XhoI位點(diǎn)，3’末端側(cè)翼是引物引入的EcoRV位點(diǎn)。
如所述(Liebl等.(1989)FEMS Microbiol Let 53299-303)，將pIntegrativ_Δ2910(SEQ ID NO15)電穿孔到谷氨酸棒狀桿菌株系A(chǔ)TCC13032中。在補(bǔ)加有50mg/l卡那霉素的CM瓊脂平板上篩選通過(guò)分子間同源重組整合有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。為了鑒定具有整合質(zhì)粒并因此破壞了RXN02910染色體拷貝的克隆，制備來(lái)源于可能克隆的染色體DNA(Tauch等.(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns等.(1994)Microbiology 1401817-1828)，并且根據(jù)Sambrook等.(1989)，Molecular Cloning.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，用Southern印跡分析進(jìn)行對(duì)照。
剔除的株系稱為ATCC13032_Δ_rxn02910。根據(jù)來(lái)自于Agilent的方法，利用Agilent 1100系列LC系HPLC檢測(cè)形成的甲硫氨酸的量。在Hypersil AA-柱(Agilent)上分離用鄰苯二醛柱前衍生的氨基酸。
株系A(chǔ)TCC13032_Δ_rxn02910比ATCC13032產(chǎn)生了顯著更少的甲硫氨酸，因此證明rxn02910實(shí)際上是甲硫氨酸生物合成的正調(diào)節(jié)物。
等同方案本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將意識(shí)到或只是使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)即能確定文中所描述的本發(fā)明具體實(shí)施方案的許多等同方案。此類等同方案旨在包括在下列權(quán)利要求中。
表1可用于本發(fā)明實(shí)踐中的棒狀桿菌和短桿菌菌株




ATCC美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，MD，美國(guó)FERM發(fā)酵研究所(Fermentation Research Institute)，Chiba，日本
NRRL農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心，北方研究室(ARS Culture Collection，Northern Regional Research Laboratory)，Peoria，IL，美國(guó)CECT西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心，Valencia，西班牙NCIMB國(guó)立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司，英國(guó)CBS真菌菌種保藏中心，NLNCTC國(guó)立典型培養(yǎng)物保藏中心(National Collection of TypeCultures)，倫敦，英國(guó)DSMZ德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)，Braunschweig，德國(guó)參考文獻(xiàn)參見(jiàn)Sugawara，H.等.(1993)World directory of collectionsof cultures of microorganismsBacteria，fungi and yeasts(4′edn)，Worldfederation for culture collections world data center on microorganisms，Saimata，Japen.
序列表<110>巴斯福股份公司(BASF Aktiengesellschaft)<120>生產(chǎn)甲硫氨酸的方法<130>AE20020777 AE20020776<140>
<141>
<160>23<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>761<212>DNA<213>谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)<220>
<221>CDS<222>(101)..(739)<223>編碼甲硫氨酸生物合成的負(fù)調(diào)節(jié)物<400>1ttgcctgtgg attaaaacta tacgaaccgg tttgtctata ttggtgttag acagttcgtc 60gtatcttgaa acagaccaac ccgaaaggac gtggccgaac gtg gct gct agc gct115Val Ala Ala Ser Ala1 5tca ggc aag agt aaa aca agt gcc ggg gca aac cgt cgt cgc aat cga163Ser Gly Lys Ser Lys Thr Ser Ala Gly Ala Asn Arg Arg Arg Asn Arg10 15 20cca agc ccc cga cag cgt ctc ctc gat agc gca acc aac ctt ttc acc211Pro Ser Pro Arg Gln Arg Leu Leu Asp Ser Ala Thr Asn Leu Phe Thr25 30 35aca gaa ggt att cgc gtc atc ggt att gat cgt atc ctc cgt gaa gct259Thr Glu Gly Ile Arg Val Ile Gly Ile Asp Arg Ile Leu Arg Glu Ala40 45 50gac gtg gcg aag gcg agc ctc tat tcc ctt ttc gga tcg aag gac gcc307Asp Val Ala Lys Ala Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ala55 60 65ttg gtt att gca tac ctg gag aac ctc gat cag ctg tgg cgt gaa gcg355Leu Val Ile Ala Tyr Leu Glu Asn Leu Asp Gln Leu Trp Arg Glu Ala70 75 80 85tgg cgt gag cgc acc gtc ggt atg aag gat ccg gaa gat aaa atc atc403Trp Arg Glu Arg Thr Val Gly Met Lys Asp Pro Glu Asp Lys Ile Ile90 95 100gcg ttc ttt gat cag tgc att gag gaa gaa cca gaa aaa gat ttc cgc451Ala Phe Phe Asp Gln Cys Ile Glu Glu Glu Pro Glu Lys Asp Phe Arg105 110 115ggc tcg cac ttt cag aat gcg gct agt gag tac cct cgc ccc gaa act499
Gly Ser His Phe Gln Asn Ala Ala Ser Glu Tyr Pro Arg Pro Glu Thr120 125 130gat agc gaa aag ggc att gtt gca gca gtg tta gag cac cgc gag tgg547Asp Ser Glu Lys Gly Ile Val Ala Ala Val Leu Glu His Arg Glu Trp135 140 145tgt cat aag act ctg act gat ttg ctc act gag aag aac ggc tac cca595Cys His Lys Thr Leu Thr Asp Leu Leu Thr Glu Lys Asn Gly Tyr Pro150 155 160 165ggc acc acc cag gcg aat cag ctg ttg gtg ttc ctt gat ggt gga ctt643Gly Thr Thr Gln Ala Asn Gln Leu Leu Val Phe Leu Asp Gly Gly Leu170 175 180gct gga tct cga ttg gtc cac aac atc agt cct ctt gag acg gct cgc691Ala Gly Ser Arg Leu Val His Asn Ile Ser Pro Leu Glu Thr Ala Arg185 190 195gat ttg gct cgg cag ttg ttg tcg gct cca cct gcg gac tac tca att739Asp Leu Ala Arg Gln Leu Leu Ser Ala Pro Pro Ala Asp Tyr Ser Ile200 205 210tagtttcttc attttccgaa ggg 762<210>2<211>213<212>PRT<213>谷氨酸棒狀桿菌<400>2Val Ala Ala Ser Ala Ser Gly Lys Ser Lys Thr Ser Ala Gly Ala Asn1 5 10 15Arg Arg Arg Asn Arg Pro Ser Pro Arg Gln Arg Leu Leu Asp Ser Ala20 25 30Thr Asn Leu Phe Thr Thr Glu Gly Ile Arg Val Ile Gly Ile Asp Arg35 40 45Ile Leu Arg Glu Ala Asp Val Ala Lys Ala Ser Leu Tyr Ser Leu Phe50 55 60Gly Ser Lys Asp Ala Leu Val Ile Ala Tyr Leu Glu Asn Leu Asp Gln65 70 75 80Leu Trp Arg Glu Ala Trp Arg Glu Arg Thr Val Gly Met Lys Asp Pro85 90 95Glu Asp Lys Ile Ile Ala Phe Phe Asp Gln Cys Ile Glu Glu Glu Pro100 105 110Glu Lys Asp Phe Arg Gly Ser His Phe Gln Asn Ala Ala Ser Glu Tyr115 120 125Pro Arg Pro Glu Thr Asp Ser Glu Lys Gly Ile Val Ala Ala Val Leu130 135 140Glu His Arg Glu Trp Cys His Lys Thr Leu Thr Asp Leu Leu Thr Glu145 150 155 160
Lys Asn Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Gln Ala Asn Gln Leu Leu Val Phe165 170 175Leu Asp Gly Gly Leu Ala Gly Ser Arg Leu Val His Asn Ile Ser Pro180 185 190Leu Glu Thr Ala Arg Asp Leu Ala Arg Gln Leu Leu Ser Ala Pro Pro195 200 205Ala Asp Tyr Ser Ile210<210>3<211>4900<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述剔除載體構(gòu)建體pS_delta655<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(295)<223>RXA00655序列的5′-片段<220>
<221>misc_feature<222>(305)..(614)<223>RXA0655序列的3′片段<220>
<221>misc_feature<222>Complement((3003)..(4424))<223>編碼枯草芽孢桿菌的果聚糖蔗糖酶(sacB)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>Complement((4425)..(4887))<220>
<221>misc_feature<222>(1042)..(1833)<223>編碼卡那霉素抗性<220>
<221>啟動(dòng)子<222>Complement((4425)..(4887))<223>用于sacB的啟動(dòng)子區(qū)<220>
<221>misc_feature<222>(1042)..(1833)<223>來(lái)自Tn5的卡那霉素抗體<220>
<221>misc_feature<222>Complement((2100)..(2960))<223>用于在大腸桿菌中復(fù)制的來(lái)自pMB的Ori
<400>3tttaaatctc gagtgccggt ggcggcttga tcttcagctt catcacatgt ctgattggtg 60ctgtcatttt gctgacgatc gtgcagttct tcactcggaa gaagtaatct gctttaaatc 120cgtagggcct gttgatattt cgatatcaac aggccttttg gtcattttgg ggtggaaaaa 180gcgctagact tgcctgtgga ttaaaactat acgaaccggt ttgtctatat tggtgttaga 240cagttcgtcg tatcttgaaa cagaccaacc cgaaaggacg tggccgaacg tggctgctag 300ctaatccttg atggtggact tgctggatct cgattggtcc acaacatcag tcctcttgag 360acggctcgcg atttggctcg gcagttgttg tcggctccac ctgcggacta ctcaatttag 420tttcttcatt ttccgaaggg gtatcttcgt tgggggaggc gtcgataagc cccttctttt 480tagctttaac ctcagcgcga cgctgcttta agcgctgcat ggcggcgcgg ttcatttcac 540gttgcgtttc gcgcctcttg ttcgcgattt ctttgcgggc ctgttttgct tcgttgattt 600cggcagtacg ggttacgcgt catatgacta gttcggacct agggatatcg tcgacatcga 660tgctcttctg cgttaattaa caattgggat cctctagacc cgggatttaa atcgctagcg 720ggctgctaaa ggaagcggaa cacgtagaaa gccagtccgc agaaacggtg ctgaccccgg 780atgaatgtca gctactgggc tatctggaca agggaaaacg caagcgcaaa gagaaagcag 840gtagcttgca gtgggcttac atggcgatag ctagactggg cggttttatg gacagcaagc 900gaaccggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac 960tggatggctt tcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc tgatcaagag 1020acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc 1080gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat 1140gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg 1200tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg 1260ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta 1320ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta 1380tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc 1440gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc 1500gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg 1560ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg 1620ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt 1680gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc 1740ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc 