專利名稱：少根根霉△的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和遺傳工程領(lǐng)域，涉及從一種絲狀真菌—根霉屬的少根根霉(Rhizopus arrhizus)中克隆Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，具體講是少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列及其應(yīng)用。將該基因直接或與不同表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)入到細(xì)菌、酵母、植物或動(dòng)物中，利用其編碼Δ6-脂肪酸脫氫酶產(chǎn)生不飽和脂肪酸的方法和應(yīng)用。
由于γ-亞麻酸等不飽和脂肪酸特殊的生物學(xué)功能，許多實(shí)驗(yàn)室在過去一直研究利用從各種生物體中克隆相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入各種生物體中，產(chǎn)生具有使不飽和脂肪酸含量發(fā)生改變的油類的方法。目前，已從動(dòng)物、植物、微生物等不同來源中分離到許多Δ6-脂肪酸脫氫基因的同源序列，并且證明具有相同的生物學(xué)功能。其中已申請(qǐng)的專利很多，中國(guó)專利92113085公開了“利用Δ6-去飽和酶生產(chǎn)γ-亞麻酸”，它闡述了蘭細(xì)菌(Synechocystis sp.PCC6803)Δ6-脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)入藻類產(chǎn)生γ-亞麻酸；中國(guó)專利98812900公開了“去飽和酶基因及其用途”，它闡述編碼線蟲(Caenorhabditiselegans)Δ6-去飽和酶的基因在酵母中γ-亞麻酸；中國(guó)專利00811423.4公開了“角齒蘚Δ6-乙炔酶和Δ6-脫飽和酶”，它闡述一種利用編碼角齒蘚(Ceratodonpurpureus)Δ6-乙炔酶/Δ6-脫飽和酶或Δ6-脫飽和酶的DNA序列生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因生物制備不飽和脂肪酸的方法，以及制備具有較高不飽和脂肪酸含量的甘油三酯的方法等。
不過，除了在酵母中證實(shí)脂肪酸譜向不飽和脂肪酸的偏移和其產(chǎn)量的提高[NapierJA et al.，1998，Biochem.J.，330611-614]，包括Δ6-脂肪酸脫氫酶在內(nèi)的各種脫氫酶在轉(zhuǎn)基因植物中的表現(xiàn)沒有達(dá)到所需的要求，它有可能表現(xiàn)出脂肪酸譜的改變，但與此同時(shí)也會(huì)發(fā)生這種轉(zhuǎn)基因植物的合成性能的顯著降低。因此迫切需要編碼包括Δ6-脂肪酸脫氫酶在內(nèi)的與不飽和脂肪酸生物合成相關(guān)的酶的基因并可以利用它們以工業(yè)化生產(chǎn)不飽和脂肪酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該核苷酸序列所編碼的Δ6-脂肪酸脫氫酶多肽、或其片段、類似物或衍生物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接，進(jìn)行功能性表達(dá)的重組載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有該基因核苷酸序列或該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用含有該基因核苷酸序列或該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞或該核苷酸序列所編碼的Δ6-脂肪酸脫氫酶多肽制備不飽和脂肪酸的方法。
本發(fā)明的第一方面，提供的是具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或該核苷酸序列的片段、類似物和衍生物。
分離的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少65％的同源性(1)具有編碼SEQ ID NO2氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列；(2)與核苷酸序列(1)互補(bǔ)的核苷酸序列。準(zhǔn)確地，該核苷酸序列具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。更準(zhǔn)確地，該核苷酸序列是選自下組中的一種(a)具有SEQ ID NO1序列中1-1482的序列和(b)具有SEQ ID NO1中29-1406的序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供分離的這個(gè)核苷酸序列所編碼的多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其片段、或其保守性變異多肽、或其衍生類似物。準(zhǔn)確地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽或其氨基酸變異不超過30％的衍生物。
本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述核苷酸序列的重組載體，以及被上述核苷酸序列或重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞。
本發(fā)明的第四方面，提供了一種用含有該基因核苷酸序列或該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞或該核苷酸序列所編碼的Δ6-脂肪酸脫氫酶多肽制備不飽和脂肪酸的方法。
本發(fā)明的其他方面由于本文技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
如本發(fā)明所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。例如，活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的核苷酸序列和多肽是沒有分離純化的，但同樣的核苷酸序列或多肽如從天然狀態(tài)中與同存在的其它物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的核苷酸序列”是指基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的DNA純化技術(shù)純化的。
