專利名稱：一種對目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的檢測裝置及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對樣品中、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的檢測裝置及其檢測方法。
在本發(fā)明中，定性和/或定量分析方法中的“檢測裝置”，是指定性和/或定量分析方法中包含有反應(yīng)器的相關(guān)裝置，其中反應(yīng)器中固定有用以同樣品中的目標(biāo)分子發(fā)生特異反應(yīng)的探針。例如，生物芯片或生物芯片試劑盒、快速檢測試劑條或快速檢測試劑盒、酶標(biāo)板或酶標(biāo)板試劑盒、等等。檢測裝置的必不可少的組成是反應(yīng)器，反應(yīng)器的必不可少的組成是探針和用以固定探針的載體。例如，目前的抗原包被生物芯片中的探針為包被抗原而載體為基片、現(xiàn)有ELISA法中的抗原包被酶標(biāo)板中的探針為包被抗原而載體為多孔板、等等。在本發(fā)明中，按照反應(yīng)器裝置中反應(yīng)器的數(shù)目n，反應(yīng)器裝置被定義為單反應(yīng)器裝置(n＝l)和多反應(yīng)器裝置(n等于或大于2)。本發(fā)明中的“反應(yīng)器”，是指反應(yīng)器裝置中探針與目標(biāo)物發(fā)生特異性反應(yīng)的場所及與其連通的其它相關(guān)結(jié)構(gòu)，例如開放式多反應(yīng)器生物芯片中的反應(yīng)池和相關(guān)的隔離結(jié)構(gòu)和進(jìn)出液結(jié)構(gòu)等、96孔酶標(biāo)板中的孔、快速檢測試劑盒的試劑條等等。
下面以生物芯片為例來簡單地說明現(xiàn)有定性和/或定量分析方法及尚待解決的問題。
在本發(fā)明中，“生物芯片”指定性和/或定量分析方法中的一種檢測裝置，其反應(yīng)器中探針同樣品中的目標(biāo)分子發(fā)生特異反應(yīng)的結(jié)果可以以可尋址的方式進(jìn)行識別，其包括現(xiàn)有的生物芯片和本發(fā)明的生物芯片。在本發(fā)明中，“生物芯片試劑盒”是指包含有生物芯片及其它檢測反應(yīng)介質(zhì)的檢測裝置。
現(xiàn)有的生物芯片，是將二種或二種以上的微量探針以可尋址的方式固定在平面載體(通常稱作基片)上形成的檢測裝置。在本發(fā)明中，我們將這類生物芯片稱為“親和平面載體生物芯片”，簡稱“親和平面生物芯片”或“平面芯片”。
最常用的生物芯片是多肽芯片和基因芯片。多肽芯片是以多個氨基酸的序列結(jié)構(gòu)(包括蛋白質(zhì))作為探針固定在基板上制備的生物芯片?；蛐酒怯么龣z標(biāo)本中核酸、核苷酸與互補(bǔ)核酸、核苷酸探針雜交，形成雜交體，或與特異性抗體結(jié)合，再用呈色反應(yīng)顯示檢測結(jié)果的芯片。生物芯片有著廣泛的應(yīng)用范圍，包括基因表達(dá)檢測、基因篩選、藥物篩選、疾病診斷治療、環(huán)境監(jiān)測和治理、司法鑒定等領(lǐng)域。
生物芯片的核心是其中固定的探針。生物芯片的探針，包括所有可以固定在固相載體上的具有生物活性的物質(zhì)，例如抗原、抗體、單鏈和多鏈DNA、RNA、核苷酸、配體、配基、多肽、細(xì)胞、組織成分等生物成分。
現(xiàn)有的生物芯片，由于其中探針直接固定在平面基片上，其在探針反應(yīng)的動力學(xué)條件、基板表面對探針穩(wěn)定性的影響、等等方面，都還有若干尚待解決的問題，其后果為固定化探針的反應(yīng)效率較低，表現(xiàn)為探針-目標(biāo)物反應(yīng)時間較長(通常在1小時以上)和靈敏度不太高(通常撿測目標(biāo)物的下限為pg級)。目前，以探針固定在平面載體上形成的其它檢測裝置，例如酶標(biāo)板等等，也都有與生物芯片同樣的問題。