1800atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgaaatga 1860ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg 1920aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg 1980atctcatgct ggagttcttc gcccacgcta gcggcgcgcc ggccggcccg gtgtgaaata 2040ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact 2100gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 2160atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 2220caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 2280cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 2340taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 2400ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 2460tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 2520gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 2580ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 2640aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 2700aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 2760agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 2820cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 2880gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 2940atcttcacct agatcctttt aaaggccggc cgcggccgcc atcggcattt tcttttgcgt 3000ttttatttgt taactgttaa ttgtccttgt tcaaggatgc tgtctttgac aacagatgtt 3060ttcttgcctt tgatgttcag caggaagctc ggcgcaaacg ttgattgttt gtctgcgtag 3120aatcctctgt ttgtcatata gcttgtaatc acgacattgt ttcctttcgc ttgaggtaca 3180gcgaagtgtg agtaagtaaa ggttacatcg ttaggatcaa gatccatttt taacacaagg 3240ccagttttgt tcagcggctt gtatgggcca gttaaagaat tagaaacata accaagcatg 3300taaatatcgt tagacgtaat gccgtcaatc gtcatttttg atccgcggga gtcagtgaac 3360aggtaccatt tgccgttcat tttaaagacg ttcgcgcgtt caatttcatc tgttactgtg 3420ttagatgcaa tcagcggttt catcactttt ttcagtgtgt aatcatcgtt tagctcaatc 3480ataccgagag cgccgtttgc taactcagcc gtgcgttttt tatcgctttg cagaagtttt 3540tgactttctt gacggaagaa tgatgtgctt ttgccatagt atgctttgtt aaataaagat 3600
tcttcgcctt ggtagccatc ttcagttcca gtgtttgctt caaatactaa gtatttgtgg 3660cctttatctt ctacgtagtg aggatctctc agcgtatggt tgtcgcctga gctgtagttg 3720ccttcatcga tgaactgctg tacattttga tacgtttttc cgtcaccgtc aaagattgat 3780ttataatcct ctacaccgtt gatgttcaaa gagctgtctg atgctgatac gttaacttgt 3840gcagttgtca gtgtttgttt gccgtaatgt ttaccggaga aatcagtgta gaataaacgg 3900atttttccgt cagatgtaaa tgtggctgaa cctgaccatt cttgtgtttg gtcttttagg 3960atagaatcat ttgcatcgaa tttgtcgctg tctttaaaga cgcggccagc gtttttccag 4020ctgtcaatag aagtttcgcc gactttttga tagaacatgt aaatcgatgt gtcatccgca 4080tttttaggat ctccggctaa tgcaaagacg atgtggtagc cgtgatagtt tgcgacagtg 4140ccgtcagcgt tttgtaatgg ccagctgtcc caaacgtcca ggccttttgc agaagagata 4200tttttaattg tggacgaatc aaattcagaa acttgatatt tttcattttt ttgctgttca 4260gggatttgca gcatatcatg gcgtgtaata tgggaaatgc cgtatgtttc cttatatggc 4320ttttggttcg tttctttcgc aaacgcttga gttgcgcctc ctgccagcag tgcggtagta 4380aaggttaata ctgttgcttg ttttgcaaac tttttgatgt tcatcgttca tgtctccttt 4440tttatgtact gtgttagcgg tctgcttctt ccagccctcc tgtttgaaga tggcaagtta 4500gttacgcaca ataaaaaaag acctaaaata tgtaaggggt gacgccaaag tatacacttt 4560gccctttaca cattttaggt cttgcctgct ttatcagtaa caaacccgcg cgatttactt 4620ttcgacctca ttctattaga ctctcgtttg gattgcaact ggtctatttt cctcttttgt 4680ttgatagaaa atcataaaag gatttgcaga ctacgggcct aaagaactaa aaaatctatc 4740tgtttctttt cattctctgt attttttata gtttctgttg catgggcata aagttgcctt 4800tttaatcaca attcagaaaa tatcataata tctcatttca ctaaataata gtgaacggca 4860ggtatatgtg atgggttaaa aaggatcggc ggccgctcga 4900<210>4<211>4323<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述載體pCLiK5MCS\integrativ\sacB<220>
<221>misc_feature<222>Complement((2418)..(3839))<223>編碼枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶(sacB)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>Complement((3840)..(4302))<223>用于sacB的啟動(dòng)子<220>
<221>misc_feature<222>(457)..(1248)<223>來(lái)自Tn5的卡那霉素抗性<220>
<221>misc_feature<222>Complement((1515)..(2375))<223>用于在大腸桿菌中復(fù)制的來(lái)自pMB的Ori<400>4tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 180cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 240gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 300ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 360
ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 420agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 480gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 540atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 600gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 660tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 720agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 780cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 840gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 900gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 960gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 1020ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 1080tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 1140gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 1200cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc 1260tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca 1320ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 1380tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc gcgccggccg 1440gcccggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 1500gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 1560cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 1620tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 1680cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 1740aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 1800cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 1860gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 1920ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 1980cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 2040aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 2100tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 2160ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 2220tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 2280ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2340agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg ccgccatcgg 2400cattttcttt tgcgttttta tttgttaact gttaattgtc cttgttcaag gatgctgtct 2460ttgacaacag atgttttctt gcctttgatg ttcagcagga agctcggcgc aaacgttgat 2520tgtttgtctg cgtagaatcc tctgtttgtc atatagcttg taatcacgac attgtttcct 2580ttcgcttgag gtacagcgaa gtgtgagtaa gtaaaggtta catcgttagg atcaagatcc 2640atttttaaca caaggccagt tttgttcagc ggcttgtatg ggccagttaa agaattagaa 2700acataaccaa gcatgtaaat atcgttagac gtaatgccgt caatcgtcat ttttgatccg 2760cgggagtcag tgaacaggta ccatttgccg ttcattttaa agacgttcgc gcgttcaatt 2820tcatctgtta ctgtgttaga tgcaatcagc ggtttcatca cttttttcag tgtgtaatca 2880tcgtttagct caatcatacc gagagcgccg tttgctaact cagccgtgcg ttttttatcg 2940ctttgcagaa gtttttgact ttcttgacgg aagaatgatg tgcttttgcc atagtatgct 3000ttgttaaata aagattcttc gccttggtag ccatcttcag ttccagtgtt tgcttcaaat 3060actaagtatt tgtggccttt atcttctacg tagtgaggat ctctcagcgt atggttgtcg 3120cctgagctgt agttgccttc atcgatgaac tgctgtacat tttgatacgt ttttccgtca 3180ccgtcaaaga ttgatttata atcctctaca ccgttgatgt tcaaagagct gtctgatgct 3240gatacgttaa cttgtgcagt tgtcagtgtt tgtttgccgt aatgtttacc ggagaaatca 3300gtgtagaata aacggatttt tccgtcagat gtaaatgtgg ctgaacctga ccattcttgt 3360gtttggtctt ttaggataga atcatttgca tcgaatttgt cgctgtcttt aaagacgcgg 3420ccagcgtttt tccagctgtc aatagaagtt tcgccgactt tttgatagaa catgtaaatc 3480gatgtgtcat ccgcattttt aggatctccg gctaatgcaa agacgatgtg gtagccgtga 3540tagtttgcga cagtgccgtc agcgttttgt aatggccagc tgtcccaaac gtccaggcct 3600tttgcagaag agatattttt aattgtggac gaatcaaatt cagaaacttg atatttttca 3660tttttttgct gttcagggat ttgcagcata tcatggcgtg taatatggga aatgccgtat 3720gtttccttat atggcttttg gttcgtttct ttcgcaaacg cttgagttgc gcctcctgcc 3780agcagtgcgg tagtaaaggt taatactgtt gcttgttttg caaacttttt gatgttcatc 3840gttcatgtct ccttttttat gtactgtgtt agcggtctgc ttcttccagc cctcctgttt 3900gaagatggca agttagttac gcacaataaa aaaagaccta aaatatgtaa ggggtgacgc 3960caaagtatac actttgccct ttacacattt taggtcttgc ctgctttatc agtaacaaac 4020ccgcgcgatt tacttttcga cctcattcta ttagactctc gtttggattg caactggtct 4080