本發(fā)明提供了一種新的分離的核苷酸序列——編碼少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列，其基本上是由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列組成的，其特征是該序列長(zhǎng)為1482bp，其中29bp-1406bp為編碼Δ6-脂肪酸脫氫酶成熟多肽SEQ ID NO2的開放閱讀框；1bp-28bp為5`非轉(zhuǎn)譯區(qū)序列，1407bp-1482bp為3`非轉(zhuǎn)譯區(qū)序列。
本發(fā)明提供了分離的核苷酸序列，該核苷酸序列基本由編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列組成。具體地，本發(fā)明的核苷酸序列具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
編碼SEQ ID NO2活性多肽的核苷酸序列包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語(yǔ)“編碼少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列”是指包括編碼少根根霉Δ6脂肪酸脫氫酶多肽的核苷酸序列和包括附加編碼和/或非編碼的核苷酸序列。
本發(fā)明的核苷酸序列可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO2所示的編碼區(qū)序列相同或是簡(jiǎn)并的變異體。如本發(fā)明所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)或多肽，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核苷酸序列。
本發(fā)明還包括編碼少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列的片段、類似物或衍生物。如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“類似物”和“衍生物”是指能編碼基本上保持本發(fā)明天然的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽的核苷酸序列。
通過本文的闡述，這樣的片段、類似物或衍生物被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明核苷酸序列的片段、衍生序列或類似序列可以是其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸發(fā)生取代、缺失、插入、倒位的核苷酸序列，即原始分離序列的人工突變體，它還具有所需的酶促功能。還可以是所述的核苷酸序列與脂肪酸生物合成的其它基因的融合序列。
如SEQ ID NO1所示的衍生物或功能性衍生物表示的等位變異體，它在衍生的氨基酸水平具有至少75％的同源性，優(yōu)選至少80％的同源性，特別優(yōu)選85％的同源性，非常特別的優(yōu)選是90％的同源性。所述同源性是基于完整氨基酸片段計(jì)算的。由所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，同源性表示同一性，就是說氨基酸序列至少70％相同。所述的新核苷酸序列在核酸水平上至少具有65％的同源性，優(yōu)選至少70％的同源性，特別優(yōu)選75％的同源性，非常特別的優(yōu)選是80％的同源性。
衍生物還表示SEQ ID NO1所示序列的同系物，如真核同系物、截短的序列，但仍具有所需功能，就是說具有這種蛋白的酶促活性，因此，功能性等同物包括上述序列的的天然變體和人工核苷酸序列。
非編碼的衍生物還表示可用于抑制所述新型蛋白生物合成的反義DNA。所述的反義DNA屬于本發(fā)明的無功能衍生物。如不具備酶促活性的衍生物。可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知生產(chǎn)無功能衍生物的其它方法有共抑制，核糖酶和內(nèi)含子的使用。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核苷酸序列(兩個(gè)序列之間具有至少50％的同源性，優(yōu)選至少70％的同源性)，并且，可雜交的核苷酸序列編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含10個(gè)核苷酸，優(yōu)選是至少20-30個(gè)核苷酸，特別優(yōu)選是至少50-60個(gè)核苷酸，非常特別的優(yōu)選是至少100個(gè)核苷酸以上。核苷酸片段也可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼的核苷酸序列。
本發(fā)明中的多肽和核苷酸序列優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的編碼的特異的核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離核苷酸序列。這些技術(shù)包括但不局限于(1)用探針與基因組或cDNA文庫(kù)雜交以檢出同源的核苷酸序列；和(2)表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的核苷酸序列片段。