在我們的初期研究中，“微粒”是與親和層析法中的“凝膠”相對應(yīng)的概念。因而，本發(fā)明的研究選擇了“將探針固定在盡可能小的載體微粒上以獲得盡可能高的反應(yīng)效率，再固定在平面載體上使其具有簡易的分析可行性”的技術(shù)路線。而目前可得的盡可能小的載體微粒，是尺寸在1-100um的微米粒子和0.1-1000nm的納米粒子。
在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)載體微粒、特別是納米微粒的至少下列兩項(xiàng)性能非常有利于達(dá)到本發(fā)明的目的1)、表面效應(yīng)隨著微粒粒徑尺寸的減小，表面原子占其總原子數(shù)的百分比增大，表面活性高，易與探針分子結(jié)合；特別是其比表面積大，單位體積載體中可以固定更多的探針，并為固定在其上的探針提供了更為有利的動力學(xué)條件，其結(jié)果是觀察到明顯降低了反應(yīng)時間和提高了檢測靈敏度(參考實(shí)施例)。
2)、小尺寸效應(yīng)隨著微粒粒徑尺寸的減小，還引起了某些宏觀性質(zhì)的變化，特別是其光學(xué)性質(zhì)的變化，有可能使得某些固定在基板上的親和微粒，不但不明顯增大、還可能減小基板的本底噪聲(表1)，這就為提高檢測靈敏度開辟了一條新的道路。實(shí)際上，某些納米材料的超常吸光性和超常透光性，已經(jīng)在其它領(lǐng)域得到應(yīng)用。在本發(fā)明中，本底噪聲定義為檢測空白對照物或陰性對照物時的背景信號強(qiáng)度。
表1列出某些固定化親和微粒載體在陰性樣品加入后測得的檢測信號強(qiáng)度。
實(shí)驗(yàn)用微粒載體分別為20-30nm金粒子(中國福建泉州長立生化有限公司)、1.4nm單順丁烯二乙酰亞胺修飾的納米金(美國NANOPROBES公司)、20-40nm氧化硅粒子(中國浙江舟山明日納米材料有限公司)、20-40nm氧化硅粒子(美國Sigma公司)、實(shí)驗(yàn)用基板為氨基改性玻片(自制，參考蔣中華等《生物分子固定化技術(shù)及應(yīng)用》，化學(xué)工業(yè)出版社，北京，1998)。實(shí)驗(yàn)用探針為兔抗人二抗和羊抗人二抗(中國北京生物制品研究所)。
實(shí)驗(yàn)時將濃度足夠稀釋的微粒載體液分別與同體積的兔抗人二抗(6mg/ml)和羊抗人二抗(6mg/ml)混合后制成探針分別為兔抗人二抗和羊抗人二抗的兩種親和微粒，然后將未純化的濃度足夠稀釋的兩種親和微粒分別點(diǎn)樣在氨基改性玻片上，在37℃反應(yīng)2小時后用小牛血清白蛋白封閉，制成微粒芯片。對照芯片為分別以同樣濃度兔抗人二抗和羊抗人二抗點(diǎn)樣在氨基改性玻片后，在同樣條件下制成的平面芯片。芯片的本底噪聲以加入5000倍稀釋的人血清后，其在芯片掃描儀(Afymetrix公司GMS 418芯片掃描儀)掃描后，用分析軟件處理獲得的結(jié)果來表示。
表1 某些固定化親和微粒載體的信號強(qiáng)度微粒載體尺寸探針信號背景信號無 - 28 57表面改性金 1.5nm 3 62金 20-30nm 5 59氧化硅 20-30nm 1 83氧化硅 20-40nm 7 76從而，本發(fā)明提供一種對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的檢測裝置，其至少包括探針(1)、微粒(2)、基板(3)和有無其它結(jié)構(gòu)單元(4)，其特征在于微粒(2)平均粒徑尺寸為0.1nm-10um，部分或全部探針(1)以直接或間接方式固定在微粒(2)上，固定有探針的微粒以直接或間接方式固定在基板(3)上。