attttcctct tttgtttgat agaaaatcat aaaaggattt gcagactacg ggcctaaaga 4140actaaaaaat ctatctgttt cttttcattc tctgtatttt ttatagtttc tgttgcatgg 4200gcataaagtt gcctttttaa tcacaattca gaaaatatca taatatctca tttcactaaa 4260taatagtgaa cggcaggtat atgtgatggg ttaaaaagga tcggcggccg ctcgatttaa 4320atc4323<210>5<211>828<212>DNA<213>谷氨酸棒狀桿菌<220>
<221>CDS<222>(101)..(805)<223>編碼甲硫氨酸生物合成的正調(diào)節(jié)物(RZA02910)<400>5aacctaggcc gatacccatg tggaaatctc gacgtcttaa atggacgatt ggagctaaaa 60ccacgaacag ctgggatttt ccacgatagg attgggtctc gtg gag att cgt tgg115Val Glu Ile Arg Trp1 5ttg gaa ggc ttt atc gcg gtc gcg gaa gaa ttg cac ttt agt aat gct163Leu Glu Gly Phe Ile Ala Val Ala Glu Glu Leu His Phe Ser Asn Ala10 15 20gcg att cgt ttg ggg atg ccg caa tcg ccg ttg agt cag ttg atc cgg211Ala Ile Arg Leu Gly Met Pro Gln Ser Pro Leu Ser Gln Leu Ile Arg25 30 35cgg ttg gag tcg gag ttg ggg cag aag ctt ttt gat cgc agt acc cgg259Arg Leu Glu Ser Glu Leu Gly Gln Lys Leu Phe Asp Arg Ser Thr Arg40 45 50tcg gtg gag tta act gcc gcg ggt cgg gcg ttt ttg cca cat gcc agg307Ser Val Glu Leu Thr Ala Ala Gly Arg Ala Phe Leu Pro His Ala Arg55 60 65ggg att gtg gcg agc gct gcg gtg gcg agg gaa gct gtg aat gct gcc355Gly Ile Val Ala Ser Ala Ala Val Ala Arg Glu Ala Val Asn Ala Ala70 75 80 85gag ggg gag atc gtt ggt gtt gtt cgc att ggt ttt tct ggt gtg ctg403Glu Gly Glu Ile Val Gly Val Val Arg Ile Gly Phe Ser Gly Val Leu90 95 100aac tat tcc acg ctg ccg ctt ttg acc agt gag gtg cat aaa cgg ctt451Asn Tyr Ser Thr Leu Pro Leu Leu Thr Ser Glu Val His Lys Arg Leu105 110 115cct aat gtg gag ttg gag ctc gtt ggt cag aag ttg acg agg gaa gcg499Pro Asn Val Glu Leu Glu Leu Val Gly Gln Lys Leu Thr Arg Glu Ala120 125 130gta agt ttg ctg cgc ttg ggg gcg ttg gat att acg ttg atg ggt ttg547Val Ser Leu Leu Arg Leu Gly Ala Leu Asp Ile Thr Leu Met Gly Leu135 140 145ccc att gag gat cca gag att gag act cgg ctg att agt ttg gaa gag595
Pro Ile Glu Asp Pro Glu Ile Glu Thr Arg Leu Ile Ser Leu Glu Glu150 155 160 165ttt tgc gtg gtg ttg ccg aag gat cat cgt ctt gcg ggg gaa gga gtg643Phe Cys Val Val Leu Pro Lys Asp His Arg Leu Ala Gly Glu Gly Val170 175 180gtg gat ttg gtg gat ctg gct aaa gat ggg ttt gtg acg acg ccg gag691Val Asp Leu Val Asp Leu Ala Lys Asp Gly Phe Val Thr Thr Pro Glu185 190 195ttt gcg ggg tct gtg ttt agg aat tcc acc ttt cag ttg tgt gct gag739Phe Ala Gly Ser Val Phe Arg Asn Ser Thr Phe Gln Leu Cys Ala Glu200 205 210gct ggt ttt gtg ccg agg atc agc cag caa gtt aat gat cct tac atg787Ala Gly Phe Val Pro Arg Ile Ser Gln Gln Val Asn Asp Pro Tyr Met215 220 225gcg ctg ttg ttg gcg cgg tagtcaatca tgggggagta tcc 828Ala Leu Leu Leu Ala Arg230 235<210>6<211>235<212>PRT<213>谷氨酸棒狀桿菌<400>6Val Glu Ile Arg Trp Leu Glu Gly Phe Ile Ala Val Ala Glu Glu Leu1 5 10 15His Phe Ser Asn Ala Ala Ile Arg Leu Gly Met Pro Gln Ser Pro Leu20 25 30Ser Gln Leu Ile Arg Arg Leu Glu Ser Glu Leu Gly Gln Lys Leu Phe35 40 45Asp Arg Ser Thr Arg Ser Val Glu Leu Thr Ala Ala Gly Arg Ala Phe50 55 60Leu Pro His Ala Arg Gly Ile Val Ala Ser Ala Ala Val Ala Arg Glu65 70 75 80Ala Val Asn Ala Ala Glu Gly Glu Ile Val Gly Val Val Arg Ile Gly85 90 95Phe Ser Gly Val Leu Asn Tyr Ser Thr Leu Pro Leu Leu Thr Ser Glu100 105 110Val His Lys Arg Leu Pro Asn Val Glu Leu Glu Leu Val Gly Gln Lys115 120 125Leu Thr Arg Glu Ala Val Ser Leu Leu Arg Leu Gly Ala Leu Asp Ile130 135 140Thr Leu Met Gly Leu Pro Ile Glu Asp Pro Glu Ile Glu Thr Arg Leu145 150 155 160Ile Ser Leu Glu Glu Phe Cys Val Val Leu Pro Lys Asp His Arg Leu165 170 175
Ala Gly Glu Gly Val Val Asp Leu Val Asp Leu Ala Lys Asp Gly Phe180 185 190Val Thr Thr Pro Glu Phe Ala Gly Ser Val Phe Arg Asn Ser Thr Phe195 200 205Gln Leu Cys Ala Glu Ala Gly Phe Val Pro Arg Ile Ser Gln Gln Val210 215 220Asn Asp Pro Tyr Met Ala Leu Leu Leu Ala Arg225 230 235<210>7<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(34)<223>有義引物<400>7gagagactcg agtggtttag gggatgagaa accg 34<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(31)<223>反義引物<400>8ctctcactag tctaccgcgc caacaacagc g 31<210>9<211>990<212>DNA<213>谷氨酸棒狀桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(12)<223>通過(guò)PCR連接的合成接頭
<220>
<221>misc_feature<222>(980)..(990)<223>通過(guò)PCR連接的合成接頭<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(13)..(271)<223>rxa02910基因的啟動(dòng)子和5′非翻譯區(qū)<220>
<221>CDS<222>(272)..(976)<223>編碼甲硫氨酸生物合成的正調(diào)節(jié)物(rxa02910)<400>9gagagactcg agtggtttag gggatgagaa accggacaca cgtgccaaaa cttcggcttt 60ttcgccaatc ttgtcacgcc tgtctggttt gcctcggatg aggtgatttc atggccaaga 120cttctaaaag ttcgacctcg caggatcgct tctaagggcc tttagcggac caacctaggc 180cgatacccat gtggaaatct cgacgtctta aatggacgat tggagctaaa accacgaaca 240gctgggattt tccacgatag gattgggtct c gtg gag att cgt tgg ttg gaa 292Val Glu Ile Arg Trp Leu Glu1 5ggc ttt atc gcg gtc gcg gaa gaa ttg cac ttt agt aat gct gcg att340Gly Phe Ile Ala Val Ala Glu Glu Leu His Phe Ser Asn Ala Ala Ile10 15 20cgt ttg ggg atg ccg caa tcg ccg ttg agt cag ttg atc cgg cgg ttg388Arg Leu Gly Met Pro Gln Ser Pro Leu Ser Gln Leu Ile Arg Arg Leu25 30 35gag tcg gag ttg ggg cag aag ctt ttt gat cgc agt acc cgg tcg gtg436Glu Ser Glu Leu Gly Gln Lys Leu Phe Asp Arg Ser Thr Arg Ser Val40 45 50 55gag tta act gcc gcg ggt cgg gcg ttt ttg cca cat gcc agg ggg att484Glu Leu Thr Ala Ala Gly Arg Ala Phe Leu Pro His Ala Arg Gly Ile60 65 70gtg gcg agc gct gcg gtg gcg agg gaa gct gtg aat gct gcc gag ggg532Val Ala Ser Ala Ala Val Ala Arg Glu Ala Val Asn Ala Ala Glu Gly75 80 85gag atc gtt ggt gtt gtt cgc att ggt ttt tct ggt gtg ctg aac tat580Glu Ile Val Gly Val Val Arg Ile Gly Phe Ser Gly Val Leu Ash Tyr90 95 100tcc acg ctg ccg ctt ttg acc agt gag gtg cat aaa cgg ctt cct aat628Ser Thr Leu Pro Leu Leu Thr Ser Glu Val His Lys Arg Leu Pro Asn105 110 115gtg gag ttg gag ctc gtt ggt cag aag ttg acg agg gaa gcg gta agt676Val Glu Leu Glu Leu Val Gly Gln Lys Leu Thr Arg Glu Ala Val Ser120 125 130 135
ttg ctg cgc ttg ggg gcg ttg gat att acg ttg atg ggt ttg ccc att724Leu Leu Arg Leu Gly Ala Leu Asp Ile Thr Leu Met Gly Leu Pro Ile140 145 150gag gat cca gag att gag act cgg ctg att agt ttg gaa gag ttt tgc772Glu Asp Pro Glu Ile Glu Thr Arg Leu Ile Ser Leu Glu Glu Phe Cys155 160 165gtg gtg ttg ccg aag gat cat cgt ctt gcg ggg gaa gga gtg gtg gat820Val Val Leu Pro Lys Asp His Arg Leu Ala Gly Glu Gly Val Val Asp170 175 180ttg gtg gat ctg gct aaa gat ggg ttt gtg acg acg ccg gag ttt gcg868Leu Val Asp Leu Ala Lys Asp Gly Phe Val Thr Thr Pro Glu Phe Ala185 190 195ggg tct gtg ttt agg aat tcc acc ttt cag ttg tgt gct gag gct ggt916Gly Ser Val Phe Arg Asn Ser Thr Phe Gln Leu Cys Ala Glu Ala Gly200 205 210 215ttt gtg ccg agg atc agc cag caa gtt aat gat cct tac atg gcg ctg964Phe Val Pro Arg Ile Ser Gln Gln Val Asn Asp Pro Tyr Met Ala Leu220 225 230ttg ttg gcg cgg tagactagtg agag990Leu Leu Ala Arg235<210>10<211>235<212>PRT<213>谷氨酸棒狀桿菌<400>10Val Glu Ile Arg Trp Leu Glu Gly Phe Ile Ala Val Ala Glu Glu Leu1 5 10 15His Phe Ser Asn Ala Ala Ile Arg Leu Gly Met Pro Gln Ser Pro Leu20 25 30Ser Gln Leu Ile Arg Arg Leu Glu Ser Glu Leu Gly Gln Lys Leu Phe35 40 45Asp Arg Ser Thr Arg Ser Val Glu Leu Thr Ala Ala Gly Arg Ala Phe50 55 60Leu Pro His Ala Arg Gly Ile Val Ala Ser Ala Ala Val Ala Arg Glu65 70 75 80Ala Val Asn Ala Ala Glu Gly Glu Ile Val Gly Val Val Arg Ile Gly85 90 95Phe Ser Gly Val Leu Asn Tyr Ser Thr Leu Pro Leu Leu Thr Ser Glu100 105 110Val His Lys Arg Leu Pro Asn Val Glu Leu Glu Leu Val Gly Gln Lys115 120 125Leu Thr Arg Glu Ala Val Ser Leu Leu Arg Leu Gly Ala Leu Asp Ile130 135 140