本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得(1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；(2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學(xué)合成是經(jīng)常選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是DNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是從高表達(dá)該基因的供體細(xì)胞分離mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)?；蚴删wcDNA文庫(kù)。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，用試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得。而構(gòu)建cDNA文庫(kù)也是通常的方法。當(dāng)結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)時(shí)，即使極少的表達(dá)產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫(kù)中篩選本發(fā)明的基因，這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標(biāo)志基因功能的出現(xiàn)或消失；(3)測(cè)定的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)通過免疫學(xué)技術(shù)測(cè)定生物學(xué)活性，來檢測(cè)基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。在第(1)中方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的核苷酸序列的任何一部分同源，其長(zhǎng)度至少10個(gè)核苷酸，優(yōu)選是至少30個(gè)核苷酸，特別優(yōu)選是至少50個(gè)核苷酸，非常特別的優(yōu)選是至少100個(gè)核苷酸。此外，探針的長(zhǎng)度通常在2000個(gè)核苷酸之內(nèi)，較佳的為1000個(gè)核苷酸之內(nèi)。此處所用得探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當(dāng)然可以用作探針。DNA探針的標(biāo)記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki et al.，1985，Science，2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫(kù)中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的核苷酸序列信息適當(dāng)?shù)倪x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明還提供了一種新的多肽序列—少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列，其基本上是由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。
本發(fā)明的多肽包括的Δ6脂肪酸脫氫酶的片段、衍生物和類似物。如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“類似物”和“衍生物”是指基本上保持本發(fā)明天然的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代、倒位、插入或缺失；或者(II)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上的某個(gè)基團(tuán)被其它基團(tuán)取代包含取代基；或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)這樣一種，其中附加的氨基酸序列融合進(jìn)成熟多肽而形成的多肽序列(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。
本發(fā)明也涉及含有編碼少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列和外源性調(diào)節(jié)序列元件結(jié)合進(jìn)行功能性表達(dá)的重組表達(dá)載體。術(shù)語(yǔ)“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。能夠影響基因表達(dá)產(chǎn)物的序列元件包括有復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯調(diào)控元件。
可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建含編碼少根根霉Δ6脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等[Sambroook，et al.，Molecular Cloning，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989]。所述的編碼少根根霉Δ6脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列可有效連接到表達(dá)載體的恰當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體的PL啟動(dòng)子真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會(huì)使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10-300bp，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。如腺病毒增強(qiáng)子。