在本發(fā)明中，“探針”是指固定在反應(yīng)器中同目標(biāo)物發(fā)生選擇性反應(yīng)以對目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的物質(zhì)，“微?！笔侵腹潭ㄌ结樀奈⒚谆蚣{米尺寸的載體，“親和微?！笔侵腹潭ㄓ刑结樀奈⒘?，“基板”是指固定親和微粒的固相載體。探針可直接或間接地與微粒聯(lián)接，間接連接的一個例子是親和微粒與其它功能微粒連接、其它功能微粒再與基板連接。所述目標(biāo)物在所述固定化親和微粒反應(yīng)器中的反應(yīng)，部分或全部為所述目標(biāo)物與所述親和微粒上的探針的反應(yīng)，部分反應(yīng)的一個例子是所述目標(biāo)物除與探針的反應(yīng)、包括與固定在微粒上的探針反應(yīng)和固定在基板上的探針反應(yīng)(例如制備親和微粒時未分離的自由探針與親和微粒一起包被到基板上的情況)。
另一方面，本發(fā)明檢測裝置，所述微粒平均粒徑尺寸為0.1-1000nm。
又一方面，本發(fā)明檢測裝置，所述微粒平均粒徑尺寸為0.1-100nm。
又一方面，本發(fā)明檢測裝置，所述微粒平均粒徑尺寸為1-10nm。
另一方面，本發(fā)明檢測裝置，所述親和微粒中的探針，為下述之一種或多種探針抗原、抗體、配體、配基、多肽和單鏈和多鏈DNA、RNA、核苷酸等等。
另一方面，本發(fā)明檢測裝置，所述微粒為可固定探針而不損失其生物活性的金屬微粒或修飾結(jié)合有功能基團(tuán)或功能物的金屬微粒、無機(jī)非金屬微粒或修飾結(jié)合有功能基團(tuán)或功能物的無機(jī)非金屬微粒和有機(jī)微?；蛐揎椊Y(jié)合有功能基團(tuán)或功能物的有機(jī)微粒。實(shí)際上，可固定探針而不損失其生物活性的微粒很多，例如已用于生化和免疫檢測方法中的納米微球、用作藥物緩釋載體的某些納米載體，等等。
本發(fā)明提供的檢測裝置，所述微粒載體為下列一種或一種以上的微粒金、釩、鉛、銀、鐵及其氧化物微粒，還包括它們的修飾結(jié)合有氨基、巰基、?；蛏锼氐难苌镂⒘?；氧化硅、氧化鈦、氧化鋁微粒；塑料(例如聚苯乙烯類、聚氯乙烯類、聚丙烯類、聚丙烯酰胺類、聚酰亞胺類、聚醚酮類)、多糖(例如葡聚糖、瓊脂糖、淀粉、及它們的改性物)、乳膠、樹脂和其它和其它高分子材料(例如尼龍)微粒。
另一方面，本發(fā)明檢測裝置，所述微粒為形成親和微粒反應(yīng)器加入空白對照物或/和陰性對照物后，其親和微粒信號強(qiáng)度不明顯大于、優(yōu)選方案為不大于、更優(yōu)選方案為小于本底噪聲的微粒。
本發(fā)明提供的檢測裝置，為至少在一個反應(yīng)器中以可尋址的方式分布有兩種或兩種以上的所述親和微粒的生物芯片或生物芯片試劑盒。本發(fā)明的生物芯片對目前的生物芯片概念進(jìn)行了拓展。本發(fā)明的生物芯片與通常的平面載體芯片不同，其探針不是固定在平面固相載體、而是在微粒載體上。在本發(fā)明中，我們將本發(fā)明的生物芯片稱為親和微粒載體生物芯片，簡稱親和微粒生物芯片或微粒芯片。在本發(fā)明中，芯片包括平面芯片和微粒芯片。在本發(fā)明中，我們將使用親和微粒生物芯片對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法稱為親和微粒生物芯片法，簡稱微粒芯片法。
本發(fā)明提供的檢測裝置，為至少在一個反應(yīng)池中以隨機(jī)的方式固定有所述親和微粒的酶標(biāo)板或酶標(biāo)試劑盒。本發(fā)明的酶標(biāo)板與通常的酶標(biāo)板不同，其探針不是固定在多孔板孔內(nèi)的平面固相載體、而是在微粒載體上。在本發(fā)明中，我們將本發(fā)明的酶標(biāo)板稱為親和微粒載體酶標(biāo)板，簡稱微粒酶標(biāo)板。在本發(fā)明中，酶標(biāo)板包括平面載體酶標(biāo)板和微粒載體酶標(biāo)板。在本發(fā)明中，我們將使用親和微粒載體酶標(biāo)板對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法稱為親和微粒載體酶標(biāo)法，簡稱微粒酶標(biāo)法。