Thr Leu Met Gly Leu Pro Ile Glu Asp Pro Glu Ile Glu Thr Arg Leu145 150 155 160Ile Ser Leu Glu Glu Phe Cys Val Val Leu Pro Lys Asp His Arg Leu165 170 175Ala Gly Glu Gly Val Val Asp Leu Val Asp Leu Ala Lys Asp Gly Phe180 185 190Val Thr Thr Pro Glu Phe Ala Gly Ser Val Phe Arg Asn Ser Thr Phe195 200 205Gln Leu Cys Ala Glu Ala Gly Phe Val Pro Arg Ile Ser Gln Gln Val210 215 220Asn Asp Pro Tyr Met Ala Leu Leu Leu Ala Arg225 230 235<210>11<211>439<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR片段用于rxa02910剔除<400>11tatactcgag ttgatcgcag tacccggtcg gtggagttaa ctgccgcggg tcgggcgttt 60ttgccacatg ccagggggat tgtggcgagc gctgcggtgg cgagggaagc tgtgaatgct 120gccgaggggg agatcgttgg tgttgttcgc attggttttt ctggtgtgct gaactattcc 180acgctgccgc ttttgaccag tgaggtgcat aaacggcttc ctaatgtgga gttggagctc 240gttggtcaga agttgacgag ggaagcggta agtttgctgc gcttgggggc gttggatatt 300acgttgatgg gtttgcccat tgaggatcca gagattgaga ctcggctgat tagtttggaa 360gagttttgcg tggtgttgcc gaaggatcat cgtcttgcgg gggaaggagt ggtggatttg 420gtggatctgg atatcagag 439<210>12<211>5156<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于谷氨酸棒狀桿菌的載體pG<220>
<221>終止子<222>(125)..(184)<223>GroEL終止子<220>
<221>misc_feature<222>(534)..(1325)<223>來(lái)自Tn5的卡那霉素抗性基因<220>
<221>misc_feature
<222>(3606)..(4727)<223>用于在谷氨酸棒狀桿菌中復(fù)制的Rep基因<220>
<221>misc_feature<222>(2598)..(3272)<223>用于在谷氨酸棒狀桿菌中復(fù)制的ORF1<220>
<221>misc_feature<222>Complement((1592)..(2452))<223>用于在大腸桿菌中復(fù)制的來(lái)自pMB的Ori<400>12tcgatttaaa tctcgagagg cctgacgtcg ggcccggtac cacgcgtcat atgactagtt 60cggacctagg gatatcgtcg acatcgatgc tcttctgcgt taattaacaa ttgggatcct 120ctagagttct gtgaaaaaca ccgtggggca gtttctgctt cgcggtgttt tttatttgtg 180gggcactaga cccgggattt aaatcgctag cgggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga 240aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga 300caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat 360agctagactg ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct 420ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct 480gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 540aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 600actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 660ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg 720aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 780ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 840tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 900tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 960gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 1020aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg 1080atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 1140tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 1200tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 1260tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 1320tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc 1380acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg 1440ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccacgc 1500tagcggcgcg ccggccggcc cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 1560gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 1620ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 1680acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 1740cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 1800caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 1860gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 1920tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 1980aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 2040ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 2100cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 2160tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 2220tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 2280ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 2340aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 2400aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaaggccg 2460gccgcggccg cgcaaagtcc cgcttcgtga aaattttcgt gccgcgtgat tttccgccaa 2520aaactttaac gaacgttcgt tataatggtg tcatgacctt cacgacgaag tactaaaatt 2580ggcccgaatc atcagctatg gatctctctg atgtcgcgct ggagtccgac gcgctcgatg 2640ctgccgtcga tttaaaaacg gtgatcggat ttttccgagc tctcgatacg acggacgcgc 2700cagcatcacg agactgggcc agtgccgcga gcgacctaga aactctcgtg gcggatcttg 2760aggagctggc tgacgagctg cgtgctcggc cagcgccagg aggacgcaca gtagtggagg 2820
atgcaatcag ttgcgcctac tgcggtggcc tgattcctcc ccggcctgac ccgcgaggac 2880ggcgcgcaaa atattgctca gatgcgtgtc gtgccgcagc cagccgcgag cgcgccaaca 2940aacgccacgc cgaggagctg gaggcggcta ggtcgcaaat ggcgctggaa gtgcgtcccc 3000cgagcgaaat tttggccatg gtcgtcacag agctggaagc ggcagcgaga attatcgcga 3060tcgtggcggt gcccgcaggc atgacaaaca tcgtaaatgc cgcgtttcgt gtgccgtggc 3120cgcccaggac gtgtcagcgc cgccaccacc tgcaccgaat cggcagcagc gtcgcgcgtc 3180gaaaaagcgc acaggcggca agaagcgata agctgcacga atacctgaaa aatgttgaac 3240gccccgtgag cggtaactca cagggcgtcg gctaaccccc agtccaaacc tgggagaaag 3300cgctcaaaaa tgactctagc ggattcacga gacattgaca caccggcctg gaaattttcc 3360gctgatctgt tcgacaccca tcccgagctc gcgctgcgat cacgtggctg gacgagcgaa 3420gaccgccgcg aattcctcgc tcacctgggc agagaaaatt tccagggcag caagacccgc 3480gacttcgcca gcgcttggat caaagacccg gacacggaga aacacagccg aagttatacc 3540gagttggttc aaaatcgctt gcccggtgcc agtatgttgc tctgacgcac gcgcagcacg 3600cagccgtgct tgtcctggac attgatgtgc cgagccacca ggccggcggg aaaatcgagc 3660acgtaaaccc cgaggtctac gcgattttgg agcgctgggc acgcctggaa aaagcgccag 3720cttggatcgg cgtgaatcca ctgagcggga aatgccagct catctggctc attgatccgg 3780tgtatgccgc agcaggcatg agcagcccga atatgcgcct gctggctgca acgaccgagg 3840aaatgacccg cgttttcggc gctgaccagg ctttttcaca taggctgagc cgtggccact 3900gcactctccg acgatcccag ccgtaccgct ggcatgccca gcacaatcgc gtggatcgcc 3960tagctgatct tatggaggtt gctcgcatga tctcaggcac agaaaaacct aaaaaacgct 4020atgagcagga gttttctagc ggacgggcac gtatcgaagc ggcaagaaaa gccactgcgg 4080aagcaaaagc acttgccacg cttgaagcaa gcctgccgag cgccgctgaa gcgtctggag 4140agctgatcga cggcgtccgt gtcctctgga ctgctccagg gcgtgccgcc cgtgatgaga 4200cggcttttcg ccacgctttg actgtgggat accagttaaa agcggctggt gagcgcctaa 4260aagacaccaa gggtcatcga gcctacgagc gtgcctacac cgtcgctcag gcggtcggag 4320gaggccgtga gcctgatctg ccgccggact gtgaccgcca gacggattgg ccgcgacgtg 4380tgcgcggcta cgtcgctaaa ggccagccag tcgtccctgc tcgtcagaca gagacgcaga 4440gccagccgag gcgaaaagct ctggccacta tgggaagacg tggcggtaaa aaggccgcag 4500aacgctggaa agacccaaac agtgagtacg cccgagcaca gcgagaaaaa ctagctaagt 4560ccagtcaacg acaagctagg aaagctaaag gaaatcgctt gaccattgca ggttggttta 4620tgactgttga gggagagact ggctcgtggc cgacaatcaa tgaagctatg tctgaattta 4680gcgtgtcacg tcagaccgtg aatagagcac ttaaggtctg cgggcattga acttccacga 4740ggacgccgaa agcttcccag taaatgtgcc atctcgtagg cagaaaacgg ttcccccgta 4800gggtctctct cttggcctcc tttctaggtc gggctgattg ctcttgaagc tctctagggg 4860ggctcacacc ataggcagat aacgttcccc accggctcgc ctcgtaagcg cacaaggact 4920gctcccaaag atcttcaaag ccactgccgc gactgccttc gcgaagcctt gccccgcgga 4980aatttcctcc accgagttcg tgcacacccc tatgccaagc ttctttcacc ctaaattcga 5040gagattggat tcttaccgtg gaaattcttc gcaaaaatcg tcccctgatc gcccttgcga 5100cgttggcgtc ggtgccgctg gttgcgcttg gcttgaccga cttgatcagc ggccgc 5156<210>13<211>6087<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于過(guò)表達(dá)甲硫氨酸生物合成的正調(diào)節(jié)物(rxn2910)的載體pGrxb2010<220>
<221>misc_feature<222>(1465)..(2256)<223>來(lái)自Tn5的卡那霉素抗性<220>
<221>misc_difference<222>(3529)..(4203)<223>用于在谷氨酸棒狀桿菌中復(fù)制的Orf1<220>
<221>misc_feature
<222>(4537)..(5658)<223>用于在谷氨酸棒狀桿菌中復(fù)制的Rep基因<220>
<221>misc_feature<222>Complement((2523)..(3383))<223>用于在大腸桿菌中復(fù)制的來(lái)自pMB的Ori<220>
<221>終止子<222>(1056)..(1115)<223>來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的GroEl終止子<220>