本發(fā)明還涉及用含有本發(fā)明編碼少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列的重組載體或直接用編碼少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。本發(fā)明中，編碼少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列或含有該核苷酸序列的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該核苷酸序列或重組載體的基因工程化宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。宿主細(xì)胞的代表性例子有大腸桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞如油菜、煙草、大豆；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2或Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
用本發(fā)明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期收集菌體，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域是眾所周知的。也可用MgCl2，電穿孔等方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用DNA轉(zhuǎn)染法、顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等方法。
本發(fā)明還涉及用上述轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞生產(chǎn)，根據(jù)宿主細(xì)胞，用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法生長(zhǎng)或培養(yǎng)。比如微生物細(xì)胞通常是在0-100℃，優(yōu)選10-60℃，同時(shí)還要氧氣。培養(yǎng)基中含有碳源，如葡萄糖，氮源，通常是有機(jī)氮的形式，如酵母提取物、氨基酸，或鹽，如硫酸銨，微量元素，如鐵、鎂鹽，如果需要的話還有維生素。在此期間培養(yǎng)基的pH可以保持固定的值，就是說，在培養(yǎng)期間進(jìn)行控制或不控制。培養(yǎng)可以分批培養(yǎng)、半不連續(xù)培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)形式進(jìn)行。在培養(yǎng)之后，收集細(xì)胞，搗碎或直接使用，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法從細(xì)胞中提取脂肪酸。
本發(fā)明還涉及一種制備不飽和脂肪酸的方法，該方法是這樣實(shí)現(xiàn)的，將具有飽和或不飽和脂肪酸甘油三酯與SEQ ID NO2一起培養(yǎng)。該方法優(yōu)選是在由能夠攝取或釋放還原性等同物的化合物存在條件下進(jìn)行的。然后，可以從甘油三酯中釋放脂肪酸。上述方法優(yōu)選可以合成具有Δ6雙鍵的脂肪酸。
本發(fā)明還涉及用上述方法制備不飽和脂肪酸，以及將其應(yīng)用于生產(chǎn)人類食品、動(dòng)物飼料、化妝品或藥品用途。
附圖
2顯示本發(fā)明的少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶和卷枝毛霉Δ6-脂肪酸脫氫酶(BAB69055)的氨基酸序列同源性比較圖。
附圖3顯示所構(gòu)建的釀酒酵母表達(dá)載體pYRAD6。
附圖4顯示γ-亞麻酸甲基酯標(biāo)準(zhǔn)物(4A)、含pYES2.0空載體的轉(zhuǎn)基因酵母(4B)和含重組質(zhì)粒pYRAD6的轉(zhuǎn)基因酵母(4C)的氣相色譜圖。
下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1從少根根霉中分離Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列用UNIQ-10柱式總RNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品)從培養(yǎng)48h的少根根霉菌絲體中提取總RNA，取1μg總RNA為模板，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)要求，反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA；根據(jù)所發(fā)表的Δ6-脂肪酸脫氫酶同源序列的組安酸保守區(qū)II和III區(qū)氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物(引物1和引物2)，以上述合成的cDNA為模板在T-Gradient PCR儀(Biometra公司)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)所用引物、組分和擴(kuò)增條件如下引物15`-TGGTGGAAG(G/A)A(C/T)AAICA(C/T)AACI(C/T)(G/T)CA(C/T)CA-3`；引物25`-GGGAA(C/T)A(G/A)G/A)TG(G/A)TGCTC(G/A)ATCTG-3`；反應(yīng)組分 加入量 終濃度模板cDNA 5μl緩沖液(10×)(含20mmol/L MgCl2)5μl 1×dNTP(2.5mmol/L)4μl 0.4mmol/L引物1(10μmol/L) 1μl 0.2μmol/L引物2(10μmol/L) 1μl 0.2μmol/LTaqase(5u/μl) 0.5μl 2.5u/反應(yīng)H2O 33.5μl總體積 50μl擴(kuò)增條件94℃變性3min，然后94℃ 1min；45℃ 1min→72℃ 2min，這樣先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，再用94℃ 1min；58℃ 1min→72℃ 1min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10min。