本發(fā)明還提供一種對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的檢測方法，其具體步驟為A、提供按已優(yōu)化濃度配制的載體微粒液；B、將探針或探針與連接劑加入載體微粒液中并使之固定在載體微粒上；C、分離或不分離自由探針與固定有探針的載體微粒；D、將C獲得的制備物按已優(yōu)化濃度直接點(diǎn)樣至基板上，并使之固定在基板上；基板上預(yù)先固定有或無連接劑或含連接劑的微粒。
E、如有必要封閉固定的載體微粒和基板。
F、加入樣品中的目標(biāo)物與親和微粒載體上的探針結(jié)合；G、分析與探針結(jié)合的目標(biāo)物得到檢測結(jié)果。
本發(fā)明通過將探針固定在微粒載體上形成親和微粒，將親和微粒固定在基板上形成親和微粒陣列來形成親和微粒檢測裝置，最終達(dá)到提高靈敏度的目的。
本實(shí)施例步驟如下微粒芯片的制備所述微粒載體液以已優(yōu)化的濃度分別與等體積HCV抗原(1.5mg/ml)和HIV1+2抗原溶液(1.5mg/ml)混合，反應(yīng)在37℃進(jìn)行2小時，形成分別固定有HCV抗原和HIV1+2抗原的四種微粒的親和微粒，分別記作A-HCV、A-HIV、B-HCV、B-HIV、C-HCV、C-HIV、D-HCV、D-HIV。然后，一種微粒形成的兩種親和微粒再以已優(yōu)化的濃度分別點(diǎn)在同一個芯片的反應(yīng)池中，4種親和微粒制成4個親和微粒芯片。在一個反應(yīng)池中，每種微粒形成的兩種親和微粒(例如，A-HCV、A-HIV)各點(diǎn)2個點(diǎn)，形成2×2親和微粒陣列，包被后，用牛血清白蛋白封閉后備用。
對照芯片E為加入同樣量相同抗原制備的常規(guī)的有8個反應(yīng)池的平面芯片。
對照芯片F(xiàn)為加入濃度分別為1.5mg/ml的相同抗原按經(jīng)典方法制備的有8個反應(yīng)池的平面芯片。
微粒芯片檢測在本實(shí)施例中，1號樣為HCV抗體陽性血清，2號樣為HIV1+2抗體陽性人血清，3號樣為陽性對照物(HCV抗體和HIV1+2抗體陽性血清對照物的混合物)，4號樣品為陰性對照物(HCV抗體和HIV1+2抗體都為陰性的血清對照物)。所有的樣品，均經(jīng)使用對照平面芯片F(xiàn)在血清20倍稀釋反應(yīng)條件下預(yù)先檢測(表1)。實(shí)驗(yàn)時4種樣品分別加入上述4種微粒載體芯片A、B、C、D和對照平面芯片E，每種樣品加2個反應(yīng)池。實(shí)驗(yàn)時，樣品作1∶5000稀釋，加樣量為5ul，反應(yīng)5分鐘后洗滌5次，洗滌液每次加入量為15ul，標(biāo)記物為羅丹明標(biāo)記的羊抗人二抗，加入量為5ul，反應(yīng)后洗滌5次，洗滌液每次加入量為15ul，干燥后進(jìn)行掃描(Afymetrix公司GMS 418芯片掃描儀)，得到反應(yīng)結(jié)果如表2。表2 微粒載體生物芯片的檢測結(jié)果

表中，“+”為陽性結(jié)果，“-”為陰結(jié)果。實(shí)施例2微粒ELISA法和微粒ELISA板在本實(shí)施例中，所用探針同實(shí)施例1，微粒為1.4納米金(美國Nanoprobes公司)和20-40nm氧化硅粒子(美國Sigma公司)(分別編號為A和B)，所用基板為ELISA微孔板(中國深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司)。