<221>misc_feature<222>(268)..(984)<223>編碼rxn02910<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(19)..(267)<223>rxn02910基因的啟動(dòng)子<400>13tcgatttaaa tctcgagtgg tttaggggat gagaaaccgg acacacgtgc caaaacttcg 60gctttttcgc caatcttgtc acgcctgtct ggtttgcctc ggatgaggtg atttcatggc 120caagacttct aaaagttcga cctcgcagga tcgcttctaa gggcctttag cggaccaacc 180taggccgata cccatgtgga aatctcgacg tcttaaatgg acgattggag ctaaaaccac 240gaacagctgg gattttccac gataggattg ggtctcgtgg agattcgttg gttggaaggc 300tttatcgcgg tcgcggaaga attgcacttt agtaatgctg cgattcgttt ggggatgccg 360caatcgccgt tgagtcagtt gatccggcgg ttggagtcgg agttggggca gaagcttttt 420gatcgcagta cccggtcggt ggagttaact gccgcgggtc gggcgttttt gccacatgcc 480agggggattg tggcgagcgc tgcggtggcg agggaagctg tgaatgctgc cgagggggag 540atcgttggtg ttgttcgcat tggtttttct ggtgtgctga actattccac gctgccgctt 600ttgaccagtg aggtgcataa acggcttcct aatgtggagt tggagctcgt tggtcagaag 660ttgacgaggg aagcggtaag tttgctgcgc ttgggggcgt tggatattac gttgatgggt 720ttgcccattg aggatccaga gattgagact cggctgatta gtttggaaga gttttgcgtg 780gtgttgccga aggatcatcg tcttgcgggg gaaggagtgg tggatttggt ggatctggct 840aaagatgggt ttgtgacgac gccggagttt gcggggtctg tgtttaggaa ttccaccttt 900cagttgtgtg ctgaggctgg ttttgtgccg aggatcagcc agcaagttaa tgatccttac 960atggcgctgt tgttggcgcg gtagactagt tcggacctag ggatatcgtc gacatcgatg 1020ctcttctgcg ttaattaaca attgggatcc tctagagttc tgtgaaaaac accgtggggc 1080agtttctgct tcgcggtgtt ttttatttgt ggggcactag acccgggatt taaatcgcta 1140gcgggctgct aaaggaagcg gaacacgtag aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc 1200cggatgaatg tcagctactg ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag 1260caggtagctt gcagtgggct tacatggcga tagctagact gggcggtttt atggacagca 1320agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta 1380aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag atctgatcaa 1440gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg 1500gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 1560gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 1620ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 1680acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 1740ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 1800gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 1860ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 1920gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 1980aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc 2040ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 2100ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 2160
ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 2220cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgaaa 2280tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgagattt cgattccacc gccgccttct 2340atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg 2400gggatctcat gctggagttc ttcgcccacg ctagcggcgc gccggccggc ccggtgtgaa 2460ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 2520actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 2580gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 2640cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 2700ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 2760ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 2820ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 2880agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 2940cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 3000aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 3060gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 3120agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3180ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3240cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3300tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 3360aggatcttca cctagatcct tttaaaggcc ggccgcggcc gcgcaaagtc ccgcttcgtg 3420aaaattttcg tgccgcgtga ttttccgcca aaaactttaa cgaacgttcg ttataatggt 3480gtcatgacct tcacgacgaa gtactaaaat tggcccgaat catcagctat ggatctctct 3540gatgtcgcgc tggagtccga cgcgctcgat gctgccgtcg atttaaaaac ggtgatcgga 3600tttttccgag ctctcgatac gacggacgcg ccagcatcac gagactgggc cagtgccgcg 3660agcgacctag aaactctcgt ggcggatctt gaggagctgg ctgacgagct gcgtgctcgg 3720ccagcgccag gaggacgcac agtagtggag gatgcaatca gttgcgccta ctgcggtggc 3780ctgattcctc cccggcctga cccgcgagga cggcgcgcaa aatattgctc agatgcgtgt 3840cgtgccgcag ccagccgcga gcgcgccaac aaacgccacg ccgaggagct ggaggcggct 3900aggtcgcaaa tggcgctgga agtgcgtccc ccgagcgaaa ttttggccat ggtcgtcaca 3960gagctggaag cggcagcgag aattatcgcg atcgtggcgg tgcccgcagg catgacaaac 4020atcgtaaatg ccgcgtttcg tgtgccgtgg ccgcccagga cgtgtcagcg ccgccaccac 4080ctgcaccgaa tcggcagcag cgtcgcgcgt cgaaaaagcg cacaggcggc aagaagcgat 4140aagctgcacg aatacctgaa aaatgttgaa cgccccgtga gcggtaactc acagggcgtc 4200ggctaacccc cagtccaaac ctgggagaaa gcgctcaaaa atgactctag cggattcacg 4260agacattgac acaccggcct ggaaattttc cgctgatctg ttcgacaccc atcccgagct 4320cgcgctgcga tcacgtggct ggacgagcga agaccgccgc gaattcctcg ctcacctggg 4380cagagaaaat ttccagggca gcaagacccg cgacttcgcc agcgcttgga tcaaagaccc 4440ggacacggag aaacacagcc gaagttatac cgagttggtt caaaatcgct tgcccggtgc 4500cagtatgttg ctctgacgca cgcgcagcac gcagccgtgc ttgtcctgga cattgatgtg 4560ccgagccacc aggccggcgg gaaaatcgag cacgtaaacc ccgaggtcta cgcgattttg 4620gagcgctggg cacgcctgga aaaagcgcca gcttggatcg gcgtgaatcc actgagcggg 4680aaatgccagc tcatctggct cattgatccg gtgtatgccg cagcaggcat gagcagcccg 4740aatatgcgcc tgctggctgc aacgaccgag gaaatgaccc gcgttttcgg cgctgaccag 4800gctttttcac ataggctgag ccgtggccac tgcactctcc gacgatccca gccgtaccgc 4860tggcatgccc agcacaatcg cgtggatcgc ctagctgatc ttatggaggt tgctcgcatg 4920atctcaggca cagaaaaacc taaaaaacgc tatgagcagg agttttctag cggacgggca 4980cgtatcgaag cggcaagaaa agccactgcg gaagcaaaag cacttgccac gcttgaagca 5040agcctgccga gcgccgctga agcgtctgga gagctgatcg acggcgtccg tgtcctctgg 5100actgctccag ggcgtgccgc ccgtgatgag acggcttttc gccacgcttt gactgtggga 5160taccagttaa aagcggctgg tgagcgccta aaagacacca agggtcatcg agcctacgag 5220cgtgcctaca ccgtcgctca ggcggtcgga ggaggccgtg agcctgatct gccgccggac 5280tgtgaccgcc agacggattg gccgcgacgt gtgcgcggct acgtcgctaa aggccagcca 5340gtcgtccctg ctcgtcagac agagacgcag agccagccga ggcgaaaagc tctggccact 5400atgggaagac gtggcggtaa aaaggccgca gaacgctgga aagacccaaa cagtgagtac 5460gcccgagcac agcgagaaaa actagctaag tccagtcaac gacaagctag gaaagctaaa 5520ggaaatcgct tgaccattgc aggttggttt atgactgttg agggagagac tggctcgtgg 5580ccgacaatca atgaagctat gtctgaattt agcgtgtcac gtcagaccgt gaatagagca 5640cttaaggtct gcgggcattg aacttccacg aggacgccga aagcttccca gtaaatgtgc 5700catctcgtag gcagaaaacg gttcccccgt agggtctctc tcttggcctc ctttctaggt 5760cgggctgatt gctcttgaag ctctctaggg gggctcacac cataggcaga taacgttccc 5820caccggctcg cctcgtaagc gcacaaggac tgctcccaaa gatcttcaaa gccactgccg 5880
cgactgcctt cgcgaagcct tgccccgcgg aaatttcctc caccgagttc gtgcacaccc 5940ctatgccaag cttctttcac cctaaattcg agagattgga ttcttaccgt ggaaattctt 6000cgcaaaaatc gtcccctgat cgcccttgcg acgttggcgt cggtgccgct ggttgcgctt 6060ggcttgaccg acttgatcag cggccgc 6087<210>14<211>2406<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述載體pINTEGRATIV<220>
<221>misc_feature<222>(457)..(1248)<223>來(lái)自Tn5的卡那霉素抗性基因<220>