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到大小約600bp的片段，用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品)回收，把回收片段亞克隆到測(cè)序載體pGEM-T(Promega公司產(chǎn)品)中；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用CaCl2法處理的大腸桿菌DH5α，在含氨芐青霉素(終濃度為100μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜；挑取平板上生長(zhǎng)的白色菌落，接入含氨芐青霉素(終濃度為100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，離心收集菌體按堿裂解法[Sambroook，et al.，1989，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory，New York，p19-21]提取質(zhì)粒，經(jīng)NcoI和SacI雙酶切和PCR擴(kuò)增鑒定正確，測(cè)序(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。測(cè)序結(jié)果顯示所擴(kuò)增得到的片段大小為593bp，通過其編碼的氨基酸序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中用Blast程序(Basic local Alignment seatch tool)[Altschul SF et al，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402]進(jìn)行同源檢索，檢索結(jié)果表明與該片段最相似的同源片段為Δ6、Δ8、Δ5-脂肪酸脫氫酶，但并不完全相同，證明所擴(kuò)增片段為新的潛在脫氫酶基因的片段。
根據(jù)所獲得的部分序列設(shè)計(jì)基因特異性引物(引物3和引物4)，利用cDNA末端擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)獲得包含上述片段的基因的3`和5`末端序列。同樣先提取細(xì)胞總RNA，用SMRTTMACER cDNA Amplification Kit(Clontech公司產(chǎn)品)反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA，用基因特異性引物和試劑盒提供的接頭引物，按PCR擴(kuò)增試劑盒(Clontech公司產(chǎn)品)分別進(jìn)行3`和5`末端序列的PCR。
引物3(3`RACE)5`-GCCATCCAATCCTTACTCTACTC-3`，(SEQ ID NO3)引物4(5`RACE)5`-TGTGGGTTCTTCATCCAGTGAGGCA-3`(SEQ ID NO4)模板cDNA 2.5μl、緩沖液(10×)5μl、dNTP(50×)1μl、引物3(10μmol/L)1μl、引物4(10μmol/L)1μl、Advantage2 Polymeerase Mix 1μl、H2O 34.5μl 擴(kuò)增條件先95℃變性2min，進(jìn)入95℃ 30sec；68℃ 3min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用上述相同的方法鑒定、測(cè)序。序列分析結(jié)果顯示3`RACE擴(kuò)增獲得從引物3序列到polyA前共619bp的序列信息，而5`RACE獲得從引物4序列到末端接頭序列之間共781bp的序列信息。用序列分析軟件(DNAMAN Version4.0，Lynnon BioSoft)將三個(gè)片段進(jìn)行拼接并進(jìn)行分析，得到如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，其中29bp-1406bp(ATG----TAA)為潛在的開放閱讀框，編碼458個(gè)氨基酸。兩側(cè)分別為5`非轉(zhuǎn)譯區(qū)(28bp)和3`非轉(zhuǎn)譯區(qū)(76bp)。根據(jù)兩個(gè)末端序列，設(shè)計(jì)基因特異性引物(引物5和引物6)按3`和5`RACE條件PCR擴(kuò)增、測(cè)序，所的結(jié)果和拼接結(jié)果一致。
引物55`-CTCGGTACCGGGGATCTTCTTTTCTTTC-3`(SEQ ID NO5)；引物65`-CTCGCATGCGTTGAACTAAAAGTGATTATTTGATC-3`(SEQ ID NO6)；實(shí)施例2所分離核苷酸序列的同源性搜索將推測(cè)Δ6-脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列在Genbank上進(jìn)行同源性搜索，所得同源序列大部分為編碼Δ6-脂肪酸脫氫酶的序列，少數(shù)為編碼Δ8-鞘脂脫氫酶、Δ5-脂肪酸脫氫酶以及其它脫氫酶和其它酶的序列，其中與來源于卷枝毛霉[Michinaka Y et al.，2003，Appl Microbiol Biotechnol，epub ahead of print]同源性最高相同性56％，相似性71％(附圖2，附圖2顯示本發(fā)明的少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶和卷枝毛霉Δ6-脂肪酸脫氫酶(BAB69055)的氨基酸序列同源性比較圖。相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用單子符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示)。這說明本發(fā)明的新的核苷酸序列所編碼的酶具有潛在Δ6-脂肪酸脫氫酶的功能。實(shí)施例3釀酒酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)SEQ ID NO1所示編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物(引物7和引物8)分離其潛在開放閱讀框序列引物75`-CACGGTACCATGAGTACATCAGATCGTCAATCAG-3`(SEQ ID NO7)；引物85`-CTCGCATGCTTAAAATGACTTTTTGCTCAATTGC-3`(SEQ ID NO8)；此兩個(gè)引物的5`端黑體分別含有KpnI和SphI酶切位點(diǎn)。所用的擴(kuò)增條件和反應(yīng)組分和3`和5`RACE相同，擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示和SEQ ID NO1所示29bp-1406bp的序列一致。