本實(shí)施例步驟如下微粒酶標(biāo)板的制備所述微粒載體液以已優(yōu)化的濃度分別與等體積HCV抗原(1.5mg/ml)和HIV1+2抗原溶液(1.5mg/ml)(分別編號為1和2)混合，反應(yīng)在37℃進(jìn)行2小時，形成分別固定有HCV抗原和HIV1+2抗原的四種微粒的親和微粒。包被有HCV抗原和HIV抗原的A微粒分別記作A1和A2微粒，包被有HCV抗原和HIV抗原的B微粒分別記作B1和B2微粒。每種親和微粒再以已優(yōu)化的濃度分別包被一個酶標(biāo)板，用牛血清白蛋白封閉，干燥后備用。對照板C1和C2中分別包被有HCV和HIV抗原，加入抗原的濃度為1mg/ml，對照板D1和D2中分別包被有HCV和HIV抗原，加入抗原的濃度與包被有親和微粒的板相同。
微粒酶標(biāo)板檢測在本實(shí)施例中，1號樣為HCV抗體陽性血清，2號樣為HIV1+2抗體陽性人血清，3號樣為陽性對照物(HCV抗體和HIV1+2抗體陽性血清對照物的混合物)，4號樣為陰性對照物(HCV抗體和HIV1+2抗體都為陰性的血清對照物)。所有的樣品，是經(jīng)對照板D1和D2在1∶10倍血清稀釋反應(yīng)條件下檢測確定的。實(shí)驗(yàn)時將1∶100倍稀釋的上述4種血清樣品分別加入6個酶標(biāo)板(4個微粒酶標(biāo)板和對照板C1和C2)。加樣量為100ul，加樣反應(yīng)15分鐘后洗滌，洗滌3次，每次洗滌量為300ul。標(biāo)記物為酶標(biāo)記的羊抗人二抗，加入量為100ul。加入底物的反應(yīng)條件和酶標(biāo)儀的檢測與經(jīng)典的ELISA相同。結(jié)果見表3。表3，微粒酶標(biāo)板的檢測結(jié)果

表中，“+”為陽性結(jié)果，“-”為陰性結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的檢測裝置，其至少包括探針(1)、微粒(2)、基板(3)和有無其它結(jié)構(gòu)單元(4)，其特征在于微粒(2)平均粒徑尺寸為0.1nm-10um，部分或全部探針(1)以直接或間接方式固定在微粒(2)上，固定有探針的微粒以直接或間接方式固定在基板(3)上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的檢測裝置，其特征在于所述微粒平均粒徑尺寸為0.1-1000nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析方法的檢測裝置，其特征在于所述微粒平均粒徑尺寸為0.1-100nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析方法的檢測裝置，其特征在于所述微粒平均粒徑尺寸為1-10nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的一種對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的檢測裝置，其特征在于所述探針，為下述之一種或多種探針抗原、抗體、配體、配基、多肽和單鏈或多鏈DNA、RNA、核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的含固定化親和微粒反應(yīng)器的裝置，其特征在于所述微粒為可固定探針而不損失其生物活性的金屬微?；蛐揎椊Y(jié)合有功能基團(tuán)或功能物的金屬微粒、無機(jī)非金屬微?；蛐揎椊Y(jié)合有功能基團(tuán)或功能物的無機(jī)非金屬微粒和有機(jī)微?