<221>misc_feature<222>Complement((1515)..(2375))<223>用于在大腸桿菌中復(fù)制的來(lái)自pMB的Ori<400>14tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 180cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 240gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 300ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 360ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 420agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 480gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 540atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 600gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 660tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 720agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 780cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 840gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 900gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 960gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 1020ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 1080tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 1140gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 1200cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc 1260tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca 1320ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 1380tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc gcgccggccg 1440gcccggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 1500gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 1560cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 1620tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 1680cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 1740aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 1800cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 1860gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 1920ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 1980cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 2040aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 2100
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 2160ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 2220tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 2280ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2340agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg ccgctcgatt 2400taaatc2406<210>15<211>2772<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于剔除甲硫氨酸生物合成的正調(diào)節(jié)物rxa02910的載體pINTEGRATIV_deltaRXA02910<220>
<221>misc_feature<222>(457)..(1248)<223>來(lái)自Tn5的卡那霉素抗性基因<220>
<221>misc_feature<222>Complement((1515)..(2375))<223>用于在大腸桿菌中復(fù)制的來(lái)自pMB的Ori<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(61)<223>rxa02910的片段(cont.自bp2772，在環(huán)狀質(zhì)粒中)<220>
<221>misc_feature<222>(2407)..(2772)<223>rxa02910的片段(lst part tp be con.from bp 1 to 61，在環(huán)狀質(zhì)粒中)<400>15ggtgttgccg aaggatcatc gtcttgcggg ggaaggagtg gtggatttgg tggatctgga 60tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 180cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 240gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 300ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 360ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 420agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 480gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 540atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 600gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 660tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 720agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 780cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 840gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 900gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 960gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 1020ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 1080tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 1140gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 1200cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc 1260tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca 1320
ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 1380tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc gcgccggccg 1440gcccggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 1500gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 1560cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 1620tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 1680cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 1740aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 1800cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 1860gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 1920ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 1980cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 2040aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 2100tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 2160ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 2220tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 2280ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2340agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg ccgctcgatt 2400taaatctcga gttgatcgca gtacccggtc ggtggagtta actgccgcgg gtcgggcgtt 2460tttgccacat gccaggggga ttgtggcgag cgctgcggtg gcgagggaag ctgtgaatgc 2520tgccgagggg gagatcgttg gtgttgttcg cattggtttt tctggtgtgc tgaactattc 2580cacgctgccg cttttgacca gtgaggtgca taaacggctt cctaatgtgg agttggagct 2640cgttggtcag aagttgacga gggaagcggt aagtttgctg cgcttggggg cgttggatat 2700tacgttgatg ggtttgccca ttgaggatcc agagattgag actcggctga ttagtttgga 2760agagttttgc gt 2772<210>16<211>717<212>DNA<213>谷氨酸棒狀桿菌<220>
<221>CDS<222>(10)..(714)<220>
<221>突變<222>(556)<223>G->A突變導(dǎo)致D/N多態(tài)性<400>16ttgggtctc gtg gag att cgt tgg ttg gaa ggc ttt atc gcg gtc gcg gaa 51Val Glu Ile Arg Trp Leu Glu Gly Phe Ile Ala Val Ala Glu1 5 10gaa ttg cac ttt agt aat gct gcg att cgt ttg ggg atg ccg caa tcg99Glu Leu His Phe Ser Asn Ala Ala Ile Arg Leu Gly Met Pro Gln Ser15 20 25 30ccg ttg agt cag ttg atc cgg cgg ttg gag tcg gag ttg ggg cag aag147Pro Leu Ser Gln Leu Ile Arg Arg Leu Glu Ser Glu Leu Gly Gln Lys35 40 45ctt ttt gat cgc agt acc cgg tcg gtg gag tta act gcc gcg ggt cgg195Leu Phe Asp Arg Ser Thr Arg Ser Val Glu Leu Thr Ala Ala Gly Arg50 55 60gcg ttt ttg cca cat gcc agg ggg att gtg gcg agc gct gcg gtg gcg243Ala Phe Leu Pro His Ala Arg Gly Ile Val Ala Ser Ala Ala Val Ala65 70 75
agg gaa gct gtg aat gct gcc gag ggg gag atc gtt ggt gtt gtt cgc291Arg Glu Ala Val Asn Ala Ala Glu Gly Glu Ile Val Gly Val Val Arg80 85 90att ggt ttt tct ggt gtg ctg aac tat tcc acg ctg ccg ctt ttg acc339Ile Gly Phe Ser Gly Val Leu Asn Tyr Ser Thr Leu Pro Leu Leu Thr95 100 105 110agt gag gtg cat aaa cgg ctt cct aat gtg gag ttg gag ctc gtt ggt387Ser Glu Val His Lys Arg Leu Pro Asn Val Glu Leu Glu Leu Val Gly115 120 125cag aag ttg acg agg gaa gcg gta agt ttg ctg cgc ttg ggg gcg ttg435Gln Lys Leu Thr Arg Glu Ala Val Ser Leu Leu Arg Leu Gly Ala Leu130 135 140gat att acg ttg atg ggt ttg ccc att gag gat cca gag att gag act483Asp Ile Thr Leu Met Gly Leu Pro Ile Glu Asp Pro Glu Ile Glu Thr145 150 155cgg ctg att agt ttg gaa gag ttt tgc gtg gtg ttg ccg aag gat cat531Arg Leu Ile Ser Leu Glu Glu Phe Cys Val Val Leu Pro Lys Asp His160 165 170cgt ctt gcg ggg gaa gga gtg gtg aat ttg gtg gat ctg gct aaa gat579Arg Leu Ala Gly Glu Gly Val Val Asn Leu Val Asp Leu Ala Lys Asp175 180 185 190ggg ttt gtg acg acg ccg gag ttt gcg ggg tct gtg ttt agg aat tcc627Gly Phe Val Thr Thr Pro Glu Phe Ala Gly Ser Val Phe Arg Asn Ser195 200 205acc ttt cag ttg tgt gct gag gct ggt ttt gtg ccg agg atc agc cag675Thr Phe Gln Leu Cys Ala Glu Ala Gly Phe Val Pro Arg Ile Ser Gln210 215 220caa gtt aat gat cct tac atg gcg ctg ttg ttg gcg cgg tag717Gln Val Asn Asp Pro Tyr Met Ala Leu Leu Leu Ala Arg225 230 235<210>17<211>235<212>PRT<213>谷氨酸棒狀桿菌<400>17Val Glu Ile Arg Trp Leu Glu Gly Phe Ile Ala Val Ala Glu Glu Leu1 5 10 15His Phe Ser Asn Ala Ala Ile Arg Leu Gly Met Pro Gln Ser Pro Leu20 25 30Ser Gln Leu Ile Arg Arg Leu Glu Ser Glu Leu Gly Gln Lys Leu Phe35 40 45Asp Arg Ser Thr Arg Ser Val Glu Leu Thr Ala Ala Gly Arg Ala Phe50 55 60Leu Pro His Ala Arg Gly Ile Val Ala Ser Ala Ala Val Ala Arg Glu65 70 75 80
Ala Val Asn Ala Ala Glu Gly Glu Ile Val Gly Val Val Arg Ile Gly85 90 95Phe Ser Gly Val Leu Asn Tyr Ser Thr Leu Pro Leu Leu Thr Ser Glu100 105 110Val His Lys Arg Leu Pro Asn Val Glu Leu Glu Leu Val Gly Gln Lys115 120 125Leu Thr Arg Glu Ala Val Ser Leu Leu Arg Leu Gly Ala Leu Asp Ile130 135 140Thr Leu Met Gly Leu Pro Ile Glu Asp Pro Glu Ile Glu Thr Arg Leu145 150 155 160Ile Ser Leu Glu Glu Phe Cys Val Val Leu Pro Lys Asp His Arg Leu165 170 175Ala Gly Glu Gly Val Val Asn Leu Val Asp Leu Ala Lys Asp Gly Phe180 185 190Val Thr Thr Pro Glu Phe Ala Gly Ser Val Phe Arg Asn Ser Thr Phe195 200 205Gln Leu Cys Ala Glu Ala Gly Phe Val Pro Arg Ile Ser Gln Gln Val210 215 220Asn Asp Pro Tyr Met Ala Leu Leu Leu Ala Arg225 230 235<210>18<211>627<212>DNA<213>白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)<220>