然后取PCR產(chǎn)物和pYES2.0分別進(jìn)行雙酶切，回收酶切大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過質(zhì)粒提區(qū)和PCR篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果見附圖3，所構(gòu)建的含有Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的酵母表達(dá)命名為pYRAD6。該質(zhì)粒是由pYES2.0(Invitrogen公司)和引物7和引物8的PCR產(chǎn)物構(gòu)建而成。質(zhì)粒和分別經(jīng)KpnI和SphI雙酶切后，電泳回收純化，經(jīng)T4DNA Ligase連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選鑒定出重組質(zhì)例，命名為pYRAD6。實(shí)施例4重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞挑取釀酒酵母菌株INVSc1單菌落于10ml YEPD液體培養(yǎng)基中、30℃搖床過夜培養(yǎng)，檢測(cè)菌液的OD600值，取適量菌液稀釋于50ml，使OD600為0.4 ；繼續(xù)培養(yǎng)2到4h后，2500rpm離心沉淀細(xì)胞，以40ml 1×TE重懸菌體，2500rpm離心沉淀細(xì)胞，以2ml1×LiAc/0.5×TE懸浮細(xì)胞，并在室溫下放置10min，此細(xì)胞即為感受態(tài)細(xì)胞；取100μl制備好的酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入1μg重組質(zhì)粒pYRAD6和100μg變性鮭精DNA，混勻，加入700μl 1×LiAc/40％PEG-4000/1×TE并混勻，于30℃溫育30min；然后，加入88μl DMSO混勻，于42℃水浴中熱激7min；離心10s沉淀細(xì)胞，加入1ml 1×TE懸浮細(xì)胞并再次離心沉淀細(xì)胞，最后加入50-100μl重懸細(xì)胞，全鋪于SC-Ura(無尿嘧啶)選擇培養(yǎng)基平板，置30℃培養(yǎng)48-72h。實(shí)施例5酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)挑取SC-Ura(無尿嘧啶)選擇培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化，接種于15ml SC-Ura選擇培養(yǎng)基(含2％的棉籽糖或葡萄糖)，28℃搖菌過夜培養(yǎng)，以5％的接種量加入含有1％NP-40，2％棉子糖的100ml SC-Ura培養(yǎng)基，再加入外源底物亞油酸，使其濃度達(dá)到0.5mmol/L，28℃繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)酵母細(xì)胞的密度達(dá)到5×106細(xì)胞/ml時(shí)，加入2％半乳糖誘導(dǎo)，18-28℃繼續(xù)培養(yǎng)72h；2500rpm收集菌體，用去離子水洗滌三次，50℃烘干，研碎，取100mg加入5ml 5％的KOH-CH3OH溶液，70℃反應(yīng)2-3h；反應(yīng)結(jié)束，冷卻到室溫，用6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值到2.0，加入4ml 14％BF3-CH3OH，70℃反應(yīng)1.5h，合成脂肪酸甲酯；再加入飽和的NaCl溶液10ml，劇烈震蕩混勻，并轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用8ml 1∶4的氯仿∶己烷抽提兩次，合并提取液；加入適量無水Na2SO4干燥提取液，靜置1h，去掉Na2SO4，把含有脂肪酸甲酯的上清液用氮?dú)獯蹈桑?00μL的正己烷回溶樣品，后用0.45mm的微孔濾膜過濾。實(shí)施例6脂肪酸氣相色譜分析按如下條件進(jìn)行儀器為島津GC-7A，柱子彈性石英毛細(xì)管柱，0.32×30m，固相支持物聚二乙二醇丁二酸酯(Poly-diethylene glycol succinate，DEGS)鍍膜物聚酰亞胺。載氣N2，線速10cm/s。分流比100∶1，氣化室溫度250℃，柱溫180℃，尾吹50ml/min，檢測(cè)器氫火焰離子化檢測(cè)器。以Sigma公司生產(chǎn)的GLA甲酯為標(biāo)準(zhǔn)品，上海生工公司產(chǎn)LA甲酯化物為底物對(duì)照，把上述方法制備的脂肪酸甲酯化的樣品，進(jìn)行GC分析，上樣量為1Ml；分析軟件Anstar，分析之星色譜工作站。
色譜分析結(jié)果見附圖4，附圖4顯示γ-亞麻酸甲基酯標(biāo)準(zhǔn)物(4A)、含pYES2.0空載體的轉(zhuǎn)基因酵母(4B)和含重組質(zhì)粒pYRAD6的轉(zhuǎn)基因酵母(4C)的氣相色譜圖。通過與已知的脂肪酸甲基酯標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間進(jìn)行比較鑒別出各個(gè)峰。圖4C中保留時(shí)間為11.383min對(duì)應(yīng)的峰即為少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶催化亞油酸產(chǎn)生的γ-亞麻酸。