；蛐揎椊Y(jié)合有功能基團(tuán)或功能物的有機(jī)微粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含固定化親和微粒反應(yīng)器的裝置，其特征在于所述微粒為下列一種或一種以上的微粒金、釩、鉛、銀、鐵及其氧化物微粒，還包括它們的修飾結(jié)合有氨基、巰基、?；蛏锼氐难苌镂⒘?；氧化硅、氧化鈦、氧化鋁微粒；塑料、多糖、乳膠、樹脂和其它高分子材料微粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的含固定化親和微粒反應(yīng)器的裝置，其特征在于所述微粒為形成親和微粒反應(yīng)器加入空白對照物或/和陰性對照物后，固定有探針的微粒的信號強(qiáng)度不明顯大于、優(yōu)選方案為不大于、更優(yōu)選方案為小于本底噪聲的微粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8之一所述的一種對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的檢測裝置，其特征在于其為至少在一個反應(yīng)器中以可尋址的方式分布有兩種或兩種以上的所述固定有探針的微粒的生物芯片或生物芯片試劑盒。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-8之一所述的一種對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的檢測裝置，其特征在于其為至少在一個反應(yīng)池中以隨機(jī)方式分布有所述固定有探針的微粒的酶標(biāo)板或酶標(biāo)試劑盒。
11.一種對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的檢測方法，其特征在于具體步驟為A、提供按已優(yōu)化濃度配制的載體微粒液；B、將探針或探針與連接劑加入載體微粒液中并使之固定在載體微粒上；C、分離或不分離自由探針與固定有探針的載體微粒；D、將C獲得的制備物按已優(yōu)化濃度直接點(diǎn)樣至基板上，并使之固定在基板上；基板上預(yù)先固定有或無連接劑或含連接劑的微粒。E、如有必要封閉固定的載體微粒和基板。F、加入樣品中的目標(biāo)物與親和微粒載體上的探針結(jié)合；G、分析與探針結(jié)合的目標(biāo)物得到檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對樣品中、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的檢測裝置及其檢測方法，所采用的方案是準(zhǔn)備一種含固定化親和微粒反應(yīng)器的裝置、使樣品與所述反應(yīng)器接觸并進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)、分析所述反應(yīng)器中的反應(yīng)結(jié)果，所述含固定化親和微粒反應(yīng)器的裝置，至少包括探針(1)、微粒(2)、基板(3)和有無其它結(jié)構(gòu)單元(4)，探針與微粒載體聯(lián)接成親和微粒(5)，親和微粒與基板聯(lián)接成固定化親和微粒(6)，固定化親和微粒本身或與其它結(jié)構(gòu)單元聯(lián)接形成固定化親和微粒反應(yīng)器，以固定化親和微粒反應(yīng)器為基礎(chǔ)可制備定性和/或定量分析裝置或試劑盒，其中，微粒載體尺寸優(yōu)選方案為1－10nm，采用本發(fā)明大大提高了檢測靈敏度。
文檔編號C12Q1/68GK1434295SQ0311744
公開日2003年8月6日 申請日期2003年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月13日
發(fā)明者鄒方霖, 陳春生, 王建霞, 陳寧 申請人:成都夸?？萍加邢薰?br>