<221>CDS<222>(1)..(624)<223>RxA00655蛋白質(zhì)同系物<400>18ttg gcc gag gcg aaa agc acg aag acg acg agt cgt cga cgt aac cgt48Leu Ala Glu Ala Lys Ser Thr Lys Thr Thr Ser Arg Arg Arg Asn Arg1 5 10 15ccg agc cct cgt cag cgc cta ttg gat ggc gca acg cag ctt ttt acc96Pro Ser Pro Arg Gln Arg Leu Leu Asp Gly Ala Thr Gln Leu Phe Thr20 25 30acc gag gga att cgg gtg atc ggc att gat cgc att ttg cgt gag gct144Thr Glu Gly Ile Arg Val Ile Gly Ile Asp Arg Ile Leu Arg Glu Ala35 40 45gat gta gcc aag gcg agt ttg tac tcc ctg ttc gga tcc aag gat gcg192Asp Val Ala Lys Ala Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ala50 55 60ctg gtt att gcc tat ttg cag aac ttg gat gaa aag tgg cgt gag cag240
Leu Val Ile Ala Tyr Leu Gln Asn Leu Asp Glu Lys Trp Arg Glu Gln65 70 75 80tat tac gag cgc act gct gag atg ggt tcg cca agc gag aaa att ctc288Tyr Tyr Glu Arg Thr Ala Glu Met Gly Ser Pro Ser Glu Lys Ile Leu85 90 95gcg ttt ttt gat cag tgt att gat gag gag ccg ctg aag gat tat cgc336Ala Phe Phe Asp Gln Cys Ile Asp Glu Glu Pro Leu Lys Asp Tyr Arg100 105 110ggt tcg cac ttc cag aat gct gct aac gag tac ccg cgc cca gag acg384Gly Ser His Phe Gln Asn Ala Ala Asn Glu Tyr Pro Arg Pro Glu Thr115 120 125gat agt gag cgc gag atc gtg tcg gtt gtg atg gaa cat cgc cgg tgg432Asp Ser Glu Arg Glu Ile Val Ser Val Val Met Glu His Arg Arg Trp130 135 140tgt ttg gag acg tta act cag ttg ttg acg gag aag aac ggg tat ccc480Cys Leu Glu Thr Leu Thr Gln Leu Leu Thr Glu Lys Asn Gly Tyr Pro145 150 155 160ggc act gtt cag gct aat cag ttg atg gtt ttt ctg gat ggt ggt ctt528Gly Thr Val Gln Ala Asn Gln Leu Met Val Phe Leu Asp Gly Gly Leu165 170 175gcg ggt tgt cgt ctg aat cgc tcg gtg gag tcg ttg aag act gct cgg576Ala Gly Cys Arg Leu Asn Arg Ser Val Glu Ser Leu Lys Thr Ala Arg180 185 190gat ctt gcg gtt cag ttg ctg tct gct cct cct gct gat tat tcg att624Asp Leu Ala Val Gln Leu Leu Ser Ala Pro Pro Ala Asp Tyr Ser Ile195 200 205tag627<210>19<211>208<212>PRT<213>白喉棒狀桿菌<400>19Leu Ala Glu Ala Lys Ser Thr Lys Thr Thr Ser Arg Arg Arg Asn Arg1 5 10 15Pro Ser Pro Arg Gln Arg Leu Leu Asp Gly Ala Thr Gln Leu Phe Thr20 25 30Thr Glu Gly Ile Arg Val Ile Gly Ile Asp Arg Ile Leu Arg Glu Ala35 40 45Asp Val Ala Lys Ala Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ala50 55 60Leu Val Ile Ala Tyr Leu Gln Asn Leu Asp Glu Lys Trp Arg Glu Gln65 70 75 80Tyr Tyr Glu Arg Thr Ala Glu Met Gly Ser Pro Ser Glu Lys Ile Leu85 90 95
Ala Phe Phe Asp Gln Cys Ile Asp Glu Glu Pro Leu Lys Asp Tyr Arg100 105 110Gly Ser His Phe Gln Asn Ala Ala Asn Glu Tyr Pro Arg Pro Glu Thr115 120 125Asp Ser Glu Arg Glu Ile Val Ser Val Val Met Glu His Arg Arg Trp130 135 140Cys Leu Glu Thr Leu Thr Gln Leu Leu Thr Glu Lys Asn Gly Tyr Pro145 150 155 160Gly Thr Val Gln Ala Asn Gln Leu Met Val Phe Leu Asp Gly Gly Leu165 170 175Ala Gly Cys Arg Leu Asn Arg Ser Val Glu Ser Leu Lys Thr Ala Arg180 185 190Asp Leu Ala Val Gln Leu Leu Ser Ala Pro Pro Ala Asp Tyr Ser Ile195 200 205<210>20<211>639<212>DNA<213>Corynebacterium efficiens YS-314<220>
<221>CDS<222>(1)..(636)<223>編碼RXA00655蛋白質(zhì)同系物<400>20gtg gct gtc agc gct tca gga aag agt agg acc agt aca ggg ggc agg48Val Ala Val Ser Ala Ser Gly Lys Ser Arg Thr Ser Thr Gly Gly Arg1 5 10 15cga cgt gat cgc ccg agc ccc cgg cag cgt ctg ctc gac agc gca acg96Arg Arg Asp Arg Pro Ser Pro Arg Gln Arg Leu Leu Asp Ser Ala Thr20 25 30aat ctg ttc acc acc gag ggc atc cgg gtc atc ggc atc gac cgt atc144Asn Leu Phe Thr Thr Glu Gly Ile Arg Val Ile Gly Ile Asp Arg Ile35 40 45ctt cgt gag gcg gat gtg gcc aag gcc agc ctg tac tcc ctc ttc ggt192Leu Arg Glu Ala Asp Val Ala Lys Ala Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Gly50 55 60tcc aag gat gct ctg gtg atc gcc tac ctg gaa aat ctg gat cag cag240Ser Lys Asp Ala Leu Val Ile Ala Tyr Leu Glu Asn Leu Asp GLn Gln65 70 75 80tgg cgt gat gcg tgg cat gag cgg acg gac cag ctc aag gac ccg gag288Trp Arg Asp Ala Trp His Glu Arg Thr Asp Gln Leu Lys Asp Pro Glu85 90 95gat aag atc atc gcc ttc ttc gac cag tgc atc gag gag gag ccg aag336Asp Lys Ile Ile Ala Phe Phe Asp Gln Cys Ile Glu Glu Glu Pro Lys100 105 110
aag ggc ttc cgg ggg tcc cac ttc cag aat gcg gcg aat gag tat cca384Lys Gly Phe Arg Gly Ser His Phe Gln Asn Ala Ala Asn Glu Tyr Pro115 120 125cgt ccg gag acg gaa tcc gag aag ggt att gtc gcc gcg gtc atg gag432Arg Pro Glu Thr Glu Ser Glu Lys Gly Ile Val Ala Ala Val Met Glu130 135 140cac cgt cgt tgg tgt cat cag acg ctg acc gat ctg ctc acg gag aag480His Arg Arg Trp Cys His Gln Thr Leu Thr Asp Leu Leu Thr Glu Lys145 150 155 160aat ggt tat ccc ggc acc acc cag gcg aat cag ctg ctg gtg ttc ctt528Asn Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Gln Ala Asn Gln Leu Leu Val Phe Leu165 170 175gat ggt ggt ctg gcg ggg tcg agg ctg gtt cag aat atc ggc ccc ttg576Asp Gly Gly Leu Ala Gly Ser Arg Leu Val Gln Asn Ile Gly Pro Leu180 185 190gaa acg gcc cgt gac ctg gcc cgg cag ttg ctg tcc gca cca ccg gcg624Glu Thr Ala Arg Asp Leu Ala Arg Gln Leu Leu Ser Ala Pro Pro Ala195 200 205gat tac tcg atc tag639Asp Tyr Ser Ile210<210>21<211>212<212>PRT<213>Corynebacterium efficiens YS-314<400>21Val Ala Val Ser Ala Ser Gly Lys Ser Arg Thr Ser Thr Gly Gly Arg1 5 10 15Arg Arg Asp Arg Pro Ser Pro Arg Gln Arg Leu Leu Asp Ser Ala Thr20 25 30Asn Leu Phe Thr Thr Glu Gly Ile Arg Val Ile Gly Ile Asp Arg Ile35 40 45Leu Arg Glu Ala Asp Val Ala Lys Ala Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Gly50 55 60Ser Lys Asp Ala Leu Val Ile Ala Tyr Leu Glu Asn Leu Asp Gln Gln65 70 75 80Trp Arg Asp Ala Trp His Glu Arg Thr Asp Gln Leu Lys Asp Pro Glu85 90 95Asp Lys Ile Ile Ala Phe Phe Asp Gln Cys Ile Glu Glu Glu Pro Lys100 105 110Lys Gly Phe Arg Gly Ser His Phe Gln Asn Ala Ala Asn Glu Tyr Pro115 120 125Arg Pro Glu Thr Glu Ser Glu Lys Gly Ile Val Ala Ala Val Met Glu130 135 140
His Arg Arg Trp Cys His Gln Thr Leu Thr Asp Leu Leu Thr Glu Lys145 150 155 160Asn Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Gln Ala Asn Gln Leu Leu Val Phe Leu165 170 175Asp Gly Gly Leu Ala Gly Ser Arg Leu Val Gln Asn Ile Gly Pro Leu180 185 190Glu Thr Ala Arg Asp Leu Ala Arg Gln Leu Leu Ser Ala Pro Pro Ala195 200 205Asp Tyr Ser Ile210<210>22<211>588<212>DNA<213>天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)<220>
<221>CDS<222>(1)..(585)<223>編碼RXA00655蛋白質(zhì)同系物<400>22atg aca tcg acc gcc gcc aga ccg ggc aga gtg gcg aag ctg ccg ccc48Met Thr Ser Thr Ala Ala Arg Pro Gly Arg Val Ala Lys Leu Pro Pro1 5 10 15cgc gag cgc atc ctc gac gcg gcc gag gag ctc ttc cag ggc gag ggc96Arg Glu Arg Ile Leu Asp Ala Ala Glu Glu Leu Phe Gln Gly Glu Gly20 25 30atc cga cgc gtg ggg gtc cag gcg atc gcc gag cgg gcc gag acc acc144Ile Arg Arg Val Gly Val Gln Ala Ile Ala Glu Arg Ala Glu Thr Thr35 40 45aag atg gcg atc tac cgg cac ttc gag acc aag gac gca ctc gtc gcc192Lys Met Ala Ile Tyr Arg His Phe Glu Thr Lys Asp Ala Leu Val Ala50 55 60gaa tgg ctg cgg atc ctg gcc gcc gag tac cag gcg gcc ttc gac cgc240Glu Trp Leu Arg Ile Leu Ala Ala Glu Tyr Gln Ala Ala Phe Asp Arg65 70 75 80gtc gag gcc gaa cat ccc ggc cgg ccc cgg gag cag atc ctg ggc ctc288Val Glu Ala Glu His Pro Gly Arg Pro Arg Glu Gln Ile Leu Gly Leu85 90 95gcc cgc ttc atc gcc gac ggg ctg ccg ggg ctc tcg cac cgg ggc tgc336Ala Arg Phe Ile Ala Asp Gly Leu Pro Gly Leu Ser His Arg Gly Cys100 105 110ccc ttc atc aac tcc ctc gcc gag ctg ccc gac cgc tcc cac ccc gcg384Pro Phe Ile Asn Ser Leu Ala Glu Leu Pro Asp Arg Ser His Pro Ala115 120 125cga cgg gtg atc gag gag cac aag gcc cgc cag acc cgc agg ctg gtc432