序列列表SEQUENCE LISTING<110> 南開大學(xué)<120> 少根根霉Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列及其應(yīng)用<130> 030528<160> 8<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 1482<212> DNA<213> 少根根霉(Rhizopus.arrhizus)<400> 1gatcttcttt tctttcacta ttttcaatat gagtacatca gatcgtcaat cagttttcac60attaaaagag ttggaactga ttaatcaaaa acatcgagat ggagataaaa gtgcgatgaa120gttcattatc attgatcgta aggtgtacga tgtgactgaa ttcttggaag atcatcctgg180tggtgcacaa gtattactga cacacgttgg aaaagatgca tctgatgtat ttcatgccat240gcatcccgag tcagcatatg aaatcttgaa caattatttt gtaggagatg taaaagatgc300acatgtaaag gagacccctt ctgctcaatt tgcttcagaa atgcgtcaac ttcgggatca360attgaaaaaa gaaggttatt ttcattctag taaagcttat tatgtttaca aggtcctctc420tactcttgct ctttgygcag ctggtcttac tcttttgtat gcttatggac atacatctac480tttagctgtt gttgcatctg ctattattgt tggtatcttt tggcaacaat gtggttggtt540ggctcatgat tttggacatc atcaatgctt tgaagatcgc tcttggaatg atgttcttgt600tgttttcctt ggaaactttt gtcaaggttt ttcattgtca tggtggaaga ataaacataa660cactcaccac gctagtacga atgttcatgg acatgatccc gatattgaca ctgctcctgt720cttattatgg gatgaatatg catctgcagc ttattatgcc tcactggatg aagaacccac780aatgatttct cgattccttg ctgaaagtgt cttgcctcat caaactcgtt attacttctt840tgttctcggc tttgctcgtt tatcatgggc catccaatcc ttactctact cattcaaaca900aggtgctatt aacaagtctc atcaactcaa cctctttgaa cgcttttgtc ttgttagtca960ctggacttta ttcacttact gtacacttgc ctggtgtagc aacgtctatc acatgatttt 1020gttctttttg gttagtcaag caactaccgg ttacacattg gcccttgtat ttgctttgaa 1080tcacaatggt atgcctgtga ttactgaaga aaaggccgag tcaatggaat ttttcgaaat 1140tcaagtgatt acaggtcgtg atgtaacact ctctccttta ggtgattggt tcatgggtgg 1200attgaactat caaatcgagc atcatgtttt ccctaatatg cctcgtcata atttacctaa 1260agtaaagcca atggtcaagt cactttgtaa gaaatatgat attaattatc acgatactgg 1320attcttgaaa ggaacattgg aagtactaaa gacattagat attacttcca agttgtcttt 1380gcaattgagc aaaaagtcat tttaatcttt tgataccatt ttcttttaga catttgcata 1440ataataaatt gttggtgatc aaataatcac ttttagttca ac 1482<210> 2<211> 458<212> PRT<213> 少根根霉(Rhizopus.arrhizus)<400> 2Met Ser Thr Ser Asp Arg Gln Ser Val Phe Thr Leu Lys Glu Leu Glu1 510 15Leu Ile Asn Gln Lys His Arg Asp Gly Asp Lys Ser Ala Met Lys Phe20 25 30Ile Ile Ile Asp Arg Lys Val Tyr Asp Val Thr Glu Phe Leu Glu Asp35 40 45His Pro Gly Gly Ala Gln Val Leu Leu Thr His Val Gly Lys Asp Ala50 55 60Ser Asp Val Phe His Ala Met His Pro Glu Ser Ala Tyr Glu Ile Leu65 70 75 80Asn Asn Tyr Phe Val Gly Asp Val Lys Asp Ala His Val Lys Glu Thr85 90 95Pro Ser Ala Gln Phe Ala Ser Glu Met Arg Gln Leu Arg Asp Gln Leu100 105 110Lys Lys Glu Gly Tyr Phe His Ser Ser Lys Ala Tyr Tyr Val Tyr Lys115 120 125Val Leu Ser Thr Leu Ala Leu Cys Ala Ala Gly Leu Thr Leu Leu Tyr130 135 140Ala Tyr Gly His Thr Ser Thr Leu Ala Val Val Ala Ser Ala Ile Ile145 150 155 160Val Gly Ile Phe Trp Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe Gly165 170 175His His Gln Cys Phe Glu Asp Arg Ser Trp Asn Asp Val Leu Val Val180 185 190Phe Leu Gly Asn Phe Cys Gln Gly Phe Ser Leu Ser Trp Trp Lys Asn
195 200 205Lys His Asn Thr His His Ala Ser Thr Asn Val His Gly His Asp Pro210 215 220Asp Ile Asp Thr Ala Pro Val Leu Leu Trp Asp Glu Tyr Ala Ser Ala225 230 235 240Ala Tyr Tyr Ala Ser Leu Asp Glu Glu Pro Thr Met Ile Ser Arg Phe245 250 255Leu Ala Glu Ser Val Leu Pro His Gln Thr Arg Tyr Tyr Phe Phe Val260 265 270Leu Gly Phe Ala Arg Leu Ser Trp Ala Ile Gln Ser Leu Leu Tyr Ser275 280 285Phe Lys Gln Gly Ala Ile Asn Lys Ser His Gln Leu Asn Leu Phe Glu290 295 300Arg Phe Cys Leu Val Ser His Trp Thr Leu Phe Thr Tyr Cys Thr Leu305 310 315 320Ala Trp Cys Ser Asn Val Tyr His Met Ile Leu Phe Phe Leu Val Ser325 330 335Gln Ala Thr Thr Gly Tyr Thr Leu Ala Leu Val Phe Ala Leu Asn His340 345 350Asn Gly Met Pro Val Ile Thr Glu Glu Lys Ala Glu Ser Met Glu Phe355 360 365Phe Glu Ile Gln Val Ile Thr Gly Arg Asp Val Thr Leu Ser Pro Leu370 375 380Gly Asp Trp Phe Met Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Val385 390 395 400Phe Pro Asn Met Pro Arg His Asn Leu Pro Lys Val Lys Pro Met Val
405 410415Lys Ser Leu Cys Lys Lys Tyr Asp Ile Asn Tyr His Asp Thr Gly Phe420 425 430Leu Lys Gly Thr Leu Glu Val Leu Lys Thr Leu Asp Ile Thr Ser Lys435 440 445Leu Ser Leu Gln Leu Ser Lys Lys Ser Phe450 455<210> 3<211> 23<212> DNA<213> 少根根霉(Rhizopus.arrhizus)<400> 3gccatccaat ccttactcta ctc 23<210> 4<211> 25<212> DNA<213> 少根根霉(Rhizopus.arrhizus)<400> 4tgtgggttct tcatccagtg aggca 25<210> 5<211> 28<212> DNA<213> 少根根霉(Rhizopus.arrhizus)<400> 5ctcggtaccg gggatcttct tttctttc 28<210> 6<211> 35<212> DNA<213> 少根根霉(Rhizopus.arrhizus)<400> 6ctcgcatgcg ttgaactaaa agtgattatt tgatc35<210> 7<211> 34<212> DNA<213> 少根根霉(Rhizopus.arrhizus)<400> 7cacggtacca tgagtacatc agatcgtcaa tcag 34<210> 8<211> 34<212> DNA<213> 少根根霉(Rhizopus.arrhizus)<400> 8ctcgcatgct taaaatgact ttttgctcaa ttgc 3權(quán)利要求
1.一種從少根根霉中分離的編碼Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列，其特征在于，它是具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或該核苷酸序列的片段、類似物和衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是選自下組(a)編碼具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列多肽或其片段、類似物、衍生物的核苷酸序列；(b)與核苷酸序列(a)互補(bǔ)的核苷酸序列；(c)與(a)或(b)有至少65％相同性的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是編碼具有SEQID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是具有SEQ IDNO1中的第29-1406bp的核苷酸序列或具有SEQ ID NO1中第1-1482bp的核苷酸序列。
5.一種多肽，其特征在于它是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽或其多肽的片段、類似物和衍生物。
6.如權(quán)利要求5所述的多肽，其特征在于它是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽或其氨基酸變異不超過30％。
7.一種表達(dá)載體，其特征在于它是由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體所構(gòu)建的重組載體。
8.一種基因工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于它是選自于下列一種宿主細(xì)胞(a)它是用權(quán)利要求1所述的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)它是用權(quán)利要求7所述的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，或這些宿主細(xì)胞的后代。
10.權(quán)利要求1-9用于生產(chǎn)不飽和脂肪酸的應(yīng)用，生產(chǎn)人類食品、動(dòng)物飼料、化妝品或藥品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從少根根霉中分離的編碼Δ
文檔編號(hào)C12N15/63GK1456671SQ03130000
公開日2003年11月19日 申請(qǐng)日期2003年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月6日
發(fā)明者李明春, 張琦, 邢來君, 孫穎 申請(qǐng)人:南開大學(xué)