Arg Arg Val Ile Glu Glu His Lys Ala Arg Gln Thr Arg Arg Leu Val130 135 140ggc atg tgt gcc gag gcg ggg atg ccc gac ccc gaa cag gtc gcg gcc480Gly Met Cys Ala Glu Ala Gly Met Pro Asp Pro Glu Gln Val Ala Ala145 150 155 160cag atc acc ttc gtc ctc gaa ggg gcg cag gtc agc acg cag aac gca528Gln Ile Thr Phe Val Leu Glu Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Asn Ala165 170 175agc atc gac cgg gcg ggg gag cgg ttg atg cgc atc gtc gag gcg atc576Ser Ile Asp Arg Ala Gly Glu Arg Leu Met Arg Ile Val Glu Ala Ile180 185 190gtc gac cag tag588Val Asp Gln195<210>23<211>195<212>PRT<213>天藍(lán)色鏈霉菌<400>23Met Thr Ser Thr Ala Ala Arg Pro Gly Arg Val Ala Lys Leu Pro Pro1 5 10 15Arg Glu Arg Ile Leu Asp Ala Ala Glu Glu Leu Phe Gln Gly Glu Gly20 25 30Ile Arg Arg Val Gly Val Gln Ala Ile Ala Glu Arg Ala Glu Thr Thr35 40 45Lys Met Ala Ile Tyr Arg His Phe Glu Thr Lys Asp Ala Leu Val Ala50 55 60Glu Trp Leu Arg Ile Leu Ala Ala Glu Tyr Gln Ala Ala Phe Asp Arg65 70 75 80Val Glu Ala Glu His Pro Gly Arg Pro Arg Glu Gln Ile Leu Gly Leu85 90 95Ala Arg Phe Ile Ala Asp Gly Leu Pro Gly Leu Ser His Arg Gly Cys100 105 110Pro Phe Ile Asn Ser Leu Ala Glu Leu Pro Asp Arg Ser His Pro Ala115 120 125Arg Arg Val Ile Glu Glu His Lys Ala Arg Gln Thr Arg Arg Leu Val130 135 140Gly Met Cys Ala Glu Ala Gly Met Pro Asp Pro Glu Gln Val Ala Ala145 150 155 160Gln Ile Thr Phe Val Leu Glu Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Asn Ala165 170 175Ser Ile Asp Arg Ala Gly Glu Arg Leu Met Arg Ile Val Glu Ala Ile180 185 190
Val Asp Gln19權(quán)利要求
1.一種對(duì)微生物的含硫化合物生產(chǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)的方法，該方法包括在調(diào)節(jié)含硫化合物的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)其中至少一種甲硫氨酸生物合成調(diào)節(jié)物的表達(dá)或活性受到調(diào)節(jié)的微生物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述含硫化合物選自甲硫氨酸、半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸和高半胱氨酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中增加甲硫氨酸的生產(chǎn)。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其中所述甲硫氨酸生物合成調(diào)節(jié)物是正或負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其中所述方法包括甲硫氨酸生物合成正調(diào)節(jié)物的超表達(dá)。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其中所述甲硫氨酸生物合成正調(diào)節(jié)物是RXN02910。
7.如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其中RXN02910由核酸分子編碼，該核酸分子包含選自下面的核酸分子a)包含與SEQ ID NO5或16的核苷酸序列具有至少60％同一性的核苷酸序列的核酸分子；b)包含含有SEQ ID NO5或16核苷酸序列的核酸的至少30個(gè)核苷酸的片段的核酸分子；c)編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含與SEQ ID NO6或17的氨基酸序列具有至少約60％同一性的氨基酸序列；d)編碼包含SEQ ID NO6或17氨基酸序列的多肽的片段的核酸分子，其中該片段包含SEQ ID NO6或17的氨基酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
8.如權(quán)利要求1至7中任一所述的方法，其中RXN02910由核酸分子編碼，該核酸分子包含如SEQ ID NO5或SEQ ID NO16所示的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，包括在增加甲硫氨酸的生產(chǎn)的條件下，培養(yǎng)甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物缺陷的微生物或者顯示降低的甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物活性的微生物。
10.如權(quán)利要求1至4和9中任一所述的方法，其中所述甲硫氨酸生物合成負(fù)調(diào)節(jié)物是RXA00655。
11.如權(quán)利要求1至4和9及10中任一所述的方法，其中RXA00655由核酸分子編碼，該核酸分子包含選自下面的核酸分子a)包含與SEQ ID NO1，18，20或22的核苷酸序列具有至少60％同一性的核苷酸序列的核酸分子；b)包含含有SEQ ID NO1，18，20或22核苷酸序列的核酸的至少30個(gè)核苷酸的片段的核酸分子；c)編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含與SEQ ID NO2，19，21或23的氨基酸序列具有至少約60％同一性的氨基酸序列；和d)編碼包含SEQ ID NO2，19，21或23的氨基酸序列的多肽的片段的核酸分子，其中該片段包含SEQ ID NO2，19，21或23的氨基酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
12.如權(quán)利要求1至4和9至12中任一所述的方法，其中RXA00655由核酸分子編碼，該核酸分子包含如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
13.如權(quán)利要求1至4和9至12中任一所述的方法，其中通過(guò)選自下面的方法獲得缺陷或降低的活性a)剔除編碼所述負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的基因；b)誘變編碼所述負(fù)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的基因，其中可以在所述基因的編碼、非編碼或調(diào)節(jié)區(qū)誘導(dǎo)所述突變；c)表達(dá)反義RNA，其中所述反義RNA與編碼所述負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的RNA的至少一部分互補(bǔ)；d)表達(dá)DNA結(jié)合蛋白，該DNA結(jié)合蛋白阻斷或減少?gòu)木幋a所述負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的基因的表達(dá)；e)表達(dá)蛋白質(zhì)結(jié)合因子，該蛋白質(zhì)結(jié)合因子阻斷或減少?gòu)木幋a所述負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的基因的表達(dá)；f)表達(dá)所述負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的顯性失活變體；和g)對(duì)編碼所述負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的mRNA去穩(wěn)定化。
14.一種生產(chǎn)甲硫氨酸的方法，該方法包括在生產(chǎn)甲硫氨酸的條件下培養(yǎng)超表達(dá)RXN02910或具有增加的RXN02910活性的微生物。
15.一種生產(chǎn)甲硫氨酸的方法，該方法包括在生產(chǎn)甲硫氨酸的條件下培養(yǎng)具有阻抑的RXA00655表達(dá)或降低的RXA00655活性的微生物。
16.一種生產(chǎn)甲硫氨酸的方法，該方法包括在生產(chǎn)甲硫氨酸的條件下培養(yǎng)微生物，該微生物a)超表達(dá)RXN02910或具有增加的RXN02910活性，且b)具有阻抑的RXA00655表達(dá)或降低的RXA00655活性。
17.如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其中所述微生物屬于棒狀桿菌屬或短桿菌屬。
18.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述微生物選自谷氨酸棒狀桿菌，Corynebacterium efficiens，力士棒狀桿菌(Corynebacteriumherculis)，百合棒狀桿菌，嗜乙酰乙酸棒狀桿菌，Corynebacteriumacetoglutamicum，嗜乙酰棒狀桿菌，產(chǎn)氨棒狀桿菌，Corynebacteriumfujiokense，Corynebacterium nitrilophilus，產(chǎn)氨短桿菌，Brevibacteriumbutanicum，叉開(kāi)短桿菌，黃色短桿菌，希氏短桿菌，Brevibacteriumketoglutamicum，Brevibacterium ketosoreductum，乳糖發(fā)酵短桿菌，Brevibacterium linens，Brevibacterium paraffinolyticum和表1中所示的菌株。
19.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒狀桿菌。
20.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，進(jìn)一步包括回收甲硫氨酸。
21.包含調(diào)節(jié)序列和選自如下的核酸分子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒a)包含與SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ IDNO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列具有至少60％同一性的核苷酸序列的核酸分子；b)包含含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ IDNO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的核酸的至少30個(gè)核苷酸的片段的核酸分子；c)編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含與SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23的氨基酸序列具有至少約60％同一性的氨基酸序列；和d)編碼多肽的片段的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO2，SEQID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ IDNO23的氨基酸序列，其中該片段包含SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23的氨基酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，其中所述調(diào)節(jié)序列能介導(dǎo)所述核酸分子在微生物中的表達(dá)。
22.如權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，其中所述調(diào)節(jié)序列是與所述核酸分子異源的啟動(dòng)子序列。
23.如權(quán)利要求21或22所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，其中以與所述啟動(dòng)子序列反義或有義的方向放置所述核酸分子。
24.如權(quán)利要求21至23中任一所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，其中所述核酸分子編碼多肽，該多肽包含SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中所示氨基酸序列。
25.如權(quán)利要求21至24任一所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20或SEQ ID NO22中所示核苷酸序列。
26.如權(quán)利要求21至25任一所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，其中所述核酸分子編碼多肽的天然等位變體，該多肽包含SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中所示的氨基酸序列。
27.包含權(quán)利要求21至26任一所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的載體。
28.如權(quán)利要求27所述的載體，其是表達(dá)載體。
29.用權(quán)利要求21至26中任一所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒或權(quán)利要求27或28所述的載體轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。
30.如權(quán)利要求29所述的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞屬于棒狀桿菌屬或短桿菌屬。
全文摘要
本發(fā)明描述了命名為MR核酸分子的核酸分子，其編碼來(lái)源于谷氨酸棒狀桿菌的新MR蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)參與精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的生物合成。本發(fā)明也提供了反義核酸分子、含有MR核酸分子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒和載體，和已經(jīng)引入該表達(dá)盒或載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了從微生物，例如谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)甲硫氨酸的方法，該方法包括在生產(chǎn)甲硫氨酸的條件下培養(yǎng)超表達(dá)或下調(diào)表達(dá)本發(fā)明至少一種MR分子的重組微生物。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的方法，該方法包括在生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品，例如甲硫氨酸的條件下培養(yǎng)具有缺失或突變的選定MR基因的重組微生物。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1694899SQ02829972
公開(kāi)日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2002年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月29日
發(fā)明者M·蓬佩尤斯, B·克勒格爾, H·施羅德, O·策爾德?tīng)? G·哈伯豪爾, S·哈夫納, C·克洛普羅格 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司